JPS63240724A - 器官形成および体性クローン変異によるグリシン種全植物体の再生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ダイスや他のグリシン種のインビトロでの組
織培養物から全植物体を再生する器官形成方法に関し、
そして核種における体性クローン変異を誘導する方法に
関する。

（従来の技術） ダイスおよびその関連種を組織培養物から再生する方法
は、長く求められている。タバコやペチュニアのような
容易に再生できる種と違って、ダイスは１組織培養物か
ら全植物体を再生する多くの従来の試みに障害があった
。組織培養物は１体性クローン変異によって、ダイスま
たはそれと交配させ得る種（例えば、　Ｇ、　　赳几）
に所望の特性を誘導させる際に、非常に望ましい。これ
らは。

また、アゲロバクチリアとの感染により、または他の手
段（これにより、外来ＤＮＡを含有する培養物中で形質
転換細胞が得られる。この外来ＤＮＡは。

次いで１種子を生じ、外来遺伝子を発現させるような全
植物体に再生される）によって、細胞を形質転換する遺
伝子工学に有益である。

Ｄ、八、Ｅｖａｎｓ　　ら　（ｍ）　　（（１９８３）
　　、　　　ｔ　　　　　　ｉｆヨ！重辷１柔グー９２
とＺヱじ乙２ノー、第１巻、　ｐｐ、１７８−１７９）
では、一般に、植物体のインビトロでの栄養分体増殖に
利用できる。３つの可能な経路が論じられている：（ａ
）腋芽の解離を高めること；（ｂ）器官形成による不定
のシュートの生成；および（Ｃ）体性の胚形成。

分裂組織、シュートの先端、または芽培養物から、腋芽
を増殖させることは、インビボですでに分化された初期
のシュートを用いることが包含される。それゆえ、完全
な植物体を作るためには。

伸長および根の分化だけが必要である。他方、インビト
ロでの器官形成および胚形成には１発生上の変化を伴う
：この変化は、ふつうは、カルスの形成と、それに続く
小植物体への再組織化である。

これは、たいていの植物では容易に達成されない。

１！ｖａｎｓ　ら（前出、　ｐ、１７８）は、ダイスで
は、従来の器官形成方法がうまくいかないことを論じて
いる。

彼らは、“腋芽増殖を誘導することは、多くの場合（例
えば、カーネーションおよびダイス）に。

適用可能と思われる。この場合、器官形成や胚形成の方
法は使えない°ことを主張している。

彼らは、　ｐｐ、１７８−１７９で、以下のことを引き
続き主張している：　“器官形成および胚形成によって
。

小植物体の増殖速度が驚くほど伸びる。しかし。

多数の副培養物や、最終的なこの形態形成可能性が完全
になくなった後、小植物体の再生能は、多くの場合、急
速に減少する。他方、腋芽増殖に対する初期の増殖速度
は、かなり遅い。それにもかかわらず、この速度は、最
初の２．３の副培養中に増加し、そして引き続く副培養
サイクルの間に。

一定のプラトーに達する。°それゆえ、これら文献の著
者は、腋芽増殖を推薦し、商業的な生産のための器官形
成および胚形成に反対している。

このような芽増殖方法は、　Ｍ、Ｓ、Ｗｒｉｇｈｔらに
より。

１９８６年に、“広ｂｓ暉１ｅ−肚しての器官形成によ
る植物体の再生”　　（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐ
ｏｒｔｓ、　　５　：　１５０−１５４）に記述されて
いる。この方法には、　ＭＳ培地上での財圧旦ｅ　　ｍ
ａｘ　　（Ｌ、）種子の成長が包含される（Ｍｕｒａｓ
ｈｉｇｅ、　Ｔ、およびＳｋｏｏｇ、　Ｆ、（１９６２
）Ｐｈｙｓｉｏｌ。

Ｐｌａｎｔ、　　１５　：　４７３）。このＭＳ培地は
、推奨される濃度の半分の無機塩、およびＲＡＰ　　（
ベンジルアミノプリン；　ＣＡＳ登録番号１２１４−３
９−７）としても公知のＢＡ　（ベンジルアデニン）を
５μＮを含有する。

成長した苗木から子葉節が切り取られ、そして節のない
組織が除去される。節のある組織の断片は。

成長培地上で培養され１次いで、推奨される濃度のわず
か１／４の有機塩および５μＨのＢＡを含有するべく変
性された同じ培地に移される。この節は。

続いて、さらに分割され、追加の培地に移され。

そして最終的には、全植物体を成熟させるために。

土壌含有培地に移される。この方法は、未分化組織の増
殖方法であることが明らかである。この方法は、脱分化
細胞の段階を経ない。この論文は。

ダイズの子葉節の特定の外部領域が誘導され１分裂組織
がある初期のシュートとなり得ること、そして培養中に
てＢＡが定常的に存在することにより。

前再生（ｐｒｏｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）組織からの
シュートの形態形成が維持される。

Ｇ、　　ｍａｘ　　（ダイズ）や虹　赳ハ（組織培養物
から得られる）を含めて、旦り劫り亜Ｂ並口を再生する
方法は、はとんど開発されていない。しかしながら、　
Ｇ、　　ｃａｎｅｓｃｅｎｓやＧ、　　ｃｌａｎｄｅｓ
ｔｉｎａのような関連した野生種では、著しい成功が得
られている。Ｄ、Ｆ、１ｌｉｌｄｅｂｒａｎｄらは、概
説の論文°゛ダイズＧ１　ｃｉｎｅ　ｍａｘ　（Ｌ、）
Ｍｅｒｒ、コ゛″　（農学および林学における遺伝子工
学　第２巻：穀物Ｉ　（Ｙ、Ｐ、Ｓ、Ｂａｊａｊ。

編）２８３−３０８．表４）、　（１９８６）にて、広
泳ｓ暉Ｆ−における最近のインビトロでの再生実験を要
約している。２９３ページの引用では、この内容は、“
未分化組織の培養“の表題でそれ以下に論じられている
。

Ｋ、に、Ｋａｒｔｈａらは、“穀物となるマメ科植物：
ダイズ、コピア、ビーナツツ、ヒョコマメおよびマメ、
の未分化組織からの植物再生”　　（Ｃａｎ、Ｊ、Ｂｏ
ｔ。

皿：　１６７１−１６７９　）にて、１μｈのＮ静およ
び０．０５〜０．１μ−のＢＡを含有する培地で、ダイ
ズシュートの最先端の未分化組織から、植物体を再生す
ることが記述されている。ＢＡに対するより高濃度下で
は、カルスは形成されるが、植物体全体の再生は得られ
ない。

７、Ｋａｍｅｙａらの“グリシン種の胚軸分節からの植
物再生”　　（１９８１，Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、Ｌｅｔ
ｔ、　２１　：　２８９−２９４）には、　Ｇ、　　ｃ
ａｎｅｓｃｅｎｓおよびＧ、　　ｔｅｍｅｎｔｅｌｌａ
の苗木からの胚軸分節を用いることが開示されている。

この胚軸分節は、　ＮＡＡおよびＢＡが種々の濃度で補
われたＭＳ培地上で培養され、正常な植物体が再生され
る。Ｇ、ｍａｘおよびＧ、　　赳ハを含む試験された８
つの種から、１〜５■／ｌ（５〜２５μＭ）ＢＡを用い
たＧ、ｃａｎｅｓｃｅｎｓの胚軸分節からだけ、高頻度
でシュートの再生が認められた。

Ｔ、Ｙ、Ｃｈｅｎｇらの“培養物におけるダイズの子葉
節区分からの植物体再生”　　（１９８０，Ｐｌａｎｔ
　Ｓｃｉ、Ｌｅｔｔ。

１９　：　９ｌ−９９）では、苗木から調節された子葉
節区分を用いて、培養物中にて、ダイズの多数のシュー
ト芽形成を刺激することが報告されている。用いられる
培地は、オーキシンＩＢＭ　　（インドール醋酸）を０
．２５μｉおよびＲＡＰを５〜５０μｈで含有していた
。この方法は、カルスの形成を含めておらず。

むしろ外植体を用いた。１０μＨより高い濃度のＲＡＰ
では、主要なシュートや根の成長が示され、そして子葉
節領域でシュート芽が形成される。土壌で独立して成長
し得る植物体全体が再生されることは、はっきりとは報
告されていない。

Ｈ，５ａｋａらの“培養物中にて、ダイズ茎の節で多数
のシュート形成の刺激”　　（１９８０，Ｐｌａｎｔ　
Ｓｃｉ、Ｌｅｔｔ。

１９　：　１９３−２０１）には、同様に、オーキシン
ＩＢＭおよび５〜５０μＭの口ＡＰを含有する培養培地
を用いて。

Ｇ、　　ｍａｘの茎の節または先端部にシュート芽を形
成することが記述されている。カルスの形成がシュート
芽の形成を妨げることが、報告された。新しい未分化組
織がカルス組織から発生することも。

植物体全体が再生することも、報告されなかった。

上の参考文献のいずれにも、新しい未分化組織の中枢の
生成が可能な組織培養物が保持され得るような、器官形
成の再生方法は記述されていない。

Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄらの概説論文で引用された上の参
考文献に加えて、以下の文献は、この技術を述べる例示
である。

ＪｌＭ、Ｗｉｄｏｌｍらの灸す旦暉１ｅ　　ＣａｎｅＳ
ＣｅｎＳの組織培養物からのシュート再生”　　（１９
８３，Ｐｌａｎｔ　ＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ　ｉ：　１
９−２０　）には、　ＮＡＡおよび５　ｍｇ　／　ｊ２
（２５μＭ）のＢＡＰを含有する培地を含むいくつかの
培地を用いて、子葉および胚軸から得られたカルスから
、シュートを誘導することが報告されている。全植物体
は再生されず、根の形成はまれであった。

Ｗ、Ｄ、Ｂｅｖｅｒｓｄｏｒｆらは、“グリシン種の組
織培養物中で得られる分化の程度”　　（１９７７、Ｃ
ｒｏｐ　　Ｓｃｉ。

１７　：　３０７−３１１　）にて、“成長中心°′と
呼ばれる未分化様の細胞のコンパクトな節を得ることを
報告した。２．４−　Ｄ　（２，４−ジクロロフェノキ
シ酢酸）および／またはＮＡＡ　（α−ナフタレン酢酸
）を０．５ｍｇ／ｌのカイネチン（６−フリルアミノプ
リン）とともに含有する誘導培地を、Ｇ、ｍａｘおよび
虹並ｎの胚軸分節を培養するために用いて、　Ｂｅｖｅ
ｒｓｄｏｒｆらは、“成長中心”を得たが、さらに植物
体までは成長しなかった。

Ｃ，八、Ｎｅｗｅｌｌらの“工ＬＪ二ｙ３≧ｊ１ｖｆ９
ＩＣａｎｅｓｃｅｎｓでの原形質体培養および植物体再
生”　　（１９８５，植物細胞の組織器官の培養　土：
　１４５−１４９　）には、苗木の胚軸組織から取った
原形質体から、　Ｇ、　　ｃａｎｅｓｃｅｎｓの全植物
体を再生することが記述されている。ある実験では、　
０．ｄ　ｒａｇ／　ｆ　（２μＭ）のＢＡ、およびｏ、
ｉｒＫ／ｌおよび１．０■／２のＮＡＡを含有するシュ
ート誘導培地が報告された。

上の記述のいずれも、全植物体の器官形成の再生を得る
べく、高濃度のＢＡＰまたは他のサイトカイニンを含む
培地にて、Ｇ、ｍａｘ胚を含有する未成熟の胚を培養す
ることは、開示されていない。

本発明者らの最近の研究は、以下のとおりである： Ｕｓｈａ　　Ｂ、Ｂａｒｗａｌｅによる修士論文“植物
の再生可能性に対するダイズの栽培変種植物のスクリー
ニング、および未分化組織からのダイズ植物の再生”は
、イリノイ大学図書館により、　１９８６年、３月１６
日に目録に入れられた。この論文は１本発明で用いる器
官形成培地、およびそれからの植物の成長を記述してい
る。

１１、Ｂ、Ｂａｒｗａｌｅらの“子葉節における複合シ
ュートの形成のための、ｔｂ亙堕ドユ　ｍａｘおよび広
す旦暉四−且ハのマメ科植物のスクリーニング（１９８
６，Ｔｈｅｏｒ。

Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、　７２　：　４２３−４２８　
）には、１μＭまたは５μ阿のＢＡＰを含有するＢ５培
地での１７８個のマメ科植物の種子の成長が記述され、
そして子葉節で形成されるシュートの数が算出されてい
る。

Ｈ，Ｒ，Ｋｅｒｎｓらの“ダイズ（虹り亘虹ｍａｘ　　
Ｌ、Ｍｅｒｒ）の懸濁培養におけて、子葉節のシュート
の増殖と体細胞胚の成長との相関関係”　　（Ｐｌａｎ
ｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ５　：　１４０−１４３
　）には、胚軸および子葉細胞に由来の組織、および成
長種子に由来の子葉組織において、サイトカイニンを含
有しない懸濁培養を用いた胚の誘導を開示している。胚
形成は、従来の研究では、子葉節にて形成されたシュー
トの数に対応すると思われた。全植物体への胚の再生は
報告されなかった。

ＩＪ、Ｂ、Ｂａｒｗａｌｅらの“いくつかのダイズマメ
科植物のカルス培養物からの、胚形成および器官形成を
経た植物体の再生”　（１９８６，Ｐｌａｎｔａ　　１
６７　：　４７３−４８１）には、この特許明細書が基
礎にしている研究の多（が報告されている。

グリシン再生の異なる方法に関して、最近の一般的に対
応する特許明細書は、　Ｇｌｅｎｎ　Ｂ、Ｃｏ１１ｉｎ
ｓらの米国特許明細書第８９３．２５６号として、　１
９８６年４月４日に出願された。この明細書には１体細
胞の胚形成を経たＧ、ｍａｘ種およびＧｌｙｃｔｎｅ種
の再生方法を記述している。この方法は、未成熟胚から
切り取られた子葉組織の培養を包含する。この明細書は
、器官形成の再生を得るべく、高濃度のサイトカイニン
を含有する培地中にて、胚全体を培養することを、開示
も請求もしていない。

（以下余白） （発明の要旨） 本発明は、十分に脱分化された培養物を体性クローン変
異によって所望の特性を備えた植物体に発生させること
による器官形成再生法であって。

グリシンマックス（ダイズ）を包含するグリシン種につ
いての非常に効果的な器官形成再生法を提供する。この
方法は、試験したすべてのダイズ遺伝子型（５４）に効
果的である。ダイズは、グリシン種が最も再生するのが
困難であることが知られている。本発明の器官形成法は
、所望の形質、懸濁培養物、およびプロトプラストを産
生ずるための形質転換および細胞選択についてもを用で
ある。

この方法は、従来の体性胚形成の再生法よりも本質的に
さらに効果的である。

本発明は、器官形成組織の培養物を形成するための器官
形成培地で未成熟胚を培養することを包含する。この培
地は、好ましくはＢＡＰであるサイトカイニンを、胚の
発芽を妨害し、器官形成性シュート産生を促進するのに
十分高い濃度で含有する。この濃度は、好ましくは少な
くとも約１０１１Ｍであり、より好ましくは約１３〜約
１４μＭであり。

好ましくは約１５μｈを越えない。

器官形成培地は、当該分野に公知のシュート形成培地の
いずれでも良く、好ましくはＭＳ培地である。この培地
は、胚の発芽よりも器官形成性シュートの産生を促進す
るのに十分な濃度の微量要素を含有すべきである。この
濃度は、好ましくは少なくとも通常の濃度の約３倍であ
り、より好ましくは通常の濃度の約４〜６倍である。

未成熟胚のサイズは、培養培地に置かれる時に約１，５
〜約１０ａｎの長さであり、好ましくは約４〜６鴫の長
さである。

培養物は周期的に、好ましくは約２〜３週間ごとに新し
い培地に移され、引続き体性クローン変異のために成長
を続けられ得る。

体性クローン変異は、自然に起こり得るか、あるいは培
養物に選択圧をかけた結果として起こり得る。ここで記
述される器官形成培養物は５体性クローン変異を誘導す
るために用いられ得る。あるいは、当該分野に公知であ
り９例えば米国特許出願第８９３．２５６号、またはＢ
ａｒｗａｌｅら、　（１９８６）。

Ｐｌａｎｔａ、　　（前出）に記載されている体性胚形
成培養物が用いられ得る。体性クローン変異により産生
される有用な変異の例は、ａ性不稔性、双生種子、アミ
ノ酸の過剰生産、病害抵抗性、除草剤耐性２例えば耐熱
性や耐寒性などのストレス耐性。

毒性の金属の存在のような不利な土壌条件を許容する能
力、および早熟性のような成熟の変異を有する表現型を
与える。

変異体の表現型は１組織培養物レベル、再生体（Ｒｏ）
レベル、　Ｒｅ世代の子孫（Ｒ３）のレベル、または自
殖または親植物とそのまた親植物との戻し交雑から得ら
れた子孫のレベルで観察され得る。好ましくは、安定し
た遺伝率を確認するために、変異体は二世代またはそれ
以上の後代で観察される。

カルス培養物から全植物体を再生するために。

培養で増殖されたシュートを細分し、当該分野に公知で
ある再生培地に置く、そして、好ましくは１６時間の光
同期の光で１発根培地に移すのに適した長さく好ましく
は、約１ｃｍ）にまで成長させる。

好ましくはＭＳ培地であるホルモンを含まない発根培地
で成長させた後、この植物体を成熟させるために土壌含
有培地に移し得る。

好ましくは、土壌含有培地に移すのに先立って。

この植物体を好ましくは特別な微量要素を含有した約１
７４強度のホアグラント溶液を含有する水耕培地に移す
。植物体の生存度および種子をつける能力は、この水耕
培地の使用により著しく増大する。

適切な高さく好ましくは、約３インチ）で、植物体を土
壌含有培地に移し、好ましくはニッケルイオンを含有す
る溶液で肥料を与える。

前述の方法で器官形成カルスから再生される植物体は、
変異体または非変異体の表現型について選択され得る。

ここで用いられる用語“器官形成°°および°“器官形
成培養°゛は、インビトロでカルス細胞培養物からのシ
ュート産生を意味する。器官形成培養では、シュート形
成に先立って胚形成培養物のように体性胚を産生せず、
しかも腋芽増殖のようにインビボで形成される構造体の
増殖、または他のタイプの植物構造体をクローニングす
るための方法をも包含しない。

グリシン種は、ＧＬｍａｘおよびＧ、　　且垣を包含す
るグリシン属の種であり、Ｇ、現」ヱｒｅａ　、　Ｇ。

Ｇ、　　ｔａｂａｃｉｎａ、およびＧＬｔｏｍｅｎｔｅ
ｌｌａのような野性種も包含する。

体性クローン変異は、所望の表現型を産生ずるための実
験組織培養における植物細胞に生じる自然の遺伝的変異
を利用した方法である。体性クローン変異の有用な議論
が、　Ｊ、Ａ、　Ｍｉｌｌｅｒ　（１９８５）“体性ク
ローン変異”　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｎｅｗｓ　１２８：１
２０〜１２１に記載されており、参考としてここにとり
あげる。

グリシン種の細胞を含む器官形成組織培養物を生産する
本発明の方法は、該グリシン種の未成熟胚を、サイトカ
イニンを含有する培地で培養する工程を包含する。該サ
イトカイニンの濃度は、胚の発芽を防ぎかつ器官形成性
シュートの産生を促進するのに十分に高い濃度である。

グリシン種のシュートを有する組織から全植物体を再生
させる本発明の方法は、該シュートを有する組織を、ホ
アグランド溶液を約０．２５倍の強度に希釈して、　Ｋ
ＣＩ、　Ｈ３ＢＯ１，ＭｎＳＯ４，ＺｕＳＯｎ、　Ｃｕ
５Ｏｎおよび（ＮＬ）Ｊｏ２０□４を包含する微量要素
を含有するように改変した溶液を含有する水耕培地に移
植し、十分に成長させ２次いで該シュートを有する組織
を、土壌を含む培地に移植し、全植物体にまで発育させ
る工程を包含する。

グリシンマックス種の細胞を含む組織培養物を生産する
本発明の方法は、該グリシンマックス種の未成熟胚を、
　ＢＡＰを約１０μＭ／！と約１５μＭ／２の間の濃度
で含有し、かつ旧培地の微量要素を通常の濃度の約４倍
と約６倍の間の濃度で含有する培地で培養する工程を包
含する。

体性クローン変異により生じた遺伝性の特性を有するグ
リシン種の植物体を生産する本発明の方法は、核種の細
胞を含む組織培養物を、該細胞の遺伝物質における体性
クローン変異をおこすのに十分な時間連続的に維持する
こと；該組織培養物から全植物体を再生させること；該
全植物体の子孫を得ること；該植物体の少なくとも２世
代および該世代の子孫における所望の特性を観察するこ
と；および、所望の特性を示す植物体子孫を選択するこ
とを包含する。

（発明の構成） グリシン種、好ましくはソーヤ亜属、そしてさらに好ま
しくはグリシンマックス由来の未成熟胚を、器官形成に
よって全植物体を再生するために培養する。未成熟胚の
サイズ範囲は、約１．５〜約１Ｏｎ＋ｎ＋、より好まし
くは約４〜約６１１ＩＩ１１である。胚は胚軸を含んで
いなければならない。軸が切除されると、良好な器官形
成が起こらないことが実証されている。

未成熟胚を培養培地に置く。多くの適切な培養培地が当
該分野で公知であり、　Ｂ５．　Ｌ２およびＭＳ培地（
Ｔ、　Ｍｕｒａｓｈｉｇｅら、　（１９６２）、前出）
が包含される。ＭＳ培地が好適である。この培地は高濃
度のサイトカイニンを含有することが重要である。多く
のサイトカイニンが当該分野で公知であり、　ＢＡＰ（
６−ベンジルアミツブリン；ベンジルアデニンとしてＢ
Ａとも呼ばれる）　、　ＡＤＥ（硫酸アデニン）、ゼア
チン、カイネチンおよび２−ｉｐ（２−イソペンタニル
アデニン）を包含する。好ましくは、サイトカイニンは
ＢＡＰである。サイトカイニンの濃度は胚の発芽を防ぐ
のに十分であるべきであり、好ましくは少なくとも約１
０μＨ９さらに好ましくは約１３〜約１４μＭである。

サイトカイニンの濃度は胚を死にいたらしめるほど高く
ないべきであり。

好ましくは約１５μ−を越えない。

培地はまた。好ましくはオーキシンを含有する。

オーキシンは２例えばＮＡＡ　（α−ナフタレン酢酸）
。

ＩＡＡ（イソインドール−３−酢酸）、ＩＢＭ（インド
ール−３−酪酸）（これらは、全てＮＡＡに類似してい
る）；または２．４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ
酢酸）　、　ｐｉｃｌｏｒａｍ　（４−アミノ−３，５
，６−トリクロロピコリン酸）　、　ｐＣＰＡ　（パラ
クロロフェノキシ酢酸）　、　２．４．５−Ｔ（２，４
，５−１−ジクロロフェノキシ酢酸）、およびｄｉｃａ
ｍｂａ（２−メトキシ、３．６一ジクロロ−〇−アニス
酸）（これらは、全て２．４−Ｄに類似している）など
の当該分野に公知であるものが用いられ得る。好ましく
は、オーキシンはＮＡＡに類似のもの、最も好ましくは
ＮＡＡが用いられ得る。オーキシンの濃度は成長を促進
するのに十分であるべきであり、好ましくはオーキシン
がＮＡＡの場合、該濃度は約０．１〜０．４μＭ、好ま
しくは０．２　μＭであるべきである。

器官形成培地の他の成分はチアミンおよびプロリンを、
チアミンは好ましくは約０．５〜５．９　ｐＨ１さらに
好ましくは５．０μＮの量で、そしてプロリンは好まし
くは約６〜約２４ｍＭ、　　さらに好ましくは約１２ｍ
Ｍの量で含有し得る。これらの成分は、　Ａ３１２７お
よびウィリアムス８２を包含する多くの表現型について
必要ではないが、いくつかの表現型の成長を促進する。

その他、　ＭＳ培地の微量元素の濃度を少なくとも通常
の濃度の約３倍、好ましくは通常の濃度の約４〜約６倍
増加させると、器官形成効率が増加することが見い出さ
れている。この微量元素は、　Ｈ，ＢＯ，。

ＭｎＳＯ４，Ｚｎ５Ｏ，Ｋｌ、　ＮａｔＭｏＯａ＋　Ｃ
ＬＩＳＯ４およびＣｏＣＩ。

である０通常の約２倍またはそれ以下の低濃度の微量元
素では、器官形成カルスの形成よりも胚発芽が、おこる
。微量元素の最も好適な形態および濃度は表１ｂに示さ
れている。

器官形成培養物を最初に、移植するのに適切なサイズの
シュートが形成されるまで、はぼ室温の暗所で約４週間
インキュベートする。

次いで、このシュートを、当該分野に公知の再生培地に
移す。該再生培地は２表１ａに示されているように、好
適にはＭＳＲまたはＢ５培地である。

当該分野に公知であるように、シュート増殖に適切な培
地は多数存在する。しかし、もろい非器官形成性カルス
の形成を引き起こさないように、サイトカイニン濃度を
再検討すべきである。用いられるサイトカイニンがＢＡ
Ｐである場合には、再生培地での濃度は約１０μＭを下
回るのが好ましい。

上記培養物は、再生培地で光を照射し、好ましくは非発
熱性の白色螢光で１平方メートルあたり１秒間に約８０
μｍｏｌのフォトンを約１６時間照射して成長させるべ
きである。明期は、はぼ室温（約２５〜２８°Ｃ）とし
、暗所は温度を下げる。（好ましくは、約１８°Ｃ）。

上記再生培地は、器官形成培地のように高濃度の微量元
素または微量要素を必要とせず、　　ＭＳＲ培地または
Ｂ５培地については表１ａに示すような組成が好ましい
。

器官形成培養物を、該培養物の高さが約１　ｃｍに達す
るまで、２または３週間ごとに再生培地から新しい再生
培地に移す。この時点で、上記培養物を当該分野に公知
の発根培地に移す。この発根培地は、好ましくは成長制
御因子を除いたＭＳ培地である。

植物体へのストレスを最小におさえるために。

発根に続いて植物体を水耕培地に移し得る。この水耕培
地は、好ましくは約１７４強度のホアグランド溶液（ｌ
ｌｏａｇｌａｎｄ、　Ｄ、Ｒ，ら（１９５０）　”土壌
を用いず植物を成長させるための水耕法”　Ｃａ１ｉｆ
ｏｒｎｉａ　Ａｇｒｉｃ。

Ｅｘｐ、　Ｓｔａ、　Ｂｕｌｌ、第３４７号）を含有す
る。このホアグランド溶液は、好ましくはＫＣ１＋　１
１３ＢＯ３，ＭｎＳＯ４゜ＺｎＳＯ４＋　ＣｕＳＯ４お
よび（ＮＨ４）　６Ｍｏ７０Ｂを含有する微量要素溶液
を添加して改変する。これらの微量要素は、好ましくは
実施例１（表２を参照）に示した形態および濃度で含有
される。好ましくは、この水耕培地は、鉄塩、好ましく
はＦｅ３３０　（Ｓｅｑｕｅｎｔｒｉｎｅ３３０Ｆｅ、
　Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ　）も含有し、該培地のｐＨは
約６．５である。この水耕での成長段階を省略すると。

再生される植物体は、植物体あたり約５個より多くの種
子を結実することはほとんどない。上記水耕培地を用い
ると、植物体は、常植物体あたり少なくとも約１０〜約
１００個までの種子を結実する。

土壌での生存率も良好であり、この段階を省略した場合
の約２０％に対して、水耕で成長させた後では約８０％
となる。この植物体を、害することなく土壌に移植する
のに十分大きくなるまで、好ましくは通常約７〜約１５
日後に該植物体が約３インチの高さになるまで水耕培地
に維持する。

上記水耕での成長に引続き、植物体を土壌から成る培地
（好ましくは、１：１：１のピートモス：バーミキュラ
イト：土壌の混合物）に移植する。

土壌で成長する植物に肥料を与えるのに、ニッケルイオ
ンを含有する肥料溶液が好ましい。この好適な肥料溶液
は、実施例１（表３を参照）に記述されている。

上記器官形成組織培養物は、２〜３週間ごとに新しい培
地に移植して連続的に維持される。そして、各カルスは
約４〜６片に細分割され得るので。

移植体あたり約ｌＯ〜約４０植物体が再生され得る。

このカルスは連続的に分裂組織部分を形成し、シｊ、−
トを生じる。

事実、異なった相で分裂の中心が観察されるので、この
カルス材料から再生した植物体の変異の度合（実施例２
を参照）は、カルスにおける高度の脱分化を示している
。

器官形成培養物から再生された植物体に生じる変異体表
現型の高い発生率は、該培養物を体性クローン変異に対
して有用なものとしている。器官形成培養物の材料を用
いて体性クローン変異を誘発するために、カルス培養物
に選択圧ががけられ得る０例えば、グリホゼート、バラ
コートおよびアトラジンのような除草剤を、完全に毒性
であるか、または亜致死的なレベルで与えて、抵抗性を
備えた植物体を産生ずることができる抵抗性カルスを誘
発し得る。パラコート耐性を引き起こす突然変異は、ス
ーパーオキサイドジスムターゼのような酵素のレベルの
増加によるものであり、該酵素の存在は病害抵抗性をも
たらし、二重に有効である。アトラジン抵抗性は、この
化合物が作物に直接に用いられることが予想されない場
合でさえ、除草剤の継代損傷を減じるのに有効である。

加熱処理（例えば、約４０°Ｃ）および低温処理（例え
ば、４℃）を、様々な長さの時間で行い、耐熱性カルス
および耐寒性カルスを得ることもできる。これらの耐性
は植物体再生に先立って再試験される。

プロリンのレベルは多くのストレス条件下で蓄積するこ
とが知られており、該プロリンはいくつかのストレスに
対する耐性を強めることが示されている。このように、
プロリンレベルを高める突然変異についての選択がなさ
れる。これは２例えばハイドロオキシプロリンまたはア
ゼチジン−２−カルボキシラードのような、毒性のある
プロリン類似物に対する抵抗性について選択することに
より行われる。

種子のアミノ酸類レベルを増加させるために。

アミノ酸選択もまた行われ得る。この選択は１例えばメ
チオニンについては、エチオニンのような毒性のあるメ
チオニン類似物を用いて選択することにより、あるいは
トリプトファンについては。

５−メチルトリプトファンのような毒性のある類似物を
用いて選択することにより行われ得る。虫害および病害
に耐する抵抗性に関連したポリフェノール性の過剰生産
を起こさせるために、毒性のあるフェニルアラニン類似
物による選択もなされ得る。

他の有用な選択は、毒性のある重金属（例えば。

カドミウム、銅、亜鉛、および鉛）の存在、および塩化
ナトリウムの存在または低いｐＨのような毒性の土壌条
件に対する抵抗性についての選択を包含する。

病害（例えば、褐色茎腐れ病）に対する抵抗性について
の選択は、好ましくは原因となる微生物の培養物の濾液
を用いて、抵抗性のある系統を生産するのに行われ得る
。

他の体性クローン変異により誘導され得る有用な形質は
、雄性不稔性および早熟性のような発生の特性を包含す
る。

あるいは、ここで示すように、特別な選択圧をかけずに
、多くの突然変異が生じる。これらの突然変異は、雄性
不稔性、早熟性および双生種子のような望ましい特性を
包含する。突然変異を誘発した後、誘発された表現型の
安定性を決定すべきである。再生された植物体（Ｒ０世
代）は、Ｒ０世代を産するために自殖される。この世代
を次いでＲ２世代を産するために自殖させ、該Ｒ２世代
はＲ１世代を産するために自殖させ得る。Ｒ０植物体は
大部分かへテロ接合体であり、はとんどの部分について
表現型が劣性であるので、所望のいずれの特性も示さな
い。Ｒ１世代で観察される望ましい特性は。

Ｒ２世代、好ましくはＲ３世代、またはＲ２世代とＲ８
世代との戻し交雑したものに引き継がれ、これらの特性
の分離パターンが観察される。所望の特性の所望の安定
度を示すために、さらなる自殖、戻し交雑または雑種世
代が必要とされ得る。当該分野に公知の統計分析が、こ
のような安定な遺伝形質を決定するために実施される。

安定な遺伝形質を示す個体は、さらに育種計画に用いる
ために選択される。

以下の実施例は説明のために提供するものであり２本発
明を制限するために提供するものではない。

（以下余白） 実施例 ・ｔ　　１：　ｌ′　ノ　による゛イズのダイズ種子を
、特に示さない限り、　ＵｒｂａｎａのｔｈｅＵ、Ｓ、
　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒ
ｅ　５ｏｙｂｅａｎ　ＧｅｒｍｐｌａｓｍＣｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎより得て、野外あるいは温室で成育させた。こ
の研究で用いた遺伝子型は、子葉節の多シュート形成分
析に基づいて選択した（Ｂａｒｗａｌｅら、　（１９８
６）＋　Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、前出
）。

高シュート産生体（６〜８のシュート）：八ｄａ　　　
　　　　　　　　　ＰＩ　　３０．６９２　　　　　　
　ＰＩ　　７９．７３９Ｂｌａｃｋｈａｗｋ　　　ＰＩ
　３１．１２２　　　　ＰＩ　４０４．１５５ＡＣａｒ
ｌｉｎ　　　　　ＰＩ　３６．６５３　　　　５ｏｏｔ
ｙ中程度のシュート産生体（６〜８のシュート）：Ａｄ
ａｍｓ　　　　　Ｊ−８８ＰＩ　５３．６５ＯＡＣａｐ
ｉ　ｔｏｌ　　　　Ｊ−１０３ＷａｙｎｅＣｅｎｔｕｒ
ｙ　　　　Ｊ−１０５ＷｅｌｌｓＥａｒｌｙａｎａ　　
　　Ｍｉｔｃｈｅｌｌ　　　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｂｌ
ａｃｋ１＋ａｂａｒｏ　　　　　Ｐｌ　１５３．２９２
Ｈｅｎｒｙ　　　　　ＰＩ　２２７．３２７多シユ一ト
分析で試験していない系統；Ｂｉｒｃｈ　ａｎｄ　Ｏａ
ｋ　　Ｊ−１１２ＳｉｍｐｓｏｎＣＮ　２９０　　　　
　ＬＮ　８０−１６０１７　５ｐａｒｋｓＣＮ　２１０
　　　　　ＰＩ　８６．０６３　　　Ｗｉｌｌｉａｍｓ
　７９３３Ｄ　　　　　　　Ｐｉｘｉｅ　　　　　Ｗｉ
ｌｌｉａｍｓ　８２Ｈａｒｓｏｙ　　　　　Ｓｈｅｒｍ
ａｎ（全てのＪ系統はＪａｃｑｕｅｓ　５ｅｅｄ　Ｃｏ
、、　Ｐｒｅｓｃｏｔｔ。

Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、　ＵＳＡより得た。Ａ３１２７は
Ａｓｇｒｏｗ　５ｅｅｄＣｏ、、　Ｋａｌａｍａｚｏｏ
＋　Ｍｉｃｈｉｇａｎ、　ＬＩＳＡより、　Ｂｉｒｃｈ
およびＯａｋはｌ１ｌｉｎｏｉｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏ
ｎ　５ｅｅｄｓ、　Ｔｏｉｏｎｏ。

１１１ｉｎｏｉｓ、　ＵＳＡより、３３Ｄ　は叶、　Ｊ
、　Ｈａｒｐｅｒ。

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ、　Ｕ
ｒｂａｎａより得た。）０．５〜１０閣までのサイズの
範囲にある胚を豆果より切出した。この豆果は、　Ｔｗ
ｅｅｎ　８０　（ポリエチレンソルビタンモノオレイン
酸；　ＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　０ｈｉｏ、　ＵＳＡ）　
　１滴を含有する。市販の漂白剤より調製した０、７８
％Ｎａ０Ｃ１中で２５〜３０分間表面を滅菌し、引き続
いてそれぞれ少なくとも５分間滅菌した脱イオン蒸留水
で２回すすいだ。はとんどへその部分を切開することに
より、胚珠の種皮を除去し、胚を取り出した。

これは完全な胚を保証する。これらの胚を器官形成（０
１？）培地（表１ａ）に置き、２５±２°Ｃ暗所で４週
間インキュベートした。ＥＢ培地を用いると。

シュートよりも体性胚が形成した。ＯＲ培地で形成した
シュートを再生培地ＭＳＲおよびＲ５（表１ａ）に移し
、明期は２５°Ｃ（非発熱性白色螢光燈（ｓｙ＋ｖａｎ
ｉａ。

Ｆａｌｌ　Ｒｉｖｅｒ、　Ｍａｓｓ、、　ＵＳＡ）から
の光、約８０　ｐ　ｍｏｌフォトンｍ　−Ｚ　ｓ−１で
１６時間）、そして晴朗は１８°Ｃとした。器官形成培
養物は、２週間または３週間ごとに移植し、明朗と晴朗
の温度を変えて、１６時間の光同期でＭＳＲおよびＲ５
培地で維持した。シュートが約１　ｃｍの高さに達した
後、これらをホルモンを含まない発根用のＭＳ培地（Ｍ
ｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ（１９６２）前出）
を有する試験管に移した。発根に引き続いて９通常、植
物体を０．２５強度のホアグランド溶液Ｎｏ、　ｌ　（
ｔｌｏｏｇｌａｎｄ、口、Ｒ３ら、　（１９５０）前出
）を入れたアルミニウムホイルで覆われたｌリッターの
広口容器に移し、温室に移し、連続的に通気した。ふた
に直径約１　ｃｍ＋の２つの穴を作り、植物体を該穴に
スポンジでおさえて保持し、該植物体の根を液に浸した
。

ホアグランド溶液を、ホアグランド溶液１リッターあた
り４　ｒｔｄｌの表２に示したような微量要素溶液、お
よび９．５ｇ／　ｉのＦｅ３３０溶液２戚を加えること
により改変した。この溶液はｐｌ＋６．５であった。

（以下余白） 表１ａ 実験で用いた培地組成 培地　　　　組　成 ？ＩＳＲＭＳ基本培地＋１．７μＭ　ＢＡＰ　＋　０．
２μＭＩＢＡｄ全ては６　ｇ　Ｑ−’Ｂａｃｔｏ寒天１
を用いて固化。

ａ　Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｄｅｔ
ｒｏｉｔ、　Ｍｉｃｈ、、　ＵＳＡ表１ｂ ＭＳ培地のための微量元素貯蔵液 ｇ／ｌ貯蔵液　　ｇ／　ｆ　ＭＳ培地 ｌｈ［ｌ（ｈ　　　　　　　　Ｏ，６２００，０２Ｚｎ
ＳＯａ　・７Ｈｚ０　　　　０．８６００　　　　．０
３Ｋｌ　　　　　　　　　　Ｏ，０Ｂ３０　　　　．０
０３ＮａｚＭｏＯ，・２１１ｚＯＯ，０２５０，００１
ＣｏＣ１ｚ　６Ｌ０　　　　　０．００２５　　　　．
０００１表ＩＣ 貯蔵溶液二８５ビタミン類 培地１℃あたり貯蔵液をｌ〇−使用。

表２ ホアグランド微量要素貯藏液 ＫＣｌ　　　　　　　　　　　　　３．７２８１１ＪＯ
ｘ　　　　　　　　　　　　１．５４６Ｍｎ５０４４Ｈ
ｚ０　　　　　　　　０．８４６ＺｎＳＯａ４１１ｚ０
　　　　　　　　　０．５７５ＣｕＳＯ４・５ＨｚＯ，
０，１２５ （Ｎｔｌｍ）＆ＭＯｔＯｚａ　−４Ｈｚ０　　　　　０
．０１８４成長制御因子を含有しないＭＳ培地で発根さ
せた後、多くの正常な緑色植物を温室に移した。この移
植を土壌混合物に直接行うと、生存率が非常に低く、植
物体は通常率さいままであった。植物体は約５個の種子
以上はほとんど生産しなかった。

しかし、上述したように、まずホアグランド溶液で成育
させてから土壌混合物に移植すると、植物の生存率およ
び成長は非常に促進され、たった２個か３個の種子しか
生産しなかった少数の小さな植物体を除いては、はとん
ど正常であった。温室または野外で成育させると、この
ように得られた全ての緑色植物は、稔性であり、１０〜
１００個の種子を生じ、これら種子から成長した植物体
（Ｒ２）は正常に発生した。

８日後、植物体を１：１：１のピートモス：バーミキュ
ライト：土壌（体積比）の混合物、または野外に移植し
た。この植物体に、　Ｐｅｔｅｒ’ｓ　Ｆｅｒｔｉｌｉ
ｚｅｒＰｒｏｄｕｃｔｓ、　　Ｗ、Ｒ，Ｇｒａｃｅ　Ｃ
ｏ、、　ｏｆ　　Ｆｏｇｅｌｓｖｉｌｌｅ。

Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａの製品であるＰｅｔｅｒｓ　
２０　：　１０　：　２０肥料７．５ｇ＃！で作成した
特別な肥料溶液で肥料を与えた。Ｄ、　Ｌ、　Ｅｓｋｅ
−ら、　（１９８３）、　　”ニッケル：豆科植物およ
び可能なすべての高等植物体のための必須微量要素”　
５ｃｉｅｎｃｅ　　２２２：６２１−６２３により。

ニッケルは豆科植物には必須な微量元素であることが見
い出されている。従って９表３で示したような微量元素
貯蔵溶液を、肥料溶液に添加するために調製した。この
肥料溶液は、　　１ｍＭ　ＭｇＳＯ４および１０ｐｐｍ
　ＦｅＥＤＴＡも含有する。微量要素溶液を２０：１０
：、２０肥料に７．５ｄ／ｆの量で添加する。次いでこ
の溶液をｌ：１０〜１：２０に希釈し、５０〜１ＯＯＩ
ＲＩ。

量を一日に一度の割合で各植物体に用いた。

組織学的研究のために、器官形成性カルスを。

ホルマリン：氷酢酸：アルコール（ＦＡＡ、体積比２：
１：１０＋６部の水）に２４時間浸漬することにより固
定した。３級ブタノール中での脱水に続いて。

この材料を５５°Ｃの熱風オープン中で市販のパラプラ
スト（ｐａｒａｐｌａｓｔＨＭｏｎｊｅｃｔ　５ｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ、　ＳＬ、　Ｌ。

ｕｉｓ＋　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、　ＵＳＡ）に浸潤させ、
封埋した。ミクロトーム切片（厚さ１０μｍ）を切り出
し、この切片をハウブト（Ｈａｕｐｔ）の溶液（Ｊｏｈ
ａｎｓｅｎ、　Ｄ、Ａ、　　（１９４０）＋　Ｐｌａｎ
ｔ　Ｍｉｃｒｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、　ＭｃＧｒａｗ−
１１ｉ１１　Ｐｕｂｌ、＋Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｌｏｎ
ｄｏｎ　ａｔ　５２３）を用いてガラススライドに付着
させた。スライドをキシレンですすぎ。

バラブラストを除去し２次いで５０％アルコールに溶解
させたサフラニンＯで１２時間染色に続いて。

９５％アルコールに溶解させたファストグリーン（Ｓｉ
ｇｎ＋ａＣｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｏ、、　　ｓｔ、　　
Ｌｏｕｉｓ、　　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、　　ＵＳＡ）で２
０〜５０秒間染色した。

表３ 肥料微量元素 ６．２５μＭ　ＨＪ（ｈ　　　　　　　　　　３８．６
５　ｒｄ／１１、ＯＢ　Ｍ　Ｍｎ５Ｏａ　　・１Ｉｚ０
　　　　　　１６９．０２、ＯｐＭＺｎＳＯａ　　・７
Ｈｚ０　　　　　　５７５０．５８Ｍ　Ｃｕ５Ｏｎ　　
５Ｈｚ０　　　　　　１２３０、５９　Ｍ　（ＮＨ４）
　２Ｍ００４　　　　　　　９８０．０１μＭ　ＣｏＳ
Ｏ４・Ｈｚｏ　　　　　　　１．７８０．２μＭ　Ｎ１
５Ｏａ　　・６ＨｔＯ５２，にの研究で用いられた５４
のダイズの遺伝子型は。

ダイズの胚形質のいくつかを用いた。実生種子での多シ
ュート形成分析（Ｂａｒｗａｌｅら、　（１９８６）、
　Ｔｈｅｏｒ。

Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、　、前出）で同定された。高シ
ュート形成体と低シュート形成体の両方を含んでいた。

この分析では、シュートは子葉節で数えられた。遺伝子
型を１種子の色、花の色、成熟時期２種子源。

および病害感受性および抵抗性を包含する。収集物中で
見られる多くの変異を包含するように選択した。

全ての培養は、長さが０．５〜１．０　ｗｍの異なる発
生段階の未成熟胚から開始した。

器官形成性カルス培養物を、高濃度の６−ペンジルアミ
ツフ゛リン（ＢＡＰ）　（１３，３μＭ）、　０．２８
Ｍ　ＦＡＡ。

および４〜５倍濃度の標準耶培地の微量元素（表５）を
含有するＯＲ培地で成長させた未成熟なダイズ胚より得
た。最も重要な因子はＢＡＰ濃度であり。

より低い濃度（３，３および６．６μＭ）では少数の器
官形成培養物を産生した（表６）。微量元素のレベルを
減らしても、応答を減少させた。各微量元素を高濃度で
個々に試験するとき、他の元素を正常（１×）レベルに
保ち、モリブデン酸塩または鉄のみをより低くすると、
応答を減少させるようであった。このように、この応答
を明らかに制御している特定の元素はないようであった
。しかし。

最も良い器官形成性カルスの成長は、全ての微量元素が
より高い濃度で存在している場合のみ得られた。予備実
験では、５〜６間の長さの胚が最大の器官形成能力を有
する培養物を与えることが示された。ａｙ　Ｍｉｌｉｔ
ａｎｔｓ　８２を包含するいくつかの遺伝子型では、器
官形成能力は１００％もの高さであった（表４）。

表４ １．５０ ２．００ ３．０　　　　　　　　　　　　２１ ４．０　　　　　　　　　　　　５３ ５．０−６．０　　　　　　　　　１００６．０−７．
０　　　　　　　　　　１０８．０またはそれ以上　　
　　　　　−でノｒ 表５ ８０ｂ ７５ｂ ４′５４ ｂ器官形成性カルスの形成よりもむしろ胚発芽（−＜　
Ｔ−余色） 表６ ３．３　　　　　　　　　　　１１ ６．６９ ９．９　　　　　　　　　　　９０ 組織学的研究は、これらの培養物の器官形成の性質を確
認した。いくつかのシュート分裂組織が見られた。これ
ら分裂組織の増殖は、すでに存在している分裂組織のみ
が増殖している場合とは必ずしも同程度ではなかった。

記述した観察は、脱分化した組織からの分裂組織部位の
新生開始の典型例である。

器官形成培養を暗所で開始した。カルスは暗所で得たが
、光誘導で発芽させた未成熟接合胚は。

直接または器官形成後にシュートを形成した。器官形成
（シュート形成開始）は暗さを必要とするが、さらに成
長するには光が必要である。ＯＲ培地で培養開始４週間
後、この培養物を光存在下で増殖培地（ＭＳＲまたはＲ
５）に置いたが、該培地では該培養物は非常に早く成長
し、２〜３週間ごとにより多くのシュートが形成される
新しい培地に移す必要があった。高いＲＡＰ濃度（１３
，３μＭ）では、４ケ月後に培養物はもろい非器官形成
性カルスを形成した。いったんシュート再生が開始され
ると。

さらなる器官形成培養物の増殖および保持のために、培
地中の高濃度のＢＡＰおよび微量元素はもはや必要なか
った。ＭＳＲまたはＲ５培地において、シュートの高さ
が約１　ｃｍに達した後、組形成を誘導するために成長
制御因子を含有しないＭＳ培地にこれらを移し得る。次
いで、水耕培地に移し、その後温室で成熟体にまで成長
させた。

器官形成培養物はＭＳＲまたはＲ５培地で１８ケ月以上
維持され、まだ器官形成能力を有しており、植物体を再
形成することができた。この方法で、さらに植物体を増
殖させるべく、カルスを４〜６の切片に細片化すると、
各移植体ごとに、　１０〜４０の植物体を再生すること
ができた。

上述の方法を用いると、ダイズの未成熟胚から器官形成
経路により植物再生体を１００％まで得ることが可能で
ある。この方法は、試験された全ての遺伝子型で成功し
ており、再生率はほんの少しの相違であった。このよう
に、成熟グループ、種皮の色、などのような遺伝子型の
差は、はとんど実質的な程度では植物体再生には影響し
なかった。

子葉節で形成されたシュートの数と植物体再生との明瞭
な相関もなかった。

（以下余白） ・ｔ　１２：　　クローン゛ 植物体が器官形成ダイズ培養物から再生されたものであ
るかを調べるため、および該植物体の子孫が自然発生的
変異を示すかどうかを調べるために、　Ｒｏ、　Ｒ＋、
　Ｒｚ、およびＲ３植物を形態学的に観察できる質的変
異体について調べた。

ダイズ（グリシン　マックスＬ、　Ｍｅｒｒ、）Ａ３１
２７゜Ａｄａｍｓ、　Ｃａｐｉｔｏｌ、　ＣＮ２１０　
Ｅａｒｌｙａｎａ＋　ＰＩ３６．６５３＋　ＰＩ３６１
．０６３．　ＰＩ４０４．１５５ＡおよびＷｉｌｌｉａ
ｍｓ　８２の種子を、　　ｔｈｅ　　Ｒｅｇｉｏｎａｌ
　　５ｏｙｂｅａｎ　　Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ。

υｎ１ｖｅｒｓｉＬｙ　ｏｆ　１ｌｌｉｎｏｉｓ、　Ｕ
ｒｂａｎａ、　Ｉ目１ｎｏｉｓから入手した。胚形成培
養および器官形成培養を未成熟胚より開始し、実施例１
および参考文献としてここで取り上げられたＵ、Ｂ、Ｂ
ａｒｗａｌｅら（１９８６）Ｐｌａｎｔａ前出、に記述
されているように維持した。これら植物体の自家受粉の
種子を野外で栽培したり、またはプエルトリコの冬期栽
培基に送った。Ｒ０植物体の自家受粉種子は１つのＲ，
ファミリーを形成し。

各Ｐ、植物体は新しいＲ２ファミリーを形成した。プエ
ルトリコで成育したファミリーからは目に見える観察結
果は得られなかったが、　Ｕｒｂａｎａ、　ＩＩ目ｎｏ
ｆｓで成育させたＲ、、　Ｒ２，およびＲ３ファミリー
は質的な変異体についての広範囲な評価を受けた。各フ
ァミリーの１２個の種子を、１．２メートルの長さの列
（各列間は０．８メートル間隔）に植えた。対照の種子
（組織培養周期を経てない植物体の自家受粉種子）も比
較のために植えた。成長時期を通じての葉の数２葉の形
態、クロロフィル欠乏性、植物体長、花の色、稔性、多
数の核形成およびシュート形成、増殖性、被軟毛性およ
び成熟性というような形質について評価した。２６３　
ＲＯ植物体が２６３Ｒ１フアミリーを産生じ、その中の
１５３が１世代以上について調べられた。１２個の種子
以上を産生ずるＲ、ファミリーのみを成育させた。個々
のＲ０植物体は次の世代でＲｔソファリーとなった。同
時に。

全てのプエルトリコで播かれて成長させられた種子を用
いて、全世代についての評価を行った。６６Ｒ２フアミ
リー（５５７８１７！植物体）および５４８　Ｒ２ファ
ミリー（１３４１５Ｒ３植物体）の全てを成長させて。

本研究で視角的評価を行った。

クロロフィル欠乏性、完全または部分的稔性。

しわのある葉の形態、双性種子２葉の異常形態。

異常な葉の数、矯性増殖性および多シュートを包含する
変異体の表現型を＋　ＲＩ＋　Ｒ２＋　とＲ３世代で観
察した。

非致死的なりロロフィル欠乏性は、いくつかのＡ３１２
７フアミリーのしおよびＲ３の両方で認められた。これ
らの植物体の葉は全てクロロフィル欠乏性であり、成長
は対照の植物体の成長よりも活気がなかった。１つのフ
ァミリーの播かれた種子における。２．７％のＲｚ植物
体および７．１％のＲ１植物体をこの形質について分離
した（表７）。劣性で唯一の遺伝形質について＋Ｒ３世
代の分離比は継代でこの形質が安定に遺伝することを示
す３：１モデルに適合する。１９０８の対照植物体のう
ち、２つはクロロフィル欠乏性を示しく０．１％の分離
比）。

この表現型が環境の因子によるものである可能性を排除
している。この形質は安定に遺伝するので。

病害がこの表現型の原因となり得る可能性は小さい。

完全な稔性が、Ｒ２世代のＣＮ２１０で見られた。分離
比１５．６％（表７）は、χ二乗検定で決定されたよう
な３：１モデルに適合する。このデータは。

Ｒ，からＲ２世代への稔性が安定に遺伝することを示唆
する。対照植物体はこの形質を示さなかった。

しわのある葉の型がＲ１世代で観察され、１つのファミ
リーにおいて３５％の植物体がこの表現型へと分離した
（表７）。同じファミリーから成長したＲ２種子は２葉
の形態学的にはほとんど変異を示さなかった。

上記の形質は、観察された変異のいくつかが安定に遺伝
することを示しており２組織培養過程の間の遺伝的変化
によることを示している。その他の３つの例では、１つ
の表現型がＲ８世代にのみに観察された（表７）、いく
つかの植物体が双性種子を生じたが、これらの植物体の
全ての種子が双性ではなかった。葉の異常形態や異常な
葉の数は。

不規則な事象として観察された。植物体の全ての小葉状
体は、これらの表現型を示さなかった。これらの表現型
を示す３小葉状体の最大数は３つであった。矯性増殖性
を示す植物体は、他の点では正常のようであった。しか
し、この形質の遺伝は分離比によっては決定できなかっ
た（表７）。花の色における違いは見られなかった。多
シュートも不規則な事象として現れた。

双性種子、矯性増殖性２葉の異常形態２葉数。

および多シュート（表７）について、最近の分離データ
はこれらの形質の遺伝を決定することを困難にしている
。３つのＲ１変異体を除いては、他の変異はこの世代で
は見られなかった（表８）。しかし、Ｒ２およびＲ，フ
ァミリーのかなりの数が変異体の表現型を発現した。

変異体の表現型の頻度は、特別な遺伝子型のＲ。

ファミリーに観察される質的に異なる変異体の表現型の
総数を、同じ系から採取しＲ，ファミリーの総数で割る
ことにより計算した。頻度を計算するこの方法は、　Ｓ
、　Ｅｄａｌｌｏら、　（１９８１）　”　）ウモロコ
シにおける。インビボでの培養および植物体再生と関連
した。染色体変異および自然突然変異の頻度”　Ｍａｙ
ｄｉｃａ　２６：３９−５６．および“再生されたトウ
モロコシ同系繁殖体における遺伝的変異を誘発された組
織培養”Ｉｎ：　Ｐｒ匹朋鮭旦り妊」蝕」ｌキム５ｅｖ
ｅｎｔｈ　　Ａｎｎｕａｌ　　Ｃｏｒｎ　　ａｎｄ　　
Ｓｏｒ　　ｈｕｍ　　ＩｎｄｕｓｔｒＲｅｓｅａｒｃｈ
　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　、Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｅｅ
ｄ　ＴｒａｄｅＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、　Ｗａｓｈｉ
ｎｇｔｏｎ、　Ｄ、Ｃ，、ｐｐ、　１４８−１６２の方
法と同様であった。頻度はＲ０植物体あたりＯ〜４の範
囲であった（表９）。４３１２７およびＷｉｌｌｉａｍ
ｓ８２についての低い頻度は誤って導かれたものであり
得る。なぜならば類似の表現型が、似てはいるが独立し
た事象であり得たにもかかわらず、１つに数えられたか
らである。また、多数のＲ，ファミリーがこれら２つの
遺伝子型から採取されたからである□。同様の表現型は
、独立の事象として数えることができなかった。という
のは、胚の起源の記録が保存されていなかったからであ
る。このように、各Ｒ０植物体の起源を決定することは
できなかった。表１０は、全２６３　Ｒ，ファミリーの
うら１５３Ｒ，ファミリーについてのみの、可能な突然
変異頻度を示している。残りの１１ＯＲ，ファミリーの
、Ｒ２およびＲ１世代は研究されていない。

Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２の胚形成および器官形成の両方の
培養物に由来する植物体の子孫を調べた。表９は。

両方の培養物由来のファミリーのＲ，およびＲｔ世代に
観察される変異を示している。１つのＲ１ファミリーお
よび８亥Ｒ１ファミリーの１２Ｒ２フアミリーを各培養
系で調べた。両方の系で見られる変異株は。

胚形成培養物が生じた植物体において、クロロフィル欠
乏性を高い頻度で存することで同様であった。他の表現
型は同じ分離比であった（表９）。

３つの扇形アルピノもまた。胚形成培養物由来のＲ０植
物で観察された。これらは成熟体にまでは成長できず３
種子は得られなかった。

（以下余白） Ａ３１２７　　　双性種子　　２　　　６２　　　３．
２矯性成長　　２　　　３０　　　６．８葉数異常　　
１　　　２７　　　３．７り００フイル欠乏　　１　　
　　　　１４　　　　　　７．ビＰＩ３６．６５３　　
　複数シュート　　　　１　　　　　　２５　　　　　
　４．０ＣＮ２１０　　　稔性　　　　８　　　５１　
　１５．６”対照 Ａ３１２７　　　　　　クロ■フィル欠乏　　２　　　
　　　１９０Ｂ　　　　　０．１矯性成長　　１　　　
１９０８　　０．ＩＣＮ２１０　　　　　　　　０　　
　１４０　　０．０ＰＩ３６．６５３　　　りＯＩＩ＋
７〈ル欠乏　　１　　　　　　　１５７　　　０．６Ｒ
，キメラアルピノ　　　　　　　　　　　　　　　　３
Ｒ１ａ　　　　　　　りｏｎフィル欠乏　　　　　　　
　　　　　１葉の形態異常　　　　　１ しわのある葉の型　　　Ｉ Ｒ２ｂ　　　　　　　りＯＯフィル欠乏　　　　　　　
　　　　　１１葉の形態異常　　　　　３ 異なる葉の数　　　　　４ 矯性成長性　　　　　　１ １７、ｅ　　　　　　　　り０ロフイル欠乏　　　　　
　　　　　　　２９葉の形態異常　　　　　１８ 異なる葉の数　　　　　２１ 矯性成長性　　　　　　４ しわのある葉の型　　　５ ａ：２００　Ｒ，ファミリーについて変異体表現型を試
験ｂ：　６６　Ｒｚファミリーについて変異体表現型を
試験ｃ：５８４　Ｒ３ファミリーについて変異体表現型
を試験胚形成 Ｒ１りｕｏフィル欠乏　　　　　　２１　　　　　　　
　　６　　　　　　２８．５葉の形態異常　　２６　　
　　１　　　３．８器官形成 Ｒ２りＯＴＪフィル欠乏　　　　　　２５　　　　　　
　　１　　　　　　４．０葉の形態異常　　３１　　　
　１　　　３．２葉数異常　　　　３０　　　　１　　
　３．３（メ、下余白） Ａ３１２７　　　　　　　　７６　　　　　　　　　０
．１１＾ｄａｍｓ　　　　　　　　　　３　　　　　　
　　　　１．３３Ｃａｐｉｔｏｌ　　　　　　　　１　
　　　　　　　　４．００ＣＮ２１０　　　　　　　　
　４　　　　　　　　　　１．００Ｅａｒｌｙａｎａ　
　　　　　　１　　　　　　　　　１．００１’１３６
．６５３　　　　　　１５　　　　　　　　　０．５３
ＰＩ３６１．０６３　　　　　　１　　　　　　　　　
２．００ＰＩ４０４．１５５八　　　　　　　５　　　
　　　　　　　　　　１．６０Ｗｉｌｌｉａａ＋ｓ　８
２　　　４７　　　　　　　　　０．１１ｂ　１２を越
える種子をつけた再生植物体数。

赳こっ℃いるとし−Ｃ欽入る。

３　：ｒ 実施例１で述べたように、器官形成および胚形成カルス
を、褐色某局れ病の原因微生物であるフィアロフォラ　
ブレガタ（助力山■賎コー　肛皿狼煎の培養濾液をｌ：
　４　（ｖ／ｖ−濾液：培地）の濃度で存在させて成長
させた。以下のような７つの遺伝子型を調べた；　ＢＳ
Ｒ−２０１，Ｃｅｎｔｕｒｙ、　ＰＺ、　４３７．８３
３゜Ｃｏｒｓｏｙ＋　Ａ３１２７＋　　Ｗｉｌｌｉａｍ
ｓ−８２＋およびＰＩ３４９４６−２゜遺伝子型ＢＳＲ
−２０１，ＰＺ、４３７．８３３およびＰＩ３４９４６
−２は褐色某局れ病に抵抗性である（Ｓｅｂａｓｔｉａ
ｎ、　Ｓ、Ａ。

ら（１９８５）　　Ｊ、　　Ｈｅｒｅｄ、　　　ヱ６：
１９４；　　５ｅｂａｓｔｉａｎ、　　Ｓ、八。

ら（１９８５）　Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉ、　　２５ニア５３
；Ｇｒａｙ、　Ｌ、Ｅ、　　ら編　（１９８５）　Ｗｏ
ｒｌｄ　Ｓｏ　ｂｅａｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｎｆ
、　　ＩＩＩＰｒｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ　、　Ｗｅｓｔｖ
ｉｅｗ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｂｏｕｌｄｅｒ、　Ｃｏ１ｏｒ
ａｄｏ。

ｐｐ、５９Ｂ−６０１）。抵抗性遺伝子型由来のもろい
器官形成カルスおよび胚形成カルスは濾液に感受性では
なかったが、怒受性遺伝子型由来の同様のカルスは濾液
で死滅した。感受性遺伝子型の培養物を。

半致死的である培養濾液１　：　４　（ｖ／ｖ）（濃度
）存在下で生育させて、３０〜４０日後、改良された生
育を示す培養物を、病害抵抗性稔性の植物体へと再生す
るために選択した。

１４：　、　　　− 遺伝子型Ａ３１２７およびＷｉｌｌｉａｍｓ８２の、実
施例１で述べた別々の器官形成カルスを、グリホゼート
（非選択的除草剤）、バラコート、およびアトラジンの
有毒かつ半致死的であるレベルでの存在下で増殖させた
。用いた濃度は以下のようであった；２５〜２００μＨ
グリホゼート、５〜２５μＭパラコートおよび１０〜１
００μ阿アトラジン。

これらの物質の高レベルでの存在下で良好に成長する培
養物を９種々の除草剤に抵抗性である稔性のある植物体
への再生について選択した。バラコート耐性培養物を、
多くの病原微生物に対する抵抗性を調べるためにさらに
試験し、バラコート耐性に関連している病害が同定され
ている。

５ニストレス　− 遺伝子型へ３１２７および−ｉ　］　１　ｉａｍｓ８２
の、実施例１で述べた別々の器官形成カルスを、４０°
Ｃの高温および４°Ｃの低温の状態で種々の期間成長さ
せた。

処理により生き残ったカルスをプロリンの増量について
試験し、適当な培養物を、ストレス抵抗性。

稔性の植物体を形成する再生について選択する。

６　：　　　　　　　　に　・　　る　　　−遺伝子型
Ａ３１２７の実施例１で述べた別々の器官形成カルスを
、以下に示すようなものの濃度存在下で成長させた：　
０．０１〜０．３　ｍＭ　Ｃｄ、　　約ｐＨ５，７；０
．０１〜０．６　ｍＭ　Ｃｕ、　０．００１〜３．０ｍ
Ｍ　Ｚｎまたは０．００１〜３、ＯｍＭ　Ｐｂ、　Ｃｕ
、　Ｚｎおよびｐｂは増殖培地で約ｐｌ＋４〜４．２と
する；または０．１％〜１０％ＮａＣ１゜改良された生
育を示す培養物を１種々の土壌条件に対する抵抗性を示
す、稔性の植物体への再生について選択する。

１７：　　したアミノ　゛・ 遺伝子型Ａ３１２７およびＷｉｌｌｉａｍｓ８２の実施
例１で述べた別々の器官形成培養物を２表１１で示した
ような濃度で４〜８週間、毒性のアミノ酸類似物存在下
で成長させた。

表１１ アミノ酸過剰生産 Ｆム敵　　　皇件皿似立　　　　　儂一度ブ■リン　　
　　　　　　ヒドロキシプロリン　　　　　　　　　　
　０．２−１．２ｍＭアゼチジン−２−カルホキシラー
）　　　　　０．０１−０．０３ｍＭメチオニン　　　
　　　　エチオニン　　　　　　　　　　　　　　　０
．０１−０．３ｍＭトリプトファン　　　　　５−メチ
ルトリプトファン　　　　　　　　０．０１−０．３ｍ
Ｍフエニ；シアラニン　　　　ｐ−フルオロフェニルア
ラニン　　　　　　０．０１−３ｍＭ毒性の類似物存在
下で良好に成長する培養物を。

増大したアミノ酸レベルを有する稔性の植物体への再生
について選択する。この植物体の選択には。

毒性の類似物による選択が用いられた。ｐ−フルオロフ
ェニルアラニンで選択した培養物をさらにポリフェノー
ル化過剰生産について試験し、陽性のものをさらに種々
の昆虫および病害抵抗性について調べた。このような抵
抗性を示すものが、試験された抵抗性を有する稔性の植
物体へと再生する。

（発明の要約） 本発明の方法は、好ましくはグリシンマックスであるグ
リシン種の器官形成組織培養物の生産および全植物体の
再生を提供する。この方法は、好ましくは少なくとも約
１０μＭ　［ｌＡＰである高濃度のサイトカイニン、お
よび好ましくは少な（とも通常の３倍の濃度のＭＳ培地
の微量要素を含有する。

器官形成培地を使用することを包含する。器官形成培地
は１体性クローン変異により誘導された所望の特性を示
す植物体を生産するのに有用である。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、グリシン種の細胞を含む器官形成組織培養物の生産
   方法であって、 該グリシン種の未成熟胚を、サイトカイニンを含有する
   培地で培養する工程を包含し、 該サイトカイニンの濃度が、胚の発芽を防ぎかつ器官形
   成性シュートの産生を促進するのに十分に高い濃度であ
   る、 生産方法。 ２、前記サイトカイニンがＢＡＰである特許請求の範囲
   第１項に記載の方法。 ３、前記ＢＡＰが、約１０μＭ／ｌと１５μＭ／ｌの間
   の濃度である特許請求の範囲第２項に記載の方法。 ４、前記培地がＭＳ培地の微量養素を通常の約４〜約６
   倍の濃度で含有する特許請求の範囲第１項に記載の方法
   。 ５、前記グリシン種がグリシンマックスである特許請求
   の範囲第１項に記載の方法。 ６、全植物体が、体性クローン変異により誘発された遺
   伝的に安定な突然変異体である特許請求の範囲第１項に
   記載の方法。 ７、特許請求の範囲第１項に記載の培地で発生させたシ
   ュートから再生された植物体、または該植物体の子孫。 ８、グリシン種のシュートを有する組織から全植物体を
   再生させる方法であって、 該シュートを有する組織を、ホアグランド溶液を約０．
   ２５倍の強度に希釈して、ＫＣｌ、Ｈ＿３ＢＯ＿３、Ｍ
   ｎＳＯ＿４、ＺｕＳＯ＿４、ＣｕＳＯ＿４および（ＮＨ
   ＿４）＿６Ｍｏ＿７Ｏ＿２＿４を包含する微量養素を含
   有するように改変した溶液を含有する水耕培地に移植し
   、十分に成長させ、次いで該シュートを有する組織を、
   土壌を含む培地に移植し、全植物体にまで発育させる工
   程を包含する、 全植物体を再生する方法。 ９、グリシンマックス種の細胞を含む組織培養物を生産
   する方法であって、 該グリシンマックス種の未成熟胚を、ＢＡＰを約１０μ
   Ｍ／ｌと約１５μＭ／ｌの間の濃度で含有し、かつＭＳ
   培地の微量養素を通常の濃度の約４倍と約６倍の間の濃
   度で含有する培地で培養する工程を包含する、 組織培養物の生産方法。 １０、体性クローン変異により生じた遺伝性の特性を有
   するグリシン種の植物体を生産する方法であって。 該種の細胞を含む組織培養物を、該細胞の遺伝物質にお
   ける体性クローン変異をおこすのに十分な時間連続的に
   維持すること； 該組織培養物から全植物体を再生させること；該全植物
   体の子孫を得ること； 該植物体の少なくとも２世代および該世代の子孫におけ
   る所望の特性を観察すること；および所望の特性を示す
   植物体子孫を選択すること、を包含する、 グリシン種の植物体の生産方法。