JPS63152977A - 新規な型のプラスミノ−ゲン活性化因子の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 童呈上優程■公団 本発明は、ヒト組織由来の正常２倍体線維芽細胞を培養
して、プラスミノーゲン活性化因子（以下ブラスミノー
ゲンアクチベーターと称する）を高い生産性で製造し得
る方法に関する。

更來■及玉 従来、血栓塞栓症（Ｔｈｒｏｓ＋ｂｏｅ＋ｗｂｏｌｉｃ
　ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）の治療には、ヒトの尿又は腎臓
細胞培養液から得られたウロキナーゼ及びβ−溶血性連
鎖球菌（β−ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ　５ｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｉ）の培養液から単離されたストレプトキナーゼ
がブラスミノーゲンアクチベーターとして線維素溶解剤
に用いられている。

しかしながら、これらの線維素（フィブリン）に対する
親和性が低いため、治療効果を得るには大量に投与され
ることが多（、したがって、内出血等の副作用を生ずる
場合や特にストレプトキナーゼは微生物由来の物質であ
るためヒトに投与すると、アレルギーを起こす場合のあ
ることが知ら　　　　　　゛れている。このような状況
から、フィブリン親和性が高くかつ血栓溶解性の優れた
副作用の少ない血栓溶解剤の提供が要望されている。

而して、近年、ヒト組織由来の正常細胞により産生され
る、ウロキナーゼとは分子量的及び免疫学的に異なる新
しいタイプのプラスミノーゲンアクチベーターに関する
研究が数多く報告されている。例えば、Ｖｅｔｔｅｒｌ
ｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ　はヒト胎児肺由来の正常２倍体線
維芽細胞ＩＭＲ−９０が分子１ｓｏ、ｏｏ。

〜６０，０００のウロキナーゼ型プラスミノーゲンアク
チベーターと抗ウロキナーゼ抗体により中和されない分
子量７３，０００の新しい型のプラスミノーゲンアクチ
ベーターとを産生ずることを明らかにしている〔ジャー
ナルオブバイオロジカルケミストリイ（Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｗ、）２５４，５７５〜５７８（１９７９）及び
２５５゜３６６５〜３６７２　（１９８０）。

また、Ｗｉｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ　は８退会のヒト胎児
肺由来の正常２倍体線維芽細胞、ヒト成人食道由来の正
常上皮細胞及び一部のヒト成人膀胱由来の正常上皮細胞
が分子１６０，０００のウロキナーゼ型のプラスミノー
ゲンアクチベーターのほかに分子量７０　、０００の抗
ウロキナーゼ抗体に中和されない新しい型のブラスミノ
ーゲンアクチベーターを産生ずることを確認している〔
カンサー　リサーチ（ｃａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ　
４０．９３３〜９３８．（１９８０））。

しかしながら、これら上記の新しい型のブラスミノーゲ
ンアクチベーターについては、その単離、精製が未だ十
分になされていないため、その酵素化学的性質も一次構
造も明らかにされていない。

本発明者は、さきに上述したような新しい型のブラスミ
ノーゲンアクチベーターの酵素化学的性質を明らかにし
、その効率的な分離、精製及び調整法を開発した（特願
昭６０−８５７６０号）、。

因に、この新しい型のブラスミノーゲンアクチベーター
は、ウロキナーゼに比べてフィブリン親和性が高く、極
めて耐熱性である特性を存し、免疫学的にウロキナーゼ
と異なる分子種である。

ところで、ヒト組織由来の正常細胞により産生される上
述したような新しい型のブラスミノーゲンアクチベータ
ーの生産に関して、最近、種々の方法が提案されるよう
になった。

例えば、上記正常細胞を培養し、細胞が２密的（ｃｏｎ
ｆｌｕｅｎｔ）に達した後、生産誘導物質としてカゼイ
ン加水分解物や各種ペプチド類を添加した無血清培地中
で培養する方法（特開昭５８−６５２１９号）及び上記
誘導物質として動物肉を酵素処理して得られるペプトン
類を用いる方法（特開昭５９−１３４７３３号）が提案
されている。しかしながら、上述したような誘導物質の
みを用いる培養方法では工業的に適した生産性を得るこ
とは困難であって、実用性に乏しいという問題がある。

本発明者は、さきにヒト組織由来の正常２倍体線維芽細
胞を高細胞密度で、ａ）ペプトン類とホスホリパーゼＡ
２又はりボキシゲナーゼの各賦活性物質とを添加した無
血清培地で培養、もしくはｈ）生産誘導物質としてペプ
トン類とＣａ”イオノフオア及びプロティンキナーゼＣ
の賦活物質とを添加した無血清培地で培養することによ
り、該天然型ブラスミノーゲンアクチヘーターの生産性
を亮めるための方法（特願昭６１−４７８０４号）を開
発したが、その後研究を進めた結果、正常２倍体線維芽
細胞の培養に当っての生産誘導物質として更に種々の物
質が使用し得ることを見出し、本発明をなすに至った。

明が７しようとする諜 したがって、本発明は、ヒト組織由来の正常２倍体線維
芽細胞により産生される特定な酵素化学的性質を有する
新しい天然型のプラスミノーゲンアクチベーターを、上
記細胞を特定な種々の物質を組合わせて添加した無血清
培地中で生産誘導させて培養することにより、著しく高
い生産性で製造し得る方法を提供することを課題とする
。

以下本発明の詳細な説明する。

衾呪■盪底 本発明の特徴は、ヒト組織由来の正常２倍体綿維芽細胞
を高細胞密度で、（ａ）生産誘導物質として、ホスホリ
パーゼＡ２、ホスホリパーゼＣ、ブラデイキニン、コン
カナバリンＡ及びフィトヘマグルチニンから成る群から
選択される１種もしくは２種以上とペプトン類とを添加
した無血清培地で培養するか、（ｂｌ生産誘導物質とし
て、ジブチリルサイクリックＡＭＰ又はフォルスコリン
とペプトン類とを添加した無血清培地で培養するか、も
しくは（ｃ）トロンビンとペプトン類とを添加した無血
清培地で培養することにより下記の酵素化学的性質を有
するブラスミノーゲンアクチベーターを生産することに
ある。

（イ）分子量： ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定で
６５．０００〜７２．０００ （ロ）蛋白分解酵素としての分Ｗ４＝ ｐ−アミノベンツアミジン　ジフロロフオスフエイト（
ＤＦＰ）メシル酸ガベキサート（ＦＯＹ）により活性阻
害を受けるセリンプロテアーゼの一種。

（ハ）基質Ｓ−２２８８に対するに一値（ｓｏｌｅ八〇
にへ　：　　１．１６Ｘ１０−’ Ｖｍａｘ（ｍｏｌｅ／ｍ１ｌｌ、　　ｕｎｉｔ）　　Ｖ
ｍａｘ　　：　　１．７ＸｌＯ−８（ニ）至適ｐＨ及び
安定ｐＨ範囲： ７．５〜９．０．５〜１０ （ホ）比活性（Ｉｕ／ｍｇ）　：　　１６．６〜１８．
７Ｘ１Ｇ’（Ｗ　ＨＯｔ−Ｐ＾スタンダードにより測定
）（へ）作用適温の範囲（ｔ）：　　３９〜４１゜（ト
）活性阻害金属イオン： Ｃｏ”、Ｚｎ富９、Ｃｄ”、ＨｇＺ−１Ｎｉ”及びＣｕ
８（チ）フィブリン親和性（結合比率、％）８３．１（
す）コンカナバリンＡカラムへの吸着性：　有（ヌ）抗
ウロキナーゼポリクローナル抗体による活性中和：　　
　　全く中和されない （ル）耐熱性（残存活性　％）： 本発明は、上述した通り、ヒト組織由来の正常２倍体線
維芽細胞を血清培地もしくは無血清培地で培養して高細
胞密度となしたものを、上記（ａｌ　ｌｂｌもしくは（
ｃ）の様な生産誘導物質を組合わせることを特徴とする
ものであって、このような誘導物質を組合わせて用いる
ことによる目的とするプラスミノーゲンアクチベーター
の生産性の向上効果は、下記知見に基づく。

すなわち、本発明者等は、ヒト組織由来の正常２倍体線
維芽細胞による新しい型のブラスミノーゲンアクチベー
ターのペプトン類による生産誘導機構を調べた結果、下
記の知見が得られた。

ｌ）ペプトン類によるプラスミノーゲンアクチベーター
の生産誘導は、細胞外Ｃａ”°濃度依存であること、２
）ペプトン類の細胞刺激によって細胞外Ｃａ”の流入、
細胞内結合Ｃａ”″の遊離、あるいは、細胞内から細胞
外へのＣａ”の流出（ｅｆｆｌｕｘ）の抑嘲等により、
細胞内Ｃａ”″濃度が上昇して、Ｃａ”依存の系が活性
化され、生産に関与する０例えば、細胞内Ｃａ”°によ
ってホスホリパーゼＡ８が活性化され、アラキドン酸カ
スケードのりポキシゲナーゼ経路（Ｉｉｐｏｘｙｇｎａ
ｓｅ　ｐａｔｈｗａｙ）が生産に関与する。

現在、細胞内Ｃａ”動員については、■細胞内外のＣａ
”濃度差による受動濃度拡散による細胞内へのＣａ”″
流入、■メチル基転移酵素が活性化され、リン脂質のメ
チル化によって、局所的に膜の流動性が高まりＣａ”の
流入が起こる。■ホスホチジルイノシトールのｔｕｒｎ
ｏｖｅｒが亢進され、ホスホチジルイノシトールのホス
ホリパーゼＣによる分解が促進され、分解産物であるイ
ノシトール３リンＭ（ＩＰ、）フオスラアチジン酸（Ｐ
Ａ）によってＣａ”動員が起こる。　ＩＰ３は細胞内結
合性Ｃａ”″を遊離、ＰＡはイオノフオア−として細胞
外から細胞内へのＣａ”流入を起こすことが知られてい
る。

以上の知見を基に、種々の細胞においてＣａ”″動員を
ひき起こす物質を検討した結果、ホスホリパーゼＣ，ホ
スホリパーゼＡｘ、ブラデイキニン、レクチンであるコ
ンカナバリンＡ、フィトヘマグルチニン等の物質は、ヒ
ト組織由来の正常２倍体線維芽細胞においてプラスミノ
ーゲンアクチベーターの生産を誘導し、又、上記物質と
ペプトン類とを組合わせることにより、生産性を著しく
向上させることを見出した。

細胞膜を通過出来ないホルモンや伝達物質は細胞股上に
存在する受容体と結合して、その情報を細胞内に伝える
機構をもつことは、よく知られており、ｃＡＭＰ　、　
Ｃａ”が細胞内情報伝達物質として注目されている。そ
こで本発明者らは、ｃ　ＡＭＰの誘導体で膜の透過性が
良く、ホスホジェステラーゼに分解されにくいと言われ
るジブチリルｃＡＭＰ（（Ｂｕ）ｚ−ＡＭＰ　）　、Ａ
ｄｅｎｙｌａＬｅ　ｃｙｃｌａｓｅ活性化により細胞内
ｃＡＭＰを上昇させるフォルスコリンとペプトン類の組
合わせにおいて、上記物質がペプトン類によるブラスミ
ノーゲンアクチベーター生産＝、＜を更に助長すること
を見出した。又、線維芽細胞や血管内皮細胞がプラスミ
ノーゲンアクチベーターを合成するのみならず、分子ｆ
ｆ１５０．０００前後の阻ｉＦ囚子（セリンプロテアー
ゼインヒビター）をも合成し、この阻害因子が組織型及
びウロキナーゼ型のブラスミノーゲンアクチベーターの
機能を阻害することが多くの報告にみられる〔プロス−
ディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ニー
・ニス・ニー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、ＵＳＡ）７８．２３４０〜２３４４．１９８１）。

ブラスミノーゲンアクチベーターと阻害因子との関係は
、細胞表面に阻害因子の受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）が
存在し、細胞よりプラスミノーゲンアクチベーターと阻
害因子が分泌され、阻害因子はセリンプロティア−ゼイ
ンヒビターであり、プラスミノーゲンアクチベーターの
活性中心に結合し゛ζ活性化され、細胞表面にある阻害
因子受容体に結合して、細胞内にインターナリゼイショ
ンされ、リソシーム内でプラスミノーゲンアクチベータ
ーは分解され、阻害因子は分解されずに再利用される。

一方、トロンビンはブラスミノーゲンアクチヘークーと
同様にセリンプロテアーゼであり、阻害因子に対して、
ブラスミノーゲンアクチベーターよりトロンビンの方が
調和性（八ｆｆ１ｎｉｔｙ）が高いため、トロンビンを
添加すると、阻害因子とトロンビンの結合が起こり、結
果として、遊離のプラスミノーゲンアクチベーターが多
くなり、プラスミノーゲンアクチベーター活性が上昇す
ると考えられる。

本発明者らは、ペプトン類とトロンビンを併用投与する
ことにより、べ、ブトン頻によるプラスミノーゲンアク
チベーターの生産誘導においてトロンビンが上記理由に
て、更に助長することを見出した。

本発明は、上記知見に基づき、上述したブラスミノーゲ
ンアクチベークー生産誘導物質とペプトン類を併用投与
することにより、従来公知のペプトン類単独を生産誘導
物質として用いる生産誘導方法に比べて、上記の新しい
型のプラスミノーゲンアクチヘーターの生産性を著しく
向上し得たものである。

本発明において、新しい型のプラスミノーゲンアクチベ
ーターの生産細胞として用いるヒト組織由来の正常２倍
体綿維芽細胞は、通常の培養に用いられる血清培地もし
くは無血清培地中で常法により培養して増殖させ、次い
で高細胞密度、好ましくはｌＸｌ０’細胞／ｌ１）以上
の細胞密度で前記（ａ）、ｆｂｌもしくは（ｃ１の生産
誘導物質とペプトン類とを組合わせて添加した無血清培
地中で培養する。この培養に際して生産誘導物質として
用いられるペプトン類は、通常の微生物の培養培地に用
いられるものであって、一般には動物肉を酵素分解して
調整され、このようなペプトン類としては、プロテオー
スペブトン、ネオペプトン等の市販品がロット差が少な
く高い生産誘導効果を示すので好ましく、ペプトン類の
培地への添加濃度は、０．１〜２．０％（Ｗ／Ｗ）が好
ましい、８亥ブラスミノーゲンアクチベーターの生産誘
導は、細胞外Ｃａ”？Ｈ度依存であり、その添加量はＣ
ａＣ１ｇとして１．８〜５．０＋ａＭが好ましく　５．
０ｓ＋Ｍを越えると、細胞に対する１貝傷がみられるの
で好ましくない。また各生産誘導物質の添加量は、ホス
ホリパーゼＣ０．２〜２．０　ｕｎｉｔ／ｃｗ　ｌホス
ホリパーゼＡｚ１００〜１０００ｕｎｉｔ／＋　１、ブ
ラデイキニン１Ｏ−７〜１０−’Ｍ　、コンカナバリン
Ａ１〜２００μｇ／１ｅｌｌ、フィトヘマグルチニン１
〜２００μｇ／ｓ　１ジブチリルサイクリックＡＭＰ　
１〜１００μ門、フォルスコリンｌＸｌ０″６〜Ｉ　Ｘ
　１０−’Ｍ、トロンビン０．５〜２．０　ｕｎｉｔ／
ｓ＋１が好ましく、上記物質とペプトンｉｌｌ　０．２
〜２．０％（Ｗ／Ｗ）　　とＣａ”°１．８〜５．０ｍ
Ｍを同時投与することにより、新しい型のプラスミノー
ゲンアクチベーターの生産性を著しく高めることができ
る。

本発明に従って、上述のようにして増殖細胞を培養する
ことにより培地中に生産されたプラスミノーゲンアクチ
ベーターの生産量は、下記手法により測定する。

ブラスミノーゲンアクチベーターの測定法：プラスミノ
ーゲンに冨んだヒトフィブリノーゲン（ＫＡＢＩ社製）
０．１ｗｔ％、低融点アガロース（牛丼化学社製）　０
．１３ｗｔ％及びトロンビン（持出製薬社製）　０．２
ｍ　ｌ　（２５単位／ｓｌ）から作成したフィブリン平
板を用い、世界保健機構（ＷＨＯ）から入手したヒト組
織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）を標
準品（ＷＨＯｔ−Ｐ＾スタンダード）としたフィブリン
プレート法で測定する。すなわち、上記培養により生産
されたプラスミノーゲンアクチベーターを含有する培養
液を０．０２％Ｔｗｅｅｎ　８０及び０．１５Ｍ食塩を
含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７゜４）で希釈し、
上記フィブリン平板に設けた直径３禦鋼の穴に該希釈試
料の５μｌを入れ、３７℃で１８時間放置した後、形成
されるフィブリン溶液窓の大きさを、上記ＷＨＯ−ｔ−
Ｐ＾スタンダードを同様に操作して形成されたフィブリ
ン溶液窓の大きさと比較して、目的の新しい型のブラス
ミノーゲンアクチベーターの国際単位（Ｉｕ／＋　１　
）を求めることができる。

以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。

実施例１ ヒト胎児由来の正常２倍体線維芽細胞、ＩＭＲ−９０（
ＡＴＣＣ、ＣＣＬ　１８６）を１５個の組繊培養フラス
コ（２５ｃｄ）中で培養し、細胞が集密的（コンフルエ
ント）に達した後（細胞密度１．５　ｘ　１０’／２５
ａＪ）　、滅菌したＰＢＳ　（リン酸緩衝液）でそれぞ
れ２回洗浄し、次いで上記フラスコ各５個には１．０％
（Ｗ／Ｗ）プロテオースペプトン及びＣａ”３．６ｍＭ
を添加した無血清培地ＤＭｌｉＭ（ｐＨ７，４）　Ｅｎ
ｓｌを加えた、別の５個のフラスコに、ホスホリパーゼ
Ｃ（１，０ｕｎｉｔ／ｍ　ｌ　）及びＣａ”３．６ｍＭ
を添加した無血清培地のＤＭＥＭ（ｐＨ７，４）５鋤ｌ
を加えた。各５個のフラスコに１％（Ｗ／Ｗ）プロテオ
ースペブトンとホスホリパーゼＣ０．５ｕｎｉｔ／−ｊ
！とＣａ”３．６ｍＭを添加した無血清培地ノＤＭＥＭ
（ｐＨ７，４）５−１を加え、それぞれ５％ｃ−含有空
気中３７℃で９日間培養を行い、培養液中に分泌された
目的プラスミノーゲンアクチベーターの生産量を測定し
た。結果は表１に示すとおりである。

実施例２ 実施例１と同様にＩＩ′１Ｒ−９０細胞を１５個の組織
培養フラスコ中でそれぞれ培養し、細胞がコンフルエン
トに達した後（細胞密度１．５　ｘ　１０’／２５ａＪ
）　、滅菌したＰＢＳでそれぞれ２回洗浄し、次いで上
記フラスコ５個に１％（−ル）プロテオースペブトン及
びＣａ”３．６ｍＭを添加した無血清培地ＤＭ’ＥＭ（
ｐＨ７，４）５ｍｌを加え、別のフラスコ５個に、ホス
ホリパーゼＡ　ｚ　５００ｕｎｉｔ／＋ｍ　１２とＣａ
”３．６ｍＭとプロテオースペプトン１．０％（Ｗ／Ｗ
）を添加した無血清培地ＤＭ［４Ｍ（ｐＨ７，４）５（
１）７！を加え、それぞれ５％ＣＯ□含有空気中３７℃
で８日間培養を行い、培養液中に分泌された目的ブラス
ミノーゲンアクチベーターの生産量を測定した。結果は
表２に示すとおりである。

実施例３ 実施例１と同様に団ト９０細胞を１０個の組織培養フラ
スコ中でそれぞれ培養し、細胞がコンフルエントに達し
た後、滅菌したＰＢＳでそれぞれ２回洗浄し、次いで上
記フラスコ５個に１％（−／リ　プロテオースペブトン
及び３．６ｍＭＣａ”を添加した無血清培地ＤＭＥＭ（
ｐｔ＋　７．４）　５ｎｊ！を加え、別のフラスコ５個
に１％（Ｗ／Ｗ）プロテオースベプトンとブラデイキニ
ン１０−６ＭとＣａ”３．６ｍＭを添加した無血清培地
ＤＭＥＭ　（ｐＨ７，４）５ｍ６を加え、それぞれ５％
ｃｏ。

含有空気中３７℃で８日間培養を行い、培養液中に分泌
された目的ブラスミノーゲンアクチベーターの生産量を
測定した。結果は表３に示すとおりである。

実施例４ 実施例１と同様にＩＭＲ−９０細胞を２５個の組織培養
フラスコ中でそれぞれ培養し、細胞がコンフルエントに
達した後、滅菌したＰＢＳでそれぞれ２回洗浄し、次い
で上記フラスコ５個にＣａ”３．６ｍＭを添加した無血
清培地ＤＭＥＭ５ｓ１、別のフラスコ５個に、プロテオ
ースペプトン１．Ｏｗｔ％とＣａ”３．６ｍＭを添加し
た無血清培地ＤＭＥＭ５ｍＪを加え、別のフラスコ５個
に、コンカナバリンＡ２０μｇ／＋＊　ｌとＣａ”。

３．６ｍＭ添加した無血清培地ＤＭＥＭ　５ｓｌを加え
、別のフラスコ５個にフィトヘマグルチニン２０μｇ／
鴎ｌとＣａ”″３．６ｍＭ添加した無血清培地ＤＭＥＭ
５ｍ＋　１を加え、別のフラスコ５個にプロテオースペ
プトン１．ｈｔ％とコンカナバリンＡ２０．ｃ＋ｇ／＋
４！とＣａ”３．６ｓＭ添加した無血清培地ＤＭＥＭ５
＋＊　ｌを加え、それぞれ５％ＣＯｔ含有空気中３７℃
で７日間培養を行い、培養液中に分泌された目的プラス
ミノーゲンアクチベーターの生産量を測定した。結果は
表４に示すとおりである。

実施例５ 実施例１と同様に団Ｒ−９０細胞を２０個の組織培養フ
ラスコ中でそれぞれ培養し、細胞がコンフルエントに達
した後、滅菌したＰＢＳでそれぞれ２回洗浄し、次いで
上記フラスコ５個にＣａ”３．６ｍＭを添加した無血清
培地ＤＭＥＭ　５ｍｌを加え、別のフラスコ５個に、ジ
ブチリルサイクリックＡ　Ｍ　Ｐ　０．６１ｍＭとＣａ
”３．６ｍＭを添加した無血？〃培地ＤＭＥＭ　５ｇ＋
／を加え、別のフラスコ５個に、プロテオースペプトン
１％（Ｗ／Ｗ）とＣａ”３．６ＩＩＭ添加した無血清培
地ＤＭＥＭ５＃ｌ　１を加え、別のフラスコ５個にプロ
テオースペブトン１．０％（Ｗ／Ｗ）とフォルスコリン
２ｘｌＯ−’ＭとＣａ”３．６ａ＋Ｍ添加した無血清培
地ＤＩＩＥＭを加え、それぞれ５％Ｃ０．含有空気中３
７℃でＩＯ口間培養を行い、培養液中に分泌された目的
プラスミノーゲンアクチベーターの生産量を測定した。

結果は表５に示すとおりである。

実施例６ 実施例１と同様にｒＭＲ−９０細胞を１０個の組織培養
フラスコ中でそれぞれ培養し、細胞がコンフルエントに
達した後、滅菌したＰＢＳでそれぞれ２回洗浄し、次い
で上記フラスコ５個にプロテオースペブトン１．０％（
Ｗ／Ｗ）とＣａ”３．６＋ｗＭを添加した無血清培地６
０＋ｗ　１を加え、別のフラスコ５個に、プロテオース
ペブトン１．０％（Ｗ／Ｗ）とトロンビン１ｕｎｉｔ／
＋ｓ１とＣａ”３．６ｍＭを添加した無血清培地６０ｗ
　Ｉｔを加え、それぞれ５％Ｃ０ｆｆ１含有空気中３７
℃で１）日間培養を行い、培養液中に分泌された目的プ
ラスミノーゲンアクチベーターの生産型を測定した。結
果は表６に示すとおりである。

手続補正書 昭和６３年３月１４日 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 １、事件の表示　昭和６１年特許願第２９９７２７号２
、発明の名称　新規な型のプラスミノーゲン活性化因子
の製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　　（６６９）雪印乳業株式会社４、代理人 住　所　東京都港区東新橋２丁目７番７号新橋国際ビル
５、補正命令の日付　　自　発 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象　　　明　　細　　書 ８、補正の内容 明細書を下記のとおり補正する。

（１）第４頁、第２行目にｒ　１０−　’〜１０−’Ｊ
とあるをｒｌｏ−’〜１０−’Ｍ　Ｊと補正する。

（２）第５頁、第３行目に「〜５Ｘ１０−’Ｊとあるを
［〜５　ｘｌＯ−’Ｍ　Ｊと補正する。

（３）第５頁、第７行目に「０．５〜２０」とあるを「
０．５〜２．０」と補正する。

（４）第１３頁、第７行目に「流入、」とあるを「流入
（ｉｎｆ　１ｕｘ）、」と補正する。

（５）第１３頁、第７行目に［遊離１，１とあるを「遊
＃（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、」と補正する。

−６）第１３頁、下から６行目にｒＣａ”動員」とある
をｒＣａ”″濃度上昇機構」と補正する。

（７）第１４頁、第３行目に［酸（ＩＦ５）　Ｊとある
を「酸（ＩＰｉ）　、Ｊと補正する。

：８）第１４頁、第３行目〜第４行目にｒＣａ”動員」
とあるを［細胞内Ｃａ”°濃度上昇」と補正する。

：９）第１６頁、下から８行目に「調和性」とあるを「
親和性」と補正する。

（１０）第１８頁、下から４行目に「１〜１００μ門」
とあるを「１〜１０００μ門」と補正する。

（１））第２０頁、第３行目に「溶液窓」とあるを「溶
解窓」と補正する。

（■２）第２０頁、第５行目に「溶液窓」とあるを「溶
解窓」と補正する。

（１３）第２４頁、表２の培養６日後の欄において、「
９５０±２４０」とあるを「６９０±４２．４Ｊと補正
する。

（１４）第３１頁、下から５行目に「無血清培地」とあ
るを「無血清培地ＤＭＥＭ　Ｊと補正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ヒト組織由来の正常２倍体線維芽細胞を培養して
   下記の酵素化学的性質を有するプラスミノーゲン活性化
   因子を製造する方法において、上記正常２倍体線維芽細
   胞を血清培地もしくは無血清培地で培養して増殖させ、
   次いで高細胞密度で（ａ）生産誘導物質として、ホスホ
   リパーゼＡ＿２、ホスホリパーゼＣ、ブラデイキニン、
   コンカナバリンＡ及びフイトヘマグルチニンから成る群
   から選択される１種もしくは２種以上とペプトン類とを
   添加した無血清培地で培養するか、（ｂ）生産誘導物質
   として、ジブチリルサイクリツクＡＭＰ又はフオルスコ
   リンとペプトン類とを添加した無血清培地で培養するか
   、もしくは（ｃ）トロンビンとペプトン類とを添加した
   無血清培地で培養することを特徴とする上記プラスミノ
   ーゲン活性化因子の製造方法； （イ）分子量： ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定で
   ６５，０００〜７２，０００ （ロ）蛋白分解酵素としての分類： ｐ−アミノベンツアミジン　ジフロロフオスフエイト（
   ＤＦＰ）メシル酸ガベキサート（ＦＯＹ）により活性阻
   害を受けるセリンプロテアー ゼの一種。 （ハ）基質Ｓ−２２８８に対するＫｍ値（ｍｏｌｅ／ｌ
   ）Ｋｍ：１．１６×１０＾−＾３ Ｖｍａｘ（ｍｏｌｅ／ｍｉｎ、ｕｎｉｔ）Ｖｍａｘ：１
   ．７×１０＾−＾８（ニ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲： ７．５〜９．０、５〜１０ （ホ）比活性（Ｉｕ／ｍｇ）：１６．６〜１８．７×１
   ０＾４（ＷＨＯ　ｔ−ＰＡスタンダードにより測定）（
   ヘ）作用適温の範囲（℃）：３９〜４１ （ト）活性阻害金属イオン： Ｃｏ＾２＾＋、Ｚｎ＾２＾＋、Ｃｄ＾２＾＋、Ｈｇ＾２
   ＾＋、Ｎｉ＾２＾＋及びＣｕ＾２＾＋（チ）フイブリン
   親和性（結合比率、％）８３．１（リ）コンカナバリン
   Ａカラムへの吸着性：有（ヌ）抗ウロキナーゼポリクロ
   ーナル抗体による活性中和：全く中和されない （ル）耐熱性（残存活性％）： ［６０℃で６０分間加熱１００．０％、９５℃で５分間
   加熱１００．０％］（２）上記増殖させた正常２倍体線
   維芽細胞を、ｌ×１０＾４細胞／ｍｌ以上の高細胞密度
   で培養する特許請求の範囲第（１）項記載の製造方法。 （３）生産誘導物質として、ホスホリパーゼＡ＿２１０
   ０〜１０００ｕｎｉｔ／ｍｌとペプトン類０．１〜２．
   ０％（Ｗ／Ｗ）及びＣａ＾２＾＋１．８〜５．０ｍＭの
   各濃度で無血清培地に添加する特許請求の範囲第（１）
   項記載の製造方法。 （４）生産誘導物質として、ホスホリパーゼＣ０．１〜
   ２．０ｕｎｉｔ／ｍｌとペプトン類０．１〜２．０％（
   Ｗ／Ｗ）及びＣａ＾２＾＋１．８〜５．０ｍＭの各濃度
   になるように無血清培地に添加する特許請求の範囲第（
   １）項記載の製造方法。 （５）生産誘導物質としてブラデイキニン１０＾−＾７
   〜１０＾−＾５とペプトン類０．１〜２．０％（Ｗ／Ｗ
   ）及びＣａ＾２＾＋１．８〜５．０ｍＭの各濃度になる
   ように無血清培地に添加する特許請求の範囲第（１）項
   記載の製造方法。 （６）生産誘導物質として、コンカナバリンＡ１〜１０
   ０μｇ／ｍｌとペプトン類０．１〜２．０％（Ｗ／Ｗ）
   及びＣａ＾２＾＋１．８〜５．０ｍＭの各濃度になるよ
   うに無血清培地に添加する特許請求の範囲第（１）項記
   載の製造方法。 （７）生産誘導物質として、フイトヘマグルチニン１〜
   １００μｇ／ｍｌとペプトン類０．１〜２．０％（Ｗ／
   Ｗ）及びＣａ＾２＾＋１．８〜５．０ｍＭの各濃度にな
   るように無血清培地に添加する特許請求の範囲第（１）
   項記載の製造方法。 （８）生産誘導物質として、ジブチリルサイクリツクＡ
   ＭＰ１〜１０００μＭとペプトン類０．１〜２．０％（
   Ｗ／Ｗ）及びＣａ＾２＾＋１．８〜５．０ｍＭの各濃度
   になるように無血清培地に添加する特許請求の範囲第（
   １）項記載の製造方法。 （９）生産誘導物質として、フオルスコリン２×１０＾
   −＾６〜５×１０＾−＾５とペプトン類０．１〜２．０
   ％（Ｗ／Ｗ）及びＣａ＾２＾＋１．８〜５．０ｍＭの各
   濃度になるように無血清培地に添加する特許請求の範囲
   第（１）項記載の製造方法。 （１０）生産誘導物質として、トロンビン０．５〜２０
   ｕｎｉｔ／ｍｌとペプトン類０．１〜２．０％（Ｗ／Ｗ
   ）及びＣａ＾２＾＋１．８〜５．０ｍＭの各濃度になる
   ように無血清培地に添加する特許請求の範囲第（１）項
   記載の製造方法。