JPS6313969B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPS6313969B2 JPS6313969B2 JP52029814A JP2981477A JPS6313969B2 JP S6313969 B2 JPS6313969 B2 JP S6313969B2 JP 52029814 A JP52029814 A JP 52029814A JP 2981477 A JP2981477 A JP 2981477A JP S6313969 B2 JPS6313969 B2 JP S6313969B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rotor
- plasma
- gradient
- hbs antigen
- sodium bromide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Chemical compound [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 58
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 42
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 42
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 8
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 16
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 16
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 16
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 9
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 4
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 4
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M potassium bromide Chemical compound [K+].[Br-] IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- -1 cesium chloride Chemical class 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 206010022004 Influenza like illness Diseases 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010000059 abdominal discomfort Diseases 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004596 appetite loss Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 235000021266 loss of appetite Nutrition 0.000 description 1
- 208000019017 loss of appetite Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 208000013465 muscle pain Diseases 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- AVTYONGGKAJVTE-OLXYHTOASA-L potassium L-tartrate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O AVTYONGGKAJVTE-OLXYHTOASA-L 0.000 description 1
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001472 potassium tartrate Substances 0.000 description 1
- 229940111695 potassium tartrate Drugs 0.000 description 1
- 235000011005 potassium tartrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000013316 zoning Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
- A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Centrifugal Separators (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は肝炎B抗原の精製方法に関する。この
精製された肝炎B抗原はワクチンとして用い得
る。肝炎Bはウイルス性の肝炎の一種であつて、
全身性の感染をうけるが、主たる病変は肝臓に現
われる。この病気は主に成人のものであつて、主
としてウイルスの長期保有者からの感染の伝達に
よつて維持されている。普通の伝播経路は、輸
血、汚染された注射針や注射筒、切り傷やひつか
き傷のある皮膚、滅菌していない歯科用器具、唾
液、性交、エアゾル化した感染血液との接触等で
ある。
肝炎Bの潜伏期は比較的長く、感染から臨床的
発症までに6週間から6個月かかることもある。
病気は普通疲労と食欲不振から始まり、筋肉痛と
腹部の不快を伴うこともある。後に黄疽、黒い
尿、軽い便、及び軽度の肝臓腫張が起ることもあ
る。ある場合には、発現は急激で、発熱、悪感、
白血球の増加を伴つて黄疽が現れることもある。
ある場合には黄疽は決して現れず、患者はインフ
ルエンザ様の症状を感じるだけである。肝炎感染
の多くは軽度の、黄疽を伴わない症状になると考
えられている。
本発明はHBs抗原を含む清澄血漿を、HBs抗
原の実質的に全部が清澄血漿から密度勾配に入る
のには効果的であるが、HBs抗原の等密度バン
ド化を完成するには非効果的条件下で、密度勾配
中での部分的等密度バンド化法にかけ、HBs抗
原の無くなつた清澄血漿を取除き、第一の工程を
清澄血漿の新しいサンプルを用いて、少なくとも
もう一回くり返すことからなる多数回負荷を行な
い、ついで平衡に達するのに効果的な条件下で等
密度バンド化法を行ない、ついで速度ゾーン分画
にかけることを特徴とする清澄血漿からHBs抗
原を精製する方法を提供するものである。
本発明により精製された肝炎Bの表面抗原
(HBs抗原)の出発物質は肝炎Bをもつ供与者か
ら血漿搬出法(plasmaphoresis)等によつて得
られた血漿である。抗原の力価の測定は、ラジオ
イムノアツセイ、受動的凝血反応、あるいは補体
結合反応等の既知の方法で行うことができる。血
漿を冷却し、それによつて生ずる寒性沈澱
(cryoprecipitate)を軽度の遠心分離で除く。清
澄血漿中のHBs抗原は等密度バンド化法
(isopycnic banding step)とそれに続く速度ゾ
ーンバンド化法(rate zonal banding step)に
よつて単離される。
等密度バンド化法においては、部分精製した濃
縮液を単離される抗原と同じ密度を含む密度勾配
を作つた液体媒体と接触せしめる。ついで液体媒
体を超遠心分離にかけることによつて、血清成分
をそれぞれの密度によつて密度勾配中に平衡な分
布に達せしめる。液体媒体の連続する分画を分離
し、希望する抗原を含む分画、即ち、密度が約
1.21から約1.24g/c.c.である分画を分取する。こ
の方法をHBs抗原の精製に応用することはドイ
ツ特許明細書第2049515号及び合衆国特許第
3636191号に述べてある。密度勾配を作る溶液の
濃度は密度範囲が約1.0から約1.41g/c.c.になる
ように選ぶ。液体媒体は直線勾配であつても、段
階的勾配であつてもよい。より好ましくは、分画
に対するその固有のより高い能力のため、段階的
勾配の形式で用いられる。
速度ゾーンバンド化法においては、部分精製し
た濃縮液を密度勾配をもつ液体媒体と接触せしめ
超遠心分離を行うが、今回は速度ゾーン法を用い
る。即ち、平衡には達しないような速度と時間で
行い、HBs抗原及び他の血清成分が媒体中での
沈降定数によつて媒体中に分布するようにする。
勾配を作る溶液の濃度は密度範囲が約1.0から約
1.28g/c.c.にわたるように選ぶ。速度ゾーン法は
HBs抗原が1.13から1.16の密度範囲にくるまで行
う。この時点で、HBs抗原は粗血漿蛋白の大部
分から分離され、最も重要なことには、血漿中の
マクログロブリン補体から分離される。速度ゾー
ン法工程を希望するHBs抗原が平衡の位置、す
なわち、密度にして約1.18から1.20g/c.c.に達す
るまで行うと、血漿中のマクログロブリン分画
が、希望するHBs抗原の分画中に不純物として
混つてくることがわかつた。
等密度バンド化法及び速度ゾーン法工程におい
て用いる液体媒体は適当なる範囲の密度勾配なら
何でもよい。従来の技術ではそのような溶液の溶
質には庶糖、臭化カリウム、塩化セシウム、酒石
酸カリウム等が含まれていた。
等密度バンド化法工程を簡便に行うには、エレ
クトロヌクレオニクスK等の遠心分離機を用い、
動いていないローター中に塩溶液(saline
solution)を満たし、ついで一定量(aliquots)
の順次密度の大きくなる液体媒体溶液で塩溶液を
押し上げて段階的勾配を形成する。血漿は、底か
ら最高密度の溶液を一部分除くことによつて、ロ
ーターの上から導入する。典型的には、血漿の体
積は段階勾配の体積の15%から40%である。遠心
分離機は、最初のリオリエンテーシヨンフエース
間に混ざるのを防ぐようにプログラムされた速度
制御システムによつて速度をあげる。平衡に到達
して生成物が適当なる密度の位置にある時に、元
の位置にリオリエンテーシヨンする際に混ること
がないように、同じ速度制御システムによつてロ
ーターの速度をおとす。次いで勾配を下からぬい
ていき、適当なカツトした密度範囲を集める。同
様の方法を速度ゾーン法においても用いる。速度
ゾーンバンド化法による適当なる密度範囲の分画
が所望の肝炎Bの抗原の濃縮液である。HBs抗
原のサイズが20nmと小さいため、等密度バンド
化工程は時間がかかり、18時間もの遠心分離処理
を必要とする。その結果、毎日24時間、毎週7日
間運転しても、遠心分離機一台当り4バツチの清
澄血漿を処理しうるのみである。遠心分離機の台
数を増やせば生産性は上がるが、遠心分離機一台
は約10万ドルもするので、厖大な資本投資が必要
となる。
等密度バンド化用勾配を多数回負荷(multiple
loading)することによつて生産性が大きく向上
し、操作の費用が大幅に減少することがわかつ
た。多数回負荷とはHBs抗原を含む清澄血漿の
サンプルを、等密度バンド化の条件で、HBs抗
原の実質的に全部が勾配の中に入るのには効果的
であるが、平衡に到達するのには非効果的な時間
だけ処理し、この工程をHBs抗原を含む清澄血
漿の別のサンプルを用いて少くとももう1回くり
返した後、等密度バンド化処理を平衡に達するの
に充分な時間だけ行う。望ましい場合には、同一
の勾配を清澄血漿で6回まで負荷できる。清澄血
漿中のHBs抗原が勾配中に入るのに要する時間
は平衡に達するのに要する時間のごく一部である
から、そしてまた、その後の平衡に達するのに要
する時間は、勾配を1回だけ負荷しても多数回負
荷しても同じだから、時間が大幅に短縮でき、単
位処理費用が安くなる。
本発明による多数回バンド化法による生産性の
向上と費用の削減は、適当なる勾配のいずれを用
いても行いうるが、望ましくは勾配は臭化ナトリ
ウムによるものである。
等密度バンド化法は約40000gから約80000gで
約10時間以上遠心分離して平衡に達するまで行
う。しかしながら、血漿を約4時間遠心分離する
とほとんど全てのHBs抗原が等密度バンド化用
勾配中に入るのがわかつている。次いで用いた血
漿のサンプルを除き、最初に用いたのと同じ体積
の血漿標品を勾配の上に重層する。その後前と同
様の条件で約10時間以上遠心分離して両方の標品
中のHBs抗原が勾配中の平衡密度領域(約1.21か
ら約1.24g/c.c.)に入りバンド形成を完了させる
ことができる。あるいは別法として、遠心分離を
4時間行い、用いた血漿を除き、3番目の新しい
血漿を勾配上に重層することができる。この多数
回負荷法を6回あるいはそれ以上行つてから約18
時間遠心分離してからバンド形成を完了してもよ
い。
チヤージする血漿の体積と勾配の体積の比は約
1.3から約1.6である。血漿を1回だけ勾配にチヤ
ージして等密度バンド形成条件下で遠心分離する
と(例えば、K−遠心分離機で毎分30000回転、
約16時間から約20時間遠心分離処理)、最初の血
漿中の蛋白量によるが、生成物は普通1.0の容
量中に約4−10mg/mlの蛋白質含有量となる。
血漿を2回勾配にチヤージし、等密度バンド形
成条件下で遠心分離すると(毎分30000回転で約
16時間から約20時間)、最初の血漿中の蛋白質量
によるが、生成物中の蛋白質量は行つたチヤージ
回数について加算的になり、典型的には1.0の
容量中に約8−20mg/mlとなる。蛋白質量はこの
ように勾配に血漿をチヤージする毎に増大する。
生成物は次いで速度ゾーンバンド化法を行う。
速度ゾーンバンド化はHBs抗原が約1.13から1.16
g/c.c.の密度領域にくるまで行う。典型的にはこ
れは約16時間から約20時間を要し、より好ましく
は約30000gから約60000gで約17時間ないし、約
18時間である。
本発明の一つの態様においては、勾配は臭化ナ
トリウムを用いて作ることができる。これまで用
いられている材料に比して臭化ナトリウムには明
白な利点がある。臭化ナトリウムの溶解度は冷蔵
温度(2〜6℃)で勾配を作る際に高密度溶液を
使うのに適している。塩化セシウムのような塩を
使う場合に比して、残存のあるいはHBs抗原に
結合したセシウムイオンによる人体への毒性の問
題を解決する必要がないのみならず、経済的にも
明らかに有利である。臭化ナトリウムの勾配中で
は、生成物物理学的性質によつてHBs抗原に結
合するイオンは全てナトリウムイオンであり、人
体の生物学的系には充分受容可能であり、毒性の
問題を起さない。
HBs抗原の生物物理学的性質については既に
充分な報告があり〔臨床研究雑誌(J.Clinical
Investigation)第52巻、1176頁(1973年)、ウイ
ルス学雑誌、(J.of Virology)第10巻、469頁
(1972年)〕、陰電荷をもつた粒子である。陽電荷
をもつナトリウムイオンが高濃度に存在すると、
ナトリウム−HBs抗原の塩分子が形成される。
従前の技術によつて得られる製品に比して、本発
明を実施するのに好ましい方法で得られるHBs
抗原は他の陽イオン、殊に外から加えたセシウム
とカリウムイオンを実質的に含まない。
臭化カリウムに比して、臭化ナトリウムの低温
での溶解度が大きいので生体物質の安定性のため
に助けになる低温を用いることが可能である。段
階的勾配を用いる方が線形勾配に比して、段階の
界面に不純物が集まり、1つの勾配でより大量の
血漿を処理できるので望ましい。
本発明に関連する抗原はそのままで肝炎Bの抗
原として用いることができ、合衆国特許第
3636191号に述べてあるように使用できる。本発
明によるHBs抗原は高度に精製されたものであ
る。等密度バンド化によつてHBs抗原は正常血
漿蛋白質に比して約100倍精製される。速度ゾー
ン工程でHBs抗原は正常血漿蛋白質に関し更に
20倍精製される。2つの工程を組合せることによ
つてHBs抗原は正常血漿蛋白質について2000倍
精製される。得られる生成物は、血清学や電気泳
動の方法では血液形物質A及びBを実質的に含ま
ないことが示された。更に、本発明の抗原は特開
昭51−139619号公報の肝炎B抗原の出発物質とし
て使用できる。
以下の実施例によつて本発明をより具体的に説
明するが、これらは本発明の範囲を限定するもの
ではない。
実施例 1(参考例)
遠心機、エレクトロヌクレオニクスK、のロー
ターを8400mlの燐酸バツフアーで充たす。脱気の
ためにローターを毎分10000回転まで回転させた
後、下記の段階的勾配をとまつているローターの
底部に注入する。
1 10%臭化ナトリウム ρ=1.08 2400ml
2 20%臭化ナトリウム ρ=1.17 1000ml
3 30%臭化ナトリウム ρ=1.28 1500ml
4 40%臭化ナトリウム ρ=1.41 3500ml
オーストラリア抗原(HBs抗原)を含む血漿
1750mlを、ローターの底部から40%臭化ナトリウ
ム1750mlを除きつつ、静止しているローターの上
部に加える。ローターを毎分30000回転に加速し、
この速度で18時間運転する。ローターをとめた
後、1.21〜1.24の密度領域のHBs抗原に富んだ部
分500mlを集め、燐酸バツフアーに対して透析す
る。
次いでローターを燐酸バツフアーで充たし、上
述と同様に脱気し、下記の段階的勾配を静止した
ローターの底部に注入する。
1 5%庶糖 ρ=1.02 2400ml
2 15%庶糖 ρ=1.06 1750ml
3 25%庶糖 ρ=1.10 1750ml
4 50%庶糖 ρ=1.23 2500ml
臭化ナトリウム中でのバンド化工程で得られた
HBs抗原に富む分画500mlを、50%庶糖500mlを
ローターの底部から除去しつつ、ローターの上部
に加える。その後ローターは毎分28000回転で18
時間運転する。ローターをとめてから、1.135〜
1.165密度領域にあるHBs抗原に富む分画500mlを
集める。
実施例 2
遠心機、エレクトロヌクレオニクスK、のロー
ターを燐酸バツフアー、8400mlで充たす。脱気す
るために、最高毎分10000回転でローターを回転
させてから、下記の段階的勾配を静止したロータ
ーの底部に注入する。
1 10%臭化ナトリウム ρ=1.08 2400ml
2 20%臭化ナトリウム ρ=1.17 1000ml
3 30%臭化ナトリウム ρ=1.28 1500ml
4 40%臭化ナトリウム ρ=1.41 3500ml
HBs抗原を含む血漿1750mlを、40%臭化ナト
リウム1750mlをローターの底部から除きつつ、静
止したローターの上部に加える。ローターは毎分
30000回転に加速し、この速度で4時間運転する。
次いでローターをとめ、40%臭化ナトリウム1750
mlをローターの底部に注入することによつて血漿
を上から押し出す。更に1750mlのHBs抗原を含
む新しい血漿を、ローターの底部から同量の40%
臭化ナトリウムを除きつつ、ローターの上に加え
る。その後ローターは毎分30000回転で18時間回
す。ローターを止めてから、1.21〜1.24の密度領
域にあるHBs抗原に富む分画1000mlを集め、燐
酸バツフアーに対して透析する。
ローターを燐酸バツフアーで充たし、上述と同
様に脱気し、下記の段階的勾配を静止したロータ
ーの底部に注入する。
1 5%庶糖 ρ=1.02 2400ml
2 15%庶糖 ρ=1.06 1750ml
3 25%庶糖 ρ=1.10 1750ml
4 50%庶糖 ρ=1.23 2500ml
臭化ナトリウム中での等密度バンド化工程で得
られたHBs抗原に富む分画1000mlを、50%庶糖
1000mlをローターの底部から除きつつ、ローター
の上部に注入する。次いでローターを毎分28000
回転で18時間運転する。ローターをとめてから、
1.135〜1.165密度領域にあるHBs抗原に富む分画
1000mlを集める。
実施例 3
遠心機、エレクトロヌクレオニクスK、のロー
ターを8400mlの燐酸バツフアーで充たす。脱気の
ため、ローターを最高毎分10000回転で回してか
ら、下記の段階的勾配を静止したローターの底部
に注入する。
1 10%臭化ナトリウム ρ=1.08 2400ml
2 20%臭化ナトリウム ρ=1.17 1000ml
3 30%臭化ナトリウム ρ=1.28 1500ml
4 40%臭化ナトリウム ρ=1.41 3500ml
HBs抗原を含む血漿1750mlを、40%臭化ナト
リウム1750mlをローターの底部から除きつつ、静
止したローターの上部に注入する。ローターは毎
分30000回転に加速してこの速度で4時間運転す
る。ローターをとめ、40%臭化ナトリウム1750ml
をローターの底部に注入することによつて血漿を
ローターの上部から押し出す。更に1750mlの
HBs抗原を含む新しい血漿を、ローター底部か
ら同量の40%臭化ナトリウムを除きつつ、ロータ
ーの上部に加える。ローターを毎分30000回転に
加速し、この速度で4時間運転する。ローターを
とめ、更に3回目のHBs抗原を含む新しい血漿
1750mlを、ローターの底部から同量の40%臭化ナ
トリウムを除きつつ、ローターの上部に注入す
る。ローターは毎分30000回転で18時間回す。ロ
ーターをとめてから、1.21〜1.24の密度領域にあ
るHBs抗原に富む分画1500mlを集め、燐酸バツ
フアーに対して透析する。
次いでローターを燐酸バツフアーで充たし、上
述と同様に脱気し、下記の段階的勾配を静止した
ローターの底部に注入する。
1 5%庶糖 ρ=1.02 2400ml
2 15%庶糖 ρ=1.06 1750ml
3 25%庶糖 ρ=1.10 1750ml
4 50%庶糖 ρ=1.23 2500ml
等密度バンド化工程で得られたHBs抗原に富
む分画1500mlを、50%庶糖1500mlをローター底部
から除きつつ、ローター上部に注入する。次いで
ローターを毎分28000回転で18時間運転する。ロ
ーターをとめてから、1.135〜1.165の密度領域に
あるHBs抗原に富む分画1500mlを集める。
実施例 4
下記の表は、本発明による多数回負荷法を用い
た場合(実施例2及び3)、唯1回負荷した場合
(実施例1)に比して、単位時間当りの収量がず
つとよくなることを示している。
【表】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for purifying hepatitis B antigen. This purified hepatitis B antigen can be used as a vaccine. Hepatitis B is a type of viral hepatitis.
The infection is systemic, but the main lesions appear in the liver. The disease primarily affects adults and is maintained primarily by transmission of infection from long-term carriers of the virus. Common routes of transmission include blood transfusions, contaminated needles or syringes, cuts or scratches on the skin, unsterilized dental instruments, saliva, sexual intercourse, and contact with aerosolized infected blood. Hepatitis B has a relatively long incubation period, which can take from 6 weeks to 6 months from infection to clinical onset.
The illness usually begins with fatigue and loss of appetite, and may be accompanied by muscle pain and abdominal discomfort. Later, jaundice, dark urine, light stools, and mild liver swelling may occur. In some cases, the onset is rapid, with fever, nausea,
Jaundice may appear with an increase in white blood cells.
In some cases, jaundice never appears and the patient only feels flu-like symptoms. Most hepatitis infections are thought to result in mild, non-jaundice symptoms. The present invention is effective in obtaining clarified plasma containing HBsAg, in which substantially all of the HBsAg enters the density gradient from the clarified plasma, but ineffective in completing isopycnic banding of HBsAg. subject the clarified plasma depleted of HBs antigen to partial isopycnic banding in a density gradient under conditions and repeat the first step at least one more time with a new sample of clarified plasma. A method for purifying HBs antigen from clarified plasma, characterized in that multiple loadings are carried out, followed by isopycnic banding under conditions effective to reach equilibrium, and then subjected to velocity zone fractionation. It provides: The starting material for the hepatitis B surface antigen (HBs antigen) purified according to the present invention is plasma obtained from a donor with hepatitis B by plasmaphoresis or the like. The antigen titer can be measured by known methods such as radioimmunoassay, passive coagulation reaction, or complement fixation reaction. The plasma is cooled and the resulting cryoprecipitate is removed by mild centrifugation. HBs antigen in cleared plasma is isolated by an isopycnic banding step followed by a rate zonal banding step. In isopycnic banding, a partially purified concentrate is contacted with a liquid medium that creates a density gradient containing the same density as the antigen to be isolated. The liquid medium is then subjected to ultracentrifugation to achieve an equilibrium distribution of the serum components in the density gradient according to their respective densities. Separate successive fractions of the liquid medium and select the fraction containing the desired antigen, i.e., with a density of approximately
A fraction of 1.21 to about 1.24 g/cc is collected. Application of this method to the purification of HBs antigens has been published in German Patent Specification No. 2049515 and US Pat.
It is stated in No. 3636191. The concentration of the solution forming the density gradient is selected so that the density ranges from about 1.0 to about 1.41 g/cc. The liquid medium may be a linear gradient or a stepped gradient. More preferably, it is used in the form of a stepwise gradient due to its inherent higher capacity for fractionation. In the velocity zone banding method, a partially purified concentrate is brought into contact with a liquid medium with a density gradient and subjected to ultracentrifugation, but this time we will use the velocity zone method. That is, it is carried out at a rate and time such that equilibrium is not reached, so that the HBs antigen and other serum components are distributed in the medium according to the sedimentation constant in the medium.
The concentration of the solution forming the gradient has a density range of approximately 1.0 to approximately
Select to cover 1.28g/cc. The speed zone method is
Repeat until HBsAg reaches a density range of 1.13 to 1.16. At this point, the HBsAg is separated from most of the crude plasma proteins and, most importantly, from the macroglobulin complement in the plasma. When the velocity zone method step is carried out until the desired HBsAg reaches a position of equilibrium, i.e., a density of about 1.18 to 1.20 g/cc, the macroglobulin fraction in the plasma becomes the desired HBsAg fraction. It was found that it was mixed in as an impurity. The liquid medium used in the isopycnic banding and velocity zoning steps may be any suitable range of density gradients. In the prior art, solutes in such solutions included sucrose, potassium bromide, cesium chloride, potassium tartrate, and the like. To easily carry out the isopycnic banding process, use a centrifugal separator such as Electronucleonics K.
A salt solution (saline) is placed in the rotor when it is not moving.
solution) and then aliquots
A stepwise gradient is formed by pushing up the salt solution with liquid medium solutions of increasing density. Plasma is introduced from the top of the rotor by removing a portion of the densest solution from the bottom. Typically, the volume of plasma is 15% to 40% of the volume of the step gradient. The centrifuge is sped up by a speed control system programmed to prevent mixing between the first reorientation faces. When equilibrium is reached and the product is at the proper density, the rotor is slowed down by the same speed control system so that it does not mix up during reorientation back to the original position. Next, cut down the gradient from the bottom and collect the appropriate cut density range. A similar method is used in the velocity zone method. Fractions of the appropriate density range by velocity zone banding are concentrated solutions of the desired hepatitis B antigen. Since the size of HBs antigen is small at 20 nm, the isopycnic banding process is time-consuming, requiring 18 hours of centrifugation. As a result, even if the centrifuge is operated 24 hours a day, seven days a week, only four batches of clarified plasma can be processed per centrifuge. Increasing the number of centrifuges would increase productivity, but each centrifuge costs about $100,000, so it would require a huge capital investment. The gradient for isopycnic banding is loaded multiple times.
It was found that productivity was greatly improved and operating costs were significantly reduced by loading the system. Multiple loading is a method of loading clarified plasma samples containing HBsAg under conditions of isopycnic banding, which is effective in getting substantially all of the HBsAg into the gradient, but is difficult to reach equilibrium. was treated for an ineffective period of time, and the process was repeated at least one more time with another sample of clarified plasma containing HBsAg, followed by a period of time sufficient to allow the isopycnic banding process to reach equilibrium. Just do it. If desired, the same gradient can be loaded up to six times with cleared plasma. Since the time required for HBsAg in clarified plasma to enter the gradient is a small fraction of the time required to reach equilibrium, and also the time required to reach equilibrium thereafter, the gradient is run only once. Since the load is the same whether it is loaded or loaded multiple times, time can be significantly reduced and unit processing costs can be reduced. The increased productivity and reduced cost of the multiple banding method of the present invention can be achieved using any suitable gradient, but preferably the gradient is based on sodium bromide. The isopycnic banding method is performed by centrifuging at about 40,000 g to about 80,000 g for about 10 hours or more until equilibrium is reached. However, it has been found that when plasma is centrifuged for about 4 hours, almost all of the HBs antigen enters the isopycnic banding gradient. The sample of plasma used is then removed and the same volume of plasma preparation used initially is layered on top of the gradient. After that, centrifugation is performed for about 10 hours or more under the same conditions as before, so that the HBs antigen in both preparations can enter the equilibrium density region (about 1.21 to about 1.24 g/cc) in the gradient and complete band formation. . Alternatively, centrifugation can be performed for 4 hours, the used plasma removed and a third fresh plasma layered on top of the gradient. After performing this multiple loading method 6 or more times, approximately 18
Banding may be completed after centrifugation for an hour. The ratio of the volume of charged plasma to the volume of the gradient is approximately
1.3 to about 1.6. Plasma is charged once onto the gradient and centrifuged under isopycnic banding conditions (e.g., 30,000 revolutions per minute in a K-centrifuge;
Depending on the amount of protein in the initial plasma, the product typically has a protein content of about 4-10 mg/ml in a 1.0 volume. Plasma was charged twice onto the gradient and centrifuged under isopycnic banding conditions (approximately 30,000 revolutions per minute).
Depending on the amount of protein in the initial plasma, the amount of protein in the product is additive with the number of charges performed, typically about 8-20 mg/ml in a volume of 1.0 becomes. The amount of protein thus increases with each charge of plasma into the gradient. The product is then subjected to a velocity zone banding process.
Velocity zone banding is approximately 1.13 to 1.16 for HBsAg.
Continue until you reach the g/cc density region. Typically this will take about 16 hours to about 20 hours, more preferably about 17 hours at about 30,000 g to about 60,000 g, and about
It is 18 hours. In one embodiment of the invention, the gradient can be created using sodium bromide. Sodium bromide has distinct advantages over materials used to date. The solubility of sodium bromide is suitable for the use of dense solutions in creating gradients at refrigeration temperatures (2-6°C). Compared to the case of using salts such as cesium chloride, not only is there no need to solve the problem of toxicity to the human body due to residual or bound cesium ions to the HBs antigen, but it is clearly economically advantageous. . In the sodium bromide gradient, due to product physics, all ions that bind to the HBs antigen are sodium ions, which are well tolerated by the human biological system and do not pose toxicity problems. do not have. There are already sufficient reports on the biophysical properties of HBs antigen [Clinical Research Journal (J. Clinical
Investigation), Vol. 52, p. 1176 (1973), J. of Virology, Vol. 10, p. 469 (1972)], and are negatively charged particles. When there are high concentrations of positively charged sodium ions,
A sodium-HBs antigen salt molecule is formed.
HBs obtained by the preferred method of carrying out the invention compared to products obtained by previous techniques
The antigen is substantially free of other cations, especially exogenously added cesium and potassium ions. The greater solubility of sodium bromide at low temperatures compared to potassium bromide allows the use of conducive low temperatures for the stability of biological materials. The use of stepwise gradients is preferable to linear gradients because impurities collect at the step interfaces and a larger amount of plasma can be processed with one gradient. The antigens related to the present invention can be used as such as hepatitis B antigens and are disclosed in US Pat.
Can be used as described in No. 3636191. The HBs antigen according to the present invention is highly purified. By isodensity banding, HBs antigen is purified approximately 100 times compared to normal plasma protein. In the velocity zone process, HBsAg is further detected with respect to normal plasma proteins.
Purified 20 times. By combining the two steps, HBs antigen is purified 2000 times over normal plasma proteins. The resulting product was shown to be substantially free of blood group substances A and B by serological and electrophoretic methods. Furthermore, the antigen of the present invention can be used as a starting material for the hepatitis B antigen of JP-A-51-139619. The present invention will be explained more specifically by the following examples, but these are not intended to limit the scope of the present invention. Example 1 (Reference Example) The rotor of a centrifuge, Electronucleonics K, is filled with 8400 ml of phosphoric acid buffer. After rotating the rotor to 10,000 revolutions per minute for degassing, the following stepwise gradient is injected into the bottom of the stopping rotor. 1 10% Sodium Bromide ρ = 1.08 2400ml 2 20% Sodium Bromide ρ = 1.17 1000ml 3 30% Sodium Bromide ρ = 1.28 1500ml 4 40% Sodium Bromide ρ = 1.41 3500ml Plasma containing Australian antigen (HBs antigen)
Add 1750 ml to the top of the stationary rotor while removing 1750 ml of 40% sodium bromide from the bottom of the rotor. Accelerate the rotor to 30,000 revolutions per minute,
Drive at this speed for 18 hours. After stopping the rotor, 500 ml of the HBs antigen-rich portion in the density region of 1.21-1.24 is collected and dialyzed against phosphate buffer. The rotor is then filled with phosphate buffer, degassed as described above, and the stepwise gradient described below is injected into the bottom of the stationary rotor. 1 5% sucrose ρ = 1.02 2400ml 2 15% sucrose ρ = 1.06 1750ml 3 25% sucrose ρ = 1.10 1750ml 4 50% sucrose ρ = 1.23 2500ml Obtained by banding process in sodium bromide
Add 500 ml of the HBs antigen enriched fraction to the top of the rotor while removing 500 ml of 50% sucrose from the bottom of the rotor. The rotor then rotates at 28,000 revolutions per minute to 18
drive for hours. After stopping the rotor, 1.135 ~
Collect 500 ml of the HBs antigen-enriched fraction in the 1.165 density region. Example 2 The rotor of a centrifuge, Electronucleonics K, is filled with 8400 ml of phosphate buffer. To degas, rotate the rotor at up to 10,000 revolutions per minute and then inject the stepwise gradient described below into the bottom of the stationary rotor. 1 10% Sodium Bromide ρ = 1.08 2400ml 2 20% Sodium Bromide ρ = 1.17 1000ml 3 30% Sodium Bromide ρ = 1.28 1500ml 4 40% Sodium Bromide ρ = 1.41 3500ml 1750ml of plasma containing HBs antigen was added to 40% Add 1750 ml of sodium bromide to the top of the stationary rotor while removing it from the bottom of the rotor. rotor per minute
Accelerate to 30,000 rpm and operate at this speed for 4 hours.
Then stop the rotor and add 40% sodium bromide 1750
Push the plasma out from the top by injecting ml into the bottom of the rotor. Add another 1750ml of fresh plasma containing HBsAg to 40% of the same volume from the bottom of the rotor.
Remove the sodium bromide and add to the top of the rotor. The rotor then rotates at 30,000 revolutions per minute for 18 hours. After stopping the rotor, 1000 ml of the HBs antigen-enriched fraction in the density region of 1.21-1.24 is collected and dialyzed against phosphate buffer. The rotor is filled with phosphate buffer, degassed as described above, and the stepwise gradient described below is injected into the bottom of the stationary rotor. 1 5% sucrose ρ = 1.02 2400ml 2 15% sucrose ρ = 1.06 1750ml 3 25% sucrose ρ = 1.10 1750ml 4 50% sucrose ρ = 1.23 2500ml HBs antigen obtained by isopycnic banding process in sodium bromide 1000ml of enriched fraction, 50% sucrose
Pour 1000ml into the top of the rotor, removing it from the bottom. Then the rotor at 28000 rpm
Runs for 18 hours on rotation. After stopping the rotor,
HBs antigen-enriched fraction in the 1.135-1.165 density region
Collect 1000ml. Example 3 The rotor of a centrifuge, Electronucleonics K, is filled with 8400 ml of phosphate buffer. For degassing, the rotor is rotated at a maximum of 10,000 revolutions per minute, and then the following graded gradient is injected into the bottom of the stationary rotor. 1 10% Sodium Bromide ρ = 1.08 2400ml 2 20% Sodium Bromide ρ = 1.17 1000ml 3 30% Sodium Bromide ρ = 1.28 1500ml 4 40% Sodium Bromide ρ = 1.41 3500ml 1750ml of plasma containing HBs antigen was added to 40% Inject 1750 ml of sodium bromide into the top of the stationary rotor while removing it from the bottom of the rotor. The rotor is accelerated to 30,000 revolutions per minute and operated at this speed for 4 hours. Stop the rotor and 1750ml of 40% sodium bromide.
The plasma is forced out of the top of the rotor by injecting it into the bottom of the rotor. Furthermore, 1750ml
Fresh plasma containing HBsAg is added to the top of the rotor while removing the same amount of 40% sodium bromide from the bottom of the rotor. The rotor is accelerated to 30,000 revolutions per minute and operated at this speed for 4 hours. Stop the rotor and use new plasma containing HBs antigen for the third time.
Inject 1750 ml into the top of the rotor while removing the same amount of 40% sodium bromide from the bottom of the rotor. The rotor rotates at 30,000 revolutions per minute for 18 hours. After stopping the rotor, 1500 ml of the HBs antigen-enriched fraction in the density region of 1.21-1.24 is collected and dialyzed against phosphate buffer. The rotor is then filled with phosphate buffer, degassed as described above, and the stepwise gradient described below is injected into the bottom of the stationary rotor. 1 5% sucrose ρ = 1.02 2400ml 2 15% sucrose ρ = 1.06 1750ml 3 25% sucrose ρ = 1.10 1750ml 4 50% sucrose ρ = 1.23 2500ml 1500ml of the HBs antigen-rich fraction obtained in the isopycnic banding step, Remove 1500ml of 50% sucrose from the bottom of the rotor and inject it into the top of the rotor. The rotor is then operated at 28,000 revolutions per minute for 18 hours. After stopping the rotor, collect 1500 ml of the HBs antigen-enriched fraction in the density region of 1.135-1.165. Example 4 The table below shows that when using the multiple loading method according to the present invention (Examples 2 and 3), the yield per unit time was increased compared to when only one loading was used (Example 1). It shows that it gets better. 【table】
Claims (1)
質的に全部が清澄血漿から密度勾配に入るのには
効果的であるが、HBs抗原の等密度バンド化を
完成するには非効果的条件下で、密度勾配中での
部分的等密度バンド化法にかけ、HBs抗原の無
くなつた清澄血漿を取除き、第一の工程を清澄血
漿の新しいサンプルを用いて、少なくとももう一
回くり返すことからなる多数回負荷を行ない、つ
いで平衡に達するのに効果的な条件下で等密度バ
ンド化法を行ない、ついで速度ゾーン分画にかけ
ることを特徴とする清澄血漿からHBs抗原を精
製する方法。 2 密度勾配が臭化ナトリウムからなる特許請求
の範囲第1項の方法。[Claims] 1. Cleared plasma containing HBs antigen is effective for substantially all of the HBs antigen to enter the density gradient from the cleared plasma, but it is difficult to complete isopycnic banding of HBs antigen. is subjected to partial isopycnic banding in a density gradient under ineffective conditions to remove cleared plasma depleted of HBsAg and repeat the first step with a fresh sample of cleared plasma to at least HBs antigen from clarified plasma characterized by multiple loading consisting of one repetition, followed by isopycnic banding under conditions effective to reach equilibrium, and then subjected to velocity zone fractionation. How to refine. 2. The method of claim 1, wherein the density gradient comprises sodium bromide.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB7657/77A GB1554811A (en) | 1977-02-23 | 1977-02-23 | Purifying hepatitis b surface antigen |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS53115812A JPS53115812A (en) | 1978-10-09 |
JPS6313969B2 true JPS6313969B2 (en) | 1988-03-29 |
Family
ID=9837320
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2981477A Granted JPS53115812A (en) | 1977-02-23 | 1977-03-19 | Hepatisis b antigen |
JP58010648A Pending JPS58180431A (en) | 1977-02-23 | 1983-01-27 | Hepatitis b antigen |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58010648A Pending JPS58180431A (en) | 1977-02-23 | 1983-01-27 | Hepatitis b antigen |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
JP (2) | JPS53115812A (en) |
CA (1) | CA1088426A (en) |
CH (1) | CH636269A5 (en) |
DE (1) | DE2709581A1 (en) |
FR (1) | FR2382238A1 (en) |
GB (1) | GB1554811A (en) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL7711378A (en) * | 1976-11-02 | 1978-05-05 | Merck & Co Inc | PROCEDURE FOR PREPARING PREPARATIONS CONTAINING DANE PARTICLES. |
FR2470795A1 (en) * | 1979-12-07 | 1981-06-12 | Pasteur Institut | PROCESS FOR THE PURIFICATION OF PARTICLES OF BIOLOGICAL ORIGIN, IN PARTICULAR OF THE SURFACE ANTIGEN OF HEPATITIS B VIRUS (AGHBS) AND THE PRODUCTS OBTAINED |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5182720A (en) * | 1974-12-09 | 1976-07-20 | Merck & Co Inc | Kanen a kogen |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3636191A (en) * | 1969-10-08 | 1972-01-18 | Cancer Res Inst | Vaccine against viral hepatitis and process |
US4017360A (en) * | 1975-05-14 | 1977-04-12 | Merck & Co., Inc. | Method for purifying hepatitis B antigen |
-
1977
- 1977-02-23 GB GB7657/77A patent/GB1554811A/en not_active Expired
- 1977-03-01 CA CA272,890A patent/CA1088426A/en not_active Expired
- 1977-03-02 FR FR7706090A patent/FR2382238A1/en active Granted
- 1977-03-04 DE DE19772709581 patent/DE2709581A1/en active Granted
- 1977-03-11 CH CH310877A patent/CH636269A5/en not_active IP Right Cessation
- 1977-03-19 JP JP2981477A patent/JPS53115812A/en active Granted
-
1983
- 1983-01-27 JP JP58010648A patent/JPS58180431A/en active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5182720A (en) * | 1974-12-09 | 1976-07-20 | Merck & Co Inc | Kanen a kogen |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA1088426A (en) | 1980-10-28 |
DE2709581A1 (en) | 1978-09-07 |
JPS58180431A (en) | 1983-10-21 |
CH636269A5 (en) | 1983-05-31 |
FR2382238B1 (en) | 1981-05-29 |
JPS53115812A (en) | 1978-10-09 |
FR2382238A1 (en) | 1978-09-29 |
GB1554811A (en) | 1979-10-31 |
DE2709581C2 (en) | 1988-04-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Frommhagen et al. | The role of aggregated γ-globulins in the anticomplementary activity of human and animal sera | |
US4024243A (en) | Process for isolating hepatitis B antigen | |
CA1106279A (en) | Hepatitis b core antigen | |
US4088748A (en) | Hepatitis B surface antigen | |
CA1066191A (en) | Hepatitis b vaccine | |
Landgraf-Leurs et al. | Adenovirus DNA: III. Separation of the complementary strands of adenovirus types 2, 7 and 12 DNA molecules | |
Callahan et al. | Characterization of Ia antigens in mouse serum | |
KR910008643B1 (en) | Method for purification of hbs antigen | |
JPS6313969B2 (en) | ||
US3975344A (en) | Interferon purification | |
US4118477A (en) | Hepatitis B antigen | |
Massey et al. | Physical properties of lipid-protein complexes formed by the interaction of dimyristoylphosphatidylcholine and human high-density apolipoprotein A-II | |
US4186193A (en) | Hepatitis B antigen | |
US4009257A (en) | Preparation of immunosuppressive materials | |
US4204989A (en) | Isolation of hepatitis B e antigen | |
James et al. | Development of Large‐Scale Fractionation Methods: III. Preparation of a Factor VIII Concentrate of Intermediate‐Purity 1 | |
US4242324A (en) | Hepatitis B antigen | |
US3903254A (en) | Separation of erythrocyte stroma from lysing medium and hemoglobin with acrinol | |
JPS63246335A (en) | Hepatitis b antigen | |
US3472831A (en) | Process for purifying mistletoe proteins by ultracentrifugation | |
EP0005864A1 (en) | Antigenic composition useful as a vaccine or vaccine intermediate, and process for preparing same | |
Aldershvile et al. | Humoral and cell-mediated immunity to hepatitis B virus antigens in acute and chronic liver disease | |
US4129646A (en) | Isolating hepatitis B Dane particles | |
CA1100038A (en) | Hepatitis b antigen | |
CA1100039A (en) | Hepatitis b antigen |