JPS63246399A

JPS63246399A - シロサケの卵黄形成促進ホルモン

Info

Publication number: JPS63246399A
Application number: JP62077519A
Authority: JP
Inventors: Kunimasa Suzuki; 鈴木　邦昌; Yasumichi Ito; 伊東　泰通
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-04-01
Filing date: 1987-04-01
Publication date: 1988-10-13
Also published as: JPH0567160B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明汀、魚類の卵黄形成促進ホルモンおよび卵成熟促
進ホルモンの精製法、それらを用いた魚類の生殖服貞量
壇大力法、およびそれらの抗体を用いたラジオイムノア
ッセイによる０躬時期の決定法に関する。

（従来の技術）唾乳類の脳下垂体からは、黄体形成ホルモン（Ｌｕｔｅ
ｉｎｉｚｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ　、以下ＬＨと略記す
る）と卵胞刺激ホルモン（Ｆｏｌｌｉｃｌｅ　ｓｔｉｍ
ｕｌａｔｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ　、以下ＦＳＨと略記す
る）の機能の異なる２８［類の生殖腺刺激ホルモン＋（
Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ以下ＧＴＨと略記する）が産
生されて゛いる。これらのＧＴＨはαおよびβと呼ばれ
る二つのサブユニットから成り、このうちαサブユニッ
トＦｉ橿関で相同な構造を持つのに対し、βサブユニッ
トは構造の変異の多い分子であることが知られている。

Ｌ）ｌについては、ヒツジＬ　Ｈ（Ｈ，Ｐａｐｋｏｆｆ
ら；Ｊ、Ａｎ、Ｃｂｅｍ、Ｓｏｃ、　９３　、１５５１
　（ｆ９７１　）：ｌ　、ヒトＬ　Ｈ（：　Ｂ、　Ｓｃ
ｈｏｍｅら；　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、
Ｍｅｔａｂ、。

１６．６）８（１９７３））、ＦＳＨＫついてＦｉ、ヒ
トＦ　Ｓ　Ｈ［Ｂ、　ＳｃｈｏｍｅらＪ、Ｃ目ｎ、Ｅｎ
ｄｏｃｒ　１ｎｏｌ　、Ｍｅｔａｂ　、。

３９．１９９（１９７４））などの報告がある。硬骨魚
類における生殖腺刺激ホルモンの研究は、コイ（Ｅ、Ｂ
ｕｒｚａｗａ−Ｇｅｒａｒｄら；　Ｇｅｎ、Ｃｏｍｐ、
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、。

３８．４２１−４４０（１９７９））、サケ（Ｅｄｗａ
ｒｄ　Ｍ。

Ｄｏｎａｌｄｓｏｎら；　Ｇｅｎ、Ｃｏｍｐ、Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌ　、　、　１８　、４６９−４８１（ｔ９
７２））などがある。これらの報告によると、魚類には
ＬＨ様のＧＴＨが一樵類のみ存在するといわれている。

それに対して、魚類にも２ＳａのＧＴＨが存在するとｂ
う報告ＣＤ、Ｒ，Ｉｄｌｅｒら；　Ｇｅｎ、Ｃ□ｍｐ、
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、、　４）　、３８４−３９１（
１９８０）、　Ｔ、Ｂ、ＮＧら；　Ｇｅｎ、Ｃｏｔｎｐ
、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　、　。

３８、ｔｌｏ−４２０（１９７９））もある。

（発明が解決しようとする問題点）しかしながら、魚類においては、−次構造解析など生化
学的研究はなされておらず、魚類に嶋乳類のＬＨ，ＦＳ
Ｈに相当する２種類のＧＴＨ分子が存在するか否かは不
明である。

（問題点ｔＳ決するための手段）本発明者らは、シロサケ脳下画体からＧＴＨの単離を試
み九ところ、−久構造および機能の異なる２′ａ類のＧ
ＴＨ，すなわち、卵黄形成を促進するＧＴＨ（卵黄形成
促進ホ／Ｉ／　モｙ　、Ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｅｓｉｓ
Ｐｒｏｍｏｒｔｉｎｇ　Ｈｏｒｍｏｎｅ、以下ＶＰＨと
略す）と、卵成熟ｔ−ｔｉ進するＧ　Ｔ　Ｈ、Ｍａｔｕ
ｒａｔｉｏｎ　ＰｒｏｍｏｒｔｉｎｇＨｏｒｍｏｎｅ、
以下ＭＰＨと略す）の単離に成功し。

本発明を完成するにいたった。

以下１本発明の詳細な説明する。

本発明は、魚類とくにシロサケのＶＰＨとＭＰＨを提供
する。

本発明のＶＰＨは、下記の理化学的性質を有する。

（Ｉ）αとβサブユニットから成る。

（■）βサブユニットのアミノ酸組成　　第１表に記載
のとおり。

（ＩＩＩ）βサブユニットのアミノ酸配列　　第２表に
記載のとおシ。

（ＩＶ）シアル酸含量　　５．３嘔（ｗ／ｗ　）（Ｖ）
等電点　　　　　４．５〜５．３（ＶＩ）分子量　　　
　　約４７０００（鴇）溶剤に対する溶解性　水溶性、
アセトン不溶本発明のＭＰＨは、下記の理化学的性質を
有する。

（１）αとβサブユニットから成る。

（■）βサブユニットのアミノ酸組成　　第１表に記載
のとおシ。

（Ｉｌｌ）βサブユニットのアミノ酸配列　　第２表に
記載のとおプ。

（ＩＶ）シアル酸含量　　２．１　％　（ｗ／ｗ）（Ｖ
）分子量　　　　　約４２０００（ＶＤ　等を点４．０〜ａ、５（ＶＩｌ）溶剤に対する溶解性　水溶性、アセトン不溶
第１表　アミノ酸組成アミノ酸　　　ＶＰＨ−β　　　　　ＭＰＨ−βＡｓｐ
　　　　　９．８　　　　　　９．７Ｔｈｒ　　　　　
８．Ｏｑ、ＢＳｅｒ　　　　　６．０　　　　　　７．６Ｇｌｕ　　
　　　９．１　　　　　１１．７Ｐｒｏ　　　　　６．
１　　　　　１１．５Ｇ　１　ｙ５．９　　　　　　５
．８Ａｌａ　　　　　３．０　　　　　　１ｊＣＹＳ　　　
　　　　１１．ロ　　　　　　　　　　１０．０Ｖａｌ
　　　　　４．５　　　　　　７．５Ｍｅｔ　　　　　
２．２　　　　　　２．５１１ｅ　　　　　６．８　　
　　　　４．８Ｌｅｕ　　　　　　　　　５．９　　　
　　　　　　　　　５．７Ｔｙｒ　　　　　２．９　　
　　　　２．８Ｐｈｅ　　　　　５．Ｑ　　　　　　　
２．ＩＨｉｓ　　　　　１．４　　　　　　２．０Ｌｙ
ｓ　　’　　　　８．０　　　　　　５．ＱＡｒｇ　　
　　　６．４　　　　　　４．０Ｔｏｔａｌ　　　１０
　Ｑ、０　　　　　１００，０本発明のＶＰＨおよびＭ
ＰＩ（ｔｌ、遡上した３、４年齢のメスのシロサケ（０
ｎｃｏｒｈｙｎｃｕｓ　ｋｅｔａ　）の脳下垂体から１
通常の糖タンパクの調製に用いられるアルコール抽出法
を用いて抽出することができる。具体的には脳下走体に
４ＧＫ冷却し几酢酸アンモニウム、エタノール抽出ｇ　
＜工ｐ／−＃１０−４０憾、酢酸アンモニウム５−１５
憾、ＥＤＴム５−１０ｍＭ、ＰＭＳＦｌ−２ｍＭ、ｐＨ
５−７）ｉ加え摩砕する。この摩砕液に、さらに上記抽
出溶液を加え、４Ｃで１０〜２０時間攪拌しながら抽出
する。抽出液を冷凍遠心（１５０ＱＱｒｐｍ　、４０゜
３０分）シ、その上清を透析後、凍結乾燥する。

この凍結乾燥物ヲ、イオン交換クロマトグラフィーおよ
びゲルｖＥｔ過クロマトグラフィーで分画し。

ＶＰＨおよびＭＰＩ（′ｋｆｆ製する。イオン交換クロ
マトグラフィーは、５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐ　Ｈ
８，５−９，０’）で平衡化し７ｔＤＥＡＥ　５２カラ
ムで行なう。ゲル濾過クロマトグラフィーは。

５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ８−９）で平衡化し之
セファデックスＧ−７５８Ｆカラムで行なう。

本発明のＶＰＨおよびＭＰＨの＃Ｏｆ検定Ｆｉ。

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｐＨ７，２，
１０−ゲル、０．１１ＳＤＳ）ｔ−用いて行なう。アミ
ノ酸組成は本物質に２０慢定沸点塩酸を加え減圧ｍＭ後
、１１０Ｃ’で２２時間加水分解し。

ＬＫＢ４４００ｆｉアミノ酸自動分析機で分析する。

本物質のＮ末端からのアミノ酸配列は、エドマンダンシ
ル法によプ決定する。本発明のＶＰＨは卵黄形成期に、
ＭＰＨｔｉ卵成熟期および排卵期に投与することにより
、硬骨魚類の正常な生殖腺の発達および排卵１に促すこ
とができる。

（発明の効果）本発明によれＦ！、シロサケ脳下撫体から、卵黄形成を
促進するＧＴ）Ｉおよび卵成熟を促進するＧＴＨが単離
され、魚類の生殖腺重量の増大、あるイハ該ホルモンの
抗体を用いたラジオイムノアッセイによる分泌時期の決
定法などに極めて有用である。

（実施例）次に本発明の実施例について記載する。

（１）　ＶＰＨおよびＭＰＨの抽出、精製３．４年齢の
メスのシロサケ（０ｎｃｏｒｈｙｃｈｕｓ　ｋｅｔａ）
脳下垂体５０２に、４ＣＫＩｇ却し友酢酸アンモニウム
、エタノール抽出溶液（５５係エタノール。

１０悌酢ばアンモニラＡ、ＳｍＭ　ＥＤＴ人、　１．５
　ｍＭＰＭＳＦ　ｐＨ６，１）　５０−を加え、ホモゲ
ナイザー？用いて１００００　ｒｐｍ　、　１０分間摩
砕し友。これに３５０１Ｒｔの上記と同じ組成の酢酸ア
ンモニウム。

エタノール抽出浴液を加え、４Ｇで１４時間攪拌し抽出
した。抽出液を冷凍遠心後（１５０００ｒｐｍ。

３０分、４ｉＣ）、上清４０〇−全透析（透析外液：蒸
留水）シ、凍結乾床して、粉末１．１ｆ１に得九。

この粉末Ｑ５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ９，０）５
０ｔＲｔＫ溶解し、同緩衝液で平衡化したＤｇ５２（Ｗ
ｈａｔｍａｎ　Ｌｔｄ製）カラム（φＬＯＸ　３０　ｃ
ｌｎ）　ｋ用い友イオン交換クロマトグラフィーで分画
し友。

溶出は、出発緩衝液に続き０．１Ｍ酢酸アンモニウム（
ｐＨ９，０）でステップワイズに溶出し７ｔ（第１図参
照）。溶出液は、５ｒｐＬｔずつの分画く回収し。

各分画は凍結乾燥し九。第１図中、ＤＥ−ＢおよびＤＥ
−Ｅの分画からは、それぞれ４５Ｉｎ９および７０〜の
凍結乾燥物が得られ九〇第１図中の分画ＤＥ−Ｂおよび
ＤＥ−Ｅは５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ９，０）で
平衡化し九セファデックスＧ−７５８Ｆカラム（φ２，
６４　Ｘ　１０００Ｉ：Ｗｌ）を用いて、さらに精製し
７ｔ（第２図、第３図参照）。溶出は。

５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ９，０）で行ない。

浴出液は２−ずつの分画に回収し、各分画は凍結乾燥し
次。第２図の分画ＤＥ−Ｂ−ｂからは１０〜。

第５図の分画ＤＥ−Ｅ−ｂからは２５〜の凍結乾燥物金
得り。分画ＤＥ−Ｂ−ｂはＶＰＨ，分画ＤＥ−Ｅ−ｂは
ＭＰＨにそれぞれ相当する。まｘ、ｖｐｕおよびＭＰＨ
ａ、ＳＤＳボリアクリルアｉドゲル電気泳動（１０ｓグ
Ａ／、　ｐＨ７，２，０，１％ＳＤＳ　）で単一バンド
であることを確認した。

（２）分子量の測定５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ９，０）で平衡化し九
セファデックスＧ−７５８Ｆカラム（φ２．４６ｘ　１
０００　ｃｍ　）に、オバルプミン（４３Ｋ）、キモト
リプシノーゲン（２５Ｋ）、　リボヌクレアーゼＡ（Ｉ
Ｉ７Ｋ）、ウシ血清アルブミン（６７Ｋ）１ｒ襟準タン
パクとして添加し、それぞれの溶出位置から検量線を作
成し友。同一カラムにＶＰＨおよびＭＰＨｉ添加し、そ
れぞれの溶出位置から分子量を求め友。第４図に示すと
おシ、ＶＰＨおよびＭＰＨの分子量は、それぞれ４７０
００および４２０００と具足され九。

（：（）　　シアル酸含量ＶＰＨおよびＭＰＨｉそれぞれ５０μｔずつ用い、　Ａ
ｍ１ｎｏｆｆ方法ＣＤ、Ａｍ１ｎｏｆｆ　；　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌＪ、、８１．３８４（１９６））］でシ
アル酸含量を測定し友。ＶＰＨおよびＭＰＨのシアル酸
含量は、それぞれ３．３係および２．１俤であった。

（４）サブユニットの分画ＶＰＨおよびＭＰＨは、０．１係トリフルオロ酢酸に溶
解し、αおよびβサブユニットに解離させ。

Ｔ　Ｓ　Ｋ　ｇｅｌ　０ＤＳ−１２０Ｔカラム（東洋曹
達工業社製）を用いた高速液体クロマトグラフィーで分
−したく第５図、第６図参照）（５）　　アミノ酸分析Ｖ’Ｐ　ＨおよびＭＰＨのβサブユニット５０μｇをそ
れぞれ２０係定沸点塩酸１００μｔに溶解し。

減圧密封後、１１０ｃで２２時間加水分解し。

４４００型アミノ酸自動分析機（Ｌ　Ｋ　Ｂ　Ｂｉｏｃ
ｈｒｏｍＬｉｄ　、製）で分析し几。結果は第１表に示
すとおりで５ＶＰＨおよびＭＰＨのβサブユニットのア
ミノ酸組成は互いに異なシ、特にプロリンおよびリジン
の含量に大きな差が認められ比。

（６）　　アミノ酸配列分析ＶＰＨおよびＭＰＨのβサブユニットは、還元カルボキ
シメチル化後、エドマンダンシル法によ、９Ｎ末端から
のアミノ酸配列を決定し九。さらに。

還元カルボキシメチル化後、トリプシン、キモトリプシ
ン、リジルエンドペプチダーゼおよヒ■８で限定分解し
て断片を回収した。この断片のアミノ酸配列全エドマン
ダンシル法により決定した。

第２表に示すように、ＶＰＨとＭＰＨは一次構造が互い
に異なる別個の分子である。

（力　生殖腺重量増大作用卿１ヒ後５．６ケ月齢（８〜１２？）の雄のニジマスの
腹腔内に、、ＶＰ）（およびＭＰＨをそれぞれ１５μｇ
ずつ３日おきに５回投与した。実験は。

水＠１２Ｃ自然光１５時間で行なつ之。最終投与後２日
目の生殖ｍ１Ｊｉｋ測定し友。第７図に示し次ように、
ＶＰＨおよびＭＰＨと４ニジマスの生殖腺を増大させ友
。

（８）　　ラジオイムノアッセイＶＰＨおよびＭＰＨのラジオイムノアッセイは。

それぞれのβサブユニットの抗血清を用いて行なった。

また、ＶＰＨおよびＭＰＨのヨード化は。

ヨードケン法（Ｐ、Ｊ、Ｆｒａｋｅｒら；　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、Ｂｉｏｐｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、８０．８４９（１９７８））
により行なつ之。ラジオイムノアッセイは、以下に述べ
る手順で行なった。被検血清１００μｔに抗ＶＰＨβお
よびＭ、Ｐ　Ｈβ血清１００μｔを加え、４Ｃで１２時
間放置後、Ｉ襟＠Ｖ　Ｐ　Ｈオ！ヒＭ　Ｐ　Ｈ１００μ
Ｌ（２００００ｃｐｍ／１００　μｔ　）　ｋ加え、さ
らに４Ｃで１２時間放置する。これに抗家兎ｒｇＧ血清
２００μｔと１０９６ポリエチレングリコール６０００
１に含む１幅正常家兎血清１００μｔを加え、室温で２
時間放置後、遠心（３０００ｒｐｍ　、　１５分）シ。

上清を除い友後、沈殿物の放射活性を測定し友。

平行して行なった既知の量のＶＰＨおよびＭＰ）Ｉの希
釈列の放射活性から検量線を作成し、被検血清中のＶＰ
ＨおよびＭＰＨの濃度を測定した。被検血清として卵黄
形成期のニジマス血清および排卵期のアマゴ血清を用い
たところ、ＶＰＨは卵黄形成期に、ＭＰＨＦｉ排卵期に
血中濃度が高くなることが明かになつ友（第８図、第９
図癖照）。この結果は１本発明のＶＰＨが卵黄形成に、
ＭＰＨが排卵および卵成熟に関与していることを示して
いる。

（９）　　卵成熟酵起ステロイドホルモン産生能ＶＰＨ
とＭＰ　Ｈｉｏ、０１　、０．１　ｋｊヒ１　μｇ−ｊ
ツ加え几ニジマスリンゲル液中で、卵成熟直助のサケ科
魚類の卵１１５Ｃで２４時間培養し、放出さし友卵成熟
誘起ステロイドホルモンをグラハムヤング等の方法ＣＧ
ｅｎ、Ｃｏｍｐ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　、　５１　
、９７（１９８３））で測定し比。その結果、第１０図
に示したように、ＭＰＨ量高い卵成熟誘起ステロイドホ
ルモン産生が認められ、ＭＰＨは卵成熟誘起ステロイド
ホルモン産生を介して卵成熟を促進することが明かにな
った。

【図面の簡単な説明】

第１図は、シロサケ脳下垂体のエタノール抽出物をＤＥ
５２カラムで分画しｔ際の溶出パターンを示すグラフ、
第２図は、第１図の分画ＤＥ−ＢをセファデックスＧ−
７５ＳＦ’カラムで分画し比際の溶出パターンを示すグ
ラフ、第３図は、第１図の分画ＤＥ−Ｅｉセファデック
スＧ−７５ＳＦカラムで分画した際の溶出パターンを示
すグラフ、第４図は、セファデックスＧ−７５ＳＦカラ
ムの溶出位置からＶＰＨおよびＭＰＨの分子量を算定し
次算定図、第５図は、ＶＰＨのサブユニツ）ｔＴ　Ｓ　
Ｋ　ｇｅｌ　０ＤＳ−１２０Ｔ力ラムＣ’Ｄ画１．几際
（Ｄ溶出パターンを示すグラフ、第６図は、ＭＰＨのサ
ブユニットｔ−Ｔ　Ｓ　Ｋ　ｇｅｌ　　０Ｄ８−１２０
Ｔカラムで分画し友際の溶出パターンを示すグラフ、第
７図は、ニジマスにおけるＶＰＨおよびＭＰＨの生殖腺
ｔｉｔの増加作用を示す図表％第８図は卵黄形成期のニ
ジマスにおける血中ＶＰＨおよびＭＰＨ量を示す図表、
第９図は、排卵期のアマゴにおける血中ｖＰＨおよびＭ
ＰＨｊｌｔ−示ス図表、第１０図は、アマゴの卵を用い
之ＶＰＨおよびＭＰＨの卵成熟訪起ステロイドホルモ／
産生能を示す図表である。第１図（分画番号）第２図（分画番号）第３図（ＴＵＢＥ　ＮＵＭＢＥＲ）第４図４．５　　　　　　　５．０ｏｇ　ＭＷ第５図　　　　　第６図ＭＩＮ、　　　　　　　　　　　　　　ＭＩＮ。第７図Ｑ２　　　　　　　０４丁ナドソマテックインデックス（χ）血中（ｙＴＨ量Ｃｎｇ／ｍ１）４ブト　卵　後第１０図Ｃｎｇ／ｍｌ’）ＶＰＨＭＰＨ］−舵々ネ山ｊＦ　ｉＪ−：　　　（７）式）％式％２　発明の名称シ［１リケの卵黄形成促進ホルモンおよび卵成熟促進ノ
トルｔンとぞの利用方法３　補ｉ■−をσる省１１件との関係・特許出願人一゛：手県釜石市東前町１９番１０　ｋ−３［ｌ　　代
　　勝　　　ゾｊ４代理人東京都混区虎）門−丁目２番２９号ＩＪｄノ閂産業ビル
５階７　　？＋１ｉｉｆの内容明細占の第１頁の発明の名称を次のとおり補正する。１−シ「］リクの卵黄形成促進ホルモンおよび卵成熟促
進ホルモンとその利用方法」

Claims

【特許請求の範囲】（１）シロサケの卵黄形成促進ホルモンおよび卵成熟促
進ホルモン。（２）シロサケの脳下垂体から抽出して得られる特許請
求の範囲第１項記載の卵黄形成促進ホルモンおよび卵成
熟促進ホルモン。（３）下記の理化学的性質を有する糖タンパクであるこ
とを特徴とするシロサケの卵黄形成促進ホルモン。（ I ）αとβサブユニットから成る。（II）βサブユニットのアミノ酸組成　第１表に記載の
とおり。（III）βサブユニットのアミノ酸配列　第２表に記載
のとおり。（IV）シアル酸含量　３．３％（ｗ／ｗ）（Ｖ）等電点　４．５〜５．３（VI）分子量　約４７０００（VII）溶剤に対する溶解性　水溶性、アセトン不溶（
４）下記の理化学的性質を有する糖タンパクであること
を特徴とするシロサケの卵成熟促進ホルモン。（ I ）αとβサブユニットから成る。（II）βサブユニットのアミノ酸組成　第１表に記載の
とおり。（III）βサブユニットのアミノ酸配列　第２表に記載
のとおり。（IV）シアル酸含量　２．１％（ｗ／ｗ）（Ｖ）分子量　約４２０００（VI）等電点　４．０〜４．５（VII）溶剤に対する溶解性　水溶性、アセトン不溶（
５）卵黄形成促進ホルモンおよび卵成熟促進ホルモンを
魚類に投与して魚類の生殖腺重量を増大させる方法。（６）卵黄形成促進ホルモンおよび卵成熟促進ホルモン
の抗体を用いたラジオイムノアッセイにより、それぞれ
の分泌時期を明かにする方法。（７）魚類がニジマスまたはシロサケである特許請求の
範囲第５項記載の方法。