JPS63141583A - Transformant and production of human interferon - Google Patents
Transformant and production of human interferonInfo
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、ヒト細胞を用いて遺伝子組換え技術によりヒ
トインターフェロンを回度することを目的とした形質転
換体およびそれによるヒトインターフェロンの生産方法
に関する。[Detailed Description of the Invention] [Industrial Application Field] The present invention provides a transformant and a method for producing human interferon using the transformant for the purpose of producing human interferon by genetic recombination technology using human cells. Regarding.
［従来の技術］
インターフェロンは抗ウィルス作用を示す糖蛋白質であ
り、抗癌剤としての利用が最も期待されている生理活性
物質である。[Prior Art] Interferon is a glycoprotein that exhibits antiviral activity, and is a physiologically active substance that is most expected to be used as an anticancer agent.
インターフェロンは種特異性が高く、すなわち、ヒトに
対してはヒトのインターフェロンしか効かないという制
約がおる上に、天然のインターフェロンは微開にしか１
ｑられないという問題があったが、近年急速な発展をと
げている遺伝子操作技術はこれら生体内微量生理活性物
質を大量に供給できる新しい方法を提供しつつある。Interferon is highly species-specific, which means that only human interferon is effective against humans, and natural interferon is only slightly effective.
However, genetic engineering technology, which has been rapidly developing in recent years, is providing a new method for supplying large amounts of these physiologically active substances in vivo.
本発明にかかわるヒトインターフェロンβヤヒトインタ
ーフェロンＴについてもすでにチャイニーズハムスター
細胞を用いた糖鎖がついたヒトインターフェロンの量産
化が報告されている（Ｓ、 Ｗ、 ５ｔａｎｆｉｅｌｄ
ｅｔ ａｌ、Ｈｏ１． Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、、４
．１７３，１９８４；Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ、 ５
ｅｒｏｎｏ Ｓｙｍｐ、、２３．６７．１９８５）。Regarding the human interferon β and human interferon T involved in the present invention, mass production of human interferon with sugar chains attached using Chinese hamster cells has already been reported (S, W, 5tanfield).
et al, Ho1. Ce11. Biol,,4
．． 173, 1984; Michel et al, 5
erono Symp, 23.67.1985).
しかし、ヒト以外の細胞を用いてヒトインターフェロン
を合成した場合、糖鎖の構造が異なる可能性がおる
このため、ヒト以外の細胞で生産したヒトインターフェ
ロンは天然型ヒトインターフェロンとは生理活性や抗原
性が異なる可能性が考えられる。However, when human interferon is synthesized using non-human cells, the sugar chain structure may be different. Therefore, human interferon produced in non-human cells has physiological activity and antigenicity different from natural human interferon. There is a possibility that the values are different.
したがって、抗癌剤などとしては天然型ヒトインターフ
ェロンの利用が望ましい。Therefore, it is desirable to use natural human interferon as an anticancer agent.
天然型ヒトインターフェロンβの生産方法としては、正
常ヒト二倍体線維芽細胞を薬剤で処理する方法があるが
（Ｅ、Ａ、Ｈａｖｅｌｌ ｅｔ ａｌ、 Ａｎｔｉｍｉ
ｃｒｏｂ。As a method for producing natural human interferon β, there is a method of treating normal human diploid fibroblasts with drugs (E, A, Havell et al, Antimi et al.
clob.
Ａｇｅｎｔｓ、 Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、、 ２．４７６
１９７２） 、これには次のような欠点がある。Agents, Chemother, 2.476
1972), which has the following drawbacks:
１、正常細胞では継代数に限りがあるため、常に新しい
細胞を供給しなければならない。1. Normal cells have a limited number of passages, so new cells must be constantly supplied.
２、生産に使用した細胞はヒトインターフェロンβ産生
後死滅するため、細胞の再使用ができない。2. The cells used for production die after producing human interferon β, so they cannot be reused.
３、一般的に細胞の増殖速度は遅いため、大量培養に移
るまでに時間がかかる。3. Cells generally have a slow growth rate, so it takes time to move to mass culture.
４、ヒト細胞の培養には高価な血清が必要なため生産コ
ストが高い。4. Production costs are high because expensive serum is required to culture human cells.
天然型ヒトインターフェロンγの生産方法としては、末
梢血リンパ球を薬剤で処理する方法があるが団、）（、
Ｊｏｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ、、 ７８（ＰｔＡ）、 １５８．１９８１）
、これには次のような欠点がある。One way to produce natural human interferon γ is to treat peripheral blood lymphocytes with drugs.
Johnson et al, Methods Enzy
mol, 78(PtA), 158.1981)
, this has the following drawbacks:
１、生産に使用した細胞はヒトインターフェロン産生後
死滅するため細胞の再使用ができない。1. The cells used for production die after producing human interferon, so they cannot be reused.
２、細胞のヒトインターフェロン産生量は低い。2. The amount of human interferon produced by cells is low.
３、血液由来細胞を用いるため、供給口に限りがおるの
で、量産化ができない。3. Since blood-derived cells are used, the supply port is limited, so mass production is not possible.
このように、従来ではヒト細胞で効率良くヒトインター
フェロンを産生できる系は存在しなかった。Thus, until now, there has been no system that can efficiently produce human interferon using human cells.
一方、遺伝子操作技術を用いたヒト細胞発現系としては
、ＢＫウィルスを利用した系（Ｇ、 Ｈｉ １ａｎｅｓ
ｉ ｅｔ ａｌ、 Ｍｏ１． Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、
、 ｌｉ、 １５５１．１９８４）、ＥＢウィルスを利
用した系（Ｊ、Ｌ、Ｙｅａｔｃｓ Ｃｔ ａｌ、 Ｎａ
ｔｕｒｅ、 ３１３．８１２．１９８５）、アデノウィ
ルスを利用した系（）ｆ、Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ、
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ
ＳＡ、８２．３５６７、１９８５）が知られているが、
これらには次のような欠点がおる。On the other hand, as a human cell expression system using genetic engineering technology, there is a system using BK virus (G, Hi 1 anes
i et al., Mo1. Ce11. Biol,
, li, 1551.1984), a system using EB virus (J.L., Yeatcs Ctal, Na
ture, 313.812.1985), system using adenovirus ()f, Yamada et al.
Proc, Natl, Acad, Sci, U
SA, 82.3567, 1985) is known,
These have the following drawbacks.
ＢＫウィルス系の宿主細胞１４３ＢやＨｅ１ａはじトイ
ンターフェロンに感受性なため、ヒトインターフェロン
の産生には向かないし、ＢＫウィルスはライスコツト
アルドリッチ症候群などの免疫疾患を引き起こすと考え
られているので（Ｊ。BK virus host cells 143B and He1a are sensitive to direct interferon, so they are not suitable for producing human interferon, and BK virus is not suitable for human interferon production.
It is thought to cause immune disorders such as Aldrich syndrome (J.
Ｖｉｒｏｌ、１６．９５９．１９７５）、ウィルス由来
の蛋白の混入が心配である。Virol, 16.959.1975), there is concern about contamination with virus-derived proteins.
ＥＢウィルス系の宿主となるＲａｊｉなどの細胞は形質
転換が困難であるし、ＥＢウィルスはバーキットリンパ
腫を引き起こすと考えられているので（Ｚｕｒ Ｈａｕ
ｓｅｎｔ、 Ｈ，ＤＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓ、
ｅｄ、 Ｔｏ。Cells such as Raji, which serve as hosts for the EB virus, are difficult to transform, and the EB virus is thought to cause Burkitt's lymphoma (Zur Hau
sent, H, DNA Tumor Virus,
ed, To.
ｚｅ、ｔ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、 ｐ７４７−７９５、１９８２）
、安全性に問題がある。ze, t, Co1d Spring Harbor L
laboratory, p747-795, 1982)
, there are safety issues.
アデノウィルス系の宿主細胞はＨｅ１ａであるためヒト
インターフェロンの産生には向かないし、この系はウィ
ルスの感染系を用いるため一過性でおる。Since the host cell of the adenovirus system is He1a, it is not suitable for producing human interferon, and this system uses a viral infection system, so it is only temporary.
さらに、ヒト細胞発現系によるヒトインターフェロンγ
の生産例としは、ＷＩ・２６ＶＡ４およびＦＬを用いた
系があるが（特開昭６ｌ−８８８７５）、その生産性は
それぞれ５２４Ｕ／２４ｈ／１０６Ｃｅ１１Ｓおよび３
Ｕ／２４ｈ／１０６ｃｅｌｌｓと低い。In addition, human interferon γ by human cell expression system
As a production example, there is a system using WI・26VA4 and FL (Japanese Patent Application Laid-open No. 61-88875), but the productivity is 524U/24h/106Ce11S and 3, respectively.
As low as U/24h/106cells.
したがって、これまではヒトインターフェロンの産生に
適したヒト細胞発現系は存在しなかった。Therefore, until now there has been no human cell expression system suitable for the production of human interferon.
［発明が解決しようとする問題点］
本発明の目的は、天然型ヒトインターフェロンを高い産
生効率で産生し、安全でかつ継代数にかぎりがない株化
ヒト細胞を遺伝子操作技術を利用して樹立することにあ
る。[Problems to be Solved by the Invention] The purpose of the present invention is to establish a human cell line that produces natural human interferon with high production efficiency, is safe, and has an unlimited number of passages, using genetic engineering technology. It's about doing.
［問題点を解決するための手段］
本発明は、ヒトインターフェロン遺伝子が真核細胞型プ
ロモータ、例えばＳＶ４０初期プロモータやマウス乳癌
ウィルス（Ｈｏｕｓｅ Ｈａｍｍａｒｙ Ｔｕｍｏｒ
Ｖｉｒｕｓ、以下ＭＭＴＶと略す）のプロモータの支配
下に置かれたベクターにより形質転換されたヒト肺癌由
来細胞およびそれによるヒトインターフェロンの生産方
法に関するものである。[Means for Solving the Problems] The present invention provides that the human interferon gene is derived from a eukaryotic promoter, such as the SV40 early promoter or the mouse mammary tumor virus (House Mammary Tumor Virus).
The present invention relates to human lung cancer-derived cells transformed with a vector placed under the control of a promoter of Virus (hereinafter abbreviated as MMTV) and a method for producing human interferon using the same.
以下に本発明で好ましい生産系である恒常的あるいは薬
剤誘導的にヒトインターフェロンを産生できる系を例に
説明する。A preferred production system of the present invention, a system capable of producing human interferon constitutively or drug-induced, will be described below as an example.
ヒト細胞でのヒトインターフェロン発現ベクターの作製
は、動物細胞内で機能するプロモータの制御下にヒトイ
ンターフェロン遺伝子が置かれた遺伝子配列と、大腸菌
での複製開始点と薬剤耐性遺伝子とからなる遺伝子配列
とを結合することにより達成せられる。ここに言うヒト
インターフェロン遺伝子とは、ヒトインターフェロンα
、βまたはγが呈する生物学的活性を有するタンパクの
アミノ酸配列をコードする遺伝子を意味する。The creation of a human interferon expression vector in human cells requires the creation of a gene sequence in which the human interferon gene is placed under the control of a promoter that functions in animal cells, and a gene sequence in E. coli consisting of an origin of replication and a drug resistance gene. This can be achieved by combining. The human interferon gene referred to here is human interferon α
, β or γ.
本発明の真核細胞型プロモータとは、動物ウィルスのプ
ロモータもしくは動物細胞遺伝子のプロモータであって
、ヒト細胞の中で下流のヒトインターフェロン遺伝子を
ｍＲＮＡへ転写する機能のあるものであれば何でもよい
。The eukaryotic promoter of the present invention may be any animal virus promoter or animal cell gene promoter that has the function of transcribing the downstream human interferon gene into mRNA in human cells.
一例として、ＳＶ４０初期プロモータ、ＳＶ４０後期プ
ロモータ、ＨＢウィルス遺伝子のプロモータ、ＭＭＴＶ
プロモータ、ヒトＴ細胞白血病ウィルスのプロモータ等
が動物ウィルスのプロモータとして挙げられる。また、
チミジンキナーゼ遺伝子のプロモータ、メタロチオネイ
ン遺伝子のプロモータ、熱ショック蛋白のプロモータ、
インターフェロン遺伝子のプロモータ等が動物細胞遺伝
子のプロモータとして挙げられる。これらは一種でも二
種以上併用しても良い。Examples include SV40 early promoter, SV40 late promoter, HB virus gene promoter, MMTV
Promoters of animal viruses include promoters of human T-cell leukemia virus and the like. Also,
Thymidine kinase gene promoter, metallothionein gene promoter, heat shock protein promoter,
Examples of animal cell gene promoters include interferon gene promoters. These may be used alone or in combination of two or more.
これらのうち恒常的に発現させるプロモータは、ＳＶ４
０初期プロモータ、ＳＶ４０後期プロモータ、アデノウ
ィルス遺伝子のプロモータ、ＨＢウィルス遺伝子のプロ
モータ、ヒトＴ細胞白血病ウィルスのプロモータ、チミ
ジンキナーゼ遺伝子のプロモータ等である。また、誘導
的に発現させるプロモータは、ＭＭＴＶプロモータ、メ
タロチオネイン遺伝子のプロモータ、熱ショック蛋白の
プロモータ、インターフェロン遺伝子のプロモータ等で
ある。Among these, the promoter for constant expression is SV4
0 early promoter, SV40 late promoter, adenovirus gene promoter, HB virus gene promoter, human T cell leukemia virus promoter, thymidine kinase gene promoter, etc. Examples of promoters that are inducibly expressed include the MMTV promoter, metallothionein gene promoter, heat shock protein promoter, and interferon gene promoter.
なお、真核細胞型プロモータの上流には、転写効率を高
めると言われているＨａｒｂｅｙマウス肉腫ウィルスの
５− ＬＴＲのエンハンサ−配列あるいはＳＶ４０のエ
ンハンサ−配列を挿入することが好ましい。It is preferable to insert the Harvey mouse sarcoma virus 5-LTR enhancer sequence or SV40 enhancer sequence, which is said to increase transcription efficiency, upstream of the eukaryotic promoter.
大腸菌における複製開始点と薬剤耐性遺伝子を結合する
ことは該ベクターＤＮＡを簡便、大量かつ純粋に調製す
るために有用である。複製開始点としては、大腸菌染色
体ＤＮＡの合成阻害剤で複製の増幅が起こることが知ら
れているコリシンＥ１プラスミド由来のもの例えばｐＢ
Ｒ３２２およびこれに類縁のプラスミドが望ましいが、
これに限定されるものではない。Linking the origin of replication in Escherichia coli to a drug resistance gene is useful for preparing the vector DNA easily, in large quantities, and in a pure manner. The replication origin may be derived from colicin E1 plasmid, which is known to cause replication amplification with an E. coli chromosomal DNA synthesis inhibitor, such as pB.
R322 and related plasmids are preferred, but
It is not limited to this.
薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、テ
トラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、
ストレプトマイシン耐性遺伝子。Drug resistance genes include ampicillin resistance gene, tetracycline resistance gene, kanamycin resistance gene,
Streptomycin resistance gene.
ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。Examples include neomycin resistance gene.
以上の様な性質を持つ２つのＤＮＡ断片を結合すること
によりヒト細胞でのヒトインターフェロン発現ベクター
を作ることができる。A human interferon expression vector in human cells can be created by joining two DNA fragments having the properties described above.
ベクターＤＮＡを導入するヒト細胞としてはヒト肺癌由
来細胞が用いられ、好ましくはヒトインターフェロンで
増殖阻害のかからないヒト細胞が用いられる。具体例と
しては、ヒト肺癌由来細胞ＰＣ８及びＰＣ１２（Ｍ、
Ｋｉｎｊｏ Ｏｔ ａｔ、 Ｂｒ、 Ｊ、 Ｃａｎｃｅ
ｒ、凹、 １５．１９７９）が挙げられる。Human lung cancer-derived cells are used as human cells into which vector DNA is introduced, and preferably human cells whose growth is not inhibited by human interferon are used. Specific examples include human lung cancer-derived cells PC8 and PC12 (M,
Kinjo Ot at, Br, J, Cance
r, concave, 15.1979).
ベクターＤＮＡの調製は一般的な方法で行うことができ
る（Ｔ、 Ｈａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、 Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ｐ８６〜９６．１９８
２）。Preparation of vector DNA can be carried out by standard methods (T., Haniatis et al., Mol.
cular Cloning, p86-96.198
2).
ベクターＤＮＡの動物細胞への導入は既存のリン酸カル
シウム法により可能である（Ｆ、 Ｌ、 Ｇｒａｈａｍ
ｅｔ ａｌ、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５４．５３６．１９
７３）。Vector DNA can be introduced into animal cells using the existing calcium phosphate method (F, L, Graham
et al., Virology, 54.536.19
73).
ヒトインターフェロン発現ベクターが導入されたヒト細
胞は、該ベクターを０４１８耐性遺伝子発現ベクターｐ
Ｓ Ｖ ２ ｎ ｅ ｏ （Ｐ、 Ｊ、 ５ｏｕｔｈ
ｅｒｎ ｅｔａｌ、 Ｊ、 ）ｆｏｌ、 ＡＩ）Ｅ）１
． Ｇｅｎｅｔ、、 １．３２７．１９８２）、あるい
はｐＮ Ｅ Ｏ５−（Ｈ，Ｌｕ５ｋｙ ｅｔ ａｌ、
Ｃｅ１ｌ、３６゜３９１、１９８４）とともに導入すれ
ば、形質転換されなかった細胞が生き残れないＧ４１８
を含む選択培地で生育できるため容易に識別できる。Human cells into which the human interferon expression vector has been introduced are transformed into 0418 resistance gene expression vector p
S V 2 n e o (P, J, 5outh
Ern etal, J, ) fol, AI) E) 1
．． Genet, 1.327.1982) or pN E O5- (H, Lu5ky et al.
If introduced with G418 (Ce1l, 36°391, 1984), non-transformed cells will not survive.
It can be easily identified because it can grow on selective media containing .
恒常的プロモータ例えばＳＶ４０初期プロモータの支配
下にヒトインターフェロン遺伝子が置かれたベクターに
より形質転換された細胞は恒常的にヒトインターフェロ
ンを培養液中に分泌し、誘導的プロモータ例えばＭＭＴ
Ｖプロモータの支配下にヒトインターフェロン遺伝子が
置かれたベクターにより形質転換された細胞は培口液中
に薬剤を添加することにより誘導的にヒトインターフェ
ロンを培養液中に分泌する。Cells transformed with a vector in which the human interferon gene is placed under the control of a constitutive promoter, such as the SV40 early promoter, constitutively secrete human interferon into the culture medium, and an inducible promoter, such as MMT.
Cells transformed with a vector in which the human interferon gene is placed under the control of the V promoter inducibly secrete human interferon into the culture medium by adding a drug to the culture medium.
形質転換された細胞により合成されたヒトインターフェ
ロンは、培養液から一般的な精製法により精製できる。Human interferon synthesized by transformed cells can be purified from the culture medium by common purification methods.
例えば、抗ヒトインターフェロン抗体を結合した抗体カ
ラムを用いれば一段でほぼ純品に近いヒトインターフェ
ロンが得られる。ヒトインターフェロンの精製に使用さ
れている数々の方法もそのまま適用することができる。For example, by using an antibody column bound with an anti-human interferon antibody, nearly pure human interferon can be obtained in one step. Numerous methods used for the purification of human interferon can also be directly applied.
［実施例］
以下に、ＳＶ４０初期プロモータ、ＭＭＴＶプロモータ
、もしくはショウジヨウバエ熱ショック蛋白のプロモー
タの支配下に置かれたヒトインターフェロン遺伝子を導
入したヒト細胞で、ヒトインターフェロンを産生させた
例を示すが、本発明は無論これに限定されるものではな
い。[Example] The following is an example in which human interferon was produced in human cells into which a human interferon gene under the control of the SV40 early promoter, MMTV promoter, or Drosophila heat shock protein promoter was introduced. However, the present invention is of course not limited to this.
実施例１
ヒトインターフェロンβ発現ベクターｐＳＶβの作製：
ｐＳ■βは、ヒトインターフェロンβ発現ベクターｐｓ
Ｖ２ＩＦＮβ（待関昭６１−５２２８３＞から真核細胞
での複製を阻害する配列（Ｈ，Ｌｕ５ｋｙｅｔ ａｔ、
Ｎａｔｕｒｅ、 ２９３．７９．１９８１）を除去し
たベクターである。作製方法は以下の通りである。（第
１図参照）
まず、ｐＳＶ２ＩＦＮβのＳＶ４０初期プロモータの上
流にあるＰｖｕＩＩサイトをＳａ１ニリンカーを用いて
３ａｌエサイトに置き換えたあと、Ｓｅ２工とＢａｍ１
−ＩＩで切断してヒトインターフェロンβの発現に必要
な１．７ＫｂのＤＮＡ断片を分離した。Example 1 Preparation of human interferon β expression vector pSVβ: pSβ is human interferon β expression vector ps
A sequence that inhibits replication in eukaryotic cells (H, Lu5kyet at,
Nature, 293.79.1981) has been removed. The manufacturing method is as follows. (See Figure 1) First, the PvuII site upstream of the SV40 early promoter of pSV2IFNβ was replaced with the 3al site using the Sa1 linker, and then Se2 and Bam1
-II to isolate a 1.7 Kb DNA fragment necessary for the expression of human interferon β.
次に、ｐＢＲ３２２から真核細胞での複製を阻害する配
列を除いたベクターｐＭＬ ２ ｄ （Ｈ，ｔｕｓｋｙ
ｅｔ ａｔ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２９３．７９．１９
８１）をＳａ Ｉ Ｉを３ａｍＨＩで切断し長鎖断片を
分離した。Next, the vector pML 2 d (H, tusky
et at, Nature, 293.79.19
81) was digested with 3amHI and the long chain fragment was separated.
これら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
結合しｐＳＶβを得た。These two DNA fragments were ligated using T4 DNA ligase to obtain pSVβ.
実施例２
ヒトインターフェロンβ発現ベクターｐＳＶ（ｒ）βの
作製：
ｐｓＶ（ｒ）βは、実施例１のｐＳＶβのヒトインター
フェロンβシグナルペプチド遺伝子の上流に翻訳効率を
高めると言われているＣＡＡＡＧ配列（Ｈ，にｏｚａｋ
、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３匹、 ２４１．１９８４）を挿
入したベクターである。作製方法は以下の通りである。Example 2 Preparation of human interferon β expression vector pSV(r)β: psV(r)β contains a CAAAG sequence ( H, niozak
, Nature, 3 animals, 241.1984). The manufacturing method is as follows.
（第２図参照）
まず、ｐＳｖβをヒトインターフェロンβシグナルペプ
チド遺伝子の上流にある制限酵素ＸｂａＩサイトで切断
後Ｓ１ヌクレアーゼを用いて平滑末端化したあと、ＳＶ
４０初期プロモータの下流にある制限酵素ＨｉｎｄＩＩ
Ｉサイトで切断することにより、ヒトインターフェロン
β遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧの上流に任意の配列を
挿入できるようにした。(See Figure 2) First, pSvβ was cut at the restriction enzyme XbaI site located upstream of the human interferon β signal peptide gene, and then blunt-ended using S1 nuclease.
Restriction enzyme HindII located downstream of the 40 early promoter
By cutting at the I site, it was possible to insert any sequence upstream of the translation initiation codon ATG of the human interferon β gene.
次に化学合成した２本のオリゴヌクレオチドをアニーリ
ングすることにより、５−末端にＨ１ｎｄｕｌｌ切断末
端を３′末端に平滑末端を持つ挿入配列を作製した。Next, by annealing two chemically synthesized oligonucleotides, an insertion sequence having an H1ndull cut end at the 5-end and a blunt end at the 3' end was created.
上記２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結
合することによりｐＳＶ（ｒ）βを得た。pSV(r)β was obtained by ligating the above two DNA fragments using T4 DNA ligase.
大腸菌に導入したベクターＤＮＡについて挿入部分の塩
基配列をＭａＸａｍ Ｇ１１ｂｅｒｔ法（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、ユム５６
０．１９７７）により決定し目的通りの配列であること
を確認した。The base sequence of the inserted portion of the vector DNA introduced into E. coli was determined using the MaXam G11bert method (Proc,
Natl, Acad, Sci, USA, Yum56
0.1977) and confirmed that the sequence was as intended.
実施例３
ヒトインターフェロンβ発現ベクターｐＳＶ（Ｈａ、ｒ
）βの作製：
ｐＳＶ （Ｈａ、ｒ）βは、実施例２のｐＳＶ（ｒ）β
のＳＶ４０初期プロモータの上流に転写効率を高めると
言われているＨａｒｂｅｙマウス肉腫ウィルスの５＝
ＬＴＲのエンハンサ−配列（以下Ｈａエンハンサ−と略
す）を挿入したベクターである。作製方法は以下の通り
である。（第３図参照）
まず、ｐＳＶ （ｒ）βをＳＶ４０初期プロモータの上
流にある制限酵素５ａｌＩサイトで切断してからＤＮＡ
ポリメラーゼＩＫ＋ｅｎｏｗ断片処理により平滑末端化
し、ざらにＢＡＰ（大腸菌アルカリフォスファターゼ）
処理により末端のリンを除去した。Example 3 Human interferon β expression vector pSV (Ha, r
) Production of β: pSV (Ha, r) β is pSV (r) β of Example 2
5 = of the Harvey mouse sarcoma virus, which is said to increase transcription efficiency upstream of the SV40 early promoter of
This is a vector into which an LTR enhancer sequence (hereinafter abbreviated as Ha enhancer) has been inserted. The manufacturing method is as follows. (See Figure 3) First, pSV (r)β is cut with the restriction enzyme 5alI site located upstream of the SV40 early promoter, and then the DNA
The ends were made blunt by polymerase IK + enow fragment treatment, and BAP (E. coli alkaline phosphatase) was added.
Terminal phosphorus was removed by treatment.
次に、Ｈａエンハンサ−を含むベクターｐＮＥ０５′（
前述）から制限酵素ＣＩａ工およびＳａＣ■消化により
Ｈａエンハンサ−を含む０．５Ｋｂの断片を分離したあ
とＤＮＡポリメラーゼＩＫｌｅｎｏｗ断片処理により平
滑末端化した。Next, the vector pNE05' containing the Ha enhancer (
A 0.5 Kb fragment containing the Ha enhancer was isolated from the above fragment by restriction enzyme CIa and SaC digestion, and then blunt-ended by DNA polymerase IKlenow fragment treatment.
上記２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合する
ことによりベクターｐｓｖ （Ｈａ、ｒ）βを得た。Vector psv (Ha, r)β was obtained by ligating the above two DNA fragments using T4 DNA ligase.
実施例４
ヒトインターフェロンβ発現ベクターＤＭＴＶβの作製
：
１）ＭＴＶβは実施例１のｐＳＶβ（７）ＳＶ４０初期
プロモータの代わりにＭＭＴＶプロモータを導入したベ
クターである。作製方法は以下の通りである。（第４図
参照）
まず、ｐＳＶβを制限酵素３ａｌＩで切断後、）−１ｉ
ｎ（［１リンカ−を用いて３ａ Ｉ エサイトをＨｉｎ
ｄ［ｌサイトに置き換えたあと、ト１ｉｎｄ［ｌで切断
してＳＶ４０初期プロモータを含まない３゜８ＫｂのＤ
ＮＡ断片を分離した。さらに、ＢＡＰ（前述）９１１理
により末端のリンを除いた。Example 4 Preparation of human interferon β expression vector DMTVβ: 1) MTVβ is a vector into which the MMTV promoter was introduced in place of the pSVβ(7)SV40 early promoter of Example 1. The manufacturing method is as follows. (See Figure 4) First, after cutting pSVβ with restriction enzyme 3alI, )-1i
n([1 Use linker to Hin
After replacing with d[l site, cut at t1ind[l to create a 3°8Kb D that does not contain the SV40 initial promoter.
The NA fragment was isolated. Furthermore, terminal phosphorus was removed using the BAP (described above) 911 procedure.
次に、ＭＭＴＶプロモータを含むベクターｐＭＴＶｄ
ｈ ｆ ｒ （Ｆ、 Ｌｅｅ ｅｔ ａｔ、 Ｎａｔｕ
ｒｅ、 ２９４．２２８゜１９８２ ）を制限酵素Ｈｉ
ｎｄＩ［Ｉで切断することによりＭＭＴＶプローＥｌを
含む１．４Ｋｂ（７）ＤＮＡ断片を分離した。Next, the vector pMTVd containing the MMTV promoter
h f r (F, Lee et at, Natu
re, 294.228°1982) with restriction enzyme Hi
A 1.4 Kb (7) DNA fragment containing the MMTV probe El was isolated by cutting with ndI[I.
これら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
結合することによりｐＭＴＶβを得た。pMTVβ was obtained by ligating these two DNA fragments using T4 DNA ligase.
実施例５
ヒトインターフェロンβ発現ベクターｐＭＴＶ（ｒ）β
の作製：
ｐＭＴＶ（ｒ）βは実施例２のｐＳＶ （ｒ）βのＳＶ
４０初期プロモータの代わりにＭＭＴＶプロモータを導
入したベクターである。作製方法は以下の通りである。Example 5 Human interferon β expression vector pMTV(r)β
Preparation: pMTV(r)β is pSV of Example 2 SV of (r)β
This is a vector into which the MMTV promoter is introduced instead of the 40 initial promoter. The manufacturing method is as follows.
（第５図参照）
まず、ｐｓＶ（ｒ）βのＳＶ４０初期プロモータの上流
にある５ａｌＩサイトをト１ｉｎｄＩＩＩサイトに置き
換えたあと、）−１ｉ ｎｄＩＩＩで切断しＳＶ４０初
期プロモータを含まない３．８ＫｂのＤＮＡ断片を分離
した。さらに、８ＡＰ（前述）処理により末端のリンを
除いた。(See Figure 5) First, after replacing the 5alI site upstream of the SV40 early promoter of psV(r)β with the 1indIII site, we cut the 3.8Kb DNA that does not contain the SV40 early promoter by cutting with )-1i ndIII. The fragments were separated. Furthermore, terminal phosphorus was removed by 8AP treatment (described above).
次に、ｐＭＴＶｄ ｈ ｆ ｒ （前述）を制限酵素Ｈ
ｉｎｄｌ［ｌで切断しＭＭＴＶプロモータを含む１゜４
ＫｂのＤＮＡ断片を分離した。Next, pMTVd h f r (described above) was treated with restriction enzyme H
indl [1°4 cut at l and containing the MMTV promoter
A DNA fragment of Kb was isolated.
上記２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合する
ことによりベクターｐＭＴＶ （ｒ）βを得た。Vector pMTV (r)β was obtained by ligating the above two DNA fragments using T4 DNA ligase.
実施例６
ヒトインターフェロンβ発現ベクターｐＭＴＶ （Ｈａ
）βの作製：
ｐＭＴＶ （Ｈａ）βは、実施例４のｐ ｉ’ｖｉ Ｔ
ＶβのＭＭＴＶプロモータの上流にＨａエンハンサ−
を導入したベクターである。作製方法は以下の通りであ
る。（第６図参照）
まず、ｐＭＴＶβのＭＭＴＶプロモータの上流にあるＨ
ｉ ｎｄＤＩサイトをＳａ ｌ Ｉリンカ−を用いて３
ａｌＩサイトに変えた。このあと３ａｌＩで切断後ＤＮ
ＡポリメラーゼＩｌｅｎｏｗ断片で処理し平滑末端化し
てからＢＡＰ （前）ホ）処理により末端のリンを除い
た。Example 6 Human interferon β expression vector pMTV (Ha
) Preparation of β: pMTV(Ha)β is pMTV(Ha)β of Example 4.
A Ha enhancer is located upstream of the MMTV promoter of Vβ.
This is a vector that introduces The manufacturing method is as follows. (See Figure 6) First, the H
The indDI site was linked using the Sal I linker.
Changed to alI site. After this, DN after cutting with 3alI
After treatment with A polymerase Ilenow fragment to make the ends blunt, terminal phosphorus was removed by BAP treatment.
次に、ｐＮＥＯ５＝ （前述）をＣ１ａ工とＳａＣ■で
切断して０．５ＫｂのＨａエンハンサ−断片を分離し、
ＤＮＡポリメラーゼＩＫ Ｉ ｅｎｏｗ断片処理で平滑
末端化した。Next, pNEO5= (described above) was cut with C1a and SaC to isolate a 0.5 Kb Ha enhancer fragment.
The ends were made blunt by DNA polymerase IK I enow fragment treatment.
これら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
結合することによりｐＭＴＶ （Ｈａ）βを得た。pMTV (Ha)β was obtained by ligating these two DNA fragments using T4 DNA ligase.
実施例７
ヒトインターフェロンβ発現ベクターｐＭＴＶ （ＳＶ
）βの作製：
ｐＭＴＶ （ＳＶ）βは実施例１（７）ｐＳＶβ（７）
ＳＶ４０初期プロモータとヒトインターフェロンβ遺伝
子の間にＭＭＴＶプロモータ（前述）を導入したベクタ
ーである。このベクターでは、ヒトインターフェロンβ
遺伝子はＳＶ４０初期プロモータとＭＭＴＶプロモータ
の支配下に置かれる。作製方法は以下の通りである。Example 7 Human interferon β expression vector pMTV (SV
) Production of β: pMTV (SV) β is Example 1 (7) pSVβ (7)
This is a vector in which the MMTV promoter (described above) is introduced between the SV40 early promoter and the human interferon β gene. This vector uses human interferon β
The gene is placed under the control of the SV40 early promoter and the MMTV promoter. The manufacturing method is as follows.
（第７図参照）
まず、ｐＳＶβを制限酵素）１ ｉ ｎｄＩＩＩで切断
後ＢＡＰ （前述）処理により末端のリンを除いた。(See Figure 7) First, pSVβ was cut with restriction enzymes) 1<i>ndIII and then treated with BAP (described above) to remove terminal phosphorus.
次に、ＭＭＴＶプロモータを含むベクターｐＭＴＶｄｈ
ｆｒ（前述）を制限酵素）−１ｉ ｎｄｌｌで切断する
ことによりＭＭＴＶプロモータを含む１゜４ＫｂのＤＮ
Ａ断片を分離した。Next, the vector pMTVdh containing the MMTV promoter
A 1°4 Kb DNA containing the MMTV promoter was obtained by cleaving fr (described above) with restriction enzyme)-1i ndll.
Fragment A was isolated.
上記２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合する
ことによりベクターｐＭＴＶ （ＳＶ）βを得た。Vector pMTV (SV)β was obtained by ligating the above two DNA fragments using T4 DNA ligase.
実施例８
ヒトインターフェロンβ発現ベクターｐＭＴＶ （ＳＶ
、ｒ）βの作製：
ｐＭＴＶ （ＳＶ、ｒ）βは実施例２のｐＳＶ（ｒ）β
のＳＶ４０初期プロモータとヒトインターフェロンβ遺
伝子の間にＭＭＴＶプロモータ（前述）を導入したベク
ターである。このベクターでは、ヒトインターフェロン
β遺伝子はＳＶ４０初期プロモータとＭＭＴＶプロモー
タの支配下に置かれる。作製方法は以下の通りでおる。Example 8 Human interferon β expression vector pMTV (SV
, r) Production of β: pMTV (SV, r) β is pSV(r) β of Example 2
This is a vector in which the MMTV promoter (described above) is introduced between the SV40 early promoter and the human interferon β gene. In this vector, the human interferon beta gene is placed under the control of the SV40 early promoter and the MMTV promoter. The manufacturing method is as follows.
（第８図参照）
まず、ｐｓＶ（ｒ）βを制限酵素Ｈｉ ｎｄＩ［ＩＴ切
断後ＳＡＰ （前述）処理により末端のリンを除いた。(See Figure 8) First, psV(r)β was digested with the restriction enzyme HindI [IT and then treated with SAP (described above) to remove terminal phosphorus.
次に、ＭＭＴＶプロモータを含むベクターｐＭＴＶｄｈ
ｆｒ（前述）を制限酵素）１ｉｎｄＩＩｌで切断するこ
とによりＭＭＴＶプロモータを含む１゜４ＫｂのＤＮＡ
断片を分離した。Next, the vector pMTVdh containing the MMTV promoter
A 1°4 Kb DNA containing the MMTV promoter was obtained by cutting fr (described above) with the restriction enzyme) 1indIIl.
The fragments were separated.
上記２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合する
ことによりベクターｐＭＴＶ （ＳＶ、ｒ）βを得た。Vector pMTV (SV, r)β was obtained by ligating the above two DNA fragments using T4 DNA ligase.
実施例９
ヒトインターフェロンβ発現ベクターｐＭＴＶ （Ｈａ
、ｒ）βの作製：
ｐｒｒｖ （Ｈａ、ｒ）βは、実施例５のｐＭＴＶ （
ｒ）βのＭＭＴＶプロモータの上流にＨａエンハンサ−
を導入したベクターである。作製方法は以下の通りであ
る。（第９図参照）
まず、実施例６のｐＭＴＶ （１−！ａ）βを制限酵素
３ａｍＨＩとｔ−１ｉ ｎｄＩ［Ｉで切断して、長鎖断
片を分離してからＳＡＰ （前述）処理により末端のリ
ンを除いた。Example 9 Human interferon β expression vector pMTV (Ha
, r) β Preparation: prrv (Ha, r) β is pMTV (
r) Ha enhancer upstream of β MMTV promoter
This is a vector that introduces The manufacturing method is as follows. (See Figure 9) First, pMTV(1-!a)β of Example 6 was cut with restriction enzymes 3amHI and t-1indI[I, long chain fragments were separated, and then treated with SAP (described above). The terminal phosphorus was removed.
次に、ｐＭＴＶ（ｒ）βをＢａｍＨＩとＨｉｎｄｌＩＩ
で切断して、短鎖断片を分離した。Next, pMTV(r)β was isolated with BamHI and HindlII.
to separate short chain fragments.
上記２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合する
ことによりｐＭＴＶ （Ｈａ、ｒ）βを得た。pMTV (Ha, r)β was obtained by ligating the above two DNA fragments with T4 DNA ligase.
実施例１０
ヒトインターフェロンβ発現ベクターｐＭＴＶ （Ｈａ
、ＳＶ、ｒ）βの作製：
ｐＭＴＶ （Ｈａ、ＳＶ、ｒ）βは、実施例３のｐＳＶ
（Ｈａ、ｒ）βのＳＶ４０初期プローＥ−夕とヒトイ
ンターフェロンβ遺伝子の間にＭＭＴＶプロモータを導
入したベクターである。作製方法は以下の通りである。Example 10 Human interferon β expression vector pMTV (Ha
, SV, r) β: pMTV (Ha, SV, r) β is pSV of Example 3
(Ha, r) This is a vector in which an MMTV promoter is introduced between the SV40 early promoter of β and the human interferon β gene. The manufacturing method is as follows.
（第１０図参照）まず、ｐｓｖ （Ｈａ、ｒ）βを制限
酵素ＨｉｎｄＩで切断してからＢＡＰ（前述）処理によ
り末端のリンを除いた。(See Figure 10) First, psv(Ha,r)β was cut with the restriction enzyme HindI, and then terminal phosphorus was removed by BAP treatment (described above).
次にＭＭＴＶプロモータを持つベクターｐＭＴＶｄｈｆ
ｒ（前述）をＨｉ ｎｄｌｌで切断し、ＭＭＴＶプロモ
ータを含む１．４ＫｂのＤＮＡ断片を分離した。Next, vector pMTVdhf with MMTV promoter
r (described above) was digested with Hindll to isolate a 1.4 Kb DNA fragment containing the MMTV promoter.
上記２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合する
ことによりｐＭＴＶ （Ｈａ、ＳＶ、ｒ）βを得た。pMTV (Ha, SV, r)β was obtained by ligating the above two DNA fragments with T4 DNA ligase.
実施例１１
ヒトインターフェロンβ発現ベクターｐＢＰＶ９７ＳＶ
（ｒ）Ｂ（Ｄ作製：
１ＰＶ９７ｓＶ （ｒ）βは、実施例２のｐｓＶ（ｒ）
βよりヒトインターフェロンβ遺伝子の動物細胞での発
現に必要な制限酵素ＡＣＣＩＩ切断断片（２Ｋｂ＞をＢ
ＰＶｌ （牛パピローマウィルス１型）仝ゲノムを含む
ベクターｐｄＢＰＶ１ （１４２−６） （Ｐ、 Ｍ、
Ｈｏｗｌｙ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、ＵＳＡ、 ７９．７１４７．１９８２）のｐ
ｖｕ［サイトに挿入したベクターである。作製方法は以
下の通りである。Example 11 Human interferon β expression vector pBPV97SV
(r)B(D production: 1PV97sV (r)β is psV(r) of Example 2
A restriction enzyme ACCII cleavage fragment (2Kb>) necessary for the expression of the human interferon β gene in animal cells is
Vector pdBPV1 (142-6) containing the PVl (bovine papillomavirus type 1) genome (P, M,
Howly, Proc, Natl, Acad,
Sci, USA, 79.7147.1982) p.
vu [This is the vector inserted into the site. The manufacturing method is as follows.
（第１１図参照）
まず、ｐｓＶ （ｒ）βをＡＣＣＩＩで切断しヒトイン
ターフェロンβ遺伝子を含む２ＫｂのＤＮＡ断片を分離
した。(See Figure 11) First, psV(r)β was cut with ACCII to isolate a 2 Kb DNA fragment containing the human interferon β gene.
次に、ｐｄＢＰＶｌ （１４２−６＞をＰｖｕＩＩで切
断し１０ＫｂのＤＮＡ断片を分離してから、ＢＡＰ処理
により末端のリンを除いた。Next, pdBPVl (142-6> was cut with PvuII to separate a 10 Kb DNA fragment, and then terminal phosphorus was removed by BAP treatment.
これら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合す
ることによりｐＢＰＶ９７ＳＶ （ｒ）βを作製した。pBPV97SV (r)β was created by ligating these two DNA fragments with T4 DNA ligase.
実施例１２
ヒトインターフェロンβ発現ベクターｐＤＨ（ｒ）βの
作製：
ｐＤＨ（ｒ）βは、実施例５のｐＭＴＶ（ｒ）βのＭ
Ｍ Ｔ Ｖプロモータをショウジヨウバエ熱ショック蛋
白プロモータに置き換えたベクターである。作製方法は
以下の通りである。（第１２図参照）
まず、ｐＭＴＶ （ｒ）βをｌ−１ｉｎｄｌｌｌで切断
してＭＭＴＶプロモータをのぞいてからＤＮＡポリメラ
ーゼＩ）（Ｉｅｎｏｗ断片処理により平滑末端化した。Example 12 Preparation of human interferon β expression vector pDH(r)β: pDH(r)β is the M of pMTV(r)β of Example 5.
This is a vector in which the MTV promoter is replaced with the Drosophila heat shock protein promoter. The manufacturing method is as follows. (See Figure 12) First, pMTV(r)β was cut with l-1indllll to remove the MMTV promoter, and then blunt-ended by DNA polymerase I (Ienow fragment treatment).
このあとＢＡＰ処理により末端のリンを除いた。Thereafter, terminal phosphorus was removed by BAP treatment.
次に、ショウジヨウバエ熱ショック蛋白プロモータを含
むベクターｐＳＰ６Ｈ３９のＰＳｔＩサイトをＨｉ ｎ
ｄＩＩＩリンカ−を用いてｌ−１ｉ ｎｄｌ［サイトに
置き換えたあと、ｌ−１ｉ ｎｄＩＩｌで切断してプロ
モータを含む０．９ＫｂのＤＮＡ断片を分離した（ｐｓ
Ｐ６Ｈ３９はｐ２３２ 、３ （Ｒ，Ｈｏｌｍｑｒｅｎ
ｅｔ ａｌ、 Ｃｅ１ｌ、 １Ｂ、 １３５９．１９７
９）のショウジヨウバエ熱ショック蛋白プロモータ断片
ＨｉｎｄｌＩＩ／ＰｓｔＩ０．９ＫｂをｐｓＰ６５ （
Ｐｒｏｍｅｇａ ３ｉ０ｔｅＣｈ社）に組み込んだベ
クターである）。Next, the PStI site of vector pSP6H39 containing the Drosophila heat shock protein promoter was
After replacing the l-1i ndl site with a dIII linker, a 0.9 Kb DNA fragment containing the promoter was isolated by cutting with l-1i ndl (ps
P6H39 is p232,3 (R, Holmqren
et al, Ce1l, 1B, 1359.197
9) was converted into psP65 (
This is a vector integrated into Promega 3i0teCh).
上記２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合する
ことによりベクターｐＤＨ（ｒ）βを得た。Vector pDH(r)β was obtained by ligating the above two DNA fragments using T4 DNA ligase.
実施例１３
ヒトインターフェロンβ発現ベクターｐＢＰＶＭＴＶ
（Ｈａ）βの作製：
ｐＢＰＶＭＴＶ （Ｈａ）βは実施例６のｐＭＴＶ（Ｈ
ａ）βとＢＰＶｌ全ゲノム（１００％）を結合したベク
ターである。作製方法は以下の通りである。（第１３図
参照）
まず、ｐＭＴＶ （Ｈａ）βをＳＶ４０ポリＡシグナル
の後ろにあるＢａｍＨＩサイトで切断後ＢＡＰ処理によ
り末端のリンを除いた。Example 13 Human interferon β expression vector pBPVMTV
Preparation of (Ha)β: pBPVMTV (Ha)β was prepared from pMTV(H
a) A vector combining β and BPVl whole genome (100%). The manufacturing method is as follows. (See Figure 13) First, pMTV (Ha)β was cut at the BamHI site behind the SV40 polyA signal, and the terminal phosphorus was removed by BAP treatment.
次に、ｐｄＢＰＶｌ （前述）をＢａｍＨＩで切断して
ＢＰＶＩ全ゲノムからなる８、ＯＫｂのＤＮＡ断片を分
離した。Next, pdBPVl (described above) was cut with BamHI to isolate an 8, OKb DNA fragment consisting of the entire BPVI genome.
これら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
結合することによりｐＢＰＶ １００ＭＴＶ（Ｈａ）β
を得た。By ligating these two DNA fragments using T4 DNA ligase, pBPV 100MTV(Ha)β
I got it.
実施例１４
ヒトインターフェロンβ発現ベクターｐＢＰＶ９７ＭＴ
Ｖ （Ｈａ）βの作製：
ｐＢＰＶ９７ＭＴＶ （Ｈａ）βは実施例６のｐＭＴＶ
（Ｈａ）βよりヒトインターフェロンβ遺伝子の動物
細胞での発現に必要な制限酵素ＡＣＣＩＩ切断断片（３
，１Ｋｂ＞をｐｄＢＰＶｌ （１４２−６＞（前）ホ）
のＰｖｕ［サイトに挿入したベクターである。作製方法
は以下の通りである。（第１４図参照）
まず、ｐＭＴＶ （Ｈａ）βをＡＣＣ■で切断しヒトイ
ンターフェロンβ遺伝子を含む３．１ＫｂのＤＮＡ断片
を分離した。Example 14 Human interferon β expression vector pBPV97MT
Preparation of V (Ha)β: pBPV97MTV (Ha)β is pMTV of Example 6
(Ha)β is a restriction enzyme ACCII cleavage fragment (3
, 1Kb> pdBPVl (142-6> (front) e)
This is the vector inserted into the Pvu site. The manufacturing method is as follows. (See Figure 14) First, pMTV(Ha)β was cut with ACC■ to isolate a 3.1 Kb DNA fragment containing the human interferon β gene.
次に、ｐｄＢＰＶｌ （１４２−６）をＰｖｕ■で切断
し１０ＫｂのＤＮＡ断片を分離したあとＳＡＰ処理によ
り末端のリンを除いた。Next, pdBPVl (142-6) was cut with Pvu■ to separate a 10 Kb DNA fragment, and the terminal phosphorus was removed by SAP treatment.
これら２つのＤＮＡ断片を７４ＤＮＡリガーゼで結合す
ることによりｐＢＰＶ９７ＭＴＶ （ｔ−１ａ）βを作
製した。These two DNA fragments were ligated with 74 DNA ligase to create pBPV97MTV (t-1a)β.
実施例１５
ヒトインターフェロンγ発現ベクターｐＭＴＶγの作製
：
ｐＭＴＶγは、ヒトインターフェロンγ遺伝子をＭＭＴ
Ｖプロモータの支配下に置いたベクターである。作製方
法は以下の通りである。（第１５図参照）
まず、実施例６のｐＭＴＶβをＭＭＴＶプロモータ下流
にあるＨ ｉ ｎｄｌ［Ｉサイトとヒトインターフェロ
ン遺伝子の下流に必るＢｑｌＩＩサイトで切断後、ＤＮ
ＡポリメラーゼＩｌｅｎｏｗ断片処理で平滑末端化して
から、ＭＭＴＶプロモータを含む３．９ＫｂのＤＮＡ断
片を分離した。Example 15 Preparation of human interferon γ expression vector pMTVγ: pMTVγ is a human interferon γ gene expressed in MMT.
This is a vector placed under the control of the V promoter. The manufacturing method is as follows. (See Figure 15) First, pMTVβ of Example 6 was cut at the H indl[I site downstream of the MMTV promoter and the BqlII site downstream of the human interferon gene, and then DN
After blunt-ending with A polymerase Ilenow fragment treatment, a 3.9 Kb DNA fragment containing the MMTV promoter was isolated.
このＤＮＡ断片とｐＳＶＩ ＦＮγ（特開昭６１−５２
２８６＞をｏｐｎｒ切断して得られるヒトインターフェ
ロンγ遺伝子を含む０．８ＫｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて結合することによりｐＭＴＶγを得
た。This DNA fragment and pSVI FNγ (Japanese Unexamined Patent Publication No. 61-52
A 0.8 Kb DNA fragment containing the human interferon γ gene obtained by opnr cleavage of
pMTVγ was obtained by ligation using A ligase.
実施例１６
ヒトインターフエロンγ発現ベクター１）ＭＴＶ （Ｓ
Ｖ）γの作製：
ｐＭＴＶ （ＳＶ）γは、実施例１５のｐＭＴＶγのＭ
ＭＴＶプロモータの上流にＳＶ４０初期プロモータを導
入したベクターである。作製方法は以下の通りである。Example 16 Human interferon γ expression vector 1) MTV (S
V) Preparation of γ: pMTV(SV)γ is the M of pMTVγ of Example 15.
This is a vector in which the SV40 early promoter is introduced upstream of the MTV promoter. The manufacturing method is as follows.
（第１６図参照）
まず、ｐＭＴＶ７”をＳａ Ｉ Ｉで切断後ＤＮＡポリ
メラーゼＩＫ Ｉ ｅｎＯＷ断片処理により平滑末端化
してからＢＡＰ処理により末端のリンを除いた。(See Figure 16) First, pMTV7'' was cut with Sa II, blunt-ended by DNA polymerase IK I enOW fragment treatment, and then terminal phosphorus was removed by BAP treatment.
次に、ｐＳＶ２ＩＦＮβ（特願 昭５９−１６９３８８
）をＰｖｕ■とＨｉｎｄＩ［Ｉで切断しＳＶ４０初期プ
ロモータを含む０．３ＫｂのＤＮＡ断片を分離してから
、ＤＮＡポリメラーゼＩＫｌｅｎｏｗ断片処理により平
滑末端化した。Next, pSV2IFNβ (patent application 1987-169388)
) was cut with Pvu■ and HindI[I to isolate a 0.3 Kb DNA fragment containing the SV40 early promoter, which was then blunt-ended by DNA polymerase IKlenow fragment treatment.
これら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
結合することによりｐＭＴＶ （ＳＶ）γを１ｑだ。By ligating these two DNA fragments using T4 DNA ligase, pMTV(SV)γ was obtained at 1q.
実施例１７ ｐＳＶβによるＰＣ１２の形質転換： 実施例１のｐＳｖβ２μ３とｐＳＶ２ｎｅ。Example 17 Transformation of PC12 with pSVβ: pSvβ2μ3 and pSV2ne from Example 1.
（前述）０．２μ９とをリン酸カルシウム法（前述）に
て約１０６個のＰＣ１２細胞に導入した。(described above) was introduced into approximately 106 PC12 cells using the calcium phosphate method (described above).
蛋白合成阻害剤Ｇ４１８ （０１８００社）を４００μ
ｇ／ｄの濃度で含む選択培地（牛胎児血清１０％とカナ
マイシン１００μ９／ｄを含むＲＰＭ１１６４０培地（
白水製薬））にて培養したところ、２０個の形質転換株
を得た。400μ of protein synthesis inhibitor G418 (01800 Company)
Selective medium (RPM11640 medium containing 10% fetal bovine serum and kanamycin 100μ9/d) at a concentration of g/d
When cultured at Hakusui Seiyaku), 20 transformed strains were obtained.
培養上清の抗ウィルス活性（即ちヒトインター７エ０ン
β活性）を３． Ｒｕｂ ｉ ｎ５ｔｅ ｉ ｎらの方
法（Ｊ、 Ｖｉｒｏｌｏａｙ、 ３７．７５５．１９８
１）に基ずき、ヒトＦＬ細胞とｖＳｖを用いたＣＰＥ阻
止法で測定したところ１２個に１００〜９００単位／ｄ
の活性が認められた。（第１７図参照）
実施例１８
ｐＳＶ （ｒ）βによるＰＣ１２の形質転換：実施例２
のｐＳＶ（ｒ）β２μ９とｐｓＶ２ｎｅｏ（前述）０．
２μ３とをリン酸カルシウム法（前述）にて約１０６９
］のＰＣ１２細胞に導入した。蛋白合成阻害剤Ｇ４１８
（０１８００社）を４００μｇ／ｄの濃度で含む選択
培地（牛胎児血清１０％とカナマイシン１００μ９／ｒ
ｎｌｌを含むＲＰＭ１１６４０培地（白水製薬））にて
培養したところ、１２個の形質転換株を得た。3. Antiviral activity (i.e., human inter7ene β activity) of the culture supernatant. The method of Rubin5tein et al. (J, Viroloay, 37.755.198
Based on 1), when measured by CPE inhibition method using human FL cells and vSv, 12 cells contained 100 to 900 units/d.
activity was observed. (See Figure 17) Example 18 Transformation of PC12 with pSV (r)β: Example 2
pSV(r)β2μ9 and psV2neo (described above) 0.
2μ3 and about 1069 using the calcium phosphate method (described above).
] was introduced into PC12 cells. Protein synthesis inhibitor G418
(Company 01800) at a concentration of 400 μg/d (fetal bovine serum 10% and kanamycin 100 μg/d).
When cultured in RPM11640 medium (Hakusui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing nll, 12 transformed strains were obtained.
培養上清の抗ウィルス活性（即ちヒトインター７エ０ン
β活性）を３．Ｒｕｂ ｉ ｎ５ｔｅ ｉ ｎらの方法
（前述）に基ずき、ヒトＦＬ細胞とｖＳｖを用いたＣＰ
Ｅ阻止法で測定したところ５個に１５０〜１８００単位
／ｄの活性が認められた。3. Antiviral activity (i.e., human inter7ene β activity) of the culture supernatant. CP using human FL cells and vSv based on the method of Rubinstein et al. (described above).
When measured by the E inhibition method, five of them were found to have an activity of 150 to 1800 units/d.
（第１７図参照）
実施例１９
Ｅ）ＳＶ （Ｈａ、ｒ）ＢによるＰＣｌ２の形質転換：
実施例３のｐｓｖ （Ｈａ、ｒ）β２μ９とｐ３ｙ２ｎ
ｅｏ （前述）０．２μびとをリン酸カルシウム法（前
述）にて約１０６個のＰＣＩ２細胞に導入した。蛋白合
成阻害剤０４１８ （０１８００社）を４００μｇ／ｒ
Ｉ１１の濃度で含む選択培地（牛胎児血清１０％とカナ
マイシン１００μｇ／ｒｄを含むＲＰＭ１１６４０培地
（日永製薬））にて培養したところ、１９個の形質転換
株を得た。 培養上清の抗ウィルス活性（即ちヒトイン
ターフェロンβ活性）を３． Ｒｕｂ ｉ ｎ５ｔｅ
ｉ ｎらの方法（前述）に基ずき、ヒトＦＬ細胞とＶＳ
Ｖを用いたＣＰＥ阻止法で測定したところ８個に１００
〜４９００単位／ｄの活性が認められた。（第１７図参
照）
実施例２０
ｐＭＴＶβによるＰＣｌ ２の形質転換：実施例４のｐ
ＭＴＶβ２μ３とＤＳＶ２ｎｅＯ（前述）０．２μ９と
をリン酸カルシウム法（前述）にて約１０６個のＰＣｌ
２細胞に導入した。(See Figure 17) Example 19 E) Transformation of PCl2 with SV (Ha,r)B: psv (Ha,r)β2μ9 and p3y2n of Example 3
eo (described above) 0.2μ cells were introduced into approximately 106 PCI2 cells by the calcium phosphate method (described above). 400 μg/r of protein synthesis inhibitor 0418 (01800 company)
When cultured in a selective medium containing a concentration of I11 (RPM11640 medium containing 10% fetal bovine serum and 100 μg/rd kanamycin (Hinaga Pharmaceutical Co., Ltd.)), 19 transformed strains were obtained. 3. Antiviral activity (i.e. human interferon β activity) of the culture supernatant. Rub in5te
Based on the method of i n et al. (described above), human FL cells and VS
When measured by CPE inhibition method using V, 100 in 8 pieces
An activity of ~4900 units/d was observed. (See Figure 17) Example 20 Transformation of PCl2 with pMTVβ: p of Example 4
MTVβ2μ3 and DSV2neO (described above) 0.2μ9 were combined with approximately 106 PCl using the calcium phosphate method (described above).
2 cells.
蛋白合成阻害剤Ｇ４１Ｂ （０１８００社）を４００μ
ｇ／ｍの濃度で含む選択培地（牛胎児血清１０％とカナ
マイシン１００μｇ／−を含むＲＰＭ１１６４０培地（
日永製薬））にて培養したところ、１８個の形質転換株
を得た。400μ of protein synthesis inhibitor G41B (01800 company)
Selective medium (RPM11640 medium containing 10% fetal bovine serum and 100 μg/- of kanamycin (
When cultured at Hinaga Pharmaceutical), 18 transformed strains were obtained.
培養上清の抗ウィルス活性（即ちヒトインター７エ０ン
β活性）をＳ、Ｒｕｂ ｉ ｎ５ｔｅ ｉ ｎらの方法
（前述）に基ずき、ヒトＦＬ［Ｉ胞とＶＳＶを用いたＣ
ＰＥ阻止法で測定したところ７個に１００〜４３００単
位／ｄの活性が認められた。The antiviral activity (i.e., human inter7ene β activity) of the culture supernatant was determined based on the method of S. Rubin5tein et al. (described above).
When measured by the PE inhibition method, seven of them were found to have an activity of 100 to 4,300 units/d.
（第１７図参照）
実施例２１
ｐＭＴＶ（ｒ）βによるＰＣｌ２の形質転換：
実施例５のｐＭＴＶ（ｒ）β２μ７とｐＳＶ２ｎｅｏ
（前述）０．２μ９どをリン酸カルシウム法（前述）に
て約１０７個のＰＣ８細胞に導入した。蛋白合成阻害剤
Ｇ４１８ （０１８００社）を４００μｇ／ｄの濃度で
含む選択培地（牛胎児血清１０％とカナマイシン１１０
０ｔｉ／ｄを含むＲＰＭ１１６４０培地（日永製薬））
にて培養したところ、２４個の形質転換株を得た。(See Figure 17) Example 21 Transformation of PCl2 with pMTV(r)β: pMTV(r)β2μ7 of Example 5 and pSV2neo
(described above) 0.2μ9 was introduced into approximately 107 PC8 cells by the calcium phosphate method (described above). Selective medium containing protein synthesis inhibitor G418 (01800) at a concentration of 400 μg/d (10% fetal bovine serum and kanamycin 110
RPM11640 medium containing 0ti/d (Hinaga Pharmaceutical))
24 transformed strains were obtained.
培養上清の抗ウィルス活性（即ちヒトインターフェロン
β活性）を、Ｓ、Ｒｕｂ ｉ ｎ５ｔｅ ｉ ｎらの方
法（前述）に基ずきヒトＦＬ細胞とＶＳｖを用いたＣＰ
Ｅ阻止法で測定したところ、１９個に１００〜５５００
単位／ｒＩＪｌの活性が認められた。The antiviral activity (i.e., human interferon β activity) of the culture supernatant was determined by CP using human FL cells and VSv based on the method of S. Rubinstein et al. (described above).
When measured by E inhibition method, 19 pieces had 100 to 5500
An activity of units/rIJl was observed.
（第１７図参照）
実施例２２
ｐＭＴＶ （Ｈａ）βによるＰＣｌ２の形質転換：
実施例６（ｉ’）ｐＭＴＶ （Ｈａ）β２μ９とｐＳＶ
２ｎｅｏ （前述）０．２μ９とをリン酸カルシウム法
（前述）にて約１０６個のＰＣ１２細胞に導入した。蛋
白合成阻害剤Ｇ４１８ （０１８００社）を４００μｇ
／ｄの濃度で含む選択培地（牛胎児血清１０％とカナマ
イシン１００μ９／ｄを含むＲＰＭＩ １６４０培地（
日永１ａｌ））にて培養シたところ、２０個の形質転換
株を１ｑた。(See Figure 17) Example 22 Transformation of PCl2 with pMTV (Ha)β: Example 6 (i') pMTV (Ha)β2μ9 and pSV
2neo (described above) and 0.2μ9 were introduced into approximately 106 PC12 cells using the calcium phosphate method (described above). 400μg of protein synthesis inhibitor G418 (01800 company)
Selective medium (RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum and kanamycin 100μ9/d) containing at a concentration of /d
When cultured at Hinaga 1al), 20 transformed strains were obtained (1q).
培養上清の抗ウィルス活性（即ちヒトインターフェロン
β活性）を３． Ｒｕｂ ｉ ｎ５ｔｅ ｉ ｒｌらの
方法（前述）に基ずき、ヒトＦＬ細胞とＶＳＶを用いた
ＣＰＥ阻止法で測定したところ１２個に１００〜２８０
０単位／ｄの活性が認められた。3. Antiviral activity (i.e. human interferon β activity) of the culture supernatant. Based on the method of Rubin5teirl et al. (described above), 12 cells had 100-280
An activity of 0 units/d was observed.
（第１７図参照）
実施例２３
ｐＭＴＶ （ＳＶ）βによるＰＣｌ２の形質転換：
実施例７（７）ｐＭＴＶ （ＳＶ）β２μ９と１）ＳＶ
２ｎｅＯ（前述）０．２μ９とをリン酸カルシウム法（
前述）にて約１０６個のＰＣ１２細胞に導入した。蛋白
合成阻害剤Ｇ４１８ （０１８００社）を４００μ９／
ｄの濃度で含む選択培地（牛胎児血清１０％とカナマイ
シン１００μ９．／−を含むＲＰＭ１１６４０培地（日
永製薬））にて培養したところ、２１個の形質転換株を
１ｑだ。(See Figure 17) Example 23 Transformation of PCl2 with pMTV (SV)β: Example 7 (7) pMTV (SV)β2μ9 and 1) SV
2neO (described above) and 0.2μ9 using the calcium phosphate method (
(described above) into approximately 106 PC12 cells. Protein synthesis inhibitor G418 (Company 01800) at 400μ9/
When cultured in a selective medium (RPM11640 medium containing 10% fetal bovine serum and 100μ9./- of kanamycin (Hinaga Pharmaceutical Co., Ltd.)) containing a concentration of d, 21 transformed strains were found to be 1q.
培養上清の抗ウィルス活性（即ちヒトインター７ｘＯン
β活性）を、３．Ｒｕｂ ｉ ｎ５ｔｅ ｉ ｎ４０方
法（前述）に基ずきヒトＦＬ細胞とｖＳｖを用いたＣＰ
Ｅ阻止法で測定したところ、１０９に１００〜５６００
単位／ｄの活性が認められた。The antiviral activity (i.e., human inter-7xOon β activity) of the culture supernatant was determined by 3. CP using human FL cells and vSv based on the Rubin5tein40 method (described above).
When measured by E inhibition method, 109 to 100 to 5600
An activity of units/d was observed.
（第１７図参照）
実施例２４
ｐｖＴｖ （ｓｖ、ｒ）βによるＰＣ１２の形質転換：
実施例８のｌ）ＭＴＶ （ＳＶ、ｒ）β２μ９とｐＳＶ
２ｎｅＯ（前述）０．２μ９とをリン酸カルシウム法（
前述）にて約１０６個のＰＣ１２細胞に導入した。蛋白
合成阻害剤０４１８ （ＧＩＢＣＯ社）を４００μｇ／
ｄの′ａ度で含む選択培地（牛胎児血清１０％とカナマ
イシン１００μｇ／威を含むＲＰＭ１１６４０培地（田
水製薬））にて培養したところ、２２個の形質転換株を
得た。(See Figure 17) Example 24 Transformation of PC12 with pvTv (sv, r)β: Example 8 l) MTV (SV, r)β2μ9 and pSV
2neO (described above) and 0.2μ9 using the calcium phosphate method (
(described above) into approximately 106 PC12 cells. 400μg/protein synthesis inhibitor 0418 (GIBCO)
When cultured in a selective medium (RPM11640 medium (Tamizu Seiyaku) containing 10% fetal bovine serum and 100 μg of kanamycin (Tamizu Pharmaceutical Co., Ltd.)) containing 10% of fetal bovine serum and 100 μg of kanamycin, 22 transformed strains were obtained.
培養上清の抗ウィルス活性（即ちヒトインターフェロン
β活性）をＳ、Ｒｕｂ ｉ ｎ５ｔｅ ｉ ｎらの方法
（前述）に基ずき、ヒトＦＬ細胞とｖＳＶを用いたＣＰ
Ｅ阻止法で測定したところ２０ｉに８００〜４８０００
単位／ｒＩｉｌの活性が認められた。The antiviral activity (i.e., human interferon β activity) of the culture supernatant was determined by CP using human FL cells and vSV based on the method of Rubinstein et al. (described above).
800 to 48,000 in 20i when measured by E inhibition method
An activity of 1/rIil was observed.
（第１７図参照）
実施例２５
ｐＭＴＶ （Ｈａ、ｒ）βによるＰＣ１２の形質転換：
実施例９のｐＭＴＶ （Ｈａ、ｒ）β２μ９とｐＳＶ２
ｎｅＯ（前述）０．２μ３とをリン酸カルシウム法（前
述）にて約１０６ＩｉｌのＰＣ１２細胞に導入した。蛋
白合成阻害剤Ｇ４１８ （ＧＩＢＣＯ社）を４００μｇ
／ｍの濃度で含む選択培地（牛胎児血清１０％とカナマ
イシン１００μ３／ｄを含むＲＰＭＩ培地（田水製薬）
）にて培養したところ、２４個の形質転換体を得た。(See Figure 17) Example 25 Transformation of PC12 with pMTV (Ha, r)β: pMTV (Ha, r)β2μ9 of Example 9 and pSV2
0.2μ3 of neO (described above) was introduced into approximately 106 Iil of PC12 cells by the calcium phosphate method (described above). 400 μg of protein synthesis inhibitor G418 (GIBCO)
/m selective medium (RPMI medium containing 10% fetal bovine serum and 100μ3/d of kanamycin (Tamizu Pharmaceutical))
), 24 transformants were obtained.
培養上清の抗ウィルス活性（即ちヒトインターフェロン
β活性）をＳ、Ｒｕｂｉ ｎ５ｔｅ ｉ ｎらの方法（
前述）に基ずき、ヒトＦＬ細胞とｖＳｖを用いたＣＰＥ
阻止法で測定したところ。２０個に１００〜３０３００
単位／ｄの活性が認められた。（第１７図参照）
実施例２６
ｐＭＴＶ （Ｈａ、ＳＶ、ｒ）βによるＰＣ１２の形質
転換：
実施例１０のりＭＴＶ （Ｈａ、ＳＶ、ｒ＞β２μ９と
ｐＳＶ２ｎｅｏ （前述＞０．２μ９とをリン酸カルシ
ウム法（前述）にて約１０６個のＰＣ１２細胞に導入し
た。蛋白合成阻害剤０４１８（ＧＩ ８００社）を４０
０μ９／ｍ１の濃度で含む選択培地（牛胎児血清１０％
とカナマイシン１００μ！？／ｄを含むＲＰＭ１１６４
０培地（田水製薬））にて培養したところ、２２個の形
質転換株を得た。The antiviral activity (i.e., human interferon β activity) of the culture supernatant was determined by the method of S. Rubinstein et al.
Based on the above), CPE using human FL cells and vSv
Measured using the inhibition method. 100~30300 for 20 pieces
An activity of units/d was observed. (See Figure 17) Example 26 Transformation of PC12 with pMTV (Ha, SV, r)β: Example 10 Transformation of MTV (Ha, SV, r>β2μ9 and pSV2neo (previously described >0.2μ9) by the calcium phosphate method ( The protein synthesis inhibitor 0418 (GI 800) was introduced into approximately 106 PC12 cells using the method described above.
Selective medium containing 10% fetal bovine serum at a concentration of 0μ9/ml
And kanamycin 100μ! ? RPM1164 including /d
0 medium (Tamizu Pharmaceutical Co., Ltd.)), 22 transformed strains were obtained.
培養上清の抗ウィルス活性（即ちヒトインターフェロン
β活性）をＳ、Ｒｕｂ ｉ ｎ５ｔｅ ｉ ｎらの方法
（前述）に基ずき、ヒトＦＬ細胞とＶＳｖを用いたＣＰ
Ｅ阻止法で測定したところ１０個に３００〜１０３００
単位／ｍｌの活性が認められた。The antiviral activity (i.e., human interferon β activity) of the culture supernatant was determined by CP using human FL cells and VSv based on the method of Rubinstein et al. (described above).
When measured by E inhibition method, 10 pieces had 300 to 10,300
Units/ml of activity was observed.
（第１７図参照）
実施例２７
ｐＭＴＶ （Ｈａ、ＳＶ、ｒ）βによるＰＣＢの形質転
換：
実施例１０のｐＭＴＶ （Ｈａ、ＳＶ、ｒ）β２μ９と
ｐＳＶ２ｎｅｏ （前述）０．２μ９とをリン酸カルシ
ウム法（前述）にて約１０７個のＰＣＢ細胞に導入した
。蛋白合成阻害剤Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ社）を４００μ
び／戒の６度で含む選択培地（牛胎児血清１０％とカナ
マイシン１００μｇ／ｍを含むＲＰＭ１１６４０培地（
田水製薬））にて培養したところ、２７個の形質転換株
を）ｑた。(See Figure 17) Example 27 Transformation of PCB with pMTV (Ha, SV, r)β: pMTV (Ha, SV, r)β2μ9 of Example 10 and pSV2neo (described above) 0.2μ9 were transformed by the calcium phosphate method ( (described above) into approximately 107 PCB cells. 400μ of protein synthesis inhibitor G418 (GIBCO)
Selective medium (RPM11640 medium containing 10% fetal bovine serum and 100 μg/m kanamycin (
When the cells were cultured at Tasui Pharmaceutical Co., Ltd., 27 transformed strains were obtained.
培養上清の抗ウィルス活性（即ちヒトインターフェロン
β活性）をＳ、Ｒｕｂ ｉ ｎ５ｔｅ ｉ ｒｌらの方
法（前述）に基ずき、ヒトＦＬ細胞とＶＳＶを用いたＣ
ＰＥ阻止法で測定したところ１８個に１５０〜２５５０
０単位／ｄの活性が認められた。The antiviral activity (i.e., human interferon β activity) of the culture supernatant was determined using human FL cells and VSV based on the method of Rubin5teirl et al. (described above).
When measured by PE inhibition method, 18 pieces had 150 to 2550
An activity of 0 units/d was observed.
（第１７図参照）
実施例２８
ｐＤＨ（ｒ）βによるＰＣ１２の形質転換：実施例１１
のｐＤＨ（ｒ）８２１１９とｐＳＶ２ｎｅｏ （＠述）
０．２μ９とをリン酸カルシウム法（前述）にて約１０
６（ＩＮのＰＣ１２細胞に導入した。蛋白合成阻害剤Ｇ
４１８ （ＧＩＢＣＯ社）を４００μ！？／ｄの濃度で
含む選択培地（牛脂児血清１０％とカナマイシン１００
μ９／ｄを含むＲＰＭ１１６４０培地（白水製薬））に
て培養したところ、２４個の形質転換株を得た。(See Figure 17) Example 28 Transformation of PC12 with pDH(r)β: Example 11
pDH(r)82119 and pSV2neo (@mentioned)
0.2 μ9 and about 10 by the calcium phosphate method (described above).
6 (transfected into IN PC12 cells. Protein synthesis inhibitor G
418 (GIBCO) 400μ! ? Selective medium containing 10% beef tallow serum and 100% kanamycin at a concentration of /d
When cultured in RPM11640 medium (Hakusui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing μ9/d, 24 transformed strains were obtained.
培養上清の抗ウィルス活性（即ちじトインターフェロン
β活性）を、Ｓ、Ｒｕｂ ｉ ｎ５ｔｅ ｉ ｎらの方
法（前述）に基ずきヒトＦＬ細胞とｖＳｖを用いたＣＰ
Ｅ阻止法で測定したところ、１２個に６３〜４０２単位
／ｄの活性が認められた。The antiviral activity (i.e. interferon β activity) of the culture supernatant was determined by CP using human FL cells and vSv based on the method of S. Rubintein et al. (described above).
When measured by the E inhibition method, 12 of them were found to have an activity of 63 to 402 units/d.
実施例２９
ｐＢＰＶｇ７３Ｖ （ｒ）βによるＰＣｌ２の形質転換
：
実施例１０のｐＢＰＶ９７ＳＶ （−ｒ’）β２μ７と
ρ５Ｖ２ｎｅｏ （前述＞０．２μ９とをリン酸カルシ
ウム法（前述）にて約１０６個のＰＣｌ２゜細胞に導入
した。蛋白合成阻害剤Ｇ４１８（Ｇ１８００社）を４０
０μｇ／ｄの濃度で含む選択培地（牛胎児血清１０％と
カナマイシン１００μｑ／ｍｌを含むＲＰＭ１１６４０
培地（白水製薬））にて培養したところ、２２個の形質
転換株を得た。Example 29 Transformation of PCl2 with pBPVg73V (r)β: pBPV97SV (-r')β2μ7 of Example 10 and ρ5V2neo (>0.2μ9 described above) were transformed into approximately 106 PCl2° cells by the calcium phosphate method (described above). The protein synthesis inhibitor G418 (G1800) was introduced at 40%
Selective medium (RPM11640 containing 10% fetal bovine serum and 100 μq/ml kanamycin) containing at a concentration of 0 μg/d
When cultured in medium (Hakusui Pharmaceutical Co., Ltd.), 22 transformed strains were obtained.
培養上清の抗ウィルス活性（即ちヒトインターフェロン
β活性）をＳ、Ｒｕｂ ｉ ｎ５ｔｅ ｉ ｎらの方法
（前述〉に基すき、ヒトＦＬ細胞とＶＳＶを用いたＣＰ
Ｅ阻止法で測定したところ１１に３００〜１０３００単
位／ｍｌの活性が認められた。The antiviral activity (i.e., human interferon β activity) of the culture supernatant was determined by CP using human FL cells and VSV based on the method of S. Rubinstein et al. (described above).
When measured by the E inhibition method, 11 was found to have an activity of 300 to 10,300 units/ml.
（第１７図参照）
実施例３０
ｐＢＰＶＭＴＶ （１−（ａ）βＬＪニルＰＣ１２の形
質転換：
実施例１３のｐＢＰＶＭＴＶ （Ｈａ）β２μ３とｐＳ
Ｖ２ｎｅｏ （前述＞０．２μ９とをリン酸カルシウム
法（前述）にて約１０１０６ｆ１のＰＣｌ ２細胞に導
入した。蛋白合成阻害剤Ｇ４’１８（Ｇ１８００社）を
４００μｇ／ｍｌの濃度で含む選択培地（牛胎児血清１
０％とカナマイシン１００μ９／ｄを含むＲＰＭ１１６
４０培地（白水製薬））にて培養したところ、２０個の
形質転換株を得た。(See Figure 17) Example 30 pBPVMTV (1-(a) Transformation of βLJnil PC12: pBPVMTV (Ha)β2μ3 and pS of Example 13
V2neo (>0.2μ9 as described above) was introduced into approximately 10106f1 PCl2 cells by the calcium phosphate method (described above). Selective medium containing the protein synthesis inhibitor G4'18 (G1800) at a concentration of 400μg/ml serum 1
RPM116 containing 0% and kanamycin 100μ9/d
40 medium (Hakusui Pharmaceutical Co., Ltd.)), 20 transformed strains were obtained.
培養上清の抗ウィルス活性（即ちヒトインターフェロン
β活性）を３．Ｒｕｂ ｉ ｒｌｓｔｅ ｉ ｎらの方
法（前述）に基ずき、ヒトＦＬ細胞とＶＳＶを用いたＣ
Ｐ Ｅ １ｓｆｌ止法で測定したところ１１個に１０
０〜２２３００単位／ｄの活性が認められた。3. Antiviral activity (i.e. human interferon β activity) of the culture supernatant. C cells using human FL cells and VSV based on the method of Rubinstein et al. (described above).
P E When measured using the 1sfl stop method, 10 out of 11
An activity of 0 to 22,300 units/d was observed.
（第１７図参照）
実施例３１
ｐＢＰＶＭＴＶ（Ｈａ）βによるＰＣＢの形質転換：
実施例１３のｐＢＰＶＭＴＶ （Ｈａ）β２μ９とｏｓ
Ｖ２ｎｅｏ （前述）０．２μ９とをリン酸カルシウム
法（前述）にて約１０７個のＰＣＢ細胞に導入した。蛋
白合成阻害剤Ｇ４１８（Ｇ１８００社）を４００μｇ／
ｒｄｌの濃度で含む選択培地（牛胎児血清１０％とカナ
マイシン１００μｇ／ｄを含むＲＰＭ１１６４０培地（
白水製薬））にて培養したところ、２５個の形質転換株
を得た。(See Figure 17) Example 31 Transformation of PCB with pBPVMTV(Ha)β: pBPVMTV(Ha)β2μ9 of Example 13 and os
0.2 μ9 of V2neo (described above) was introduced into approximately 10 7 PCB cells using the calcium phosphate method (described above). 400μg/protein synthesis inhibitor G418 (G1800)
Selective medium (RPM11640 medium containing 10% fetal bovine serum and 100 μg/d of kanamycin (
When cultured at Hakusui Seiyaku), 25 transformed strains were obtained.
培養上清の抗ウィルス活性（即ちヒトインターフェロン
β活性）をＳ、Ｒｕｂ ｉ ｎ５ｔｅ ｉ ｎらの方法
（前述）に基ずき、ヒトＦＬ細胞とｖＳｖを用いたＣＰ
Ｅ阻止法で測定したところ１５個に１００〜２０２００
単位／ｍ１の活性が認められた。The antiviral activity (i.e., human interferon β activity) of the culture supernatant was determined by CP using human FL cells and vSv based on the method of Rubinstein et al. (described above).
As measured by E inhibition method, 100 to 20,200 in 15 pieces.
An activity of units/ml was observed.
（第１７図参照〉
実施例３２
１）ＢＰＶｇ７ＭＴＶ （Ｈａ）βによるＰｃ１２の形
質転換：
実施例１３（７）ｐＢＰＶ９７ＭＴＶ （Ｈａ）β２μ
３とｐＳＶ２ｎｅｏ （前述＞０．２１１’９３：’）
ジ酸カルシウム法（前述）にて約１０６個のＰＣＢ細胞
に導入した。蛋白合成阻害剤Ｇ４１８（Ｇ１８００社）
を４００μｇ／ｍｌの濃度で含む選択培地（牛胎児血清
１０％とカナマイシン１００μ７／ｍｌを含むＲＰＭ１
１６４０培地（白水製薬））にて培養したところ、２４
個の形質転換株を得た。(See Figure 17) Example 32 1) Transformation of Pc12 with BPVg7MTV (Ha)β: Example 13 (7) pBPV97MTV (Ha)β2μ
3 and pSV2neo (previously >0.211'93:')
It was introduced into about 106 PCB cells using the calcium diacid method (described above). Protein synthesis inhibitor G418 (G1800)
Selective medium (RPM1 containing 10% fetal bovine serum and 100 μg/ml of kanamycin) containing 400 μg/ml of
When cultured in 1640 medium (Hakusui Seiyaku), 24
A number of transformed strains were obtained.
培養上清の抗ウィルス活性（即ちヒトインターフェロン
β活性）をＳ、Ｒｕｂ ｉ ｎ５ｔｅ ｉ ｎらの方法
（前述）に基ずき、ヒトＦＬ細胞とｖｓＶを用いたＣＰ
Ｅ阻止法で犯定したところ１２個に１００〜２００００
単位／ｄの活性が認められた。The antiviral activity (i.e., human interferon β activity) of the culture supernatant was determined by CP using human FL cells and vsV based on the method of Rubinstein et al. (described above).
100 to 20,000 for 12 crimes committed under the E Prevention Law
An activity of units/d was observed.
（第１７図参照）
実施例３３
１）ＳＶＩ ＦＮ７によるＰｃ１２の形質転換：ｐＳＶ
Ｉ ＦＮγ（特開昭６１−５２２８６＞２μ９と１）Ｓ
Ｖ２ｎｅｏ （前述＞０．２．Ｃ１とをすン酸カルシウ
ム法（前述）にて約１０６個のＰＣ１２細胞に導入した
。蛋白合成阻害剤Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ社）を４００μ
ｇ／ｄの濃度で含む選択培地（牛胎児血清１０％とカナ
マイシン１００ｕｃｉ／ｄｌを含むＲＰＭ１１６４０培
地（白水製薬））にて培養したところ、９個の形質転換
株を得た。(See Figure 17) Example 33 1) Transformation of Pc12 with SVI FN7: pSV
IFNγ (JP-A-61-52286>2μ9 and 1)S
V2neo (>0.2.C1 as described above) was introduced into approximately 106 PC12 cells by the calcium sulfate method (described above). Protein synthesis inhibitor G418 (GIBCO) was introduced at 400μ
When cultured in a selective medium (RPM11640 medium (Hakusui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 10% fetal bovine serum and 100 uci/dl of kanamycin) containing a concentration of g/d, nine transformed strains were obtained.
培養上清の抗ウィルス活性（即ちヒトインターフェロン
γ活性）を、３．ＲｕｂｉｎＳｔｅｉｎらの方法（前述
）に基ずきヒトＦＬ細胞と５ｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕ
ｓを用いたＣＰＥ阻止法で測定したところ、５個に１０
０〜９３６単位／ｄの活性が認められた。（第１８図参
照）
実施例３４
ｐＳＶＩＦＮ７／ＢＰＶ によるＰＣ９７（Ｐ）
１２の形質転換：
ｐＳＶＩＦＮｒ／ＢＰＶｇ７（ｐ）（特［６１−５２２
８６＞は、ＳＶ４０初期プロモータの支配下に置かれた
ヒトインターフェロンγ遺伝子をからなる２、０Ｋｂの
遺伝子配列をｐｄＢＰＶｌ（前述）のｐｖｕ［サイトに
導入したベクターである。3. Antiviral activity (i.e. human interferon γ activity) of the culture supernatant. human FL cells and 5indbis viru based on the method of Rubinstein et al. (described above).
When measured by CPE inhibition method using s, 10 out of 5
An activity of 0 to 936 units/d was observed. (See Figure 18) Example 34 Transformation of PC97(P) 12 with pSVIFN7/BPV: pSVIFNr/BPVg7(p) (Special [61-522
86> is a vector in which a 2.0 Kb gene sequence consisting of the human interferon γ gene under the control of the SV40 early promoter was introduced into the pvu site of pdBPVl (described above).
ｐＳＶＩＦＮ７’／ＢＰＶ ２μ９とｐＳＶ９７
（Ｐ）
２ｎｅＯ（前述）０．２μ９とをリン酸カルシウム法（
前述）にて約１０６個のＰＣＩ２細胞に導入した。蛋白
合成阻害剤Ｇ４１８ （ＧＩＢＣＯ社〉を４００μｇ／
ｒＩｔｌの濃度で含む選択培地（牛胎児血清１０％とカ
ナマイシン１００μｇ／ｒｎｌを含むＲＰＭ１１６４０
培地（白水製薬））にて培養したところ、２３個の形質
転換株を得た。pSVIFN7'/BPV 2μ9 and pSV97
(P) 2neO (described above) 0.2μ9 and calcium phosphate method (
(described above) into approximately 106 PCI2 cells. 400μg/protein synthesis inhibitor G418 (GIBCO)
Selective medium (RPM11640 containing 10% fetal bovine serum and 100 μg/rnl of kanamycin) containing rItl concentration.
When cultured in medium (Hakusui Pharmaceutical Co., Ltd.), 23 transformed strains were obtained.
培養上清の抗ウィルス活性（即ちヒトインターフェロン
γ活性）を、３． Ｒｕｂ ｉ ｎ５ｔｅ ｉ ｎらの
方法（前述）に基ずきヒトＦＬ細胞と５ｉｎｄｂｉｓ
ｖｉｒｕｓを用いたＣＰＥ阻止法で測定したところ、
１９個に１００〜２１６００単位／ｍ１の活性が認めら
れた。（第１８図参照）実施例３５
ｐＭＴＶγによるＰＣｌ２の形質転換：実施例１５のｐ
ＭＴＶ７２μ９とｐＳＶ２ｎｅＯ（前述）０．２μ９と
をリン酸カルシウム法（前述）にて約１０６個のＰＣ１
２細胞に導入した。蛋白合成阻害剤０４１８ （ＧＴＢ
ＣＯ社）を４００μｇ／威の濃度で含む選択培地（牛胎
児血清１０％とカナマイシン’１００μ９／ｄを含むＲ
ＰＭ１１６４０培地（白水製薬））にて培養したところ
、２７個の形質転換株を得た。3. Antiviral activity (i.e. human interferon γ activity) of the culture supernatant. Based on the method of Rubin5tein et al. (described above), human FL cells and 5indbis
As measured by a CPE inhibition method using a virus,
Activity of 100 to 21,600 units/ml was observed in 19 samples. (See Figure 18) Example 35 Transformation of PCl2 with pMTVγ: p of Example 15
MTV72μ9 and pSV2neO (described above) 0.2μ9 were combined into approximately 106 PC1 cells using the calcium phosphate method (described above).
2 cells. Protein synthesis inhibitor 0418 (GTB
Selective medium (R containing 10% fetal bovine serum and Kanamycin '100μ9/d) containing 400μg/d
When cultured in PM11640 medium (Hakusui Pharmaceutical Co., Ltd.), 27 transformed strains were obtained.
培養上清の抗ウィルス活性（即ちヒトインターフェロン
γ活性）を、Ｓ、Ｒｕｂ ｉ ｎ５ｔｅ ｉ ｎらの方
法（前述）に基ずきヒトＦＬ細胞と５ｉｎｄｂｉｓ
ｖｉｒｕｓを用いたＣＰＥ阻止法で測定したところ、１
７個に１００〜４１１０単位／ｄの活性が認められた。The antiviral activity (i.e., human interferon γ activity) of the culture supernatant was determined using human FL cells and 5indbis cells based on the method of S. Rubintein et al. (described above).
When measured by a CPE inhibition method using a virus, 1
An activity of 100 to 4110 units/d was observed in 7 samples.
（第１８図参照）実施例３６
ｐＭＴＶ （ＳＶ）ｌ：よるＰＣｌ ２の形質転換：
実施例１６のｐＭＴＶ （ＳＶ）γ２μ３とｐＳｙ２ｎ
ｅｏ （前述）０．２μ３とをリン酸カルシウム法（前
述）にて約１０６個のＰＣ１２１１１胞に導入した。蛋
白合成阻害剤Ｇ４１８ （ＧＩＢＣＯ社）を４００μ９
／ｄの濃度で含む選択培地（牛胎児血清１０％とカナマ
イシン１００μ９／ｄを含むＲＰＭ１１６４０培地（白
水製薬））にて培養したところ、３２＠の形質転換株を
得た。(See Figure 18) Transformation of PCl2 with Example 36 pMTV(SV)l: pMTV(SV)γ2μ3 and pSy2n of Example 16
eo (described above) and 0.2μ3 were introduced into approximately 106 PC12111 cells using the calcium phosphate method (described above). 400μ9 of protein synthesis inhibitor G418 (GIBCO)
When cultured in a selective medium (RPM11640 medium (Hakusui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 10% fetal bovine serum and 100μ9/d of kanamycin) containing a concentration of /d, 32 transformed strains were obtained.
培養上清の抗ウィルス活性（即ちヒトインターフェロン
γ活性）を、Ｓ、Ｒｕｂ ｉ ｎ５ｔｅ ｉ ｎらの方
法（前述）に基ずきヒトＦＬ細胞と５ｉｎｄｂｉｓ
ｖｉｒｕｓを用いたＣＰＥ阻止法で測定したところ、２
９個に１００〜４６５００単位／ｄの活性が認められた
。（第１８図参照）実施例３７
ｐＭＴＶ （ＳＶ、ｒ）β／ＰＣ１２クローン産生イン
ターフェロンの抗体中和：
飽和細胞密度まで増殖したｐＭＴＶ （ＳＶ、ｒ）β／
ＰＣ１２クローンを誘導培地（デキサメサゾン１０−６
Ｍと牛胎児血清１０％を含むＲＰＭ１１６４０培地（白
水製薬））にて３７℃で４８時間培養し得られた培養液
について、抗ヒトインターフェロンβ抗体あるいは抗ヒ
トインターフェロンγ抗体で処理してから既述の方法で
抗ウィルス活性を測定したところ、抗ヒトインターフェ
ロンβ抗体で特異的に中和された。結果を第１表に示す
。The antiviral activity (i.e., human interferon γ activity) of the culture supernatant was determined using human FL cells and 5indbis cells based on the method of S. Rubintein et al. (described above).
When measured by a CPE inhibition method using a virus, 2
Activity of 100 to 46,500 units/d was observed in 9 samples. (See Figure 18) Example 37 Antibody neutralization of pMTV(SV,r)β/PC12 clone-produced interferon: pMTV(SV,r)β/grown to saturation cell density.
PC12 clones were grown in induction medium (dexamethasone 10-6
The culture solution obtained by culturing at 37°C for 48 hours in RPM11640 medium (Hakusui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing M and 10% fetal bovine serum was treated with anti-human interferon-β antibody or anti-human interferon-γ antibody and then incubated as described above. When the antiviral activity was measured using the method described above, it was found to be specifically neutralized by anti-human interferon-β antibody. The results are shown in Table 1.
第１表
この結果より、ｐＭＴＶ （ＳＶ、ｒ）β／ＰＣ１２ク
ローンはヒトインターフェロンβを産生していることが
確認された。From the results shown in Table 1, it was confirmed that the pMTV (SV, r)β/PC12 clone produced human interferon β.
実施例３８
ｐＳＶＩ ＦＮγ／ＢＰＶ９７（Ｐ）／ＰＣＩ ２クロ
ーン産生インターフエロンの抗体中和：飽和細胞密度ま
で増殖したｐＳＶＩ ＦＮγ／ＢＰＶ ／ＰＣ１
２クローンを牛胎児血清１０９７（Ｐ）
％を含むＲＰＭ１１６４０培地（日永製薬）にて３７℃
で４８時間培養し得られた培養液について、抗ヒトイン
ターフェロンβ抗体あるいは抗ヒトインターフェロンγ
抗体で処理してから既述の方法で抗ウィルス活性を測定
したところ、抗ヒトインターフェロンγ抗体で特異的に
中和された。結果を第２表に示す。Example 38 Antibody neutralization of pSVI FNγ/BPV97(P)/PCI 2 clone-produced interferon: pSVI FNγ/BPV/PC1 grown to saturation cell density
Two clones were incubated at 37°C in RPM11640 medium (Hinaga Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 1097 (P)% fetal bovine serum.
The culture solution obtained by culturing for 48 hours was treated with anti-human interferon-β antibody or anti-human interferon-γ antibody.
When the antiviral activity was measured by the method described above after treatment with the antibody, it was found to be specifically neutralized by anti-human interferon γ antibody. The results are shown in Table 2.
第２表
注） ＩＦＮ： インターフェロンこの結果より、
ｐＳＶＩ ＦＮγ／ＢＰＶ９□（１）／ＰＣ１２クロー
ンはヒトインターフェロンγを産生じていることが確認
された。Table 2 Note) IFN: Interferon From this result,
It was confirmed that the pSVI FNγ/BPV9□(1)/PC12 clone produced human interferon γ.
実施例３９
ｐＭＴＶ （Ｈａ、ＳＶ、ｒ）β／ＰＣ８クローンのヒ
トインターフェロンβ生産能：実施例２７で得られたｐ
ＭＴＶ （Ｈａ、ＳＶ。Example 39 Human interferon β production ability of pMTV (Ha, SV, r) β/PC8 clone: pMTV (Ha, SV, r) β/PC8 clone obtained in Example 27
MTV (Ha, SV.
ｒ）β／ＰＣＢクローンＮＯ１９を、２４穴マイクロプ
レート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）で飽和細胞密度まで増殖さ
せた後、次の４種の培地を用いて、１日当りのヒトイン
ターフェロンβ生産量を２５日間にわたり測定した。（
第１９図参照）第１９図中、１０％ＦＣ３＋ＤＥＸは、
牛胎児血清１０％とデキサメサゾン１０−６Ｍを含むＲ
ＰＭ１１６４０培地を、
５％ＦＣ３＋ＤＥＸは、牛胎児血清５％とデキサメサゾ
ン１０−６Ｍを含むＲＰＭ１１６４０培地を、
１％ＦＣ３＋ＤＥＸは、牛胎児血清１％とデキサメサゾ
ン１０−６Ｍを含むＲＰＭ１１６４０培地を、
１０％ＦＣ８ＤＥＸは、牛胎児血清１０％を含むＲＰＭ
１１６４０培地をを各々示す。r) After growing β/PCB clone NO19 to saturated cell density in a 24-well microplate (Corning), the amount of human interferon β produced per day was measured over 25 days using the following four types of media. did. (
(See Figure 19) In Figure 19, 10%FC3+DEX is
R containing 10% fetal bovine serum and 10-6M dexamethasone
PM11640 medium, 5% FC3+DEX uses RPM11640 medium containing 5% fetal bovine serum and 10-6M dexamethasone, 1% FC3+DEX uses RPM11640 medium containing 1% fetal bovine serum and 10-6M dexamethasone, 10% FC8DEX uses RPM11640 medium containing 1% fetal bovine serum and 10-6M dexamethasone. , RPM containing 10% fetal bovine serum
11640 medium is shown respectively.
この結果より、Ｉ）ＭＴＶ （Ｈａ、ＳＶ、ｒ）β／Ｐ
Ｃ８クローンは、いずれの培地においても２５日間にわ
たり継続的にヒトインターフェロンを生産すること、ま
た、このクローンの高い生産性を維持するためには、５
％以上の牛胎児血清と１０−６Ｍのデキサメサゾンを加
えた培地が好ましいことがわかった。From this result, I) MTV (Ha, SV, r) β/P
The C8 clone continuously produces human interferon for 25 days in any medium, and in order to maintain high productivity of this clone,
% or more of fetal bovine serum and 10 −6 M dexamethasone were found to be preferable.
実施例４０
ｐＭＴＶ （Ｈａ、ＳＶ、ｒ）β／ＰＣ８クローン産生
ヒトインターフェロンβの物性：実施例２７で得られた
ｐＭＴＶ （ｔ−ｉａ、ＳＶ。Example 40 Physical properties of pMTV (Ha, SV, r)β/PC8 clone-produced human interferon β: pMTV (t-ia, SV) obtained in Example 27.
ｒ）β／ＰＣ８クローンＮＯ１９を牛胎児血清２゜５％
とデキサメサゾン１０−６Ｍを含むＲＰＭ１１６４０（
日永製薬）培地にて培養し、２３８００単位／ｄのヒト
インターフェロンβ活性を示す培養液３２．５αを得た
。培養液中のヒトインターフェロンβをブルーセフ１０
−スカラム、抗ヒトインターフェロンβモノクローナル
抗体カラムおよび逆相ＨＰＬＣで精製したところ、ヒト
線維芽細胞由来天然型ヒトインターフェロンβとＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の挙動が同じであった
。（第２０図参照）
第２０図中の天然型ＨｕｌＦＮβとは、ヒト正常二倍体
線維芽細胞を薬剤で処理し生産したヒトインターフェロ
ンβで必る。ＰＣ８由来ＨｕＩＦＮβとは、ｐｒｖｒｒ
ｖ （Ｈａ、ＳＶ、ｒ）β／ＰＣＢクローンの生産した
ヒトインターフェロンβである。大腸菌由来ヒトインタ
ーフェロンβとは、ヒトインターフェロンβ大腸菌発現
ベクターにより形質転換された大腸菌により生産された
、糖鎖を持たないヒトインターフェロンβである。r) β/PC8 clone NO19 with fetal bovine serum 2.5%
and RPM 11640 containing dexamethasone 10-6M (
A culture solution 32.5α was obtained which exhibited a human interferon β activity of 23,800 units/d. Human interferon β in the culture medium was treated with Bluecef 10.
- After purification using Scal column, anti-human interferon β monoclonal antibody column and reverse phase HPLC, it was found that natural human interferon β derived from human fibroblasts and SDS
The behavior of polyacrylamide gel electrophoresis was the same. (See Figure 20) Natural HulFNβ in Figure 20 is human interferon β produced by treating human normal diploid fibroblasts with a drug. PC8-derived HuIFNβ is prvrr
v (Ha, SV, r) Human interferon β produced by β/PCB clone. E. coli-derived human interferon β is human interferon β without sugar chains, which is produced by E. coli transformed with a human interferon β E. coli expression vector.
この結果より、ｐＭＴＶ （ト１ａ、ＳＶ、ｒ）β／Ｐ
Ｃ８クローンの生産するヒトインターフェロンβは、天
然型と同様に糖鎖が付加されたポリペプチドであること
が確認された。From this result, pMTV (t1a, SV, r)β/P
It was confirmed that the human interferon β produced by the C8 clone is a polypeptide with added sugar chains, similar to the natural type.
［発明の効果コ
本発明により天然型ヒトインターフェロンを高い効率で
産生じ、かつ継代数にかぎりが無い株化ヒト細胞を樹立
することができた。[Effects of the Invention] According to the present invention, it was possible to establish a human cell line that produces natural human interferon with high efficiency and has an unlimited number of passages.
第１図は本発明のベクターの一例であるｐＳ■βの作製
方法を示すものである。
第２図は本発明のベクターの一例で必るｐＳＶ（ｒ）β
の作製方法を示すものである。
第３図は本発明のベクターの一例であるｐＳｖ（Ｈａ、
ｒ）βの作製方法を示すものである。
第４図は本発明のベクターの一例であるｐＭＴ■βの作
製方法を示すものである。
第５図は本発明のベクターの一例で必るｐＭＴＶ （ｒ
）βの作製方法を示すものである。
第６図は本発明のベクターの一例であるｐＭＴＶ （Ｈ
ａ）βの作製方法を示すものである。
第７図は本発明のベクターの一例であるｐＭＴＶ （Ｓ
Ｖ）βの作製方法を示すものである。
第８図は本発明のベクターの一例であるｐＭＴＶ（ＳＶ
、ｒ）βの作製方法を示すものである。
第９図は本発明のベクターの一例であるｐＭＴＶ（Ｈａ
、ｒ）βの作製方法を示すものでおる。
第１０図は本発明のベクターの一例であるｐＭＴＶ （
Ｈａ、ＳＶ、ｒ）βの作製方法を示すものである。
第１１図は本発明のベクターの一例であるｐＢＰＶ９７
３Ｖ（ｒ）βの作製方法を示すものである。
第１２図は本発明のベクターの一例であるｐＤＨ（ｒ）
βの作製方法を示すものである。
第１３図は本発明のベクターの一例であるｐＢＰＶＭＴ
Ｖ（Ｈａ）βの作製方法を示すものである。
第１４図は本発明のベクターの一例であるｐＢＰＶ９□
ＭＴＶ（Ｈａ）βの作製方法を示すものである。
第１５図は本発明のベクターの一例であるＤＭＴＶγの
作製方法を示すものである。
第１６図は本発明のベクターの一例であるｐＭＴＶ（Ｓ
Ｖ）γの作製方法を示すものである。
第１７図は本発明の宿主・ベクター系により生産された
ヒトインターフェロンβの活性を示すものである。
第１８図は本発明の宿主・ベクター系により生産された
ヒトインターフェロンγの活性を示すものである。
第１９図は本発明のｐＭＴＶ （Ｈａ、ＳＶ、ｒ）β／
ＰＣ８クローンの継続したヒトインターフェロンβの生
産と、生産性に及ぼす血清濃度とデキサメサゾンの影響
を示すものである。
第２０図は本発明のｐＭＴＶ （Ｈａ、ＳＶ、ｒ）β／
ＰＣ８クローンの生産したヒトインターフェロンのＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動のパターンを示すも
のである。FIG. 1 shows a method for producing pS■β, which is an example of the vector of the present invention. Figure 2 shows an example of the vector of the present invention, pSV(r)β.
This shows a method for manufacturing. FIG. 3 shows pSv(Ha,
r) A method for producing β is shown. FIG. 4 shows a method for producing pMT■β, which is an example of the vector of the present invention. Figure 5 shows an example of the vector of the present invention, pMTV (r
) shows the method for producing β. FIG. 6 shows pMTV (H
a) A method for producing β is shown. FIG. 7 shows pMTV (S
V) shows a method for producing β. FIG. 8 shows pMTV (SV), which is an example of the vector of the present invention.
, r) shows a method for producing β. FIG. 9 shows pMTV (Ha), which is an example of the vector of the present invention.
, r) shows the method for producing β. FIG. 10 shows pMTV (
This shows a method for producing Ha, SV, r)β. Figure 11 shows pBPV97, which is an example of the vector of the present invention.
This shows a method for producing 3V(r)β. Figure 12 shows pDH(r), which is an example of the vector of the present invention.
This shows a method for producing β. Figure 13 shows pBPVMT, which is an example of the vector of the present invention.
This shows a method for producing V(Ha)β. Figure 14 shows pBPV9□, which is an example of the vector of the present invention.
This shows a method for producing MTV(Ha)β. FIG. 15 shows a method for producing DMTVγ, which is an example of the vector of the present invention. FIG. 16 shows pMTV(S), which is an example of the vector of the present invention.
V) shows a method for producing γ. FIG. 17 shows the activity of human interferon β produced by the host-vector system of the present invention. FIG. 18 shows the activity of human interferon γ produced by the host-vector system of the present invention. Figure 19 shows pMTV (Ha, SV, r)β/ of the present invention.
Figure 2 shows the continued production of human interferon beta by the PC8 clone and the effects of serum concentration and dexamethasone on productivity. Figure 20 shows pMTV (Ha, SV, r)β/ of the present invention.
SD of human interferon produced by PC8 clone
This shows the pattern of S-polyacrylamide gel electrophoresis.
Claims (8)
インターフェロン遺伝子を持つベクターにより、ヒト肺
癌由来細胞を形質転換して得られる形質転換体。(1) A transformant obtained by transforming human lung cancer-derived cells with a vector containing a human interferon gene under the control of a eukaryotic promoter.
ータ、マウス乳癌ウィルスのプロモータおよびショウジ
ョウバエ熱ショック蛋白のプロモータからなる群から選
ばれる一種以上である特許請求の範囲第（１）項記載の
形質転換体。(2) The transformation according to claim (1), wherein the eukaryotic promoter is one or more selected from the group consisting of SV40 early promoter, mouse mammary tumor virus promoter, and Drosophila heat shock protein promoter. body.
フェロンβ遺伝子あるいはヒトインターフェロンγ遺伝
子である特許請求の範囲第（１）項記載の形質転換体。(3) The transformant according to claim (1), wherein the human interferon gene is the human interferon β gene or the human interferon γ gene.
である特許請求の範囲第（１）項記載の形質転換体。(4) Human lung cancer-derived cells are PC8 or PC12
The transformant according to claim (1).
インターフェロン遺伝子を持つベクターにより形質転換
されたヒト肺癌由来細胞を、培養することを特徴とする
ヒトインターフェロンの生産方法。(5) A method for producing human interferon, which comprises culturing human lung cancer-derived cells transformed with a vector containing a human interferon gene under the control of a eukaryotic promoter.
ータ、マウス乳癌ウィルスのプロモータおよびショウジ
ョウバエ熱ショック蛋白のプロモータからなる群から選
ばれる一種以上である特許請求の範囲第（５）項記載の
ヒトインターフェロンの生産方法。(6) The human interferon according to claim (5), wherein the eukaryotic promoter is one or more selected from the group consisting of SV40 early promoter, mouse mammary tumor virus promoter, and Drosophila heat shock protein promoter. production method.
フェロンβ遺伝子あるいはヒトインターフェロンγ遺伝
子である特許請求の範囲第（５）項記載のヒトインター
フェロンの生産方法。(7) The method for producing human interferon according to claim (5), wherein the human interferon gene is the human interferon β gene or the human interferon γ gene.
である特許請求の範囲第（５）項記載のヒトインターフ
ェロンの生産方法。(8), human lung cancer-derived cells are PC8 or PC12
A method for producing human interferon according to claim (5).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61288879A JP2530632B2 (en) | 1986-12-05 | 1986-12-05 | Production method of human interferon |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61288879A JP2530632B2 (en) | 1986-12-05 | 1986-12-05 | Production method of human interferon |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63141583A true JPS63141583A (en) | 1988-06-14 |
| JP2530632B2 JP2530632B2 (en) | 1996-09-04 |
Family
ID=17735948
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61288879A Expired - Lifetime JP2530632B2 (en) | 1986-12-05 | 1986-12-05 | Production method of human interferon |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2530632B2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63141582A (en) * | 1986-12-05 | 1988-06-14 | Toray Ind Inc | Cell originated from host human pulmonary cancer |
Citations (3)
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| JPS6152283A (en) * | 1984-08-15 | 1986-03-14 | Toray Ind Inc | Expression vector |
| JPS6188875A (en) * | 1984-10-05 | 1986-05-07 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | Human interferon-gamma |
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1986
- 1986-12-05 JP JP61288879A patent/JP2530632B2/en not_active Expired - Lifetime
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| JP2530631B2 (en) * | 1986-12-05 | 1996-09-04 | 東レ株式会社 | Transformant |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2530632B2 (en) | 1996-09-04 |
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