JPS63109365A - 化学プローブおよび酵素センサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は化学（生化学を含む）プローブと電気化学検
出技術に利用する酵素（例えば、ヒボキサンチンあるい
はイノシン酵素）固定センサーとしてかかるプローブを
使用する組立体に関する。

他の動物又は、人間組織の検査における利用も考えられ
るが、そのようなプローブのための重要な利用は、魚あ
るいは獣肉の鮮度を決定することにある。

そのうえ、かかるプローブは身体組織又は液体、そして
栄養素とそのようなものの中に含まれているブドウ糖、
尿素、尿酸、トリグリセリド、リン脂質、クレアチニン
、アミノ酸、乳酸、キサンチン、コンドロイチン、トラ
ンスアミナーゼ等の種々の成分のわずかな量を検出する
ために使用できる。

（先行技術） 電気化学とイオン特性センサーは５０年以上の間、実験
室で使用されている。最も一般的なセンサーは、ポーラ
ログラフとペーハー計で、両方井水溶液中の特定イオン
濃度を感知する電気化学的反応に依存している。この種
のセンサーは、本来無機イオンに限定されている。近年
、特定酵素基体を利用することにより、通常のベーハー
電極又はポーラログラフの分析技術を介して、反応副生
物を検出するということに基づいている独特で鋭敏なセ
ンサーを考案することを可能にした。

この科学技術の最も簡単な実施例は、酵素を維持するが
基体と反応生成物の拡散を許す膜によってカバーされた
活性面上に塗布された酵素をもつペーハー（又は他の）
電極があげられる。

センサーは数センチメートルの大きさが典型的で、分か
ら時間の応答平均時間をもっている。

ざらに、すぐれｆ二先行技術としては、中空カテーテル
皮下注射器に差し込まれるＰＥＴ（電界効果トランジス
タ）を使用する小規模センサーの開発があげられる。セ
ンサーと混合膜は小さい（数百μｍの大きさ）がもろい
ので、それらが挿入される組織との直接接触の際、機械
的に保護される必要がある。

この機械的保護の必要性により、センサー上にデッドス
ペースが出来て、その結果拡散障害やセンサ一応答時間
の低速化を招来する。

これらのセンサーは、カテーテル・ウェルにおける超小
型回路素子の取付配線が面倒であるため比較的高価であ
る。

ヒボキサンチン又はイノシン酵素センサーを用いて、魚
鮮度試験を行うことは従来知られている。

典型的なそのようなセンサーは、伝統的なポルタンメト
リー酸素電極上に固定されたヒボキサンチン酸化（Ｈｘ
オキシダーゼ）酵素の使用に基礎をおいている。魚が死
んだとき、魚肉のＡＴＰ（アデノシン・トリフオスフェ
ート）の分解が始まり、ＡＤＰ（アデノシン　ジ　フォ
スフェート）やＡＭＰ（アデノシン　モノフォスフェー
ト）が成形される。変化中のこれらの化合物はＩＭＦ（
イノシン５°−モノフォスフェート）、イノシン、ヒボ
キサンチン、キサンチン、そして最後に尿酸に分解され
る。

イノシン又はヒボキサンチン（魚の種による）は保存期
間の増大と共に蓄積する。そして、それらの化合物の一
つあるいは他の濃度が鮮度の表示を行う。

なお、この動作の詳細は文献、特に食品科学技術者協会
によるジャーナル　オブ　フード　サイエンス（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　　５ｃｉｅｎｃｅ）　４８
−（２）巻４９６−５００（１９８３）発行のイー・ワ
タナベ（Ｅ、　Ｗａｔａｎａｂｅ）他による［酵素セン
サーによる魚肉中のヒボキサンチンの測定」と題された
論文に述べられている。

この目的のために酵素電極を使うという方針が数年前に
提案されて以来、かなりの実際的限界を経験したにもか
かわらず、数多くの装置が開発され、有益なことが立証
された。

前述のワタナベ論文に示されているこの方法はいわゆる
クラーク型の電極を採用している。それはプラチナ陰極
と鉛陽極アルカリ性の電解質（ＫＯＨ）そして酸素透過
テフロン膜から成っている。

酵素固定膜は、このテフロン膜上にしっかり固定され、
セルローズアセテートの透析外膜でおおわれている。前
述のこのシステムの目的の一つは、応答速度を速めると
ともに、以前に開発されたシステム構造を単純化するこ
とである。

ワタナベ論文では応答時間が約３０秒に減少したと報告
している。これは以前に要求された１０分に比べて優っ
ているが、実験室の条件に適合するだけで、１時間に試
せるサンプルの数を制限するものであって、実際的でな
い。

他の電気化学センサーの範囲は、１９８５年２月アナリ
ティカル　ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）刊、ジョン・ディー・クザバン（Ｊｏ
ｈｎＤ　、　Ｃｚａｂａｎ）著「臨床化学における電気
化学センサー：昨日今日明日」第５７−２巻３４５ベー
ノに述べられている。

例えば、食品加工のような多くの産業的応用に必要なセ
ンサーの開発には現在の科学技術では解決できないコス
トと性能基準の問題に直面する。

負性を監視するためには、応答平・均時間は１秒以下で
、コストは１セント以下でなければならない。

このコストについては、販売価格は１０ドルで、少なく
とも１０００回の試験に使えるセンサーを意味している
。応答時間に対する要求により、組織中へ差し込めるセ
ンサーはサンプルから数１０μｍ以上離すという機械的
保護のないセンサーを要求することになる。セルローズ
、テフロン等普通の膜材料は１０μｍの厚さでは組織中
へ繰り返し差し込むに耐えるほど十分丈夫でない。

以下余白 （発明の要約） 本発明の目的は前述の困難を克服し、例えばわずか１秒
という速い応答時間の化学酵素センサーを提供すること
にある。しかも、製造するのが安価で、作動信頼性を保
持しつつ、繰り返し使用に十分耐えるほど頑丈であるも
のを提供することにある。

この目的のために、本発明は陽極酸化されたアルミニウ
ム酸化物の薄層を含む外膜をとり入れた化学酵素センサ
ーを提供している。この材料には数多くの小セルがあり
、それらは電解質を含むのに、そしてその中の酵素を不
動化するのに理想的である。

アルミニウムの電気化学的陽極酸化は、気孔セルの大き
さ、深さが正確に調節できる多孔性構造を作り出す。こ
の方法で作られた構造はマスキング技術やエツチング技
術で得られる大きさより小さい幾何学的な形をしている
。

その結果、この構造は酵素固定または不動化に理想的で
ある。個々の電気化学的セルを作ることにより、他の技
術で得られるよりも、もっと小さな理想的な酵素センサ
ー形状が低コストで提供できるのである。

加えて、陽極酸化されたアルミニウム酸化物は、水カビ
ストンのような摩耗性の高い機械類において、被膜とし
て使われるので、大変高い摩滅耐性をもっている。

このように、上述の技術上の問題点は大きさく応答時間
の限度）とコスト（製造限度と繰返し使用限度）であっ
たが、これら両問題とも調節された細孔の大きさ、陽極
酸化されたアルミニウム酸化物、膜不動または固定化マ
トリックスを、普通センサー用に使う高分子材料の代わ
りに使うことによって解決される。陽極酸化されたアル
ミニウム酸化物を使うことのもう一つの利点は、従来技
術を使って簡単に製造できるコストの低い材料であると
いうことである。パーガモン　プレス（Ｐ　ｅｒｇａｍ
ｏｎＰ　ｒｅｓｓ）刊　「アルミニウムとその合金の陽
極酸化」特に「陽極化されたアルミニウムの特性」とい
う題の第１４章を参照されたい。

センサーの小規模化により、プローブは魚のような検査
において、゛皮下注射のように容易に差し込まれる、ハ
ンディ装置という形態をとる。他方、例えば魚のケース
中の魚肉鮮度のような、対象物の即時表示を使用者に提
供する。

本発明の特殊な形態は詳しく以下で述べるが、検査され
るべき組織に突き通すためにシャフトが細い先端で終わ
っており、ハンディな化学的プローブを提供し、そのと
がった端部の近くのシャフト表面に非常に浅いくぼみの
ある酵素センサーを形成する。

このセンサーは前述の電解質、一対のセンサー電極、セ
ンサーの外面を成すようにこれら電極上に広がる膜から
成っており、このような面はシャフト表面の続きを成し
ている。その膜には陽極酸化されたアルミニウム酸化物
の大変薄い層があり、外面から電極の各々の面との通路
へ延びる数多くの小セルをもっている。これらのセルに
は電解質が含まれており、固定酵素を含むセンサー電極
の一番目と連結している。

前述の電極と各々のセンサー電極間に電圧を加えるため
に、かつまた各々のセンサー電極内を流れる電流を比較
するために、電極は電気的に回線につながれる。

本発明はこのようなプローブに関するだけでなく、この
ようなプローブ用の酵素センサーにも関するものである
。

さらに本発明は、このような酵素センサー用の組立体に
関するものである。

以下、本発明を添付図面に示す具体例に基づき詳細に説
明する。

（実施例） 第１．２図はエラストマ一連結部１２とシャフト１４を
もつプローブ１ｏを表す。シャフト１４はとがった端部
１６で終わっており　（幅Ａが典型的な場合Ｉ　Ｈ）、
センサー２０はとがった端部１６より内方の上面１８に
ある浅いくぼみ１７の中に位置している。

また、センサー２０は上面Ｉ８と共にとがった端部１６
を規定する傾斜面２２に配置することもできる。

どちらの場合も、センサーの外面は一旦、プローブの先
端を組織の表面を突き通したら、検査中の組織と密接に
接触するようになっている。第２図に示されているセン
サー２０には銀比較電極２４と四つのプラチナセンサー
電極２６があり、連結部１２内の接触部３０にのびる各
々の銅伝導体２８につながっている。これらの接触部は
プローブをハンディな電子コントロール（図示せず）と
適合させるための手段を提供する。

各々のプラチナ電極２６は非常に小さく、長さ１０μｍ
四方つまり面積１００μｍ！である。それに比べると銀
電極２４は電極の分極化を避けるために大きく成ってい
る。

第１のプラチナ電極２６はいわゆるＰｔ０２−Ｅセンサ
ーになるために適当な酵素を含む電解質ボディとつなが
っている。

他方、第２の電極２６は酵素なしの同様の構造をしてお
り、いわゆるＰ　ｔ　Ｏ！センサーの機能を果たす。後
者のセンサーは酸素の局部濃度を表示し、それは結果の
解釈に必要となる。

第２図に示されている他の二つの電極２６は予備で、ま
た別の測定をするために異なった酵素と共に使うことが
できる。したがって、３番目と４番目の電極２６はなし
で済ませることもできる。

第３図はセンサー２０の切断面を表し、特に一つのプラ
チナ電極２６と銀電極２４が中間金部材２７を通して各
々の銅伝導体２８につながっているのを示している。３
２は絶縁層を、３３はプローブシャフト１４のステンレ
ス鋼を表し、それは浅いくぼみ１７内のセンサー２０の
まわりを取り囲んでいる。

活性な電極２４と２６の上には、センサ−２０全体をお
おって外層、すなわち陽極酸化されたアルミニウム酸化
物の膜３４がある。この層３４は多孔性で（第４図参照
）数多くの小センサー３５をふくんでいる。

セル３５の典型的な大きさは長さ１μｍ１直径０．１〜
０．０５μｍである。後者の寸法は好ましくない細胞破
片の吸蔵に対しては理想的であるとともに、ヒポキサジ
ンおよび酸素の効果的な移動および効果的な酵素の固定
化を可能にする。プラチナ電極２６は各セル３５の内端
において２６ａで示す位置にある。

同様に、銀電極２４をおおう各セル３５の内端は電極２
４をおおう塩化銀層（図示せず）と直接接続している。

なお、上記塩化銀層はセル内での蒸着または電着によっ
て形成できる。

センサー製造時に、金属および酸化物の異なる層間が密
着することに関する問題を避けるために、他の構成を使
用可能である。

すなわち、基本回路コンダクタ−（導電体）および電極
パッドを厚いアルミニウム層で製造し、その後所望の深
さまで陽極酸化するとよい。そして、貴金属の触媒電極
面を陽極酸化されたアルミニウム層上に付着させる。こ
の製造法は陽極酸化された酸化物構造と下層の回路コン
ダクタ−との間に最大の結合強度を与える。集積回路の
製造に使用される伝統的な蒸着およびエツチング技術に
よって製造できるが、そのセンサー２０の製造中におい
て、上層アルミニウムに対して陽極酸化が行なわれる。

゛その際、膜３４を形成するためにプラチナおよび銀電
極２４．２６を被覆する部分の金属アルミニウムは完全
に陽極酸化されるが、プローブの他の部分は短絡をさけ
るため陽極酸化は行なわれない。

陽極酸化された酸化アルミニウムの浅い層３４ａを見る
と、その下にアルミニウム層３６が残っており、公知の
蒸着技術によって適用された陽極酸化されない酸化アル
ミニウム、酸化ケイ素または酸化タンタルの絶縁層３９
を覆っている。陽極酸化層の外面は耐摩耗性表面として
機能する。また、膜３４はセンサー酵素３７の理想的な
固定用マトリックスを提供する（第４図参照）。酵素３
７は生理食塩水溶液または高分子ゲルのような適当な電
解質中で膜３４の各セルの内側に共有結合的に固定され
る。

セルは解放することができる（第４図参照）し、非常に
薄い補助膜によってカバーすることもできる（第５図参
照）。

かかる補助［３ｇとしては、適当なイオンおよび分子透
過性を有する脂質二重層（ｌｉｐｉｄ　　ｂｉｌａｙｅ
ｒ）または薄いテフロン層あるいは溶剤デポジットポリ
マー層または真空蒸着金属または酸化物層が挙げられる
。このような補助膜３８の典型的な厚みは０．０２μｍ
となり、その厚みは非常に薄いので、セル３５の上端は
、センサー２０の外面から有効に内方にのびているとみ
なすことができる。かかる補助膜３８の主要な機能は安
定性を増強し、かつ生化学的材料による望まない汚染を
排除することによって、センサーの寿命を延ばすことに
ある。この補助膜３８派、陽極酸化されたアルミニウム
膜３４の耐久性を存しないが、それによって架橋される
セル開口が非常に小さくなるため、高度の機械的剛性を
有することになろう。

作動中、上述の渡辺論文で報告されたように従来技術と
本質的に同様にセンサーは、化学的かつ電気的に機能す
る。

かかる機能の詳細は、渡辺他による「食用魚におけるヒ
ポキサジン及びイノシン測定用酵素センサー」　（アプ
ライド　マイクロバイオロジーアンド　バイオテクノロ
ジー（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
）（１９８４）　１９：１１１１−２２゜スブリンガー
ーバーロジー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌｏｇｙ）９
７頁参照）に報告されている。第６図は電気配線図で、
４０の位置で図示しない電池から印加されるＤＣ電圧は
第１増幅器によって増幅され、Ｐ　Ｏ。

−Ｅセンサー電極２６Ｘと基準電極２４間に印加する一
方、第２増幅器４２によってｐ　ｔｏ、センサー電極２
６Ｙと基準電極２４間に印加される。レジスター４３及
び４４を横断する電圧によって検出されるそれぞれの電
流は、比較器４５によって比較され、ターミナル４１の
出力はヒポキサジン濃度を示す。他方、酸素濃度はレジ
スター４４から増幅器４８を介してターミナル４７に現
れる。

本発明の改良点は基本的に改善された作動速度で、３０
倍かそれ以上速いという点にある。これは、関連した拡
散距離が非常に短いという小規模化が一部関与し、また
、膜３４の外面に対して位置する検査中の組織と電極２
４．２６との直接の接触の結果でもある。陽極酸化され
たアルミニウム酸化物層（膜）３４の高多孔性質はこの
直接の接触を確実にする。さらに、外膜３８（第５図）
が使われたとしても、この膜３８の極端な薄さから見る
と、かかることは本質的に変わらない。膜３４のセル３
５は酵素を固定させるためのすぐれたマトリックスを提
供するのに適当な大きさである。

同時に陽極酸化されたアルミニウム酸化物層は高い摩耗
耐性のある外面を提供している。この特性は何回も検査
中の組織を突き通すのに使われた後も確実に機能し続け
るプローブを構成するのに重要である。

電気的騒音妨害を減らすために（なぜなら、センサー中
の電流は非常に小さい、例えばＩＱ−Ｉｆアンペア程度
であるので）、電極２６はお互い大きさや配置が類似し
ており、電極２４に対して対称的に配置される。さらに
、これら電極とそれらにのびる伝導体（コンダクタ−）
には図示しないシールドが施されている。かかるシール
ドは取っ手１２内に入っている高度のインピーダンス回
路（第６図）からの漏れ電流を減らす機能を果たす。

本発明は図面に示された特別のセンサーの型だけに限度
されるものではない。

化学的感知を行うソリッドステート装置におい　　　゛
て、近年多くの開発がされてきた。特に、イオン選択性
電界効果トランジスター（ＩＳＰＥＴＳ）また電位差セ
ンサー、パイロ電気式エンタルピーセンサーや面音響波
センサーが知られている。面音響波（ＳＡＷ）センサー
は表面波伝達特性への一時的変異を探知する。ＳＡＷ装
置に基づく化学センサーあるいはバイオセンサーは特定
の化合物を探知するために選択的親和力層を使う。また
、今まで作られてきたエンタルピーセンサーの多くは発
熱反応に触媒作用を及ぼす特殊酵素基質に基づいて製造
されてきた。センサーそのものは微小な温度差に応答す
る。異なった型の電位差センサーが数多く設計され、い
くつかは商業上利用できるものである。電位差バイオセ
ンサーの検出特異性はしばしば特殊酸化酵素あるいは過
酸化酵素基板により媒介されることにある。

特定の生化学化合物または複雑な媒体中の物質代謝を感
知するこれらの装置の能力により、生命医学上の監視や
診断を可能なものにする。また、食品加工管理への応用
をも可能なものにする。

ショ糖やモノアミン、リン脂質、コレステロール等のよ
うな基体に特有の生命電気化学の技術批評がニス・スズ
キ（Ｓ　、　Ｓ　ｕｚｕｋｉ）とアイ・カルベ（■、　
Ｋａｒｕｂｅ）による論文に発表されている　（アプラ
イド　バイオケミストリー　アンド　バイオエンジニア
リング（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　　ａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）Ｖｏｌ、
　３（１９８１））。

本発明の陽極酸化されたアルミニウム酸化物は酵素固定
によく適応する多孔性材料の耐摩耗性を有し、外膜を必
要とするこれら化学センサーいずれにも適応できるもの
である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の好ましい具体例に関する生化学プロ
ーブの縮小透視図、第２図はプローブの拡大平面図、第
３図はプローブ内に組込まれたセンサーの拡大断面図で
、縦方向が拡張されている。 第４図はセンサーの一部拡大断面図で、縦方向スケール
は縮小されている。第５図は第４図の変形例の部分図、
第６図は電気回路図である。 １０・・・プローブ、１４・・・シャフト、１６・・・
とがった端部 ２０・・・センサー、２２・・・傾斜面第５図 第６図

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）外部膜（３４）を有する化学センサー（２０）で
   あって、その膜が電解質を含み、かつ酵素（３７）を固
   定するための多数の小セル（３５）を有する陽極酸化さ
   れた酸化アルミニウム薄層からなることを特徴とする化
   学センサー。
2. （２）比較電極（２４）と、少なくとも一本のセンサー
   電極（２６）と、上記電極を越えて延びる膜（３４）か
   らなる構成において、上記膜が上記電極のそれぞれ一つ
   と連絡するように外表面から延びる多数の小セル（３５
   ）を有する陽極酸化された酸化アルミニウム薄層からな
   る特徴とする化学プローブ（１０）における酵素センサ
   ー（２０）として、使用するための組立体。
3. （３）センサー電極を一対備える前記第（２）項記載の
   組立体。
4. （４）比較電極（２４）と、一対のセンサー電極（２６
   ）と、センサーのための外表面を備えるように上記電極
   を越えて延びる膜（３４）からなる化学プローブ（１０
   ）として使用するための酵素センサーにおいて、上記膜
   が上記電極のそれぞれと連絡する上記外表面から延びる
   多数の小セル（３５）を有する陽極酸化された酸化アル
   ミニウム薄層からなり、上記セルが電解質を含み、固定
   された酵素（３７）をも含む上記センサー電極の最初の
   一つにこれらセルが連絡することを特徴とする酵素セン
   サー。
5. （５）試験される組織に侵入するための鋭い端部（１６
   ）で終わるシャフト（１４）を有する化学プローブにお
   いて、 （ａ）上記端部に隣接するシャフトの表面（１８）上に
   位置する酵素センサーであって、 （ｂ）該センサーが比較電極（２４）と、一対のセンサ
   ー電極（２６）と、センサーの外表面を形成するように
   上記電極を越えて延びる膜（３４）からなり、（ｃ）上
   記膜が上記電極のそれぞれと連絡するように上記外表面
   から延びる多少の小セル（３５）を有する陽極酸化され
   た酸化アルミニウム薄層からなり、 （ｄ）上記セルは電解質を含み、これらセルは固定され
   た酵素（３７）をも含む上記センサー電極の最初の一つ
   と連絡し、 （ｅ）上記電極は比較電極と各センサー電極との間に電
   圧を印加し、各センサー電極を流れる電流を比較するた
   めに回路（４０−４５）に接続されることを特徴とする
   化学プローブ。
6. （６）センサーの外表面が上記シャフト表面の続きを形
   成する前記第（５）項記載の化学プローブ。
7. （７）陽極酸化された酸化アルミニウム膜が１０μｍを
   越えない厚みを有する前記第（５）項記載の化学プロー
   ブ。
8. （８）上記厚みがおよそ１μｍである前記第（７）項記
   載の化学プローブ。
9. （９）プローブの鋭い先端が約１ｍｍの横断寸法を有し
   、センサー電極は約１００μｍ＾２の面積を有し、陽極
   酸化アルミニウム膜は約１μｍの厚みを有し、セルは直
   径約０．１〜０．０５μｍである前記第（５）項記載の
   化学プローブ。