JPS63121753A

JPS63121753A - 抗体検出法

Info

Publication number: JPS63121753A
Application number: JP26723086A
Authority: JP
Inventors: Kunihiko Sato; 邦彦佐藤; Hiroshi Kuroki; 洋黒木; Yoshio Tanaka; 田中　義夫; Shuichi Tokuhisa; 修一徳久; Koichi Nanba; 難波　功一
Original assignee: KACHIKU EISEI SHIKENJO
Current assignee: KACHIKU EISEI SHIKENJO
Priority date: 1986-11-10
Filing date: 1986-11-10
Publication date: 1988-05-25
Anticipated expiration: 2011-06-19
Also published as: JP2507873B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はヘルペスウィルス感染症の簡易迅速抗体検出法
に関し、さらに詳しくはヘルペスウィルス感染細胞を固
相化したプレートに再検血清を加え、抗原抗体反応を行
なわせた後、抗原に特異的に結合した抗体を酵素標識抗
体あるいは酵素標識プロティンＡでの反応で検出する方
法である。

［従来の技術１発明が解決しようとする問題点］ウィル
ス病抗体の検出には、ウィルス中和試験、補体結合反応
、赤血球凝集抑制反応、寒天ゲル内沈降反応、免疫電気
泳動法、酵素抗体法、蛍光抗体法等が用いられている。

しかし、これらはそれぞれ、生ウィルスの必要性、精製
抗原の必要性、高額特殊機器の必要性。

熟練技術の必要性、迅速性あるいは感度等のいずれかに
問題が残されており、応用には限界があった。

［問題点を解決するための手段］そこで本発明者は酵素抗体法により抗体検出を行なうに
あたり、上記のような欠点を解消すべく鋭意検討した。

その結果、固相化したウィルス感染細胞を用いることに
より目的が達成できることを見出し、かかる知見に基づ
いて本発明を完成したのである。

すなわち本発明は、酵素抗体法により抗体検出を行なう
にあたり、固相化ヘルペスウィルス感染細胞を用いるこ
とを特徴とする抗体検出法を提供するものである。

本発明の方法は基本的には酵素抗体法であるが、抗原に
固相化したヘルペスウィルスを用いるため、特異抗原抗
体反応の結果を限局したウィルス感染細胞の染色の有無
によって判定するものである。

本発明に用いるヘルペスウィルスを固相化したプレート
の作製は、例えば次の方法で行なうことができる。ある
細胞を選び、増殖培養液で細胞数を調整し、プラスチッ
クプレートに分注する。これを３０〜３８℃、好ましく
は３７°Ｃ１５〜７％炭酸ガス卿卵器内で３〜７日間、
好ましくは５日間培養し、単層を形成させる。培養液を
除いたあとに、ブラック数８０〜１６０個、好ましくは
約１００個に調整したウィルス液を接種し、２５〜３７
℃で３０〜８０分間、通常は３７℃で１時間吸着させる
。接種液を除き、０．７〜１．３％メチルセルロース液
を加え、３０〜３８℃、好ましくは３７℃、５〜７％炭
酸ガス卿卵器日間２４〜５２時間、好ましくは３Ｂ時間
培養し、培養終了後、メチルセルロース液を除き、冷燐
酸緩衝食塩液（以下、ＰＢＳと略記する。）で洗浄し、
メチルアルコールで室温下に固定する。固定後、メチル
アルコールを除き乾燥して固相化プレートを得る。

次に、本発明の反応術式を示す。固相化プレートの１穴
ごとに希釈液で５０〜２００倍、通常は１００倍に希釈
した再検血清を加え、室温で２０〜８０分間、通常は３
０分間静置する。この場合、希釈液には牛血清、馬血清
および山羊血清のいずれかを加えた高張の食塩水を用い
る。再検血清を除き、各穴を高張の食塩水で洗浄する。

そこへ、各穴に高張の食塩水を十分に加え、室温で１０
〜６０分間、通常は１０分間静置した後、高張の食塩水
を除く。各穴に酵素標識抗体あるいは酵素標識プロティ
ンＡを加え、室温で２０〜６０分間、通常は３０分間静
置する。各穴を高張の食塩水で洗浄したのち、各穴に高
張の食塩水を十分に加え、室温で１０〜６０分間、通常
は１０分間静置した後、高張の食塩水を除く。

さらに、各穴へ染色液（例えば０．０２％ジアミノベン
チジン液）を加え、室温で遮光して１０〜３０分間静置
し、水道水で洗浄し乾燥後、ブラック染色されたものを
抗体陽性として観察する。

本発明で使用するヘルペスウィルス固相化プレートは一
７０℃で保存することにより１２ケ月間後においても、
その有効性は変わらない。

［実施例１次に、実施例を挙げて本発明の詳細な説明する。

実施例１酵素抗体ブラック法による豚ヘルペスｌ型の抗体検出固
相化プレートの調製：　ＨｍＬｕ−１の細胞の細胞数を
４　Ｘ　１０５個／ａＲになるように増殖培養液で調整
し、プラスチックプレートに分注したのち、３７℃、５
％炭酸ガス卿日間内で５日間培養した。

単層細胞が形成されたのち、培養液を除きブラック数約
１００個に調整したウィルス液を接種し、３７℃で１時
間吸着させ、接種液を除き０．８％メチルセルロース液
を加えて３７℃、５％炭酸ガス鼾卵器内で３６時間培養
した。培養終了後、メチルセルロース液を除き、ＰＢＳ
ｉで１回洗浄し、メチルアルコールで室温にて１０分間
固定した。固定後、メチルアルコールを除き、乾燥した
ものを固相化プレートとして用いた。

反応術式：固相化プレートはｌ穴ごとに希釈液［牛血清
５〜ｌＯ％加えた２％食塩液］で１００倍に希釈した再
検血清０．２　ｔｓＩ！を加え、室温で３０分間静置し
た。次いで、この再検血清を除き、各穴を洗浄液［２％
食塩液］で３回洗浄後、穴いっばいになるように洗浄液
を加え、室温で１０分間静置し洗浄液を除いた。金穴に
ペルオキシダーゼ標識抗豚ＩｇＧウサギ血清またはペル
オキシダーゼ標識プロティンＡをそれぞれ０．２　ｍｆ
ｌずつ加え、室温で３０分間静置した。各穴を洗浄液で
３回洗浄し、さらに洗浄液を穴いっばいに分注し、室温
で１０分間静置したのち洗浄液を除いた。さらに、０．
０２％ジアミノベンチジン液を０．５　ｍＲずつ加え、
室温で遮光し２０分間静置した。次いで、水道水で洗浄
し乾燥後、ブラック染色を観察した。判定はブラックが
染色されたものを抗体陽性とした。

免疫血清での抗体検出二上記の方法を用いて豚ヘルペス
ウィルス１型免疫山羊血清（中和抗体価１　：　１０２
４）　　、豚コレラウィルス免疫豚血清（中和抗体価１
　：　５０００）およびＴＧＥウィルス免疫豚血清（中
和抗体価１　：　２０００）による反応を行なった。

なお、対照として豚ヘルペスウィルス１型免疫豚血清（
中和抗体価１　：　１２Ｂ　）およびＳＰＦ豚血清を用
いた。その結果、豚ヘルペスウィルス１型免疫豚血清で
は抗体陽性で１８００倍に希釈したものまでブラックが
染色された。しかし、ＳＰＦ豚血清ではブラックは染色
されなかった。また、豚ヘルペスウィルス１型免疫山羊
崩清、豚コレラウィルス免疫豚血清およびＴＧＥウィル
ス免疫豚血清でもブラックの染色はみられなかった。な
お、これらブラックの染色がみられなかった各種免疫豚
血清で前処理した後に豚ヘルペスウィルス１型免疫豚血
清で末法を行なったところ、前記同様１８００倍の希釈
までブラックが染色され、抗体が検出された（表１参照
）。

実験感染豚経過血清での抗体検出：実験感染豚４頭の経
過血清５２例についての抗体を４つの試験法で比較した
。すなわち、酵素抗体ブラック法（ＩＩＰＳ法）、酵素
抗体法（ＥＬＩＳＡ法）、補体要求性中和試験（ＧＲＮ
法）および中和試験（ＮＴ法）を行なった。その結果、
最も早く抗体を検出し得た方法は酵素抗体ブラック法（
水沫）であった。次いて補体要求性中和試験が早かった
。また、中和試験と酵素抗体法は末法に比べ２日後の血
清で初めて抗体陽性となった。（第１〜４図参照）。

各種試験法による野外豚血清からの抗体検出の比較ニオ
−ニスキー病の発生が認められた養豚場から採取した１
０５例の血清を用いて上記４種の試験法で抗体の検出を
比べた。その結果、末法は補体要求性中和試験と同様に
抗体の検出率が最も高く、１０５例中７Ｂ例であり、し
かも同一個体が抗体陽性であった。また、中和試験では
１０５例中７ｏ例であり、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）
では１０５例中６Ｂが抗体陽性であった。なお、酵素抗
体ブラック法は補体要求性中和試験と１００％一致し、
中和試験および酵素抗体法とは信頼限界（Ｐ　＞　０．
２０）で９２％の一致率であった（表２，３参照）。

固相化プレートの保存試験ニー２０°Ｃと一７０°Ｃで
保存した固相化プレートについて、豚ヘルペスウィルス
ｌ型免疫豚血清とＳＰＦ豚血清を用い酵素抗体ブラック
法によりその有効性を検討した。

その結果、−２０°Ｃに保存したものは３ケ月間、−７
０°Ｃに保存したものは１２ケ月間保存した後において
もその有効性は低下することなく、特異的に抗体を検出
することが明らかとなった。（表４参表　　　２酵素抗体ブラック法、補体要求性中和試験および中和試験による野外豚血清１０５例の抗体検出の比較表　　　３酵素抗体法、酵素抗体ブラック法、補体要求性中和試験
および中和試験による野外豚血清９９例の抗体検出の比較表　　４ ★非特異反応による発色実施例２酵素抗体ブラック法による牛伝染性鼻気管炎（ＩＢＲ）
ウィルスの抗体検出固相化プレートの調製：牛胎児腎由来（以下、ＭＩＩＢ
Ｋと略記する。）細胞の細胞数を３　Ｘ　１０５個／ｍ
ｐになるように増殖培養液で調整し、プラスチックプレ
ートに分注し、実施例１と同様の方法で固相化プレート
を作成した。

反応術式：固相化プレートは１穴ごとに希釈液［山羊血
清５〜１０％を加えた２％食塩液］で１００倍に希釈し
た可検牛血清０．２　ｍｊ）を加え、室温で３０分間静
置した。次いで、この再検血清を除き各穴を洗浄液［２
％食塩液］で３回洗浄後、穴いっばいになるように洗浄
液を加え、室温で１０分間静置し除去した。金穴にペル
オキシダーゼ標識抗豚１ｇＧウサギ血清またはペルオキ
シダーゼ標識プロティンＡを０．２　ｍｉＪずつ加え、
室温にて３０分間静置した後、実施例１と同様の方法を
用い判定した。

免疫血清での抗体検出二上記の方法を用いて牛伝染性鼻
気管炎ウィルス免疫ウサギ血清（中和抗体価１　：　１
０２４）　　、牛アデノウィルス７型免疫牛血清（中和
抗体価１　：　１０２４）およびパラインフルエンザウ
ィルス３型免疫牛血清（中和抗体価ｌ：５１２）による
反応を行なった。なお、対照として牛伝染性鼻気管炎つ
ィルス免疫牛血清（中和抗体価１　：　１０２４）およ
び初乳未摂取子牛血清を用いた。その結果、牛伝染性鼻
気管炎つィルス免疫牛血清では抗体陽性で１２，８００
倍に希釈したものまでブラックが染色された。しかし、
初乳未摂取子牛血清ではブラックは染色されなかった。

また、牛伝染性鼻気管炎ウィルス免疫ウサギ血清、牛ア
デノウィルス７型免疫牛血清およびパラインフルエンザ
ウィルス３型免疫牛血清でもブラックの染色はみられな
かった。なお、これらブラックの染色がみられかなった
各種免疫牛血清で前処理した後に牛伝染性鼻気管炎つィ
ルス免疫牛血清で末法を行なったところ、前記同様１２
，８００倍の希釈までブラックが染色され、抗体が検出
され、実施例１と同様に反応は特異的であった。（表５
参照）。

実験感染牛経過崩清の抗体検出：実験感染牛４頭の経過
血清２７例についての抗体を４つの試験法で比較した。

すなわち、酵素抗体ブラック法（ＩＩＰＳ法）、酵素抗
体法（Ｅｌ、ＩＳＡ法）、補体要求性中和試験（ＣＲＮ
法）および中和試験ＣＮＴ法）を行なった。その結果、
最も早く抗体を検出した方法は酵素抗体ブラック法（末
法）であった。また、補体要求性中和試験では４７中１
例が酵素抗体法および中和試験より早く抗体を検出した
。しかし、その他の例では差は認められなかった。なお
、末法は他の３つの方法に比べ３日間前の血清から抗体
陽性となった。（第５〜８図参照）。

［発明の効果］本発明による反応は特異的であり、より早期に抗体を検
出し、さらに抗体検出率が高い方法である。また、本発
明の方法は特別な場所、機材などを必要とせず、簡易で
迅速、かつ感度の優れた方法である。しかも、固相化プ
レートを一７０℃に保存することにより１２ケ月間後に
おいても、その有効性が変らないことから血清診断法と
して有用である。

【図面の簡単な説明】

第１〜４図は実験感染豚血清の各種試験による抗体（価
）の推移を示すグラフ、第５〜８図は実験感染中血清の
各種試験による抗体（価）の推移を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

酵素抗体法により抗体検出を行なうにあたり、固相化ヘ
ルペスウィルス感染細胞を用いることを特徴とする抗体
検出法。