JPS63267278A - Base sequence coding bonded interferon - Google Patents
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は医薬品あるいは試薬として用いることができる
、β型インターフェロンとγ型インターフェロンとを連
結してなるインターフェロン結合体を製造するために必
要な該結合体を暗号化する塩基配列、該塩基配列を含む
該結合体発現のための組換え体ＤＮＡ、および該組換え
＃［ＮＡにより形質転換された形質転換体に関する。[Detailed Description of the Invention] [Industrial Application Field] The present invention is directed to the production of an interferon conjugate formed by linking β-type interferon and γ-type interferon, which can be used as a pharmaceutical or a reagent. The present invention relates to a nucleotide sequence encoding a conjugate, a recombinant DNA containing the nucleotide sequence for expressing the conjugate, and a transformant transformed with the recombinant #[NA.
インターフェロンは抗腫瘍作用、抗ウィルス作用をはじ
めとする多面的生物活性を有するタンパク質であり、そ
の臨床応用が注目を集めている。Interferon is a protein with multifaceted biological activities including antitumor and antiviral activities, and its clinical applications are attracting attention.
インターフェロンはその誘導物質、産生細胞あるいは抗
原性によりα、β、γ型の三種に分類されるが、それぞ
れ遺伝子の構造、タンパク質としての物性、生物活性に
違いのあることが知られている〔小林茂保編“インター
フェロンの科学″講談社（１９８５） ）。Interferon is classified into three types, α, β, and γ, depending on its inducer, producing cell, or antigenicity, and it is known that each type has differences in gene structure, physical properties as a protein, and biological activity [Kobayashi Shigeyasu (ed.), “The Science of Interferon” (Kodansha (1985)).
β型インターフェロン（ＩＦＮ−β）はおもに線維芽細
胞をウィルスや二重鎖ＲＮＡなとの核酸を用いて誘発し
、産生される糖タンパク質であり、ｐＨ２処理に安定、
５６°Ｃ処理に不安定な性質を有する。β型インターフ
ェロンを暗号化する遺伝子はすでに単離され（Ｔａｎｉ
ｇｕｃｈｉら＜１９７９） Ｐｒｏｃ、 Ｊｐｎ、 Ａ
ｃａｄ、 ５５． Ｓｅｒ、 Ｂ、 ４６４−４６８
） 、塩基配列およびアミノ酸配列が明らかにされて
おり、さらに得られたｃＤＮＡを利用して、大腸菌を宿
主とする生産系が開発されている（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ
ら（１９８０） Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７７、５２３０−５２３３
ＨＧｏｅｄｄｅｌ ら （１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ ｆ？ｅｓ。β-type interferon (IFN-β) is a glycoprotein produced by inducing fibroblasts with nucleic acids such as viruses and double-stranded RNA, and is stable to pH 2 treatment.
It has unstable properties when treated at 56°C. The gene encoding β-type interferon has already been isolated (Tani
guchi et al. <1979) Proc, Jpn, A
cad, 55. Ser, B, 464-468
), the nucleotide sequence and amino acid sequence have been revealed, and a production system using E. coli as a host has been developed using the obtained cDNA (Taniguchi et al.
(1980) Proc, Natl, Acad,
Sci, USA 77, 5230-5233
H. Goeddel et al. (1980) Nucleic
Ac1ds f? es.
８、４０５７−４０７４ ； Ｄｅｒｙｎｃｋら（１９
８０） Ｎａｔｕｒｅ ２８７、１９３−１９７ ）。8, 4057-4074; Derynck et al. (19
80) Nature 287, 193-197).
γ型インターフェロン（ＩＦＮ−γ）はおちにＴリンパ
球をマイトジェン処理することにより誘発される糖タン
パク質であり、ｐＨ２処理に対し不安定な性質を有する
。γ型インターフェロンについても暗号化する遺伝子が
単離され塩基配列が明らかにされるとともに、大腸菌を
用いた生産系が構築されているＣ Ｄｅｖｏｓら（１９
８２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １
０． ２４８７−２５０１ ；Ｇｒａｙら（１９８２
） Ｎａｔｕｒｅ ２９５．５０３−５０８ ）。また
天然型についてアミノ酸配列が報告されている（ Ｒｉ
ｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔら＜１９８４）Ｊ、 Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、 ２５９．６７９０−６７９７ ）。γ-type interferon (IFN-γ) is a glycoprotein induced by mitogen treatment of T lymphocytes, and is unstable to pH 2 treatment. The gene encoding γ-type interferon has also been isolated and its nucleotide sequence has been revealed, and a production system using Escherichia coli has been constructed.
82) Nucleic Ac1ds Res, 1
0. 2487-2501; Gray et al. (1982
) Nature 295.503-508). The amino acid sequence of the natural type has also been reported (Ri
nderknecht et al. <1984) J. Biol.
Chem, 259.6790-6797).
α、β、γ型インターフェロンの中で、α、β型は従来
丁型インターフェロンと呼ばれていたもので、アミノ酸
配列で２９％の一致を示し高い構造類似性が示唆されて
おり（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら（１９８０）Ｇｅｎｅ
１０．１１−１５ ） 、さらにその認識するレセプタ
ーも同じであるといわれている。このためα、β型共存
下での作用は相加的である。これに対しγ型インターフ
ェロンは従来■型と呼ばれていたものであり、■型との
アミノ酸配列類似性は低く、その認識するレセプターも
異なるといわれているＣＢｒａｎｃａら（１９８１）
Ｎａｔｕｒｅ ２９４． ７６８−７７０ ） 。その
ため１型、■型ではそれぞれの示す抗ウイルススペクト
ル、抗細胞増殖効果のスペクトルは異なっており〔小林
茂保編パインターフェロンの科学′″講談社＜１９８５
） ２２−６８ ：］また両作用において相乗効果を示
すことが認められているＣＣｚａｒｎｉｅｃｋｉら（１
９８４） Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 ４９．４９０−４９６
； Ｆｌｅｉｓｈｍａｎｎ Ｊｒ、ら（ｔ９８４）
Ｊ、 ＩＦＮ、 Ｒｅｓ、 ４．２６５−２７４ 、特
開昭５９−９８０１９）。Among α-, β-, and γ-type interferons, α- and β-types were conventionally called D-type interferons, and their amino acid sequences showed 29% identity, suggesting high structural similarity (Taniguchi et al. 1980) Gene
10.11-15), and the receptors that recognize it are also said to be the same. Therefore, the effects are additive when α and β types coexist. On the other hand, γ-type interferon was conventionally referred to as type ■, and it is said that the amino acid sequence similarity with type ■ is low, and the receptors that recognize it are also different, as reported by CBranca et al. (1981).
Nature 294. 768-770). Therefore, the antiviral spectrum and the spectrum of anti-cell proliferation effects of type 1 and type II are different [edited by Shigeyasu Kobayashi, The Science of Pine Interferon'', Kodansha <1985
) 22-68: ] Also, CCzarniecki et al. (1
984) J, Virol, 49.490-496
; Fleishmann Jr, et al. (t984)
J, IFN, Res, 4.265-274, JP-A-59-98019).
インビトロにおいては既存のβ、γ型インターフェロン
を混合すればこの相乗作用が示されるが、インビボにお
いてはそれぞれのインターフェロンの体内動態の異なる
ことが予測され、二種のインターフェロンがその作用部
位に存在するかどうかは疑問があり、すなわちインビト
ロで示される相乗作用がインビボで示されるかについて
疑問視される。In vitro, this synergistic effect is shown when existing β- and γ-type interferons are mixed, but in vivo, the pharmacokinetics of each interferon is predicted to be different, and it is difficult to determine whether two types of interferons are present at the site of action. It is questionable whether the synergy shown in vitro will be shown in vivo.
上記の欠点を解消するためβ、γ型インターフェロンを
一つのポリペプチドに連結させ、β、γ型温合物による
相乗作用を単独のポリペプチドに発揮させることができ
れば、体内動態の問題も解消され有用なことと考えられ
る。またこのような連結されたインターフェロンは一つ
のポリペプチドに元のβ、γ型インターフェロン混合物
の相乗作用を示すため、分子あたりの作用が天然に存在
するインターフェロンより増強されることとなり、作用
の強いインターフェロンを得ることが可能と考えられる
。In order to solve the above-mentioned drawbacks, if β and γ type interferon can be linked to one polypeptide and the synergistic effect of the β and γ type mixture can be exerted on a single polypeptide, the problem of pharmacokinetics can be solved. This is considered useful. In addition, such linked interferon exhibits a synergistic effect of the original β- and γ-type interferon mixture in one polypeptide, so the effect per molecule is stronger than that of naturally occurring interferon, making it a highly active interferon. It is considered possible to obtain
また異なる作用スペクトルを持つβ、γ型インターフェ
ロンの活性を一つのポリペプチドに表現させれば、作用
スペクトルの広いポリペプチドを作製することができる
と考えられる。しがしまだこのようなβ、γ型インター
フェロンを−っのポリペプチドに連結させる試みは成さ
れていない。Furthermore, if the activities of β- and γ-type interferons, which have different action spectra, are expressed in one polypeptide, it is possible to create a polypeptide with a wide action spectrum. However, no attempt has yet been made to link such β- and γ-type interferons to other polypeptides.
元来二つの異なる作用をしていたポリペプチドを結合さ
せ、一つのポリペプチドに元に二つの機能を持たせる例
はすでに知られている（ Ｙｏｕｒｎｏら（１９７０）
Ｎａｔｕｒｅ ２２８．８２０−８２４ ； Ｎｅｕ
ｂｅｒｇｅｒら（１９８４） ＮａｔＬＩｒｅ ３１２
．６０４−６０８ ； Ｂｕｌｏｗら（１９８５）Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３ 、８２１−８２３）
。また、インシュリンを連結しポリペプチドの安定化を
はがっな例も報告されている〔５ｈｅｎ、 Ｓｈｉ−ｔ
ｌｓｉａｎｇ （１９８４） Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ８．ユ
、 ４６２７−４６３１ ） 。There are already known examples of combining polypeptides that originally had two different functions, giving one polypeptide two functions (Yourno et al. (1970))
Nature 228.820-824; Neu
Berger et al. (1984) NatLIre 312
．． 604-608; Bulow et al. (1985) Bi
otechnology 3, 821-823)
. There have also been reports of stabilization of polypeptides by linking insulin [5hen, Shi-t
lsiang (1984) Proc, Natl.
, Acad, Sci, USA 8. Yu, 4627-4631).
他の例としてγ型インターフェロンとインターロイキン
−２を連結、一つのポリペプチドに表現し、両活性を発
現させた例が開示されている（特開昭６０−２４１８９
０＞。しかしながらβ、γ型インターフェロンを一つの
ポリペプチドに発現させ、作用スペクトルが広く、かつ
作用の強いインターフェロンを製造した例はまだ知られ
ていない。As another example, an example has been disclosed in which γ-type interferon and interleukin-2 are linked and expressed in one polypeptide to express both activities (Japanese Patent Laid-Open No. 60-24189
0>. However, there is no known example of producing interferon with a broad spectrum of action and strong action by expressing β and γ interferons in one polypeptide.
本発明は、従来β型インターフェロン、γ型インターフ
ェロンとして独立に産生されていたインターフェロンポ
リペプチドを一つのポリペプチドに連結し、β、γ型イ
ンターフェロンがそれぞれ保持していた抗ウィルス作用
、抗細胞増殖作用などの生物活性を単独のポリペプチド
で発揮する作用スペクトルの広いインターフェロン結合
体を製造するものであり、かつ、β、γ型インターフェ
ロン混合体の示す相乗作用を単独のポリペプチドで発揮
する作用の強力なインターフェロン結合体を提供するも
のである。The present invention combines interferon polypeptides, which were conventionally produced independently as β-type interferon and γ-type interferon, into a single polypeptide, thereby achieving the antiviral and anti-cell proliferation effects that β-type and γ-type interferon possess, respectively. The purpose is to produce an interferon conjugate with a wide spectrum of action that exhibits the biological activities of a single polypeptide such as The present invention provides an interferon conjugate that is a unique interferon conjugate.
本発明はβ型インターフェロンとγ型インターフェロン
とを連結してなるインターフェロン結合体を暗号化する
塩基配列、該結合体の発現のための制御部位を付加した
組換え体ＤＮＡ、および該組換え体ＤＮＡにより形質転
換された形質転換体に関する。The present invention provides a base sequence encoding an interferon conjugate formed by linking β-type interferon and γ-type interferon, a recombinant DNA to which a control site for the expression of the conjugate is added, and the recombinant DNA. The present invention relates to a transformant transformed by.
本発明におけるβ型インターフェロン、γ型インターフ
ェロンとは、それぞれのインターフェロン特有の活性を
有するものであれば全てを包含する。そのポリペプチド
部分は、たとえばγ型インターフェロンにおいては、Ｎ
末端にアミノ酸残基が三残基付加されたもの（Ｇｒａｙ
ら＜１９８２） Ｎａｔｕｒｅ２９５ 、５０３−５０
８ ）や、Ｃ末端部の欠損しているもの（Ｒｏｓｅら（
１９８３） Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ、 ２１５ 、２７
３ ）が知られているが、このようにアミノ酸残基が付
加あるいは欠損しているものも本発明に含まれる。In the present invention, the β-type interferon and the γ-type interferon include all interferons as long as they have the specific activity of each interferon. For example, in γ-type interferon, the polypeptide portion is N
One with three amino acid residues added to the end (Gray
<1982) Nature295, 503-50
8) and those lacking the C-terminus (Rose et al.
1983) Biochem, J, 215, 27
3) is known, but the present invention also includes those in which amino acid residues are added or deleted.
またアミノ酸残基の一部置換したγ型インターフェロン
も開示されているが（特開昭５９−９３０９３号公報、
特開昭５９−１６７５９６号公報）、それぞれのインタ
ーフェロン特有の活性を有しておればこれらも本発明に
包含される。好ましくは、β型インターフェロンについ
ては第１図に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドがよく、γ型インターフェロンについては第２図のも
のがよい。In addition, γ-type interferon with partial substitution of amino acid residues has also been disclosed (Japanese Patent Application Laid-Open No. 59-93093,
(Japanese Unexamined Patent Publication No. 167596/1983), these are also included in the present invention if they have the activity specific to each interferon. Preferably, a polypeptide having the amino acid sequence shown in FIG. 1 is preferable for β-type interferon, and a polypeptide having the amino acid sequence shown in FIG. 2 is preferable for gamma-type interferon.
これらβ、γ型インターフェロンの連結順序は特に限定
しない。すなわち、β型のポリペプチドが新しい結合ポ
リペプチドのＮ末端側に、γ型がＣ末端側に配置されて
もよいし、またその逆でもよい。The order in which these β- and γ-type interferons are linked is not particularly limited. That is, the β type polypeptide may be placed on the N-terminal side of the new binding polypeptide, and the γ type may be placed on the C-terminal side, or vice versa.
β、γ型インターフェロンの連結部位について、β、γ
型のポリペプチドを直接連結してもよいし、両者の間に
スペーサーペプチドを介して連結してもよい。スペーサ
ーペプチドを介して酵素を連結した例として、β−ガラ
クトシダーゼのサブユニットを連結した例が報告されて
いるが（Ｋｕｓｈｉｎｋｅら（１９８５） ＥＨＢＯＪ
、虹、 １０６７−１０７３ ：］ 、この例に示され
るように親水性のアミノ酸残基を多く含むポリペプチド
により連結されることが好ましい。Regarding the binding site of β and γ type interferon, β and γ
These types of polypeptides may be directly linked, or may be linked via a spacer peptide between them. As an example of linking enzymes via a spacer peptide, an example of linking subunits of β-galactosidase has been reported (Kushinke et al. (1985) EHBOJ
, Niji, 1067-1073: ], as shown in this example, it is preferable that they be linked by a polypeptide containing many hydrophilic amino acid residues.
さらにスペーサーとしては、自然界に存在するタンパク
質のドメイン間を繋ぐポリペプチドを利用することもで
きる。スペーサーペプチドは通常アミノ酸の数が５０以
下のものが用いられ、好ましくはイムノグロブリン分子
のスイッチペプチドと呼ばれるペプチドがよく、さらに
Ｔｈｒ−Ｇ Ｉ ｎ−Ｌｅｕ−Ｇ １ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒ
ｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｖａｌ
−Ｔｈｒで示されるペプチドが好ましい。Furthermore, as a spacer, polypeptides that connect domains of proteins that exist in nature can also be used. The spacer peptide usually has 50 or less amino acids, preferably a peptide called a switch peptide of immunoglobulin molecules, and more preferably a peptide called a switch peptide of an immunoglobulin molecule.
o-Lys-Ala-Ala-Lys-3er-Val
-Thr peptides are preferred.
本発明では、β型インターフェロンとγ型インターフェ
ロンとを連結してなる構造体をインターフェロン結合体
と呼ぶ。特にＮ末端側にβ型インフェロン、Ｃ末端側に
γ型インターフェロンのポリペプチドを連結したものを
インターフェロンβγ結合体（ＩＦＮ−βγ）とし、そ
の逆をインターフェロンγβ結合体（ＩＦＮ−γβ）と
呼ぶ。In the present invention, a structure formed by linking β-type interferon and γ-type interferon is referred to as an interferon conjugate. In particular, a polypeptide in which β-type inferon is linked to the N-terminus and γ-type interferon to the C-terminus is called an interferon βγ conjugate (IFN-βγ), and the reverse is called an interferon γβ conjugate (IFN-γβ). .
また各インターフェロンの連結部にスペーサーペプチド
を含むものをそれぞれインターフェロンβＣγ結合体（
ＩＦＮ−βＣγ）あるいはインターフェロンγＣβ結合
体（ＩＦＮ−γＣβ）と呼ぶこととする。In addition, interferon βCγ conjugates (
IFN-βCγ) or interferon γCβ conjugate (IFN-γCβ).
インターフェロン結合体を得る手段としては、有機合成
によりアミノ酸を付加し合成する方法、遺伝子操作の手
法を用いて、ＤＮＡレベルで目的のポリペプチドを発現
するよう設計し、適当な形質転換体により発現させる方
法がある。本発明において、目的のポリペプチドを得る
ための方法は特に限定されるものではないが、遺伝子操
作の手法を用いた方がより容易に目的のポリペプチドを
得ることができるため好ましい。As a means to obtain an interferon conjugate, the desired polypeptide is designed to be expressed at the DNA level using a method of adding amino acids by organic synthesis or a genetic manipulation method, and then expressed by an appropriate transformant. There is a way. In the present invention, the method for obtaining the target polypeptide is not particularly limited, but it is preferable to use genetic engineering techniques because the target polypeptide can be obtained more easily.
遺伝子操作の手法を用いてインターフェロン結合体を得
るためには、それぞれのβ、γ型インターフェロンを暗
号化する塩基配列を直接あるいはスペーサーペプチドを
暗号化する塩基配列を介して連結した構造を持つＤＮＡ
に、発現のための適当な制御部位を結合することにより
組換え体内での発現が達成される。In order to obtain an interferon conjugate using genetic engineering techniques, DNA having a structure in which base sequences encoding each β and γ interferon are linked directly or via a base sequence encoding a spacer peptide is required.
Expression in a recombinant body is achieved by attaching appropriate control sites for expression to the protein.
インターフェロン結合体を暗号化する塩基配列としては
、目的のポリペプチドを暗号化するものであれば特に限
定されない。すなわち、あるアミノ酸に対するコドンが
複数個存在する場合、いずれを用いてもかまわない。好
ましくはβ型あるいはγ型インターフェロンｃＤＮＡの
塩基配列（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら（１９８０） Ｇｅｎ
ｅ １０．１１−１５ ＨＤｅｖｏｓら＜１９８２）
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １０．２４
８７−２５０１．１に一致することが好ましい。インタ
ーフェロン結合体を暗号化する塩基配列を得る手段とし
てＤＮＡ合成による方法、あるいはβ、γ型インターフ
ェロンを暗号化する遺伝子を取り出し連結する方法が行
い得るし、両者を組み合わせた方法でもよい。ＤＮＡ合
成により目的の塩基配列を得る方法は、すでに報告され
ている手法ＣＥｄｇｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２
９２．７５６−７６２ ＨＴａｎａｋａら（１９８３
） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １１．
１７０７−１７２３ ）に従えば達成される。β型ある
いはγ型インターフェロンを暗号化する遺伝子としては
、いわゆる染色体上の遺伝子とｃＤＮＡを用いることが
できるが、ｃＤＮＡを用いる方が好ましい。それぞれの
ｃＤＮＡは公知の方法に従って単離することができる［
：Ｔａｎ１ｊ；１ｕｃｈｉら（１９７９） Ｐｒｏｃ、
Ｊｐｎ、 Ａｃａｄ、 ５５． Ｓｅｒ、 Ｂ。The base sequence encoding the interferon conjugate is not particularly limited as long as it encodes the polypeptide of interest. That is, if there are multiple codons for a certain amino acid, any of them may be used. Preferably, the base sequence of β-type or γ-type interferon cDNA (Taniguchi et al. (1980) Gen
e 10.11-15 HDevos et al. <1982)
Nucleic Ac1ds Res, 10.24
87-2501.1 is preferred. As a means for obtaining the base sequence encoding the interferon conjugate, a method using DNA synthesis, a method of extracting and linking genes encoding β and γ type interferon, or a method combining both methods may be used. The method of obtaining the desired base sequence by DNA synthesis is an already reported method, CEdge et al. (1981) Nature 2.
92.756-762 HTanaka et al. (1983
) Nucleic Ac1ds Res, 11.
1707-1723). As the gene encoding β-type or γ-type interferon, so-called chromosomal genes and cDNA can be used, but it is preferable to use cDNA. Each cDNA can be isolated according to known methods [
: Tan1j; 1uchi et al. (1979) Proc,
Jpn, Acad, 55. Ser, B.
４６４ ； Ｇｏｃｄｄｅｌ ら （１９８０）
Ｎｕｃｌｅｉｃ 八ｃｉｄｓ Ｒｅｓ、 ８、４
０５７−４０７４ ； Ｄｅｒｙｎｃｋら（１９８０）
Ｎａｔｕｒｅ ２８７゜１９３−１９７ ； Ｄｅｖ
ｏｓら（１９８２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ
ｅｓ。464; Gocdel et al. (1980)
Nucleic 8cids Res, 8, 4
057-4074; Derync et al. (1980)
Nature 287°193-197; Dev
os et al. (1982) Nucleic Ac1ds R
es.
１０、２４８７−２５０１ Ｈａｒａｙら（１９８２
） Ｎａｔｕｒｅ ２９５゜５０３−５０８ ）。また
、これらの文献から公知の塩基配列の一部をプローブと
して、公知の方法〔Ｏｋａｙａｍａら（１９８３） Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｃ＋ｙ３ 、２８０ ）により調製したｃＤＮＡラ
イブラリーよりコロニーハイブリダイゼーションにより
選択し得ることもできる。10, 2487-2501 Haray et al. (1982
) Nature 295°503-508). In addition, using a part of the base sequence known from these documents as a probe, a known method [Okayama et al. (1983) M
o1ecular and Ce1lular Bio
It is also possible to select by colony hybridization from a cDNA library prepared by loc+y3, 280).
これらのｃＤＮＡ配列からインターフェロン結合体を暗
号化する塩基配列を得るには、それぞれのｃＤＮＡを適
当な制限酵素により消化した後、そのまま、あるいはマ
ングビーンヌクレアーゼやＤＮＡポリメラーゼエのフレ
ノウ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼなどによって平滑末
端を形成させた後結合すればよい。好ましくは制限酵素
処理により欠失したポリペプチドを暗号化する塩基配列
を合成りＮＡにより補って両ｃＤＮＡを連結すれば、完
全な長さのβ型インターフェロンと７−型インターフェ
ロンポリペプチドが連結されることになりよい。また、
この時スペーサーペプチドを暗号化する塩基配列を側構
造遺伝子の間に挿入しておくこともできる。また連結の
他の方法として、あらかじめβ、γ型インターフェロン
の構造遺伝子の５′あるいは３′末端部位に合成りＮＡ
を利用する手法によりＣＧｏｅｄｄｅ ｌら（１９７９
） Ｎａｔｕｒｅ ２８１、５４４−５４８ ）制限酵
素部位を導入しておき、それらを消化、平滑末端化など
の処理後、側構造遺伝子を連結してもよい。要はβ、γ
型インターフェロン構造遺伝子の読み取り相が一致して
連結されればどのような方法でもよい。To obtain the base sequence encoding the interferon conjugate from these cDNA sequences, each cDNA is digested with an appropriate restriction enzyme and then digested directly or with mung bean nuclease, Flenow fragment of DNA polymerase, T4 DNA polymerase, etc. The ligation may be carried out after forming blunt ends. Preferably, by synthesizing a base sequence encoding the deleted polypeptide by restriction enzyme treatment, supplementing it with NA, and connecting both cDNAs, the full-length β-type interferon and 7-type interferon polypeptides are connected. It could be a problem. Also,
At this time, a base sequence encoding a spacer peptide can also be inserted between side structural genes. Another method for linking is to synthesize NA into the 5' or 3' end of the structural gene of β- or γ-type interferon.
C Goeddel et al. (1979
) Nature 281, 544-548) Restriction enzyme sites may be introduced, and after processing such as digestion and blunt-ending, side structural genes may be ligated. Basically β, γ
Any method may be used as long as the reading phases of the type interferon structural genes match and are linked.
上記のインターフェロン結合体を暗号ｆヒする塩基配列
を利用してポリペプチドを生産させるには、動植物細胞
、酵母、大腸菌が用いられる。大腸菌内で前記の塩基配
列よりポリペプチドを発現させるためには、転写開始の
ためのプロモーター配列および翻訳のためのＳＤ配列、
ＡＴＧコドンをその前部に付与する必要がある。プロモ
ーター配列としては、１−ａｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡなど
の遺伝子のプロモーターが知られているが、プロモータ
ーとしての活性を有する配列であればどのようなもので
もよい。好ましくは【叩プロモーターのような強いプロ
モーターを用いることがよい。ＳＤ配列はりボゾームＲ
ＮＡの結合部位であり、繋訳には必須の部位である。本
発明においてはＳＤ配列についても特に限定するもので
はない。このように構成されたポリペプチド発現のため
の制御部位に翻訳のための信号ＡＴＧコドンを付与した
インターフェロン結合体を暗号化する塩基配列を連結す
ることによりポリペプチド発現は達成される。Animal and plant cells, yeast, and Escherichia coli are used to produce polypeptides using the base sequences encoding the interferon conjugates described above. In order to express a polypeptide from the above base sequence in E. coli, a promoter sequence for initiation of transcription, an SD sequence for translation,
It is necessary to add an ATG codon to its front. Promoters of genes such as 1-ac, trp, and recA are known as promoter sequences, but any sequence having promoter activity may be used. It is preferable to use a strong promoter such as a tampon promoter. SD array beam bosome R
It is a binding site for NA and is an essential site for tethering. In the present invention, there are no particular limitations on the SD arrangement. Polypeptide expression is achieved by linking a base sequence encoding an interferon conjugate provided with a signal ATG codon for translation to the thus constructed control site for polypeptide expression.
ＡＴＧコドンの付与は公知の方法（Ｇｏｅｄｃｌｅ ｌ
ら＜１９７９） Ｎａｔｕｒｅ ２８１．５４４−５４
８ ）に従い合成りＮＡを用いて行い得る。また、β型
インターフェロンの場合は公知の方法（Ｔａｎｉｇｕｃ
ｈｉら（１９８０） Ｐｒｏｃ、 Ｎａ口、 Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ、 ＬＩＳＡ ７７、５２３０−５２３
３ ）によりＡＴＧコドンを露出できる。The ATG codon was added by a known method (Goedcle
<1979) Nature 281.544-54
8) using synthetic NA. In addition, in the case of β-type interferon, a known method (Taniguc
hi et al. (1980) Proc, Naguchi, Acad
, Sci. LISA 77, 5230-523
3) allows the ATG codon to be exposed.
ここで得られたＤＮＡを宿主に導入するには、ベクター
ＤＮＡを利用する。大腸菌で用いられるベクターＤＮＡ
としてはｐＢＲ３２２、ｐｓｏｌｏｌなどに代表される
プラスミドＤＮＡ、およびλファージのようなファージ
ＤＮＡが挙げられるがいずれをも用い得る。このベクタ
ーＤＮＡと前記のインターフェロン結合体を発現するよ
う構成されたＤＮＡを連結し、公知の方法（Ｈａｎｉａ
ｔｉｓら“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ″Ｃｏ
１ｄ Ｓｐｒｕｉｎｇ ）ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ （１９８２） ｐ２５０−２５５：）に従い
、大腸菌とＤＮＡを接触させれば形質転換体を得ること
ができる。Vector DNA is used to introduce the DNA obtained here into a host. Vector DNA used in E. coli
Examples include plasmid DNAs such as pBR322 and psolol, and phage DNAs such as λ phage, and any of them can be used. This vector DNA and the DNA constructed to express the above-mentioned interferon conjugate were ligated, and a known method (Hania
tis et al. “Molecular cloning”Co
1d Spruing ) labor
(1982) p250-255:), transformants can be obtained by contacting E. coli with DNA.
形質転換された大腸菌株について、天然培地、半合成培
地、合成培地を用いて培養することによりインターフェ
ロン結合体の生産は達成される。Production of the interferon conjugate is achieved by culturing the transformed E. coli strain using a natural medium, semi-synthetic medium, or synthetic medium.
ここでの培養には液体培地が適しており、好ましくは、
たとえば発現系にｔｒｐプロモーターを用いた場合には
、インドールアクリル酸を培養途中に加え、インターフ
ェロンの生産を誘導することがよい。他のプロモーター
を用いる場合も、それぞれ特有の誘導剤を用いることが
好ましく、これによりインターフェロン結合体の生産量
は増大する。A liquid medium is suitable for this culture, preferably
For example, when the trp promoter is used in the expression system, indoleacrylic acid may be added during the culture to induce interferon production. Even when using other promoters, it is preferable to use a specific inducer for each promoter, thereby increasing the amount of interferon conjugate produced.
以上のごとく得られたインターフェロン結合体を生産す
る大腸菌を公知の方法〔堀江武−１山下仁平編集：「蛋
白質・酵素の基礎実験法」南江堂（１９８１） ３−７
） 、たとえば酵素処理、超音波処理、措漬法、加圧
処理などにより破砕することにより粗インターフェロン
結合体抽出液が得られる。グアニジン塩酸塩、尿素など
による処理（［）ａｖｉｓら（１９８３） Ｇｅｎｅ
２１．２７３−２８４ ）と組み合わせれば抽出効率
は向上し好ましい。Escherichia coli producing the interferon conjugate obtained as described above was obtained using a known method [Takeshi Horie-1, edited by Hitoshi Yamashita: "Basic Experimental Methods for Proteins and Enzymes" Nankodo (1981) 3-7
), a crude interferon conjugate extract can be obtained by crushing, for example, by enzymatic treatment, ultrasonic treatment, dipping method, pressure treatment, etc. Treatment with guanidine hydrochloride, urea, etc. ([) avis et al. (1983) Gene
21.273-284) is preferred because the extraction efficiency improves.
さらに得られた粗抽出液から公知の方法〔堀江武−１山
下仁平編集：［蛋白質・酵素の基礎実験法」南江堂（１
９８１） １８−３８２ ］ 、たとえば塩析、限外
濾過、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティークロマト
グラフィー、電気泳動等の方法、あるいはこれらを組み
合わせることによって、高純度のインターフェロン結合
体を得ることができる。Furthermore, using the obtained crude extract, a known method [Takeshi Horie-1 edited by Nipei Yamashita: [Basic experimental methods for proteins and enzymes] Nankodo (1)
981) 18-382], for example, a highly pure interferon conjugate can be obtained by methods such as salting out, ultrafiltration, ion exchange, gel filtration, affinity chromatography, electrophoresis, or a combination thereof.
動物細胞を用いてインターフェロン結合体を発現させる
には、動物細胞内で機能するプロモーターの制御下にイ
ンターフェロン結合体を暗号化する塩基配列を配置する
必要がある。動物細胞内で機能するプロモーターの例と
して、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモ
ーター、ＨＢウィルス遺伝子のプロモーター、ＭＭＴＶ
プロモーター、チミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター
、メタロチオネイン遺伝子のプロモーター、熱シヨツク
蛋白のプロモーター、インターフェロン遺伝子のプロモ
ーターが挙げられる。これらプロモーターの制御下に、
大腸菌の場合と同様の方法でインターフェロン結合体を
暗号化する塩基配列を連結すればよい。プロモーターは
一種でも二種以上併用してもよい。なお、真核細胞型プ
ロモーターの上流に、転写効率を高めると言われている
Ｈａｒｂｅｙマウス肉腫ウィルスの５’ＬＴＲのエンハ
ンサ−配列やＳＶ４０のエンハンサ−配列を挿入しても
よい。好ましくは、細胞外分泌のためのシグナルペプチ
ドを暗号化する塩基配列を、インターフェロン結合体を
暗号化する塩基配列の前部に付加しておけば、ポリペプ
チドは培養上清に生産される。In order to express an interferon conjugate using animal cells, it is necessary to place a base sequence encoding the interferon conjugate under the control of a promoter that functions in animal cells. Examples of promoters that function in animal cells include SV40 early promoter, SV40 late promoter, HB virus gene promoter, and MMTV.
Examples include promoters, thymidine kinase gene promoters, metallothionein gene promoters, heat shock protein promoters, and interferon gene promoters. Under the control of these promoters,
The base sequences encoding the interferon conjugate may be linked in the same manner as in the case of E. coli. The promoter may be used alone or in combination of two or more. Note that the 5'LTR enhancer sequence of Harvey mouse sarcoma virus or the SV40 enhancer sequence, which is said to increase transcription efficiency, may be inserted upstream of the eukaryotic promoter. Preferably, if a base sequence encoding a signal peptide for extracellular secretion is added to the front of a base sequence encoding an interferon conjugate, the polypeptide is produced in the culture supernatant.
ここで得られたＤＮＡを動物細胞に導入するため大量に
調製するには、大腸菌における複製開始点と薬剤耐性因
子を連結しておくと有用である。In order to prepare a large amount of the DNA obtained here for introduction into animal cells, it is useful to link the origin of replication in E. coli with a drug resistance factor.
複製開始点としては、コリシンＥ１プラスミド由来のも
の、たとえばｐＢＲ３２２およびこれに類縁のプラスミ
ドが望ましいが、これに限定されるものではない。薬剤
耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性、テトラサイク
リン耐性、カナマイシン耐性などを担う遺伝子が例とし
て挙げられる。The replication origin is preferably one derived from the colicin E1 plasmid, such as pBR322 and plasmids related thereto, but is not limited thereto. Examples of drug resistance genes include genes responsible for ampicillin resistance, tetracycline resistance, kanamycin resistance, and the like.
また、宿主細胞内での自律増殖が可能な複製開始点、た
とえばＳＶ４０、ポリオーマウィルスの複製開始点を連
結しておくとよい。これらのＤＮＡ断片を連結しインタ
ーフェロン結合体発現ベクターが得られれる。Furthermore, it is preferable to link a replication origin that is capable of autonomous replication within a host cell, such as an SV40 or polyoma virus replication origin. By ligating these DNA fragments, an interferon conjugate expression vector can be obtained.
ベクターＤＮＡの調製は一般的な方法で行うことができ
る（Ｔ、ＭａｎｉａｔｉＳ ｅｔ ａｔ、 Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ｐ８６〜９６．１９８２
＞。Preparation of vector DNA can be carried out by a general method (T., ManiatiS et at, Molec.
ular Cloning, p86-96.1982
>.
ベクターＤＮＡを導入する動物細胞としては、ヒト、サ
ル、チャイニーズハムスター、マウス等の細胞を用いる
ことができるが、目的物がヒトインターフェロン結合体
である場合にはヒト細胞を用いることが望ましい。ヒト
細胞としては、産生される糖付加ポリペプチドで増殖阻
害のかからないものが用いられる。好ましいヒト細胞は
、ヒト肺癌由来細胞、特にＰＣ８およびＰＣ１２（Ｈ，
Ｋｉｎｊｏ ｅｔ ａｌ、 Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、
３９．１５．１９７９）である。As the animal cells into which the vector DNA is introduced, cells of humans, monkeys, Chinese hamsters, mice, etc. can be used, but when the target product is a human interferon conjugate, it is preferable to use human cells. As human cells, glycosylated polypeptides produced that do not inhibit proliferation are used. Preferred human cells are human lung cancer-derived cells, especially PC8 and PC12 (H,
Kinjo et al, Br, J, Cancer,
39.15.1979).
ベクターＤＮＡの細胞への導入は公知のリン酸カルシウ
ム法により行うことができる（ Ｆ、 Ｌ、 Ｇｒａｈ
ａｍ Ｃｔ ａｔ、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 ５４．５３
６．１９７３ ）。Vector DNA can be introduced into cells by the known calcium phosphate method (F, L, Grah
am CT at, Virology, 54.53
6.1973).
インターフェロン結合体発現プラスミドが導入された細
胞株を得るには、たとえばこのベクターを０４１８耐性
遺伝子発現ベクターｐｓＶ２ｎｅＯ（Ｐ、Ｊ、５ｏｕｔ
ｈｅｒｎ ｅｔ ａｔ、 Ｊ、Ｈｏ１．Ａｐｐｌ、 Ｇ
ｅｎｅｔ、、 ｐ３２７、１９８２ ）あるいはｐＮＥ
Ｏ５’ （Ｈ，Ｌｕ５ｋｙ ｅｔａｔ、 Ｃｅ１ｌ、
３６ ３９１．１９８４＞とともに導入すれば、形質
転換されなかった細胞が生き残れないＧ４１８を含む選
択培地で生育できるなめ容易に識別できる。To obtain a cell line into which an interferon conjugate expression plasmid has been introduced, for example, this vector can be transformed into a 0418 resistance gene expression vector psV2neO (P, J, 5out
Hern et at, J, Ho1. Appl, G.
enet, p327, 1982) or pNE
O5' (H, Lu5ky etat, Ce1l,
36 391.1984>, the non-transformed cells can be easily identified as they can grow in a selective medium containing G418, where they cannot survive.
以上のようにして得られた形質転換体を、たとえば牛胎
児血清を含む培地で培養すればインターフェロン結合体
は培養上清に回収され、先に述べた方法により精製され
る。このようにして得られるインターフェロン結合体は
糖鎖を伴なうポリペプチドである。When the transformant obtained as described above is cultured, for example, in a medium containing fetal bovine serum, the interferon conjugate is recovered in the culture supernatant and purified by the method described above. The interferon conjugate thus obtained is a polypeptide accompanied by a sugar chain.
上記の操作により得られたインターフェロン結合体は、
抗ヒトβ型インターフェロン抗体、抗ヒトγ型インター
フェロン抗体と結合することから、両者の抗原性を有し
ている。また各々の抗体による中和試験から、β、γ型
インターフェロン両方の活性を一つのポリペプチドで表
現していることが示されている。The interferon conjugate obtained by the above operation is
Since it binds to anti-human β-type interferon antibody and anti-human γ-type interferon antibody, it has the antigenicity of both. Furthermore, neutralization tests using each antibody have shown that a single polypeptide expresses both β- and γ-type interferon activities.
以下に本発明の具体的な実施例を示す。実施例中に示さ
れる基本的な遺伝子操作の手法は、”Ｎ。Specific examples of the present invention are shown below. The basic genetic manipulation technique shown in the examples is "N.
Ｉｃｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ” （Ｈａｎｉａｔ
ｉＳら（１９８２） Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｔｌａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ）に従った。Iccular cloning” (Haniat
iS et al. (1982) Cold Spring tla
rbor Laboratory).
本発明の具体例を示す前に、本発明の構成のために必要
なヒトβ型インターフェロン、ヒトγ型インターフェロ
ン発現プラスミドについて参考例として簡単に述べる。Before presenting specific examples of the present invention, human β-type interferon and human γ-type interferon expression plasmids necessary for constructing the present invention will be briefly described as reference examples.
すでに報告されている方法〔呑口（１９８２）生化学５
４．３６３−３７７ ）に従い作製したヒトβ型インタ
ーフェロン発現プラスミドｐＴｕ ＩＦＮβ−５をＨｉ
ｎｄｌ［消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断
片処理により平滑末端とし、Ｂｇｌ［リンカ−を連結、
ＢｇｌＩ［消化した後、Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａリガーゼを
用いて自己環化させプラスミドｐＹ〇−１０を得た。ｐ
Ｙｏ−１０を５ａｌＩ、Ｃ１ａ工消化し、アガロースゲ
ル電気泳動により約８３０ｂｐのＤＮＡ断片を分取した
。このＤＮＡ断片を特開昭６１−１９４８７号公報に記
載されているプラスミドｐ６ｈｕ７−Ａ２のＣ１ａＩ−
３ａｌＩ部位間に挿入した構造を持つプラスミドがｐＫ
Ｍ６である。（第３図）
ヒト扁桃由来リンパ球をＰＨＡ （フィトヘモアグルチ
ニン）とＴ Ｐ Ａ （１２−ｏ −ｔｅｔｒａｄｅｃ
ａｎｏｙｌ−ｐｈｏｒｂｏｒ−１３−ａｃｅｔａｔｅ）
で処理し、ヒトγ型インターフェロン生産を誘導しな後
（Ｖｉｌｃｅｋら（１９８３）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａ
ｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３４ １３１） 、細胞より
ｍＲＮＡを調製した。ｍ ＲＮ Ａの調製とｃＤＮＡの
調製およびプラスミドへのクローニングは、公知の方法
（Ｏｋａｙａｍａら（１９８３） Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
ａｎｄ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３
、２８０ ）に従った。得られなＣＤＮＡライブラリー
の中から、公知のヒトγ型インター７ ｘ ｏ ンｌｉ
造遺伝子（Ｇｏｅｄｄｅ ｌらＮａｔｕｒｅ（１９８２
）堕５ ．５０３−５０９ ：）の３′末端近傍に対応
する５ ’ −ＡＧＧＡＣ八八ＣＣへへＴＡＣＴ −３
’の配列を有する合成りＮＡをプローブとしてコロニー
ハイブリダイゼーションを行い、ヒトγ型インターフェ
ロンｃＤＮＡを有するプラスミドｐＩＦＮ−γ１５を得
た。次にｐＩＦＮ−７１５をＮｄｅ工、ＢａｍＨＩ消化
後、アガロースゲル電気泳動により約０．９ｋｂのＤＮ
Ａ断片を分取した。また５′−ＣＧＡＴＧＣＡＧＧ八Ｃ
ＣＣＡ−３へ ’ 、 ５ ’ −ＴＡＴＧＧＧ
ＴＣＣＴＧＣＡＴ−３′のＤＮＡオリゴマーを合成し、
５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン
酸化した後、それぞれ約ｓｐｍｏ＋ｅ／μｍとなるよう
に混合し、６５℃、３分間加熱、急冷した後、再度６５
℃で３分間加熱し、室温に放置することにより徐々に冷
却させ、アニーリングを行った。このＤＮＡオリゴマ−
７９ｍｏｌｅ 、 ｐ Ｉ Ｆ Ｎ７−１５のＮｄｅニ
ーＢａｍＨＩ断片０．３ｐｍｏｌｅおよび（１）で示し
たｐＫＭ６を、ＣＩａＩ、ＢａｍＨＩ消化後ア消化−ア
ガロースゲル電気泳動取した約４２ｏｏｂｐのＤＮＡ断
片Ｑ、 １ｐｍｏ＋ｅを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結した後、Ｅ、Ｇ。Already reported methods [Noguchi (1982) Biochemistry 5
The human β-type interferon expression plasmid pTu IFNβ-5 prepared according to
ndl [After digestion, the ends were made blunt by Flenow fragment treatment with T4 DNA polymerase, and Bgl [linkers were ligated,
After digestion with BglI, the product was self-circularized using T4 DNA ligase to obtain plasmid pY〇-10. p
Yo-10 was digested with 5alI and C1a, and a DNA fragment of about 830 bp was fractionated by agarose gel electrophoresis. This DNA fragment was converted into the C1aI-
The plasmid with the structure inserted between the 3alI sites has a pK
It is M6. (Figure 3) Human tonsil-derived lymphocytes were treated with PHA (phytohemoagglutinin) and TPA (12-o-tetradec).
anoyl-phorbor-13-acetate)
to induce human γ-type interferon production (Vilcek et al. (1983) Infection a
nd Immunity 34 131), mRNA was prepared from the cells. Preparation of mRNA, preparation of cDNA, and cloning into plasmids are carried out using known methods (Okayama et al. (1983) Molecular
and Ce1lular Biology 3
, 280). From the obtained cDNA library, known human γ-type inter-7
Gene synthesis (Goeddel et al. Nature (1982)
) Fallen 5. 503-509: TACT-3 to 5'-AGGAC88CC corresponding to the vicinity of the 3' end of
Colony hybridization was performed using a synthetic NA having the sequence ' as a probe to obtain plasmid pIFN-γ15 containing human γ-type interferon cDNA. Next, pIFN-715 was digested with Nde and BamHI, and approximately 0.9 kb DNA was analyzed by agarose gel electrophoresis.
Fragment A was fractionated. Also 5'-CGATGCAGG8C
to CCA-3', 5'-TATGGG
Synthesize TCCTGCAT-3' DNA oligomer,
After phosphorylating the 5' end using T4 polynucleotide kinase, they were mixed to approximately spmo+e/μm, heated at 65°C for 3 minutes, rapidly cooled, and then incubated again at 65°C.
Annealing was performed by heating at .degree. C. for 3 minutes and allowing to cool gradually by leaving at room temperature. This DNA oligomer
79 mole, 0.3 pmole of the Ndeny BamHI fragment of pIF N7-15 and pKM6 shown in (1) were digested with CIaI and BamHI, followed by agarose gel electrophoresis, and the approximately 42oobp DNA fragment Q was mixed with 1 pmo+e. and after ligation using T4 DNA ligase, E,G.
Ｉ ｉ ＭＣ１０６１（ＣａｓａｄａｂａｎらＪ、
）１０１． Ｂ１１１、 （１９８０） １３８ 、
１７９−２０７ ） ヲ形質転換シタ。アンピシリン耐
性で選択した形質転換株について、５′−丁Ａ丁ＧＧＧ
ＴＣＣＴＧＣＡＴ−３’ Ｄ Ｎ Ａオリゴマーをプロ
ーブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行い、ヒ
トγ型インターフェロン発現プラスミドｐ６ｈｕγ−Ｎ
１（第４図）を得た。I i MC1061 (Casadaban et al. J,
)101. B111, (1980) 138,
179-207) Transformation site. For transformed strains selected for ampicillin resistance, 5′-Ding A Ding GGG
Colony hybridization was performed using TCCTGCAT-3' DNA oligomer as a probe, and human γ-type interferon expression plasmid p6huγ-N
1 (Figure 4) was obtained.
次にβおよσγ型インターフェロンＣＤＮＡを連結する
ために、それぞれの構造遺伝子の５′末端、３′末端に
制限酵素部位を導入したプラスミドを作製した。Next, in order to link the β and σγ type interferon CDNAs, plasmids were prepared in which restriction enzyme sites were introduced into the 5' and 3' ends of each structural gene.
（３） ｐＫＭ６−ｃｘｈｏの 製ニ ブラスミドｐＫＭ６−ｃｘｈｏの構造を第５図に示す。(3) Production of pKM6-cxho The structure of plasmid pKM6-cxho is shown in FIG.
ｐＫＭ６をＢＳｔＥＩＩ、ＢａｍＨＩ消化し、（２）に
示した方法に準じて作製したアダプターＤＮＡ
Ｇ１丁ＡＣＣ丁ＣＣＧＡＡＡＣ丁ＣＧＡＧＣＴＧＡＧＡ
ＧＧＣＴＴＴＧＡＧＣＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧを連結し、
プラスミドｐＫＭ６−ｃｘｈｏｔ得た。Adapter DNA G1 ACC CCGAAAC CGAGCTGAGA was prepared by digesting pKM6 with BStEII and BamHI and following the method shown in (2).
concatenate GGCTTTGAGCTCGACTCTAG,
Plasmid pKM6-cxhot was obtained.
ｏＫＭ６−ｃｘｈｏをｘ’ｈＯ■消化し突出シタ塩基を
削りとることにより、ヒトβ型インターフェロンのＣ末
端アミノ酸アスパラギンを暗号化するＡＡＣが露出され
ることになる。Digesting oKM6-cxho with x'hO■ and removing the protruding site base exposes AAC encoding the C-terminal amino acid asparagine of human β-type interferon.
（４） ｐ６ｈｕ７Ｎ１−ＣＫＩ）ｎの作製ニアラスミ
ドｐ６ｈｕ７’Ｎ１−ＣＫｐｎの構造を第６図に示す。(4) Preparation of p6hu7N1-CKI)n The structure of nearasmid p6hu7'N1-CKpn is shown in FIG.
ｐ６ｈｕ７−ＮｌをＣＬａＩ、Ｂａｍｔ−（工消化し、
アガロースゲル電気泳動により約４２００ｂｐのＤＮＡ
断片と、約１０５０ｂｐのＤＮＡ断片を分取する。１０
５０ｂｐのＣ１ａＩ−ＢａｍＨＩ断片をざらにＨｉｎｆ
Ｉ消化し、アガロースゲル電気泳動により４００ｂｐの
ＤＮＡ断片を分取した。約４２００ｂｐのＣＩａＩ−３
ａｍＨＩ断片、４００ｂｐのＱｌａｌミニ−１ｉｎｆＩ
断片と（２）に示した方法に準じて６本のＤＮＡオリゴ
マーより作製した下に示すＤＮＡアダプター
ＡＧＴＣＡＧＡ丁ＧＣＴＧ丁ＴＴＣＧＣＧＧＴＣＧＡＣ
ＧＴＧＣＡＴＣＣＣＡＧＧＴＣＴＡＣＧＡＣＡＡＡＧＣ
ＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＣＧＴＡＧＧＧＴＣＧＴＡＣＣＡ
ＴＧＡＧＡＴＣＴＧ
ＣＡＴＧＧＴＡＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＡＧを混合連結し
、Ｅ、ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１を形質転換した。アン
ピシリン耐性を示す形質転換株について、５’ −ＧＡ
ＴＣＣＡＧＡＴＣＴＣＡ丁Ｇをプローブとしてコロニー
ハイブリダイゼーションを行ったところ、１１８株中４
株が陽性を示し、これらはプラスミドｐ５ｈｕγ−ＣＫ
ｐｎを保持していた。p6hu7-Nl was digested with CLaI, Bamt-
Approximately 4200 bp of DNA was determined by agarose gel electrophoresis.
The fragment and a DNA fragment of approximately 1050 bp are fractionated. 10
Roughly insert the 50bp C1aI-BamHI fragment into Hinf
1 digestion, and a 400 bp DNA fragment was fractionated by agarose gel electrophoresis. CIaI-3 of approximately 4200 bp
amHI fragment, 400 bp Qlal mini-1infI
The DNA adapter shown below was prepared from the fragment and six DNA oligomers according to the method shown in (2).
GTGCATCCCAGGTCTACGACAAAGC
GCCAGCTGCACGTAGGGTCGTACCA
TGAGATCTG CATGGTACTCTAGACCTAG was mixed and ligated and E. coli MC1061 was transformed. For transformed strains showing ampicillin resistance, 5'-GA
When colony hybridization was performed using TCCAGATCTCA Ding G as a probe, 4 out of 118 strains were detected.
strains were positive and these were plasmid p5huγ-CK
It held pn.
ｐ６ｈｕ７−ＣＫＤｎをＫｐｎＩ消化し突出した部分を
削ることにより、ヒトγ型インターフェロンのＣ末端ア
ミノ酸グルタミンを暗号化するＣＡＧが露出されること
になる。By digesting p6hu7-CKDn with KpnI and removing the protruding portion, CAG encoding the C-terminal amino acid glutamine of human γ-type interferon is exposed.
（５）ｐＧｈｕＴＮ１△ＢＳ−ＮＨｉｎの作製ニブラス
ミドｐ６ｈｕＴＮ１ΔＢＳ−ＮＨｉｎの構造を第７図に
示す。ｐｅｈｕγ−Ｎ１を１ａｓｔＥＩｒ消化し、得ら
れた粘着末端をＤＮＡポリメラーゼエのフレノウ断片を
用いて平滑末端とした後、５ａｌＩリンカ−を連結、Ｓ
ａ Ｉ Ｉ消化した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて自
己環化させ、プラスミドｐ６ｈｕγＮ１−△ＢＳを得た
。次にｐＫＭ６をＥｃｏＲＩ、５ａｌＩ消化し、アガロ
ースゲル電気泳動により約３７００ｂＰのＤＮＡ断片を
分取し、さらに別にｐ ６ ｈ ｕ ７ Ｎ １−△Ｂ
ＳをＮｄｅ ■、５ａｌＩ消化し、アガロースゲル電気
泳動により約８００ｂｐのＤＮＡ断片を分取した。(5) Preparation of pGhuTN1ΔBS-NHin The structure of the niblasmid p6huTN1ΔBS-NHin is shown in FIG. pehuγ-N1 was digested with 1astEIr, the resulting sticky ends were made into blunt ends using the Flenow fragment of DNA polymerase, and a 5alI linker was ligated, and S
After a II digestion, the product was self-circularized using T4 DNA ligase to obtain plasmid p6huγN1-ΔBS. Next, pKM6 was digested with EcoRI and 5alI, and a DNA fragment of approximately 3700 bP was fractionated by agarose gel electrophoresis, and further p6hu7N1-ΔB
S was digested with NdeⅠ and 5alI, and a DNA fragment of about 800 bp was fractionated by agarose gel electrophoresis.
これら２種のＤＮＡ断片と（２）の方法に準じて作製し
た下記のＤＮＡアダプターとを連結し、目的のプラスミ
ドｐ６ｈｕ７Ｎ１△Ｂ Ｓ Ｎ Ｈｉ ｎＡＡＴＴＧ
ＣＧＣＡＧＧＡＣＣＣＡ
ＣＧＣＧＴＣＣＴＧＧＧＴＡＴ
を得た。ｐ６ｈｕ７Ｎ１△ＢＳ−ＮＨｉｎをＨ１ｎＰＩ
消化し突出部分を削ることにより、ヒトγ型インターフ
ェロンのＮ末端アミノ酸、グルタミンを暗号化するＣＡ
Ｇを露出できる。These two types of DNA fragments were ligated with the following DNA adapter prepared according to method (2) to create the desired plasmid p6hu7N1ΔB S N Hi nAATTG.
CGCAGGACCCA CGCGTCCTGGGTAT was obtained. p6hu7N1ΔBS-NHin to H1nPI
CA encodes glutamine, the N-terminal amino acid of human gamma interferon, by digesting and removing the protruding parts.
G can be exposed.
ｐｔｒｐ６ｈｕ ＩＦＮ−ｒβの作製方法を第８図に示
す。プラスミドｐＫＭ６ ３０μｇをＣ１ａＩ消化した
後、マングビーンヌクレアーゼ１５単位で３７℃１５分
間反応し、粘着末端を平滑末端とした。これをさらにＢ
ｇｌＩＩ消化した後、アガロースゲル電気泳動により約
ｃ；ｏｏｂｐのＤＮＡ断片を分取した。別にプラスミド
ｐ６ｈｕγＮ１−ＣＫｐｎをＫｐｎ■消化した後、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端を形成させ、さらに
ＢａｍＨＩ消化してアガロースゲル電気泳動により、約
４８００ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。それぞれのＤＮ
Ａ断片を混合、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、Ｅ、
ｃｏ １ ｉ ＨＢＩＯＩ （ＢＯＶＯｒら（１９
６９） Ｊ、Ｈｏ１． Ｂｉｏｌ、 ４１．４５９−
４７２ 〕を形質転換した。得られたアンピシリン耐性
の形質転換体について、上記の操作で得たｐＫＭ６の０
１ａＩ−Ｂｇ ｌ ｌｌｌｔｆｉ片をニックトランスレ
ーションによって３２Ｐラベル化したＤＮＡをプローブ
としてコロニーハイブリダイゼーションを行ったところ
、５６株中６株が陽性を示しな。これらの株についてプ
ラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素切断点地図を作製し
たところ、第８図に示す構造を持っていた。さらに代表
様γβ６の保持するプラスミドＤＮＡの５ａｌＩ消化物
をＭ１３ファージに組み込みＤＮＡ塩基配列を決定した
ところ、ＩＦＮ−γとＩＦＮ−βの′！Ｉ４造遺伝子が
読み取り枠が一致して連結されており、目的のプラスミ
ドｐｔｒｐ６ｈｕ ＩＦＮ−γβを得た。また同時に形
質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ（ｐｔｒｐ６ｈｕ
ＩＦＮ−γβ）を得な。The method for producing ptrp6hu IFN-rβ is shown in FIG. After 30 μg of plasmid pKM6 was digested with C1aI, it was reacted with 15 units of mung bean nuclease at 37° C. for 15 minutes to convert sticky ends into blunt ends. Add this further to B
After glII digestion, a DNA fragment of approximately c;oobp was fractionated by agarose gel electrophoresis. Separately, after digesting plasmid p6huγN1-CKpn with Kpn■, T4
A DNA fragment of about 4800 bp was obtained by forming blunt ends with DNA polymerase, further digesting with BamHI, and performing agarose gel electrophoresis. Each DN
Mix A fragments, ligate with T4 DNA ligase, E,
co 1 i HBIOI (BOVOr et al. (19
69) J, Ho1. Biol, 41.459-
472] was transformed. Regarding the obtained ampicillin-resistant transformant, the pKM6 0 obtained by the above procedure was
When colony hybridization was performed using 32P-labeled DNA from the 1aI-Bgllltfi fragment by nick translation as a probe, 6 out of 56 strains showed no positivity. When plasmid DNA was extracted from these strains and a restriction enzyme breakpoint map was prepared, they had the structure shown in Figure 8. Furthermore, when the 5alI digested product of plasmid DNA held by representative-like γβ6 was incorporated into M13 phage and the DNA base sequence was determined, it was found that '' of IFN-γ and IFN-β! The I4 synthetic gene was ligated with matching reading frames, and the target plasmid ptrp6hu IFN-γβ was obtained. At the same time, transformant E, coli HBIOI (ptrp6hu
IFN-γβ).
ｐｔｒ６ｐｈｕ ＩＦＮ−βγの作製方法を第９図に示
す。プラスミドｐＫＭ６−ｃｘｈｏ ２０μｇをｘｈ
ｏＩ消化した後、１５単位のマングビーンヌクレアーゼ
で３７℃１５分間処理し、平滑末端を形成さぜな後、５
ａｌＩ消化した。これをアガロースゲル電気泳動にかけ
、約４５．００ ｂ ｐのＤＮＡ断片を分取した。別に
ｐ６ｈｕγＮ１△ＢＳ−ＮＨｉｎ ３０μｇをＨｉｎ
ＰＩ消化した後、３０単位のマングビーンヌクレアーゼ
で３７’ＣＩ５分間処理し、さらにこれを５ａｌＩ消化
した後、アガロースゲル電気泳動により、約８６０ｂｐ
のＤＮＡ断片を分取した。それぞれのＤＮＡ断片を混合
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、Ｅ、ｃｏｌｉ
ＨＢＩＯＩを形質転換した。得られたアンピシリン耐性
の形質転換株のうち、５０株についてｐ６ｈｕγＮ１−
ＣＫｐｎを作製する際に利用したＤＮＡオリゴマー５’
−ＡＧＴＣ八ＧΔへＧＣＴＧＴＴＴＣを用いてコロニー
ハイブリダイゼーションを行ったところ、２８株が陽性
を示した。代表様βγ３１についてプラスミドＤＮＡを
単離し、制限酵素切断点地図を作製したところ、第９図
の構造を示し、さらにＢｓｔＥ［−３ａ Ｉ Ｉ断片を
Ｍ１３ファージにクローン化し、ＤＮＡ塩基配列を調べ
なところ、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ横道遺伝子が読み取
り枠を合わせて連結されており、ｐｔｒｐ６ｈｕＩＦＮ
−βγを得た。また同時に形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ
ＨＢＩＯＩ（ｐｔｒｐ６ｈｕＩＦＮ−βγ）を得た。The method for producing ptr6phu IFN-βγ is shown in FIG. 9. 20 μg of plasmid pKM6-cxho
After oI digestion, treat with 15 units of mung bean nuclease for 15 minutes at 37°C to form blunt ends.
Digested with alI. This was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of approximately 45.00 bp was fractionated. Separately, 30 μg of p6huγN1ΔBS-NHin was added to Hin
After PI digestion, treatment with 30 units of mung bean nuclease for 5 minutes at 37'CI, and further digestion with 5alI, agarose gel electrophoresis revealed that approximately 860 bp
DNA fragments were fractionated. Mix the respective DNA fragments, ligate them using T4 DNA ligase, and incubate them with E. coli.
HBOI was transformed. Of the ampicillin-resistant transformants obtained, 50 strains were p6huγN1-
DNA oligomer 5' used to create CKpn
- When colony hybridization was performed using GCTGTTTC to AGTC8GΔ, 28 strains showed positive results. Plasmid DNA was isolated for representative-like βγ31, and a restriction enzyme breakpoint map was prepared, which showed the structure shown in Figure 9. Furthermore, the BstE [-3a II fragment was cloned into M13 phage and the DNA base sequence was examined. , IFN-β, and IFN-γ transverse genes are linked with their reading frames aligned, and ptrp6huIFN
−βγ was obtained. At the same time, transformants E, coli
HBIOI (ptrp6huIFN-βγ) was obtained.
実」Ｕ辻ユ
インターフェロン Ｃ、Ａ −ニブラスミドｐｔｒｐｈ
ｕ ＩＦＮ−７ｃβの作製方法を第１０図に示す。ｐＫ
Ｍ６をＣ１ａＩ消化した後、さらにＢｇｌＩＩ消化し、
アガロースゲル電気泳動により約５００ｂｐのＤＮＡ断
片を分取した。別にスペーサーペプチドを暗号化するＤ
ＮＡ断片を（２）に示す方法に準じ、４本のＤＮＡオリ
ゴマーより作製した。このＤＮＡ断片の構造を第１１図
に示す。このＤＮＡ断片１０ｐｍｏ ｌ ｅと先に分離
しなｐＫＭ６のＣ１ａＩ−ＢｇｌＩＩ断片、および実施
例１に示したｐ６ｈｕ７Ｎ１−ＣＫｐｎより分離した約
４８００ｂｐのＤＮＡ断片を混合、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
により連結し、Ｅ、ｃｏｌｉＨＢＩＯＩを形質転換した
。得られたアンピシリン耐性を示す形質転換株８２株に
ついて、実施例１に示したプローブを用いてコロニーハ
イブリダイゼーションを行ったところ３株が陽性を示し
た。Fruit” U Tsuji Interferon C, A-niblasmid ptrph
The method for producing u IFN-7cβ is shown in FIG. 10. pK
After digesting M6 with C1aI, it was further digested with BglII,
A DNA fragment of approximately 500 bp was fractionated by agarose gel electrophoresis. Separately encode the spacer peptide
NA fragments were prepared from four DNA oligomers according to the method shown in (2). The structure of this DNA fragment is shown in FIG. 10 pmol of this DNA fragment, the previously isolated C1aI-BglII fragment of pKM6, and the approximately 4800 bp DNA fragment isolated from p6hu7N1-CKpn shown in Example 1 were mixed and ligated using T4 DNA ligase, and E. coli HBOI Transformed. When colony hybridization was performed on the obtained 82 transformed strains exhibiting ampicillin resistance using the probe shown in Example 1, 3 strains showed positive results.
この３株よりプラスミドＤＮＡを得出し、制限酵素地図
を作製したところ、１株のみが目的の構造のプラスミド
ｐｔｒｐ６ｈｕ ＩＦＮ−７ｃβを保持していた。この
時同時に形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ（ｐｔ
ｒｐ６ｈｕＩＦＮ−７ｃβ）を得た。When plasmid DNA was obtained from these three strains and a restriction enzyme map was prepared, only one strain retained the plasmid ptrp6hu IFN-7cβ having the desired structure. At this time, transformants E, coli HBIOI (pt
rp6huIFN-7cβ) was obtained.
実施例１〜３で得られた形質転換体について、トリプト
ファン１００μｇ ／ ｍｌ、アンピシリン１００μｇ
／ ｍｌを含むＬＢ培地（バクトドリブトン１．０％
、酵母エキス０．５％、食塩０．５％、グルコース０．
１％、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７，２に調製）に
植菌し、３０℃で８時間培養し、これをグルコース１．
０％、カザミノ酸１゜０％を含むＭ９培地（リン酸１カ
リウム０．３％、リン酸２ナトリウム０６６％、塩化ア
ンモニウム０．１％、食塩０，５％に別滅菌したビタミ
ンＢ１を１μｇ ／ ｍｌ、硫酸マグネシウムを１ｍＭ
によるよう添加する）に１，０％植菌し、２５℃で培養
を続ける。約１０時間後にインドールアクリル酸を終濃
度１０μｇ ／ ｍｌとなるように添加し、さらに８時
間培養を続行した。この間グルコース切れとならないよ
う適宜４０％グルコース溶液を添加し、またｐ Ｈが６
．０〜７．０に保たれるよう１４％ＮＨ４ＯＨ溶液を用
いて調製した。その後２ｍｌの培養液よりｉｏｏｏｏｇ
、４分の遠心分離により菌体を集菌、さらに生理食塩水
で洗浄した後、この菌体を１ｍｌのリゾチーム３■、Ｅ
Ｄ Ｔ Ａ ２ ｍＭ、食塩３０ ｍ Ｍ、グリセロ
ール２０％を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に
懸濁し、水中で６０分間放！した。凍結融解を３回繰り
返し、菌体を破砕した後、３００００ｇ、２０分の遠心
分離により細胞残滓を除去したものを活性測定用の標品
とした。インターフェロンの抗ウイルス活性測定法は“
インターフェロンの科学″〔小林茂保編（１９８５）講
談社ｐ１３−２０）に示されている、ＦＬ細胞−シンド
ビスウイルスを用いたＣ Ｐ Ｅ ５０阻示法を用いた
９活性測定の際の標準品としては、ＮＩＨｎａｔｕｒａ
ｌＩＦＮ−７０ｇ２３−９０１−５３０によって力価較
正した組換え体により生産されたＩＦＮ−γラボリファ
レンスを用いた。活性測定の結果を表１に示す。参考の
ため、ヒトβ型インターフェロンを発現するプラスミド
ｐＫＭ６、およびヒトγ型インターフェロンを発現する
プラスミドｐ６ｈｕγ−Ｎ１を保持するＥ、ｃ。For the transformants obtained in Examples 1 to 3, tryptophan 100 μg/ml and ampicillin 100 μg
/ml of LB medium (Bactodributon 1.0%
, yeast extract 0.5%, salt 0.5%, glucose 0.
1%, adjusted to pH 7.2 using sodium hydroxide), cultured at 30°C for 8 hours, and inoculated with glucose 1.
1 μg of sterilized vitamin B1 in M9 medium (0.3% monopotassium phosphate, 0.66% disodium phosphate, 0.1% ammonium chloride, 0.5% table salt) and 1.0% casamino acids. /ml, 1mM magnesium sulfate
Inoculate 1.0% of the cells (add as required) and continue culturing at 25°C. Approximately 10 hours later, indole acrylic acid was added to a final concentration of 10 μg/ml, and the culture was continued for an additional 8 hours. During this time, 40% glucose solution was added as appropriate to prevent glucose depletion, and the pH was adjusted to 6.
．． It was prepared using 14% NH4OH solution to keep it between 0 and 7.0. Then, from 2 ml of culture solution, ioooog
The bacterial cells were collected by centrifugation for 4 minutes, washed with physiological saline, and then added to 1 ml of lysozyme 3, E.
Suspend in Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 2 mM DTA, 30 mM sodium chloride, and 20% glycerol, and leave in water for 60 minutes! did. After repeating freezing and thawing three times to crush the bacterial cells, cell debris was removed by centrifugation at 30,000 g for 20 minutes, and the product was used as a preparation for activity measurement. The method for measuring the antiviral activity of interferon is “
As a standard product for measuring 9 activity using the CP E 50 inhibition method using FL cell-Sindbis virus, as shown in "The Science of Interferon" [edited by Shigeyasu Kobayashi (1985), Kodansha p13-20). is NIH natura
A recombinantly produced IFN-γ lab reference titer calibrated with lIFN-70g23-901-530 was used. The results of the activity measurement are shown in Table 1. For reference, E, c holds plasmid pKM6 expressing human β-type interferon and plasmid p6huγ-N1 expressing human γ-type interferon.
ｌｉ ８８１０１株について、前記の操作により調製
したインターフェロン粗抽出液の抗ウィルス活性を示し
た。各々のプラスミド保持株はインターフェロンに特徴
的な抗ウィルス活性を示した。For the li 88101 strain, the antiviral activity of the interferon crude extract prepared by the above procedure was demonstrated. Each plasmid-carrying strain showed antiviral activity characteristic of interferon.
以下余白
第１表
実施例４の方法に従って培養した菌液１ｍｌより１００
００ｇ、４分の遠心分離により菌体を集菌した。この菌
体を５００μｍの２−メルカプトエタノール５％、ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）２％を含む６２．５ｍＭ
）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ６，８）に懸濁した後、沸騰
水浴中で５分間加熱し、放冷した後に５０μｍのブロム
フェノールブルー０．０５％、グリセロール７０％を含
む６２．５ｍＭ）リス−塩Ｈ）ＪＦＥ液（ｐＨ６，８）
を添加し、電気泳動用のサンプルとした。５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動はレムリの方法（Ｎａｔｕ
ｒｅ ２２７ （１９７０） ０８０ 〕に従った。ゲ
ル濃度は１５％を用い、マーカータンパク質としては、
リゾチーム分子Ｋ １４４００、トリプシンインヒビタ
ー分子ｆｆ１２１５００、カルボニックアンヒドラーゼ
分子ｆｆ１３１０００、オボアルブミン分子量４５００
０、ウシ血清アルブミン分子量６６２００、ホスホリパ
ーゼＢ分子量９２５００を用いた。100% from 1 ml of bacterial solution cultured according to the method of Example 4 in Table 1 in the margin below.
Bacterial cells were collected by centrifugation at 00g for 4 minutes. This bacterial cell was dissolved in 62.5 mM containing 5% 2-mercaptoethanol and 2% sodium dodecyl sulfate (SDS).
62.5mM lis containing 0.05% of 50 μm bromophenol blue and 70% glycerol after being suspended in lis-hydrochloric acid buffer (pH 6, 8), heated for 5 minutes in a boiling water bath, and allowed to cool. -Salt H) JFE solution (pH 6,8)
was added to prepare a sample for electrophoresis. 5DS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed using Laemmli's method (Natsu
re 227 (1970) 080]. The gel concentration used was 15%, and the marker protein was
Lysozyme molecule K 14400, trypsin inhibitor molecule ff121500, carbonic anhydrase molecule ff131000, ovalbumin molecular weight 4500
0, bovine serum albumin molecular weight 66,200, and phospholipase B molecular weight 92,500.
泳動終了後のゲルをウマシーブリリアントブルーＲ２５
０により染色し、タンパク質を検出した。After the electrophoresis, the gel was coated with Horsesea Brilliant Blue R25.
The protein was detected by staining with 0.
同時に泳動したゲルについて、公知の方法〔国都、＜１
９８３）細胞工学２１０６１−１０６８）を用いてニト
ロセルロース膜にタンパク質を移した後、第一抗体とし
て市販の抗ヒトβ型インターフェロンウマイムノグロブ
リンあるいは抗ヒトγ型インターフェロンウマイムノグ
ロブリンを用い、さらにペルオキシダーゼ標識したプロ
ティンＡと反応させることによりインターフェロン結合
体の位置を決定した。上前ウェスタンブロッティングの
結果とマーカータンパク質の相対移動度の結果より、イ
ンターフェロン結合体の分子量はＩＦＮ−γβ、ＩＦＮ
−βγは共に約３７０００であり、ＩＦＮ−γＣβは約
３８０００であった。すなわち、ヒトβ型インターフェ
ロン（分子量約２００００）とヒト７・型インターフェ
ロン（分子量約１７０００＞が連結され、一つのポリペ
プチドとなっていることがわかった。The gels that were run at the same time were analyzed using a known method [Kokuto, <1
After transferring the protein to a nitrocellulose membrane using Cell Engineering 21061-1068), commercially available anti-human β-type interferon horse immunoglobulin or anti-human γ-type interferon horse immunoglobulin was used as the first antibody, and further peroxidase labeling was performed. The location of the interferon conjugate was determined by reacting it with the protein A obtained. From the results of Western blotting and the relative mobility of marker proteins, the molecular weight of the interferon conjugate was determined to be IFN-γβ, IFN-γβ, and IFN-γβ.
-βγ were both about 37,000, and IFN-γCβ was about 38,000. That is, it was found that human β-type interferon (molecular weight approximately 20,000) and human type 7 interferon (molecular weight approximately 17,000) were linked to form one polypeptide.
実施例４に示す方法で調製したＥ、ｃｏｌｉＨＢＩＯＩ
（ｐｔｒｐ６ｈｕＩＦＮ−ｒβ）からの粗インターフ
ェロン抽出液を５％仔ウシ血清１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ
（ｐＨ７，３）を含むイーグルＭＥＭ培地で５倍に希
釈する。このインターフェロン液１ｍｌに対し、同培地
で５０倍に希釈した抗ＩＦＮ−βウサギ抗血清（中和価
２７００ Ｕ／ｍ１）、あるいは抗ＩＦＮ−γウサギ抗
血清（中和価２０００ Ｕ ／ ｍｌ ）を１ｍ１加え
、３７℃で３０分間保温したものについて抗つイスル活
性を測定した。この時、対照として抗血清の代わりに培
地のみを入れたもの、また各々の抗血清希釈液０．５ｍ
ｌずつ入れたものについても同様に測定しな。結果を第
２表に示す。E. coli HBIOI prepared by the method shown in Example 4
The crude interferon extract from (ptrp6huIFN-rβ) was mixed with 5% calf serum 10mM Hepes.
Dilute 5 times with Eagle MEM medium containing (pH 7.3). Add anti-IFN-β rabbit antiserum (neutralizing titer 2,700 U/ml) or anti-IFN-γ rabbit antiserum (neutralizing titer 2,000 U/ml) diluted 50 times with the same medium to 1 ml of this interferon solution. The anti-irritant activity was measured after adding 1 ml of the mixture and keeping it warm at 37°C for 30 minutes. At this time, as a control, only medium was added instead of antiserum, and 0.5 m of each antiserum dilution was added.
Do the same measurement for each liter of water. The results are shown in Table 2.
第２表
各々の抗血清により活性が中和され、ミドβ型あるいは
γ型インターフェロ２両方の作用を持つことが明らかと
なった。また抗血清中和時にたとえば抗ＩＦＮ−γ抗血
清を用いた場合、６．０×１０５Ｕ／ｄを中和価２０Ｕ
／ｍｌの抗血清で中和すると、１ 、 ７Ｘ １０３Ｕ
／ｒｄ！となることから、このＩ ＦＮ−ｒ−βはＩＦ
Ｎ−β、Ｉ ＦＮ−７”の相乗作用を現わしていること
がわかった。The activity was neutralized by each antiserum in Table 2, and it was revealed that the antiserum had the effect of both mid-β-type and γ-type interfero-2. In addition, when using anti-IFN-γ antiserum during antiserum neutralization, the neutralization value is 20U at 6.0×105U/d.
When neutralized with antiserum at 1.7X 103U/ml
/rd! Therefore, this IFN-r-β is IF
It was found that the synergistic effect of N-β and IFN-7'' was exhibited.
実施例７
ｐｔｒｐ６ｈｕ ＩＦＮ−βｃ７の作製方法を第１２図
に示す。プラスミドｐＫＭ６−ｃｘｈ。Example 7 A method for producing ptrp6hu IFN-βc7 is shown in FIG. 12. Plasmid pKM6-cxh.
２０μ９をＸｈＯＪ消化した後、１５単位のマングビー
ンヌクレアーゼで３７℃１５分間処理し、平滑末端を形
成させた後５ａｌＩ消化した。これをアガロースゲル電
気泳動にかけ約４５００ｂｐのＤＮＡ断片を分取した。After 20μ9 was digested with XhOJ, it was treated with 15 units of mung bean nuclease at 37°C for 15 minutes to form blunt ends, and then digested with 5alI. This was subjected to agarose gel electrophoresis and a DNA fragment of approximately 4500 bp was fractionated.
別にｐ６ｈＵ７Ｎ１ΔＢＳ−ＮＨｉｎ ３０μ９＠Ｈ
ｉｎＰＩ、Ｓａｌ工消化後、アガロースゲル電気泳動に
より約８６０ｂｐのＤＮＡ断片を分取した。上記２つの
ＤＮＡ断片と実施例３に示す方法で得たスペーサーポリ
ペプチドを暗号化するＤＮＡ断片’ｌＱｐｍｏｌｅを混
合、Ｔ ４ ’Ｄ Ｎ Ａリガーゼにより連結し、Ｅ、
ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩを形質転換した。得られたア
ンピシリン耐性を示す形質転換体２０４株について、実
施例２に示したプローブ、およびスペーサーポリペプチ
ドを暗号化するＤＮＡ断片作製の際に用いたＤＮＡオリ
ゴマー５ ’ −ＣＧＴＴＡＣＣＧＡＣＴＴＡＧＣＡを
プローブとして、コロニーハイブリダイゼーションを行
った。２株が陽性を示し制限酵素を用いた分析結果から
、１株が目的のプラスミドｐｔｒｐ６ｈｕ ＩＦＮ−β
Ｃγを保持していた。。この時同時に形質転換体Ｅ、ｃ
ｏｌｉ ＨＢＩＯＩ（ｐｔｒｐ６ｈｕＩＦＮ−βｃｒ
＞を得た。実施例４の方法に従ってこの菌株を培養、菌
体抽出液を作製し、抗ウィルス活性を測定した。抽出液
あたり３ 、９ Ｘ １０４Ｕ／ｍｌの抗ウィルス活性
が認められた。Separately p6hU7N1ΔBS-NHin 30μ9@H
After digestion with inPI and Sal, a DNA fragment of approximately 860 bp was fractionated by agarose gel electrophoresis. The above two DNA fragments and the DNA fragment 'lQpmole encoding the spacer polypeptide obtained by the method shown in Example 3 were mixed, ligated with T4' DNA ligase, and E.
E. coli HBIOI was transformed. The obtained 204 transformants exhibiting ampicillin resistance were subjected to colony hi Breedization was performed. Two strains were positive, and from the analysis results using restriction enzymes, one strain was found to be the target plasmid ptrp6hu IFN-β.
It retained Cγ. . At this time, transformants E and c
oli HBIOI(ptrp6huIFN-βcr
> obtained. This strain was cultured according to the method of Example 4, a bacterial cell extract was prepared, and the antiviral activity was measured. Antiviral activity of 3.9 x 104 U/ml per extract was observed.
実施例６に示す方法により、Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯ
Ｉ （ｐｔｒｐ６ｈｕＩＦＮ−７ｃβ）からの租インタ
ーフェロン抽出液について、抗体による中和を検討した
。比較のため、組換え体により製造されたＩＦＮ−β、
ＩＦＮ−γをほぼ等量混合したもの（ＩＦＮ混液：終濃
度ＩＦＮ−β ８６００ Ｕ ／ ｍｌ、Ｉ Ｆ Ｎ
ｒ ２４００ Ｕ ／ ｍｌ ）を用いて同様の実
験を行った。結果を第３表に示す。By the method shown in Example 6, E. coli HBIO
Neutralization using antibodies was investigated for the extract of milled interferon from I (ptrp6huIFN-7cβ). For comparison, recombinantly produced IFN-β,
A mixture of approximately equal amounts of IFN-γ (IFN mixture: final concentration 8600 U/ml of IFN-β, IFN
A similar experiment was performed using r 2400 U/ml). The results are shown in Table 3.
第３表
ＩＦＮ−７ｃβにおいても、それぞれ抗ＩＦＮ−β、抗
ＩＦＮ−γ抗血清により活性が部分的に中和され、さら
に両抗血清の存在により、はぼ完全に活性は失われた。Regarding IFN-7cβ in Table 3, the activity was partially neutralized by the anti-IFN-β and anti-IFN-γ antisera, respectively, and the activity was almost completely lost in the presence of both antisera.
すなわち、ＩＦＮ−γＣβはＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γの
立体構造をとったらのが１つのポリペプチドに連結され
ており、両者の活性を１つのポリペプチドで発揮してい
ることがわがっな。That is, it is understood that IFN-γCβ takes the three-dimensional structures of IFN-β and IFN-γ, and is linked to one polypeptide, and exerts both activities with one polypeptide.
また、ＩＦＮ混液に見られる抗ウィルス作用に間する相
乗作用をＩＦＮ−γＣβも同様に示しており、この分子
が１分子でＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γの相乗作用を示すこ
とを確認した。In addition, IFN-γCβ similarly exhibited the synergistic effect between the antiviral action seen in the IFN mixture, and it was confirmed that this molecule exhibits a synergistic effect between IFN-β and IFN-γ in one molecule.
ｐＳＶβは、ヒトインターフェロン３発現ベクターｐＳ
Ｖ２４ＦＮβ（特開昭６１−５２２８３＞から真核細胞
での複製を阻害する配列（Ｈ，Ｌｕ５ｋｙｅｔ ａｔ、
Ｎａｔｕｒｅ、 ２９３．７９．１９８１）を除去し
たベクターである。作製方法は以下の通りである。pSVβ is human interferon 3 expression vector pS
V24FNβ (Japanese Unexamined Patent Publication No. 61-52283), a sequence that inhibits replication in eukaryotic cells (H, Lu5kyet at,
Nature, 293.79.1981) has been removed. The manufacturing method is as follows.
まず、ｐＳＶ２１．ＦＮβの５ｖ４０初期７’Ｏモータ
ーの上流にあるＰｖｕ ｌｌ［サイトを５ａｌＩリンカ
−を用いて５ａｌＩサイトに置き換えたあと、５ａｌＩ
とＢａｍＨＩで切断してヒトインターフェロンβの発現
に必要な１．７ＫｂのＮＤＡ断片を分離した。First, pSV21. After replacing the Pvu ll [site upstream of the 5v40 early 7'O motor of FNβ with the 5alI site using a 5alI linker, the 5alI
and BamHI to isolate a 1.7 Kb NDA fragment necessary for the expression of human interferon β.
次に、ｐＢＲ３２２から真核細胞での複製を阻害する配
列を除いたベクターｐＭＬ２ｄ （Ｍ、Ｌυｓｋｙ ｅ
ｔ ａｌ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２９３．７９．１９８１
）をＳａｌ工をＢａｍＨＩで切断し長鎖断片を分離した
。Next, vector pML2d (M, Lυsky e
tal, Nature, 293.79.1981
) was digested with BamHI and the long chain fragment was separated.
これら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
結合しｐＳＶβを得な。These two DNA fragments are ligated using T4 DNA ligase to obtain pSVβ.
上記Ａ項で得られたｐＳＶβを制限酵素Ｓａｌ工で切断
後、Ｈｉｎｄｌｌ［リンカ−を用いてＳａｌ■サイトを
ＨｉｎｄｌｌＪサイトに置き換えなあと、ＨｉｎｄｌＩ
Ｉで切断してＳＶ４０初期プロモーターを含まない３．
８ＫｂのＤＮＡ断片を分離した。After cleaving the pSVβ obtained in Section A above with restriction enzyme Sal, Hindll[linker is used to replace Sal■ site with HindllJ site, HindlI
3. Cut with I and do not contain the SV40 early promoter.
An 8 Kb DNA fragment was isolated.
さらに、ＢＡＰ （大腸菌アルカリフォスファターゼ）
処理により末端のリンを除いた。Furthermore, BAP (Escherichia coli alkaline phosphatase)
Terminal phosphorus was removed by treatment.
次に、ＭＭＴＶプロモーターを含むベクターｐＭＴＶｄ
ｈ ｆ ｒ （Ｆ、Ｌｅｅ ｅｔ ａｔ、 Ｎａｔｕｒ
ｅ、 ２９４．２２８、１９８２ ）を制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩ［［で切断することによりＭＭＴＶプロモーターを
含む１．４ＫｂのＤＮＡ断片を分離した。Next, the vector pMTVd containing the MMTV promoter
h f r (F, Lee et at, Natur
e, 294.228, 1982) with the restriction enzyme Hin
A 1.4 Kb DNA fragment containing the MMTV promoter was isolated by cutting with dI.
これら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
結合することによりｐＭＴＶβを得た。pMTVβ was obtained by ligating these two DNA fragments using T4 DNA ligase.
ｐＭＴＶγは、ヒトインターフェロンγ遺伝子をＭＭＴ
Ｖプロモーターの支配下に置いたベクターである。作製
方法は以下の通りである。pMTVγ converts the human interferon γ gene into MMT
This is a vector placed under the control of the V promoter. The manufacturing method is as follows.
上記Ｂ項で得られたｐＭＴＶβをＭＭＴＶプロモーター
下流にあるＨｉｎｄＩｆｆサイトとヒトインターフェロ
ン遺伝子の下流にあるＢｇｌＩＩサイトで切断後、ＤＮ
Ａポリメラーゼエに１ｅｎｏｗ断片処理で平滑末端化し
てから、ＭＭＴＶプロモーターを含む３．９ｋｂのＤＮ
Ａ断片を分離した。After cutting pMTVβ obtained in Section B above at the HindIff site downstream of the MMTV promoter and the BglII site downstream of the human interferon gene, the DN
A 3.9kb DNA containing the MMTV promoter was made blunt-ended by 1ennow fragment treatment with A polymerase.
Fragment A was isolated.
このＤＮＡ断片とｐ ＳＶ Ｉ ＦＮγ（特開昭６１−
５２２８６＞をＤｐｎ工切餅切断得られるヒトインター
フェロンγ遺伝子を含む０．８ＫｂのＤＮＡ断片をＴ
４ Ｄ Ｎ Ａリガーゼを用いて結合することによりｐ
ＭＴＶγを得た。This DNA fragment and pSV I FNγ (Unexamined Japanese Patent Publication No. 1986-
A 0.8 Kb DNA fragment containing the human interferon γ gene obtained by cutting Dpn-52286> into T
4 by ligation using DNA ligase.
MTVγ was obtained.
ｐＭＴＶ（ＳＶ）γは、ｐＭＴＶγのＭＭＴＶプロモー
ターの上流にＳＶ４０初期プロモーターを導入したベク
ターである。作製方法は以下の通りである。pMTV(SV)γ is a vector in which the SV40 early promoter is introduced upstream of the MMTV promoter of pMTVγ. The manufacturing method is as follows.
上記０項で得られたｐＭＴＶγをＳａｌ工で切断後、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩＫ１ｅｎｏｗ断片処理により平滑末
端化してからＢＡＰ処理により末端のリンを除いた。After cutting the pMTVγ obtained in the above section 0 with Sal,
The ends were made blunt by NA polymerase IK1enow fragment treatment and the terminal phosphorus was removed by BAP treatment.
次に、ｐＳＶ２ＩＦＮβ（特開昭６ｌ−５２２８３）を
Ｐｖｕ［とＨｉｎｄ■で切断しＳＶ４０初期プロモータ
ーを含む０．３ＫｂのＤＮＡｒｇｒ片を分離してから、
ＤＮＡポリメラーゼエに１ｅｎＯｗ断片処理により平滑
末端化した。Next, pSV2IFNβ (JP 61-52283) was cut with Pvu[ and Hind■, and a 0.3 Kb DNA Argr piece containing the SV40 early promoter was isolated.
The ends were made blunt by treating with 1enOw fragment using DNA polymerase.
これら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
結合することによりｐＭＴＶ （ＳＶ）γを得た。pMTV(SV)γ was obtained by ligating these two DNA fragments using T4 DNA ligase.
Ｅ、ヒトインターフェロン 糸七合体動物細胞発ニブ
ラス≧ド ＭＴＶ ＳＶ 、 の Ｓ：ｐ ＭＴ
Ｖ （Ｓ Ｖ ） ”ｒ、／３はｐＭＴＶ（ＳＶ）ｒの
ヒトインターフェロンγ遺伝子をヒトインターフェロン
γβ結合体遺伝子に置き換えたベクターであって、次の
ようにして作製しなく第１３図参照χ実施例１に従って
得られたｐｔｒｐ６ｈｒＩＦＮ−７−βの１０μｆをＮ
ｄｅ 工とＤｐｕ工で消化した後、アガロースゲル電気
泳動により約１３００ｂｐのＤＮＡ断片を分取した。別
に、前記り項により得られたｐＭＴＶ （ＳＶ）７をＢ
ａ１ｌＩで消化した後、ＤＮＡポリメラーゼＩＫ１ｅｎ
ｏｗ断片処理により平滑末端を形成さぜ、さらにＮｄｅ
Ｉで消化してアガロースゲル電気泳動により約５１００
ｂｐのＤＮＡ断片を分取しな。それぞれのＤＮＡ断片を
混合、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、ｐＭＴＶ （
ＳＶ）？−・βを得た。E, human interferon heptalytic animal cell-derived nibulus ≥ de MTV SV, S: p MT
V (S V ) "r, /3 is a vector in which the human interferon γ gene of pMTV (SV) r is replaced with the human interferon γ β conjugate gene, and it is not produced as follows, but is carried out as shown in Figure 13. 10 μf of ptrp6hrIFN-7-β obtained according to Example 1 was
After digestion with de and Dpu, a DNA fragment of approximately 1300 bp was fractionated by agarose gel electrophoresis. Separately, pMTV (SV)7 obtained in the above section was
After digestion with a1lI, DNA polymerase IK1en
ow fragment treatment to form blunt ends, and further Nde
Digested with I and analyzed by agarose gel electrophoresis to obtain approximately 5100
Separate bp DNA fragments. The respective DNA fragments were mixed and ligated using T4 DNA ligase to create pMTV (
SV)? −・β was obtained.
ｐＭＴＶ （ＳＶ）ｒｃβは、ｐＭＴＶ （ＳＶ）γの
ヒトインターフェロ以遺伝子をヒトインターフェロンγ
Ｃβ結合体遺伝子に置き換えたベクターであって、次の
ようにして作製しな（第１４図参照）。pMTV (SV)rcβ is the human interferon gene of pMTV (SV) γ.
A vector in which the Cβ conjugate gene is replaced is prepared as follows (see Figure 14).
実施例３に従って得られたｐｔｒｐ６ｈｒ丁ＦＮ−７ｃ
βの１０μｇをＮｄｅ■とＤｐｕ工で消化した後、アガ
ロースゲル電気泳動により約１３００ｂｐのＤＮＡ断片
を分取した。別に、実施例９のＤ項により得られたＰＭ
ＴＶ（ＳＶ）γをＢａ１ｌＩで消化した後、ＤＮＡポリ
メラーゼＩＫＩｅｎｏｗＩｒ片処理により平滑末端を形
成させ、さらにＮｄｅ 王で消化してアガロースゲル電
気泳動により約５１００ｂｐ（７）ＤＮＡ断片を分取し
な。ptrp6hr Ding FN-7c obtained according to Example 3
After 10 μg of β was digested with Nde■ and Dpu, a DNA fragment of about 1300 bp was fractionated by agarose gel electrophoresis. Separately, PM obtained according to Section D of Example 9
After digesting TV(SV)γ with BalI, blunt ends were formed by treatment with DNA polymerase IKIenowIr, further digestion with Nde King, and a DNA fragment of approximately 5100 bp (7) was fractionated by agarose gel electrophoresis.
それぞれのＤＮＡ断片を混合、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによ
り連結し、ｐＭＴＶ （ＳＶ）γＣβを得な。The respective DNA fragments were mixed and ligated using T4 DNA ligase to obtain pMTV(SV)γCβ.
実施例９に従って得られたｐＭＴＶ（ＳＶ）γ。pMTV(SV)γ obtained according to Example 9.
β４μｇと０４１８耐性遺伝子発現ベクターｐＳＶ２ｎ
ｅｏ （Ｊ、５ｏｕｔｈｃｓｅｔ ａｌ、 Ｊ、Ｍ
ｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ。β4μg and 0418 resistance gene expression vector pSV2n
eo (J, 5outhcset al, J, M
o1. Appl, Genet.
、 １Ｌ３２７．１９８２） ０ 、４μｇとを、リン
酸カルシウム法（Ｆ、Ｌ、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ、
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 ５４．５３６゜１９７３）にて
約１０６個のヒト肺癌由来ＰＣＩ２細胞（Ｈ，Ｋｉｎｊ
ｏ ｅｔ ａｔ、 Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、 ３９．
１５． ｔ９７９）に導入した。蛋白阻害剤Ｇ４１８（
ＧＩＢＣＯ社）を４００μｇ／ｍｌの濃度で含む選択培
地〔牛胎児 。, 1L327.1982) 0, 4 μg using the calcium phosphate method (F, L, Graham et al.
About 106 human lung cancer-derived PCI2 cells (H, Kinj
o et at, Br, J, Cancer, 39.
15. t979). Protein inhibitor G418 (
A selective medium containing GIBCO (Bovine Fetus) at a concentration of 400 μg/ml.
血清１０％とカナマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＲＰ
Ｍ１１６４０培地（日永製薬）〕にて培養したところ、
２４個の形質転換体を得た。RP containing 10% serum and 100 μg/ml kanamycin
When cultured in M11640 medium (Hinaga Pharmaceutical),
Twenty-four transformants were obtained.
培養上清の抗ウィルス活性を、ＦＬ細胞−シンドビスウ
イルスを用いた実施例４に記載のＣＰＥ５ｏ阻止法で測
定したところ、２２個に活性が認められた。活性測定の
結果を第４表に示す。When the antiviral activity of the culture supernatant was measured by the CPE5o inhibition method described in Example 4 using FL cell-Sindbis virus, activity was observed in 22 cells. The results of the activity measurement are shown in Table 4.
以下余白
第４表
犬旌透１ス
実施例１０に従って得られたｐＭＴＶ （ＳＶ）７ｃβ
４μｇとｐｓＶ２ｎｅｏ （実施例１１９照）０．４
μｇとを、実施例１１に準じてリン酸カルシウム法にて
約１０６個のＰＣＩ２細胞に導入した。蛋白合成阻害剤
Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ社）を４００μｇ ／ ｍｌの濃
度で含む選択培地〔牛胎児血清１０％とカナマイシン１
００μｇ ／ ｍｌを含むＲＰＭ１１６４０培地（日永
製薬）〕にて培養したところ、２６個の形質転換体を得
な。Table 4 below: pMTV (SV)7cβ obtained according to Example 10
4 μg and psV2neo (see Example 119) 0.4
μg was introduced into approximately 10 6 PCI2 cells using the calcium phosphate method according to Example 11. Selective medium containing protein synthesis inhibitor G418 (GIBCO) at a concentration of 400 μg/ml [10% fetal bovine serum and 1 kanamycin]
When cultured in RPM11640 medium (Hinaga Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 00 μg/ml, 26 transformants were obtained.
培養上清の抗ウィルス活性を、実施例１１と同様にＦＬ
細胞−シンドビスウイルスを用いたＣＰＥ５ｏ阻止法で
測定しなところ、２０個に活性が認められた。活性測定
の結果を第５表に示す。The antiviral activity of the culture supernatant was measured using FL as in Example 11.
When measured by CPE5o inhibition method using cell-Sindbis virus, activity was observed in 20 cells. The results of the activity measurement are shown in Table 5.
第５表
〔発明の効果〕
以上のように、本発明はβ型インターフェロンとγ型イ
ンターフェロンを暗号化する塩基配列を連結し、遺伝子
操作の手法を用いて組換え体により、従来天然には存在
しなかったインターフェロン結合体を生産させたもので
ある。Table 5 [Effects of the Invention] As described above, the present invention connects the base sequences encoding β-type interferon and γ-type interferon, and uses genetic engineering techniques to create recombinants that do not exist in nature in the past. This product produced an interferon conjugate that did not.
本発明により得られたインターフェロン結合体は、従来
β型インターフェロンあるいはγ型インターフェロンそ
れぞれに担われていた作用を単独のポリペプチドで示す
ため、今までの単独のインターフェロンには見られなか
った幅広い抗ウイルス作用スペクトルあるいは抗細胞増
殖作用スペクトルなどの作用スペクトルを示すものであ
る。すなわち既存のインターフェロンよりすぐれた抗ウ
ィルス剤、抗腫瘍剤として使用することが可能である。The interferon conjugate obtained by the present invention exhibits the effects of conventional β-type interferon or γ-type interferon as a single polypeptide, so it has a wide range of antiviral properties that have not been seen with single interferons up until now. It shows the action spectrum such as action spectrum or anti-cell proliferation action spectrum. That is, it can be used as an antiviral agent and an antitumor agent superior to existing interferons.
またインターフェロン結合体は、β、γ型インターフェ
ロン混合物が示す相乗作用を一つのポリペプチドで示す
ため、分子あたりの活性が増大し今までのインターフェ
ロンに見られない強力な作用を持つこととなる。このよ
うに相乗作用を期待するためインビトロの実験では既存
のβ、γ型インターフェロンを混合すればよいが、イン
ビボではそれぞれの体内動態が異なり、目的の部位に必
ずしもβ、γ型インターフェロン両者が存在していると
は限らない。インターフェロン結合体においては１分子
で元の相乗作用を発揮しているため、このような体内動
態の問題はおこらず期待される高い活性が発現される。Furthermore, since the interferon conjugate exhibits the synergistic effect of a mixture of β and γ interferon in a single polypeptide, the activity per molecule increases and it has a powerful effect not seen in previous interferons. In order to expect a synergistic effect, existing β- and γ-type interferons can be mixed in in vitro experiments, but in vivo, their pharmacokinetics are different, and both β- and γ-type interferons may not necessarily be present at the target site. It doesn't necessarily mean that Since the interferon conjugate exhibits its original synergistic effect with just one molecule, such problems with pharmacokinetics do not occur and the expected high activity is expressed.
すなわちインターフェロン結合体は既存のインターフェ
ロン、あるいはその混合物より作用の高い抗ウィス剤、
抗Ｍ瘍剤として利用できる。In other words, the interferon conjugate is an anti-Whisper agent that is more effective than existing interferons or their mixtures.
It can be used as an anti-M tumor agent.
またβ、γ型インターフェロン混合物を調製する際に、
従来はそれぞれのポリペプチドを別々に調製しその後混
合する必要があったが、本発明のポリペプチドであれば
一度の調製で同じ効果を発揮できる。このようにして生
産されたインターフェロン結合体はそのまま結合体ポリ
ペプチドとしても使用できるし、必要に応じて連結部分
を切り離してβ、γ型インターフェロン混合物としても
使用できる。いずれにしてもその調製の操作は、各々の
インターフェロンを別々に調製する場合にくらべ簡略化
されることになる。In addition, when preparing a mixture of β and γ interferon,
Conventionally, each polypeptide had to be prepared separately and then mixed, but the polypeptide of the present invention can exhibit the same effect with a single preparation. The interferon conjugate produced in this way can be used as a conjugate polypeptide as it is, or can be used as a β- and γ-type interferon mixture by cutting off the linking portion, if necessary. In any case, the preparation procedure will be simpler than when each interferon is prepared separately.
第１図は成熟ヒトβ型インターフェロンのアミノ酸配列
の一例を、第２図は成熟ヒトγ型インターフェロンのア
ミノ酸配列の一例を示す。第３図はヒトβ型インターフ
ェロン発現プラスミドｐＫＭ６の構造を示し、第４図は
ヒトγ型インターフェロン発現プラスミドｐ６ｈｕγ−
Ｎ１の構造を示す。第５図はヒトβ型インターフェロン
構造遺伝子を取り出すためにｘｈｏＩ部位を導入したプ
ラスミドｐｋＭ６−ｃｘｈｏの構造を示す。また第６図
、第７図にはヒトγ型インターフェロン構造遺伝子を取
り出すために、それぞれＫｐｎＩ、ＨｉｎＰＩ部位を導
入したプラスミドｐ６ｈｕγＮ１−ＣＫｐｎ、ｐ６ｈｕ
７Ｎ１△ＢＳ−ＮＨｉｎの構造を示す。第８図はインタ
ーフェロン７−・β結合体発現プラスミド作成の概要を
、第９図はインターフェロンβ・γ結合体発現プラスミ
ド作成の概要を示す。第１０図はインターフェロンγＣ
β結合体発現プラスミド作成の概要を示す。第１１図に
はスペーサーペプチドのアミノ酸配列および暗号化する
塩基配列を示す。第１２図はインターフェロンβＣγ結
合体プラスミド作成の概要を表す。
第１３図はヒトインターフェロンγ・β結合体動物細胞
発現プラスミド作成の概要を示す。第１４図はヒトイン
ターフェロンγＣβ結合体動物細胞発現プラスミド作成
の概要を示す。
１・・・・・・ヒトβ型インターフェロン構造遺伝子２
・・・・・・ヒトＴ型インターフェロン構造遺伝子３・
・・・・・ヒトＴ型インターフェロンＣＤＮＡのポリペ
プチドを暗号化しない部分
４・・・・・・ＳＶ４０初期プロモーター５・・・・・
・ＭＭＴＶプロモーター
６・・・・・・ヒトＴ型インターフェロンのシグナルペ
プチド配列
特許出願人 東 し 株 式 会 社ＤＹＶ
ｈケ
弔′７ Ｍ
ＴＱＬＣｉＱＰＫＡＡＫＳＶＴ
ＡＣＴＣＡＣ；ＣＴＧＧＣ；ＣＣＡＧＣＣＧＡＡＡＧＣ
ＴＧＣＴＡＡＧＴＣＣｉＧＴＡＡＴＧＡＧＴＣＧＡＣＣ
ＣＧＧＴＣＧＧＣＴＴＴＣＧＡＧＣＡＴＴＣＡＣ；ＣＣ
ＡＴＴＧＣ竿１１口FIG. 1 shows an example of the amino acid sequence of mature human β-type interferon, and FIG. 2 shows an example of the amino acid sequence of mature human γ-type interferon. Figure 3 shows the structure of human β-type interferon expression plasmid pKM6, and Figure 4 shows the structure of human γ-type interferon expression plasmid p6huγ-
The structure of N1 is shown. FIG. 5 shows the structure of plasmid pkM6-cxho into which an xhoI site has been introduced to extract the human β-type interferon structural gene. In addition, Fig. 6 and Fig. 7 show plasmids p6huγN1-CKpn, p6hu
The structure of 7N1ΔBS-NHin is shown. FIG. 8 shows an outline of the construction of a plasmid expressing an interferon-7-β conjugate, and FIG. 9 shows an outline of construction of a plasmid expressing an interferon β-γ conjugate. Figure 10 shows interferon γC
An outline of the construction of a β-conjugate expression plasmid is shown. FIG. 11 shows the amino acid sequence of the spacer peptide and the encoding base sequence. FIG. 12 shows an outline of the construction of interferon βCγ conjugate plasmid. FIG. 13 shows an outline of the construction of a plasmid for expressing human interferon γ/β conjugate in animal cells. FIG. 14 shows an outline of the construction of a plasmid for expressing human interferon γCβ conjugate in animal cells. 1...Human β-type interferon structural gene 2
...Human T-type interferon structural gene 3.
...portion of human T-type interferon CDNA that does not encode a polypeptide 4 ...SV40 early promoter 5 ...
・MMTV promoter 6...Signal peptide sequence of human T-type interferon Patent applicant Azuma Shi Co., Ltd. DYV hke-sorou'7 M TQLCiQPKAAKSVT ACTCAC;CTGGC;CCAGCCGAAAGC
TGCTAAGTCCiGTAATGAGTCGACC
CGGTCGGCTTTCGAGCATTCAC; CC
ATTGC rod 11 mouths
Claims (3)
連結してなるインターフェロン結合体を暗号化する塩基
配列(1) Base sequence encoding an interferon conjugate formed by linking β-type interferon and γ-type interferon
連結してなるインターフェロン結合体を暗号化する塩基
配列を含み、その前部に該結合体の発現のための制御部
位を暗号化する塩基配列を有する組換え体ＤＮＡ。(2) A set containing a base sequence encoding an interferon conjugate formed by linking β-type interferon and γ-type interferon, and having a base sequence encoding a control site for the expression of the conjugate at the front thereof. Replacement DNA.
連結してなるインターフェロン結合体を暗号化する塩基
配列を含み、その前部に該結合体の発現のための制御部
位を暗号化する塩基配列を有する組換え体ＤＮＡにより
形質転換された形質転換体。(3) A set containing a base sequence encoding an interferon conjugate formed by linking β-type interferon and γ-type interferon, and having a base sequence encoding a control site for the expression of the conjugate at the front thereof. A transformant transformed with recombinant DNA.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62056677A JPS63267278A (en) | 1986-03-14 | 1987-03-13 | Base sequence coding bonded interferon |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61-54651 | 1986-03-14 | ||
| JP5465186 | 1986-03-14 | ||
| JP61-308694 | 1986-12-26 | ||
| JP62056677A JPS63267278A (en) | 1986-03-14 | 1987-03-13 | Base sequence coding bonded interferon |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63267278A true JPS63267278A (en) | 1988-11-04 |
Family
ID=26395448
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62056677A Pending JPS63267278A (en) | 1986-03-14 | 1987-03-13 | Base sequence coding bonded interferon |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63267278A (en) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5196320A (en) * | 1989-09-20 | 1993-03-23 | Abbott Biotech, Inc. | Method of producing engineered binding proteins |
| JPH06500116A (en) * | 1990-08-29 | 1994-01-06 | ジェネティックス・インスティテュート・インコーポレイテッド | Multiregional hematopoietic stimulating factors |
| WO2001047545A1 (en) * | 1999-12-28 | 2001-07-05 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Preventives and remedies for chronic hepatitis |
| US6617135B1 (en) | 1999-08-09 | 2003-09-09 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Multiple cytokine protein complexes |
| US8907066B2 (en) | 2009-04-22 | 2014-12-09 | Merck Patent Gmbh | Antibody fusion proteins with a modified FcRn binding site |
| US8926973B2 (en) | 2001-03-30 | 2015-01-06 | Merck Patent Gmbh | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
-
1987
- 1987-03-13 JP JP62056677A patent/JPS63267278A/en active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5196320A (en) * | 1989-09-20 | 1993-03-23 | Abbott Biotech, Inc. | Method of producing engineered binding proteins |
| JPH06500116A (en) * | 1990-08-29 | 1994-01-06 | ジェネティックス・インスティテュート・インコーポレイテッド | Multiregional hematopoietic stimulating factors |
| US6617135B1 (en) | 1999-08-09 | 2003-09-09 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Multiple cytokine protein complexes |
| WO2001047545A1 (en) * | 1999-12-28 | 2001-07-05 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Preventives and remedies for chronic hepatitis |
| US8926973B2 (en) | 2001-03-30 | 2015-01-06 | Merck Patent Gmbh | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
| US8907066B2 (en) | 2009-04-22 | 2014-12-09 | Merck Patent Gmbh | Antibody fusion proteins with a modified FcRn binding site |
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