【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
に産業上の利用分野】
本発明はアミノ基を有する、例えば、蛋白質。
ペプチド、アミノ酸等を容易に固定化出来る新規なハロ
ゲン化シアン活性化粒状多孔質キチンに関し、このもの
は、アフィニティクロマトグラフィー用担体、酵素固定
化用担体等の分野に好適なものである。INDUSTRIAL APPLICATION FIELD The present invention relates to proteins having an amino group, for example, proteins. The present invention relates to a novel cyanide halide-activated granular porous chitin that can easily immobilize peptides, amino acids, etc., and is suitable for use in the fields of affinity chromatography carriers, enzyme immobilization carriers, and the like.
【従来の技術】[Conventional technology]
従来、特公昭５７−２１５２９号に開示されている如く
、臭化シアンによって活性化されたアガロースは知られ
ており、ハロゲン化シアンで活性化すれば分子中の水酸
基と反応しアミノ基と反応し易くなる。しかし、上記公
報に開示されているアガロースやデキストランの如き多
糖類等のゲルをハロゲン化シアンで活性化したものをア
フィニティークロマトグラフィーや固定化酵素用担体に
供した場合には、該多糖類はゲル状であって、強度が不
足するため通液時の圧力上昇が著しくなり、実用的でな
い欠点がある。
Ｋ発明が解決しようとする問題点】
本発明は上述の如く、工業的に使用する場合に、圧損を
生じない様な強度を有する蛋白質、ペプチドアミノ酸等
を容易に固定化できる新規なハロゲン化シアン活性化多
糖類を得ることを目的とし、本発明者等の開発した粒状
多孔質キチンを用いることによって上記問題点を解決し
た。Conventionally, as disclosed in Japanese Patent Publication No. 57-21529, agarose activated with cyanogen bromide has been known, and when activated with cyanogen halide, it reacts with the hydroxyl group in the molecule and reacts with the amino group. It becomes easier. However, when a gel of a polysaccharide such as agarose or dextran as disclosed in the above publication is activated with cyanogen halide and subjected to affinity chromatography or a carrier for immobilized enzyme, the polysaccharide becomes a gel. However, due to the lack of strength, the pressure rises significantly during liquid passage, making it impractical. [Problems to be Solved by the Invention] As mentioned above, the present invention is a novel cyanogen halide that can easily immobilize proteins, peptide amino acids, etc. that have a strength that does not cause pressure loss when used industrially. The above problems were solved by using granular porous chitin developed by the present inventors for the purpose of obtaining an activated polysaccharide.
【問題点を解決するための手段】[Means to solve the problem]
本発明は、粒状多孔質キトサンを無水酢酸等のアセチル
化剤でＮ−アセチル化して粒状多孔質再生キチンとした
後に、アルカリ条件下でハロゲン化シアンと反応させて
得られる、ハロゲン化シアン活性化粒状多孔質キチンに
関するものである。
粒状多孔質キトサンは、低分子量キトサンの酸性溶液を
塩基性溶液中に落下させて得られる。本発明に用いる低
分子量キトサンは平均分子量が１０．０００〜２３０，
０００のものである。
低分子量キトサンは、フレーク状の高分子量キトサンを
、過硼酸ソーダ水溶液中で加温処理することにより、所
望の低い分子量を有する良質なキトサンが青られる。
低分子量キトサンは、酢酸、ジクロル酸ＩＩ、 ！ｉｌ
ｌ酸の単独又は混合物の水溶液に溶解させてキトサン酸
性溶液とする。その濃度は取扱いの容易な範囲を適宜選
択出来るが、２〜２０％の範囲が好ましい。
該キトサン酸性溶液を孔径０．１〜０．２５ ｒＭφの
ノズルより圧力下で塩基性凝固液中に一定量ずつ落下さ
せることによって粒状多孔質キトサンが得られる。
凝固浴の塩基性物質としては、水酸化ナトリウム、水酸
化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、アンモニ
ア、エチレンジアミン等のアルカリ性物質が用いられ、
塩基性物質には、水又はメタノール、エタノール等の極
性を有するアルコール類又は水とアルコールとの混合物
に曲記塩基性物質を加えて使用する。１ｑられた粒状多
孔質キトサンは極性溶媒を用いて中性になる迄充分洗浄
を行う。この様にして得られた粒状多孔質キトサンをア
ルコールで水置換後、例えばエタノール中で無水酢酸を
用いて反応させ、ドアセチル化を行い、更に苛性ソーダ
水溶液の如きアルカリ性溶液で処理してエステル結合を
切断して完全なキチン化を計り、粒状多孔質再生キチン
とする。
該粒状多孔質再生キチンを苛性ソーダ水溶液の如きアル
カリ性溶液でｐＨを１０〜２０に調節しながらハロゲン
化シアンを反応させる。ハロゲン化シアンとしては、臭
化シアン、塩化シアンが使用される。かくして得られた
ハロゲン化シアン活性化粒状多孔質キチンはキチン質か
ら成っているので結晶構造にも優れ、強度に富んだ粒状
物質で、粒状物の表面及び割断面を観察してわかるよう
に均質に形成された微細孔を有する多孔性粒状物である
。
従って、表面積も大きいのでハロゲン化シアンの結合量
も多くなり、活性化能も増大し、アミノ基を有する蛋白
質、ペプチド、アミノ酸等の固定化能も極めて大きい特
色がある。
以下、実施例について本発明を説明するが、本発明はこ
の範囲に限定されるものではない。
実施例において比表面積は、試料を液体窒素中で急冷凍
結し、１０−４トール、−４０℃、８時間真空乾燥し、
１４０℃、４０分間脱ガス後、比表面積自動測定装置（
島）ｆマイクロスリティックス２２００型）にてＢＥＴ
法で測定した。
実施例１
脱アセチル化度８２％、平均分子ｆｉ ４８．０００の
キトサン６０９を酢１１３ＪＪを含む水９４０ｇ中に溶
解して固形分濃度６重量％のキトサン酸性溶液を得た。
該キトサン酸性溶液を７％苛性ソーダ、３０％メタノー
ル、６３％水からなる塩基性溶液中に孔径０．１５輔φ
のノズルより噴霧落下させて、これを中性になる迄水洗
し、平均粒径０．１ｆｆｉｆｉφ２比表面積６４．０Ｔ
Ｉｔ、／’７の粒状多孔質キトサン１℃を得た。
この５０ｄを採取し、エタノールで４回置換し、水を完
全にアルコールで置換した。このものに３倍モルの無水
酢酸を加え、エタノール中で２４時間攪拌し、ドアセチ
ル化させ中性になる迄洗浄し、更に、ＩＮ−Ｎａ０１１
５０戒を加え１時間処理し、中性になる迄充分水洗した
。平均粒径ｏ、１ｍｍφ、比表面積６４．０ＴＩｔ／ｇ
の粒状多孔質キチン５０ｍ２が得られた。
更に、該粒状多孔質キチン５０ｄを２５０ｄの水に懸濁
し、５Ｎ−苛性ソーダでｐＨを１０〜１２とした。２５
ｇ／２５０戒の臭化シアン水溶液を少量ずつ攪拌下に、
１）Ｈを１０〜１２に制御しながら５Ｎ−苛性ソーダを
加え反応させる。２５０ｄ臭化シアン水溶液の添加が終
了した後、更に３０分間攪拌し、冷水で良く洗浄して臭
化シアン活性化粒状多孔質キチン４４戒を得た。
上記のようにして得られた平均粒径０．１ｍｍφの臭化
シアン活性化粒状多孔質キチンと粒径が０．１１Ｒ＃Ｉ
φのアガロースの臭化シアン活性化粒状物（）？ルマシ
アファインケミカル％ｌ、ＣＮＢｒセファロ−スンを拘
谷Ｍ傭製の長さ２５ｃｍ＋径ｏ、ａｃｔｎの耐圧カラム
（１５０Ｋｙ／ ｃｔ！ ＞を用いて充填し、水を一定
流量流した時の圧力上昇度合を調べた結果、図面に示す
如くであった。本発明の臭化シアン活性化粒状多孔質キ
チンは強度に優れているため、通液による圧力の上昇が
小さく、アガロース粒状物に比べ優れているこ′とが判
る。
更に、得られた臭化シアン活性化粒状多孔質キチン１−
を採取し、ＩＩＨ９，０，ＩＮ硼酸緩衝溶液で洗浄した
後、２戒の１％γ−グロブリン溶液を加え、２時間振盪
してγ−グロブリンを固定化した。
固定化量を残液の吸光度と原液の吸光度の差から求めた
処、５．４６１ｙｊ／Ｍ１であった。
また、比較のため、粒径が０．１Ｍφの上記のアガロー
ス臭化シアン活性化粒状物１成を用いて同様の条件でγ
−グロブリンを固定化し、固定化量を残液の吸光度と原
液の吸光度の差から求めたところ、３，７ｑ／ｄであっ
た。
実施例２
実施例１で青だ粒状多孔質キチンに１％γ−グロブリン
の代りに１％ヘモグロビンを用いて実施例１と同量、同
操作により固定したところ、ヘモグロビンの固定化量は
３．０５１Ｒｙ／ｄであった。
実施例３
脱アセチル化度７８％、平均分子ｆｆ１６５，０００の
キトサン７０９を酢酸３５９を含む水９３０ ｇ中に溶
解し、固形分濃度７％のキトサン酸性水溶液を得た。該
キトサン酢ＭＦＢ液を１０％苛性ソーダ、 ３０％メタ
ノール、６０％水からなる塩基性溶液中に、孔径０．２
５１１＃Ｉφのノズルより落下させてこれを中性になる
迄水洗し、平均粒径１．ＯＩＩ＃ｌφ、比表面ＭＡ８５
ｒｒｔ／ｇの粒状多孔質キトサン１λを得た。この５０
ｄを採取しエタノールで４回洗浄し、水を＠換した。そ
して３倍モルの無水酢酸を加え、エタノール中で２４時
間攪拌し中性になる迄水洗し、更に１Ｎ−苛性ソーダ５
０ｓｅを加えた後完全に水洗し、平均粒径１、ｏＩＭφ
、比表面積７５ＴＩｔ／９の粒状多孔質キチン５０ｉを
得た。
該粒状多孔質キチン５０ｄを２５０−の水に懸濁し、５
Ｎ−苛性’／ −タｔ” ＤＨＩＯ〜１２ニ制ａｔ、り
。２５ ｇ／２５０ｄの臭化シアン水溶液を少量ずつｐ
Ｈを１０〜１２に５Ｎ−苛性ソーダで調節しながら加え
反応させる。
２５０戒の臭化シアン水溶液を添加終了俊更に３０分攪
拌し、冷水でよく洗浄して臭化シアン活性化粒状多孔質
キチン４４戒を得た。
上記のようにして得られた臭化シアン活性化粒状多孔質
キチン１戒を採取し、ｐＨ９，０，１１４硼酸緩衝溶液
で軽く洗浄した後、２ｒｄの１％γ−グロブリン溶液を
加え、２時間振盪してγ−グロブリンを固定した。固定
化量は、３．７４ ｔｑ／ｌｄｌでありた。
Ｋ発明の効果］
本発明によるハロゲン化シアン活性化粒状多孔質キチン
は、充分な強度を有する多孔質の粒状体であって、上記
実施例１及び図面に記載のようにカラム充填剤として用
いても充分な強度を有するため通液時に圧損を生じず、
工業的な利用に極めて適したものである。
また、本発明のハロゲン化シアン活性化粒状多孔質キチ
ンは、粒径の揃った、粒状体の表面及び内部に均質に形
成された微細孔を有し、比表面積の大きい粒状体である
ため、蛋白質やペプチドアミノ酸等を多量に固定化する
ことができる。The present invention provides activated cyanogen halide, which is obtained by N-acetylating granular porous chitosan with an acetylating agent such as acetic anhydride to obtain granular porous regenerated chitin, and then reacting it with cyanogen halide under alkaline conditions. It concerns granular porous chitin. Granular porous chitosan is obtained by dropping an acidic solution of low molecular weight chitosan into a basic solution. The low molecular weight chitosan used in the present invention has an average molecular weight of 10.000 to 230,
000. Low molecular weight chitosan is obtained by heat-treating flaky high molecular weight chitosan in an aqueous sodium perborate solution to obtain high quality chitosan having a desired low molecular weight. Low molecular weight chitosan is acetic acid, dichloric acid II, ! il
Chitosan is dissolved in an aqueous solution of l acid alone or as a mixture to obtain an acidic solution of chitosan. The concentration can be appropriately selected within a range that is easy to handle, but a range of 2 to 20% is preferred. Granular porous chitosan is obtained by dropping a certain amount of the chitosan acidic solution into the basic coagulation liquid under pressure from a nozzle with a pore diameter of 0.1 to 0.25 rMφ. As the basic substance in the coagulation bath, alkaline substances such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, potassium carbonate, ammonia, and ethylenediamine are used.
As the basic substance, the basic substance is added to water, a polar alcohol such as methanol or ethanol, or a mixture of water and alcohol. The 1q granular porous chitosan obtained is thoroughly washed with a polar solvent until it becomes neutral. After replacing the water with alcohol, the granular porous chitosan thus obtained is reacted with acetic anhydride in ethanol to perform door acetylation, and further treated with an alkaline solution such as aqueous caustic soda to cleave the ester bond. to ensure complete chitinization and produce granular porous regenerated chitin. The granular porous regenerated chitin is reacted with cyanogen halide while adjusting the pH to 10 to 20 with an alkaline solution such as an aqueous solution of caustic soda. As the cyanogen halide, cyanogen bromide and cyanogen chloride are used. The cyanogen halide-activated granular porous chitin thus obtained is composed of chitin, so it has an excellent crystal structure, is a strong granular material, and is homogeneous as can be seen by observing the surface and cut surface of the granular material. It is a porous granule having micropores formed in it. Therefore, since the surface area is large, the amount of cyanogen halide bound increases, the activation ability increases, and the ability to immobilize proteins, peptides, amino acids, etc. having amino groups is also extremely high. The present invention will be described below with reference to Examples, but the present invention is not limited to this scope. In the examples, the specific surface area was determined by rapidly freezing the sample in liquid nitrogen, vacuum drying at 10-4 Torr, -40°C for 8 hours,
After degassing at 140°C for 40 minutes, the specific surface area automatic measuring device (
Island) BET on f Microslytics 2200 type)
It was measured by the method. Example 1 Chitosan 609 with a degree of deacetylation of 82% and an average molecular fi of 48.000 was dissolved in 940 g of water containing 113 JJ of vinegar to obtain an acidic chitosan solution with a solid content concentration of 6% by weight. The acidic chitosan solution was placed in a basic solution consisting of 7% caustic soda, 30% methanol, and 63% water with a pore size of 0.15φ.
The spray was dropped from a nozzle and washed with water until it became neutral.The average particle size was 0.1ffifiφ2 and the specific surface area was 64.0T.
Granular porous chitosan with It, /'7 at 1°C was obtained. This 50d was collected and replaced with ethanol four times to completely replace water with alcohol. To this was added 3 times the mole of acetic anhydride, stirred in ethanol for 24 hours, washed until it was acetylated and neutralized, and further added IN-Na011
50 precepts were added, treated for 1 hour, and thoroughly washed with water until it became neutral. Average particle size o, 1mmφ, specific surface area 64.0TIt/g
50 m2 of granular porous chitin was obtained. Further, 50 d of the granular porous chitin was suspended in 250 d of water, and the pH was adjusted to 10 to 12 with 5N caustic soda. 25
While stirring a cyanogen bromide aqueous solution of g/250 g/250 g, little by little,
1) Add 5N caustic soda and react while controlling H to 10-12. After the addition of the 250d cyanogen bromide aqueous solution was completed, the mixture was further stirred for 30 minutes and thoroughly washed with cold water to obtain cyanogen bromide activated granular porous chitin 44. Cyanogen bromide activated granular porous chitin with an average particle size of 0.1 mmφ obtained as above and particle size of 0.11R#I
Cyanogen bromide activated granules in agarose of φ ()? The degree of pressure rise when a pressure-resistant column (150 Ky/ct!) with a length of 25 cm + diameter o, actn (150 Ky/ct!) manufactured by Koriya M was packed with Lumacia Fine Chemical %l and CNBr Sepharose and water was flowed at a constant flow rate. The results of the investigation were as shown in the drawings.The cyanogen bromide-activated granular porous chitin of the present invention has excellent strength, so the increase in pressure due to liquid passage is small, and it is superior to agarose granules. Furthermore, the obtained cyanogen bromide activated granular porous chitin 1-
After washing with IIH9,0,IN boric acid buffer solution, 1% γ-globulin solution of 2 precepts was added and shaken for 2 hours to immobilize γ-globulin. The amount of immobilization was determined from the difference between the absorbance of the residual solution and the absorbance of the stock solution, and was found to be 5.461yj/M1. In addition, for comparison, γ
- Globulin was immobilized, and the amount of immobilization was determined from the difference between the absorbance of the residual solution and the absorbance of the stock solution, and it was found to be 3.7 q/d. Example 2 When 1% hemoglobin was used instead of 1% γ-globulin on blue-grained porous chitin in Example 1 and the same amount and procedure as in Example 1 was used, the amount of hemoglobin immobilized was 3. It was 051 Ry/d. Example 3 Chitosan 709 having a degree of deacetylation of 78% and an average molecular weight of ff 165,000 was dissolved in 930 g of water containing acetic acid 359 to obtain an acidic chitosan aqueous solution with a solid content concentration of 7%. The chitosan vinegar MFB solution was placed in a basic solution consisting of 10% caustic soda, 30% methanol, and 60% water with a pore size of 0.2.
511#Iφ nozzle and washed with water until neutral, and the average particle size was 1. OII#lφ, specific surface MA85
Granular porous chitosan 1λ of rrt/g was obtained. This 50
d was collected and washed four times with ethanol, and the water was replaced with @. Then, 3 times the mole of acetic anhydride was added, stirred in ethanol for 24 hours, washed with water until neutral, and further 5 mols of 1N caustic soda.
After adding 0se, wash completely with water, average particle size 1, oIMφ
Granular porous chitin 50i with a specific surface area of 75TIt/9 was obtained. The granular porous chitin 50d was suspended in 250 ml of water, and
N-Caustic'/-Tat'' DHIO ~ 12 at, ri. 25 g/250 d of cyanogen bromide aqueous solution was added little by little.
Add H to 10 to 12 while adjusting with 5N caustic soda and react. Immediately after addition of the 250 cyanogen bromide aqueous solution was completed, the mixture was stirred for 30 minutes and thoroughly washed with cold water to obtain 44 cyanogen bromide activated granular porous chitin. The cyanogen bromide activated granular porous chitin 1 obtained as above was collected and washed lightly with a pH 9, 0, 114 boric acid buffer solution, and a 2nd 1% γ-globulin solution was added thereto for 2 hours. The γ-globulin was fixed by shaking. The amount of immobilization was 3.74 tq/ldl. Effects of the Invention] The cyanogen halide-activated granular porous chitin according to the present invention is a porous granular material having sufficient strength, and can be used as a column packing material as described in Example 1 and the drawings above. It also has sufficient strength so that no pressure loss occurs when liquid is passed through.
It is extremely suitable for industrial use. In addition, the cyanogen halide-activated granular porous chitin of the present invention is a granular material with a uniform particle size, uniformly formed micropores on the surface and inside of the granular material, and a large specific surface area. Large amounts of proteins, peptide amino acids, etc. can be immobilized.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]
図面は、本発明による臭化シアン活性化粒状多孔質キチ
ンと、従来のアガロースの臭化シアン活性化粒状物とを
カラムに充填した際の、通液時の圧力上昇を示すグラフ
である。The drawing is a graph showing the pressure increase during liquid passage when a column is filled with cyanogen bromide-activated granular porous chitin according to the present invention and conventional cyanogen bromide-activated granular agarose.