JPS63218700A - 新規蛋白質およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 技術分野 本発明は、新規蛋白質およびその製造法に関する。さら
に詳細には、本発明は、分子量が約３０，０００、等重
点が３．９〜４．０、Ｎ未端部のアミノ酸配列が特定の
ものであって、かつＥＧＦ様活性を有する新規蛋白質、
およびこれを人尿中から取得する製造方法に関するもの
である。

先行技術 ］−エン（Ｓ、Ｃｏｈｅｎ　）らは、マウス顎下腺中よ
り神経成長因子（ＮＧＦ）を精製する過程で新生児マウ
スの眼瞼開裂及び切歯出現を早める物質を発見して上皮
細胞成長因子（Ｅｐｌｄｅｒ＊ａｌ　ＧｒｏｗｔｈＦａ
ｃｔｏｒ、以下ＥＦＧという）を名づけた（Ｊ、Ｂｌｏ
ｌ、Ｃｈｅｍ、、　２３７．１５５５（１９８２）　）
。

このＥＧＦは、人にも存在することが知られている。す
なわち、ｈＥＧＦは、１９７５年コーエコーＳ、Ｃｏｈ
ｅｎ　）らにより人尿中から単離された上皮組織の増殖
角化を促進するヒト由来の因子として紹介（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７２．１３１
７（１９７５））されたものであって、同年、グレゴリ
−（Ｈ，Ｇｒｅｇｏｒｙ　）らによって人尿中から単離
された胃酸分泌抑制作用をもつヒトウロガストロン（ｈ
ｕｍａｎ　Ｕｒｏｇａｓｔｒｏｎｅ　）として紹介（Ｎ
ａｔｕｒｅ。

２５７．３２５（１９７５））されたポリペプチドと同
一物質であり、分子量約６０００．５３コのアミノ酸よ
り構成され、その分子量に３本のジスルフィド結合を有
するポリペプチド〔代謝、１７．５１（１９８０））で
あるということがわかっている。

ところで、従来より、人尿または血清中からＥＧＦ様活
性を有する種々のＥＧＦ誘導体（ＥＧＦを構成するアミ
ノ酸の任意のアミノ酸付加もしくは欠如等の点で上記Ｅ
ＧＦとは相違するが、該因子と同様のあるいは類似の生
理活性および薬理活性を有するもの）が発見、分離され
ている。

例えば、グレゴリ−（Ｈ，ＯｒｅｇＯｒ）ｌ　）らによ
って、尿中から発見された、ｈＥＧＦのＣ未端アミノ酸
の１つ（アルギニン）が欠如した誘導体（Ｎａｔｕｒｅ
。

罎５７．３２５〜３２７（１９７５））　、さらに、本
発明者らにより尿中から単離された、ｈＥＧＦのＣ未端
アミノ酸の２つ（ロイシン−アルギニン）が欠如した誘
導体、および３つのアミノ酸（グルタミン酸−ロイシン
−アルギニン）が欠如した誘導体、などが確認されてい
る（いずれも特願昭６０−２６３５３４号明細書参照）
。

一方、アミノ酸が付加した高分子型誘導体に関しては、
血漿中の分子量約３３，０００の物質（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、
Ｉｎｖｅｓｔ、、　７２．２４９〜２５９（１９８３）
）　、血清中の分子量約１００．０００〜２００，００
０の物質［Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　、７７
、　３１３〜３１８（１９７９））　、または人尿中の
分子量約２８，０００および３３，０００の物質［Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｒＣＩｉｎｉｃａｌ　　Ｅｎｄｏｃｒｌ
ｎｏｌｏｇｙ　　ａｎｄ　　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、　
　４８　　。

８７３（１９７９）　）等の存在が示唆されているが、
朱だ単離同定されてないのが現状である。

〔発明の概要〕

要旨 本発明は、人尿中のＥＧＦ様活性成分に関して鋭意、研
究を行った結果、新規蛋白質を発見し、かつその製造法
を確立したことに基づくものである。

すなわち、本発明による新規蛋白質は、下記イ）〜ハ）
の理化学的性状により特定化され、かつＥＧＦ様活性を
有すること、を特徴とするものである。

イ）　分子量が約３０，０００　（ＳＤＳ電気泳動によ
る測定）であること。

口）　等電点が３．９〜４．０（ポリアクリルアミド等
電点電気泳動による測定）であること。

ハ）　Ｎ未端アミノ酸配列が下記の通りであること。

（表中、１．５．１０．．１５．１６および２０の数字
は、Ｎ未端からの順番を示す。

（）は、アミノ酸が未定であることを示す。

矢印（−）は、Ｎ未端側から分析を行ったことを示す。

） 二）　　トリプシンで処理したものが、これを逆相系高
速液体クロマトグラフィーに付したときにヒトＥＧＦお
よびヒトＥＧＦ　（１−４８）と同じ溶出パターンを示
す画分にヒトＥＧＦの免疫活性を有するものであること
。

ホ）　アルギニンエステラーゼで処理したものが、これ
を逆相系高速液体クロマトグラフィーに付したときにヒ
トＥＧＦと同じ溶出パターンを示す画分にヒトＥＧＦの
免疫活性を有するものであること。

また、本発明による上記新規蛋白質の製造法は、下記ａ
）〜ｄ）の工程からなること、を特徴とするものである
。

ａ）　人尿を用意すること。

ｂ）　上記人尿を抗ｈＥＧＦ抗体結合アフィニティクロ
マトグラフィーに付すこと。

Ｃ）　工程ｂ）で得られた吸着画分をゲルか過に付すこ
と。

ｄ）　工程Ｃ）で得られた精製画分を逆相系高速液体ク
ロマトグラフィーに付すこと。

効果 本発明による新規蛋白質は、ＥＧＦと同様な活性を有す
ることより、種々の医薬品化が期待できること、また本
発明による新規蛋白質は、生体内酵素であるアルギニン
エステラーゼで消化されてｈＥＧＦに、またトリプシン
で消化されてｈＥＧＦとｈＥＧＦ　（１−４８）とにな
ることが、後記実験例のＨＰＬＣによる分析で認められ
ることより、プロドラッグとしても大いに期待できる。

〔発明の詳細な説明〕

新規蛋白質 本発明による新規蛋白質は、下記の理化学的性状、およ
びＥＧＦ様活性を示すものである。

１）　理化学的性状 ａ）　分子量：約３０，０００　（ＳＤＳ電気泳動）。

ｂ）　等電点：３．９〜４．０（ポリアクリルアミド等
重点電気泳動）。

ｃ）　　Ｎ未端アミノ酸配列： （１，５１，１０，１５，１６，２０数字、（）、（→
）の定義は前記と同様である。） ２）　　ＥＧＦ様活性 ａ）　　３７３細胞の増殖促進作用。

ｂ）　抗ｈＥＧＦ抗体との反応性。

Ｃ）　　トリプシンで、またアルギニンエステラ−ゼで
、処理したものを逆相系ＨＰＬＣに付したときにｈＥＧ
ＦおよびｈＥＧＦ　（１−４８）（トリプシンの場合）
あるいはｈＥＧＦ　（アルギニンエステラーゼの場合）
と同じ溶出パターンを示す画分は、ｈＥＧＦの免疫活性
を有する。

なお、詳細は後記実験例を参照されたい。

製造法 本発明における新規蛋白質の製造法は、下記の工程ａ）
〜ｄ）からなるものである。

ａ）　人尿を用意すること。

ｂ）　上記人尿を抗ｈＥＧＦ抗体結合アフィニティクロ
マトグラフィーに付すこと。

Ｃ）　工程ｂ）で得られた吸着画分をゲル濾過に付すこ
と。

ｄ）　工程Ｃ）で得られた精製画分を逆相系高速液体ク
ロマトグラフィーに付すこと。

各工程の詳細は、下記の通りである。

人尿の調整（ａ） 本発明製造法に用いる人尿は、格別の処理をせずにその
まま使用してもよく、また必要に応じて、人尿を酢酸、
塩酸等の任意の酸によりｐＨ３〜４に調整し、弱酸性イ
オン交換体（カルボキシメチルセルロース、カルボキシ
メチルアガロース、メタクリル酸系樹脂等のカルボキシ
ル基を導入したイオン交換樹脂など）に吸着させたのち
弱酸性下で洗浄し、酢酸アンモニウムのような弱アルカ
リ性緩衝液で溶出させるという一般的な方法で前処理し
て、あらかじめ尿中の夾雑タンパクを除去しておいても
よい。

上記ａ）で調整された尿は、これを抗ｈＥＧＦ抗体結合
アフィニティクロマトグラフィーに付し、吸着画分とし
て目的とする新規蛋白質画分を得ることができる。

本発明でいう抗ｈＥＧＦ抗体結合アフィニティクロマト
グラフィーは、任意の抗ｈＥＧＦ抗体を任意のアフィニ
ティクロマトグラフィー用樹脂に固定化してなるもので
ある。その調製方法、具体例等はいずれも公知ないし周
知である。高純度の抗ｈＥＧＦ抗体を使用する該クロマ
トグラフィーについては、本発明者らにより提出された
特願昭６０−２６３５３４号明細書を参照することがで
きる。

ゲル濾過による精製（ｃ） ゲルか過は、はぼ均一な孔径の三次元の網目構造を有し
ている高分子のゲルか過剤を用いて分子量の異なる水溶
性高分子物質を分離する方法をいう。ゲルか過剤として
はデキストランゲル〔例えばＳｅｐｈａｄｅｘＲ（Ｐｈ
ａｒｍａｅｉａ　Ｐｉｎｅ　ＣｈｅＩｌｌｃａｌｓ）　
）、アクリルデキストランゲル〔例えば、 ５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｒ（Ｐｈａｒ　ｍａｃｉａ　Ｆｉ
ｎｅ　Ｃｈｅｓｉｃａｌｓ　）　）、ポリアクリルアミ
ドゲル〔例えばＢｉｏ−Ｇｅｔ　Ｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　）あるいはアガロースゲ
ル等任意のものを使用することができる。

本発明におけるゲル濾過による精製工程は少なくとも１
回行えばよいが、複数回行うことにより精製効率が上る
ことは言うまでもない。

逆相系高速液体クロマトグラフィーによる精製（すγ 高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、充填剤の
種類によって、分配吸着クロマトグラフィー、ゲル浸透
クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィ
ーに分類できるが、本発明の場合は、前者の分配吸着ク
ロマトグラフィー（逆相系）が好ましい。

ここで逆相系とは、逆相系クロマトグラフィーをいい、
リガンドとしてアルキル基（Ｃ１−０１８）などの疎水
性基、好ましくはメチル基、を化学的に結合させた担体
たとえばシリカを固定相として含水有機溶媒で溶出を行
う方法をいう。また、このような系における所望蛋白質
の溶出は、アセトニトリルやアルコール類（エタノール
、プロパツール等）で行うのがふつうであり、これらの
濃度を直線的に増加させる直線的濃度勾配法によって行
なうのが好ましい。

このような高速液体クロマトグラフィー自体は公知であ
って、種々の成書や文献、例えば（１）化学増刊１０２
「タンパク質・ペプチドの高速液体クロマトグラフィー
Ｊ　　（１９８４）、東京化学問人刊、（１１）底置「
クロマトグラフィー分離システムＪ　　（１９８１）丸
善刊等を参照することができる。また、このようにして
得られた新規蛋白質の精製度の確認は、高速液体クロマ
トグラフィーや電気泳動等の手段によって行う（後記参
考側参照）のが一般的である。そして、さらにここで得
られた蛋白質の物理化学的性質（アミノ酸組成、−次構
造、二次構造等）を調べればなおさらよい。

本発明の場合はこのようなりロマトグラフィーの一興体
例として、まず工程Ｃ）で得られた粗精製新規蛋白質画
分を凍結乾燥し、ついでこれを溶媒（アセトニトリル、
酢酸を含む水溶液）に溶解したのち逆相系の高速液体ク
ロマトグラフィーに付すことにより精製された新規蛋白
質画分を、常法により凍結乾燥したのち、酢酸塩として
得ている（詳細は後記実験例を参照されたい）。

実験例 １）　人尿から新規蛋白質の精製 成人男子法２０リットルに酢酸１リツトルを加え（ｐＨ
３〜４）、この中に、５％酢酸で活性化させた約２５０
ｍ１の［バイオ・レックス（Ｂｌｏ−Ｒｅｘ）７０Ｊ（
バイオ・ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　）社、２００〜４００
メツシユ）を加え、４℃で１晩攪拌してｈＥＧＦ吸着さ
せた。約２時間静置後、上清を除去し、樹脂をグラスフ
ィルター上で回収し、まず、３．６リツトルの０．０Ｏ
ＩＮ塩酸で洗浄後、１リツトルの１．０Ｍ酢酸アンモニ
ウム緩衝液ｐＨ８，０で溶出させた。溶出液の電気型導
度が室温で３０　ｍｍｈａになるまで蒸留水で希釈後、
上述のアフィニティカラムに供給した。０．１５Ｍ塩化
ナトリウムを含むｐＨ７，０のリン酸緩衝液で溶出液の
２８０　ｎｍ＋こおける吸光度が０．００３以下になる
まで洗浄後、１．０Ｍ酢酸で溶出させた。

溶出液を凍結乾燥後、５．０ｍｌの１Ｍ酢酸に溶解させ
て、同緩衝液で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−５
０（φ１．６Ｘ１００備）カラムに負荷した。

溶出ｆｆ１５７〜７７ｍ１の間の画分を集め、凍結乾燥
後、１．０ｍｌのＰＢＳ（−）ｌ：溶解し、同緩衝液（
ＰＢＳ　（−））で平衡化した。これを、５ｅｐｈａｃ
ｒｙｌ　Ｓ　−２００（φ１．０Ｘ１２０ＣＩ１１）カ
ラムに負荷した。

溶出量５０〜５５ｍ１の画分を、凍結乾燥後、５００Ｒ
ｇのＨＰＬＣ用開始液に溶解し、ＴＭＳ−２５０（東洋
ソーダ社製）カラムを用いた逆相系ＨＰＬＣによる分離
精製に付した。

分離条件は下記のとおりである。

・装　置二日本分光　５Ｒ−２ ・カラム：東洋曹達　ＴＭＳ−２５０ φ４．６ｍｍＸ７．　５０１ト 力ラム温度：４０℃　　・流速：０．６ｍｌ／分・溶離
液及び溶離条件： Ａ液　１％アセトニトリル ０．０５％ＴＦＡ　（）リフルオロ酢酸）Ｂ液　８０％
アセトニトリル ０．０５％ＴＦＡ 溶離条件は、下表のようなＡ液とＢ液濃度によるグラジ
ェントで行なった。

・検出波長：２１０ｎ厘 第１図に示すように、この段階で、はぼ均一に精製され
、同一条件下で再度分離精製する事により、高純度な目
的物質を得る事が出来た。収量は、ｈＥＧＦに対するＲ
ＩＡより求めた結果、約６．０Ｒｇであった。

得られた目的蛋白質を５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動で分析すると、２−メルカプトエタノール存在下、
非存在下とも、単一バンドを示し、その推定分子量は、
３０にであった。また、ｐＨ勾配（ｐＨ３，５からｐＨ
５，０）を有するポリアクリルアミド・ディスクゲル等
電点電気泳動により、等重点を求めた結果、３．９〜４
．０を示した。

２）　　Ｎ未端アミノ酸配列 Ｎ未端配列分析は、公知の方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、２５８．７９９０（１９８１）　）に従っ
て、気相プロテインシークエンサーにより行なった。そ
の結果は、第１表に示した通りである。

第１表 アミノ酸配列 零　表中１．５．１Ｏ１１５，１６，２０の数字は、Ｎ
未端からの順番を示す。

（）は、アミノ酸が未定であることを示す。矢印（＝）
は、Ｎ未端側から分析を行ったことを示す。

３）　細胞増殖活性 ３Ｔ３細胞（２Ｘ　１０’セル／　ｍｌ　）と牛胎児血
清１％を含むダルベツコ変法ＥＭＥを培地２ｍｌを３５
ｍ＋ｓφＸ１０＋ａｍシャーレに入れ、３７℃、炭酸ガ
ス５％、空気９５％のインキユベーターで単層培養した
。１日後、１）で得た新規蛋白質を約１−　　Ｏａ＋ｇ
／ｍｌになるように入れ、毎日（４日間）血球計算盤を
もちいて細胞数を測定した。また、新規蛋白質を含まな
いコントロールも同時に行なった。結果は、第２図に示
したとおりである。

４）　抗ヒトＥＧＦ抗体との反応性 ヒトＥＧＦに対するポリクローナル抗体を用いたラジオ
イムノアッセイに於て、１）で得られた新規蛋白質は第
３図に示した様にｈＥＧＦと平行な標準曲線を示した。

５）　新規蛋白質の酵素によるプロセシングｌ）で得ら
れた新規蛋白質９．０μｇを１００μｇのＰＢＣ（−）
に溶解し、４５μｇのトリプシン（ＴＰＣＫ処理、Ｗａ
ｓｈｉｎｇｔｏｎ社）を加え、３７℃で１時間消化を行
なった。反応液をただちに、１）に示した条件下に逆相
系ＨＰＬＣで分析した結果、ｈＥＧＦとｈＥＧＦ　（１
−４８）の溶出位置に、免疫活性が溶出した。その結果
は、第４図に示した通りである。

６）　さらに、１）で得られた新規蛋白質１２μｇをμ
ＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ８，０）
１００μｇに溶解し、６０μｇのアルギニンエステラー
ゼ（ピアス社）を加えて、３７℃で１４時間消化を行な
った。反応液をただちに、１）に示した条件下に逆相系
ＨＰＬＣで分析した結果、ｈＥｃ；Ｆ溶出位置にのみ、
免疫活性が溶出した。その結果は、第５図に示す通りで
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実験例１）項で逆相系高速液体クロマトグラ
フィーを行なったときのクロマトグラムを複写したもの
である。 １・・・ｈＥＧＦ免疫活性 ２・・・逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより溶出さ
れた画分の吸光度、 ３・・・ＣＨ３ＣＮの濃度 第２図は、実験例３）項における上皮細胞の増殖試験結
果を示すグラフである。 第３図は、実験例４）項における抗ヒトＥＧＦ抗体との
反応性を調べた結果を示すグラフである。 第４図は、実験例５）項における逆相ＨＰＬＣクロマト
グラフィーを行ったときのクロマトグラムを模写したも
のである。 第５図は、実験例６）項における逆相ＨＰＬＣクロマト
グラフィーを行ったときのクロマトグラムを模写したも
のである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記イ）〜ハ）の理化学的性状により特定化され、
   かつＥＧＦ様活性を有することを特徴とする、新規蛋白
   質。 イ）分子量が約３０，０００（ＳＤＳ電気 泳動による測定）であること。 ロ）等電点が３．９〜４．０（ポリアクリ ルアミド等電点電気泳動による測定）であること。 ハ）Ｎ未端アミノ酸配列が下記の通りであ ること。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （表中、１、５、１０、１５、１６および２０の数字は
   、Ｎ未端からの順番を示す。 （　）は、アミノ酸が未定であることを示す。 矢印（→）は、Ｎ未端側から分析を行ったことを示す。 ） ニ）トリプシンで処理したものが、これを 逆相系高速液体クロマトグラフィーに付したときにヒト
   ＥＧＦおよびヒトＥＧＦ（１−４８）と同じ溶出パター
   ンを示す画分にヒトＥＧＦの免疫活性を有するものであ
   ること。 ホ）アルギニンエステラーゼで処理したも のが、これを逆相系高速液体クロマトグラフィーに付し
   たときにヒトＥＧＦと同じ溶出パターンを示す画分にヒ
   トＥＧＦの免疫活性を有するものであること。 ２、下記ａ）〜ｄ）の工程からなることを特徴とする、
   下記イ）〜ホ）の理化学的性状により特定化され、かつ
   ＥＦＧ様活性を有する新規蛋白質の製造法。 ａ）人尿を用意すること。 ｂ）上記人尿を抗ｈＥＧＦ抗体結合アフィ ニティクロマトグラフィーに付すこと。 ｃ）工程ｂ）で得られた吸着画分をゲルろ 過に付すこと。 ｄ）工程ｃ）で得られた精製画分を逆相系 高速液体クロマトグラフィーに付すこと。 イ）分子量が約３０，０００（ＳＤＳ電気 泳動による測定）であること。 ロ）等電点が３．９〜４．０（ポリアクリ ルアミド等電点電気泳動による測定）であること。 ハ）Ｎ未端アミノ酸配列が下記の通りであ ること。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （表中、１、５、１０、１５、１６および２０の数字は
   、Ｎ未端からの順番を示す。 （　）は、アミノ酸が未定であることを示す。 矢印（→）は、Ｎ未端側から分析を行ったことを示す。 ） ニ）トリプシンで処理したものが、これを 逆相系高速液体クロマトグラフィーに付したときにヒト
   ＥＧＦおよびヒトＥＧＦ（１−４８）と同じ溶出パター
   ンを示す画分にヒトＥＧＦの免疫活性を有するものであ
   ること。 ホ）アルギニンエステラーゼで処理したも のが、これを逆相系高速液体クロマトグラフィーに付し
   たときにヒトＥＧＦと同じ溶出パターンを示す画分にヒ
   トＥＧＦの免疫活性を有するものであること。