JPS6270395A - ペニシリン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 灯１の外野一 本発明はペニシリン誘導体に関オろ。

発明び孕イ．１　ｊ２ トリペブチＦ’　６　−　（Ｌ−α−アミノアンビル）
−Ｌ−ンステイニル−■）−バリン（ΔＣＶ）は、ペニ
シリン誘導体、セファロスポリン誘導体およびセファマ
イノン誘導体のようなβ−ラクタノ、抗生物質の生合成
の重要な中間体である。さらに詳しくは、ペニシリウム
・クリソケヌノ−＼（Ｙ）ｃｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃ　ｈ
　ｒ　ｙ　ｓ　ｏ　ｇ（＞、ｎ　ｕ　ｍ　）お、■−び
アクレモニウ１、・クリソケヌム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕ
ｍ　　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）（セファＵＪスボリウ
ム°アクレモニウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍａ
ｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）としても知られている）は、β−
ラクタムの生合成の第一段階を共有干ろということは明
らかである３、該生合成において、トリペプチドＡＣＶ
はＬ−α−アミノアツベ−Ｉ・、Ｌ−ノステインおよび
ｌ、　　バリンから形成され、ついで八ＣＶの環化によ
りイソペニシリンＮに形成される。

その後、該生合成経路は分かれろ。ペニンリウＪ２（■
）ｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）に関しては、該Ｌ−ａ−アミ
ノアジピル側鎖は疎水性側鎖、たとえば、ペニシリンＧ
（ベンンルペニンリノ）の場合のフェニルアセデル側鎖
に返還ざねろ。アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
）に関（７ては、該Ｌ−α−アミ７ノアンビル側鎖は■
）一体にエビ化され、ペニシリンＮを与え、ついて該べ
二−ンリンＮのデア゛シリジン環の）広大に３１−リゾ
アセトキンセファ［２スポリンＣＧ　’″Ｊ−えろ。、
Ａ　ＣＶをイソペニシリンＮに環化する作用を４−ろ環
化酵素（イソペニノリンＮンンセターセ、または−１ｌ
−イクラーゼとｆＩド唱゛）の基質特異性に関（７て種
々の研究チーノ・により研究がＦｉなわれてきた。

ペニシリウム、・クリソゲヌム（Ｔ’　、　ｃｈｒｙｓ
ｏｇｅｎｕｍ）お３Ｌびアクレモニウム・クリソゲヌ１
＼（Ａｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のイソペニシリンＮシ
ンセターゼ、は狭い基質特異性を示すことが立証された
３、例えば、バリンの位置にグリノンを含￥Ｊ゛オろ１
−リペプチトは環化段階を阻害オろことか示された。関
連するｌ・リペプチドグルタヂオン（γ−グルタミルー
ンステイニル　グリノン）か該反応混合物に加えられた
場合にもΔＯＶ環化が阻害されることが判明した。

−・般に、該結果は、該トリペプチドの３位のアミノ酸
（オなわら、■）−バリン）の性質にはある程度の許容
性かあり、２位（■、−シーンイン）は許容＋１がなく
、１位（Ｔ−、−α−アミノアンピン酸）はわずかの８
４容性しかないことを示している。したがって、Ｌ−カ
ルボキノメチルンステイン、アジピン酸またはＤ−α−
アミノアジピン酸は該トリペプチドの１位にてＬ−α−
アミノアジピン酸と変換できるが、■、−グルタミン酸
、■７−アスパラギン酸、カプロン酸、デルタ−アミノ
ピメリン酸、グルタミン酸、アミノピメリン酸および酢
酸を含むより多くの酸は変換できない。事実、ボールド
ウィンら（Ｂａｌｄｗｉｎ　　ｅｔ　　ａｌ、　Ｘツヤ
−ナル・才ブ・ケミカル・ソザイエティー・ケミカル・
コミ、−ニケーションＸＪ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　
Ｃｈｅｍ、Ｃｏｍｍｕｎ。

）、１２２５〜１２２７（１９８４，）のオックスフォ
ード・デーム（Ｊ１最近、該）・リペプヂドの第１残基
は、ペニシリンへの連続的変換のためにカルボギノコ）
（を末端とする６炭素または等価の鎖を有していなｉＪ
ればならないと結論した。

さらに、）Ｊニル酢酸を供給してセファロスポリウム（
Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）に直接フェニルアセチ
ルセファロスポリンを生産させようとする多くの試みが
失敗したのは、おそらく、セファロスポリウム（Ｃｃｐ
ｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）が必要であると考えられてい
るペニンリンアノルトランスフエフーゼ酵素を欠いてい
るために生じたものであると考えられる。

光狸や士−峰 本発明の目的は、ペニシリン誘導体およびその関連化合
物の新規方法を提供オろちのである。もう１つの目的は
酵素サイクラーゼの新規基質の提供である。

３２男−リ」勺− 予期せぬことに、サイクラーゼはへテ〔ｌペブチドフゴ
ニルアセヂル　Ｌ−ソステイニル−Ｄ−）＜リン（ＰＣ
Ｖ）を直接ペンシルペニノリン（ペニシリンＧ）にヘテ
ロペプヂドフエノキンアセヂル−■７−ンステイニルー
■）−バリン（ＰＯＣＶ）をペニシリンＶに変換でき、
同様に他のアリールアシル−Ｌ−ノステイニルー■〕−
バリンヘテロペプチドをペニシリン誘導体に変換できろ
ことが判明した。

したか−）で、本発明は、サイクラーゼを用いたＰＣＶ
、Ｐ００＼、ｒまたは他のＰＣＶ同族体の環化からなる
ことを特徴とオろペニシランの製造法を提イＪ（オろ４
、 ヘテロペプチドＰＣＶおよびｐｏｃｖは、それ１′口＋
、新規化合物てある。これらの新規化合物は、式 ％式％） にて示さ石ろ４、 さらに一般的には、本発明に用いられろヘテロペプチド
は新規化合物であり、本発明の−・部を形成４−る。

妖す夷−賢炒体誕１ｐ泄Ｊ丞 本発明は、ヘテロペプチドＰＣＶがアクレモニウム・ク
リソゲヌＡ（Ａｃｒｃｍｏｎｉｕｍ　　ｃｈｒｙｓｏｇ
ｃｎｕｍ）の細胞不含抽出物により直接ベンンルペニシ
リンに変換できろという驚くべき発見に基づいている。

それ以後の研究により、他のアリールアシル−し−ンス
ナイニルーＤ−バリンヘテロベプヂドをペニシリン誘導
体に変換することができ、および他の酵累隙を用いるこ
とができることが示された。

収率は一般に比較的低いが、それにもかがゎら４゛、変
換の程度は著しく、該アリールアシルへテロペプチドに
対オろザイタラーゼの親和性を明確に示している。

遺伝子Ｅ学技術により、該親和性を増大さ）」ることか
できる。さらに、また、アクレモニウム・クリソゲヌム
（Ａ　、　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の還拡大酵素（デ
アセトギンセファロスボリンＣンンセターゼ・エクスパ
ングーセ）を遺伝子的に修飾でき、基質として疎水性ペ
ニシランを許容できる場合、疎水性セファロスポリンを
生産できろ。

本発明の方法に用いるサイクラーゼは、代表的には、サ
イクラーゼ産生貞菌または細菌のようなサイクラーゼ産
生微生物の細胞不含抽出物と（７て用いろ。好適なサイ
クラーゼ産生真菌類および細菌類と１．では、アクレモ
ニウム・クリソゲヌム（Ａ。

ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ベニツリウム・クリソゲヌ
、’、、　（Ｐ　。

ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）およびストレプトミセス・ク
ラブリゲルス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｃｌａ
ｖｕｌｉｇｃｒｕｓ）が挙げられろ。細胞不含抽出物は
、該培養を採取し、好適な緩衝培地にて該細胞を再懸濁
し２、該細胞を、例えば、音波処理により破壊し、つい
で遠心分離Ｉ２て粗製抽出物を得ろ。該粗製サイクラー
ゼ（Ｊ常法により精製できろ。

細胞不含抽出物の別法として、死滅、溶解細胞または該
ヘテロペプチドに対し透過性にした細胞を用いるこがで
き、ザ〜イクラーゼ源が該ヘテロペプチド活性を所望の
β−ラクタムに変換オろかとうか筒中な試験で測定する
。

通常の固定化法を用いろサイクラーゼまたはサイクラー
ゼ含有物質の固定化形態を用いることができろ。

遺伝ｒ・１．学および他の技術を用いて、本発明方法に
用いろために改良した修飾サイクラーゼを有する細胞に
発達さＵることかできると考えられるので、本発明は、
また、改良サイクラーゼの使用に及ぶ。

第１に、本発明方法は、ペニシリンＧ１ペニシリン■ま
たは６−アミド側鎖に芳香族性を有する他の公知のペニ
シリン誘導体の生産を目的とする。

明らかな。１；うに、要すれば、化学的または生合成的
修飾に関連して、他のへテロペプチドを用いることもで
きる。この方法にて、事実−１−１半合成ペニノリンを
生産することができる。

本発明の新規なヘテロペプチドは対応する構造を有しお
よび式 ％式％ ［式中、Ａｒは芳香族基、例えば、非置換または適当な
置換括（メチル、メトキシ、フゴノキノ、ヒトし１ギン
、塩素、フッソなどから選択される１〜３個の置換拮の
よパ）な）にて置換されてよいフェニルまた（］ヘテロ
芳香族環（窒素、酸素および硫黄から選択さイまた１〜
４個のへテロ原子を有する５よたは６員ヘテ［Ｊ芳香族
環のような）、お。ＬびＺは中結合、−ＣＴＩＲ−Ｘ（
Ｒは、代表的には、ｌ１３４ＪＩ−Ｔ、−１−Ｃ００Ｉ
−■などであり、要すれば、保護ずろ）、　（−０Ｃ１
，ＩＩえ一塙または２価へテロ環状法（窒素、酸素およ
び硫黄から選択された１〜１１個のへテロ原子を有する
５または６員へづ・口篤香族環のような）を☆：味オる
］で示されるヘテロペプチドを包含しろろ。

本発明のへテロペプチドは、他の異性体形が該サイクシ
ーゼの作用を阻害シフ・）ると考えられるので、好」：
Ｉ、＜は、Δｒ−７．−ＣＯ−Ｌ−システイニル−■）
−バリン形態にて用いられる。

本発明に用いるヘテロペプチド基質の製造に通常のベプ
チ）・合成法が採用できろ。代表的には、そのような方
法は、通常、誘導体としてのおよび／または特殊なカッ
プリング剤の使用によるアミノ酸のカップリングからな
る０、代表的な該へう・ロベプチド製造法は、ンスヂン
のＮ−アシル化、ついで通常のカップリング法、例えば
、Ｅト〕１．）　Ｑ法を用いろヘンズヒトリルエスう一
ルのよ−）なバリン誘導体とのカップリングにより行な
う。、ついて、脱保護して該ヘラ〔ｌベブヂトをジスル
フィドとじて得ろ３．別法と１−７で、ノスヂンは公知
の技術を用いてバリンとカップリングでき、ついて適当
なアソル基を（７１加して該ノベブヂドとオろ。該ヘテ
ロペプチドは、上た、他の公知のアミノ酸結合法を用い
て製造できろ。

該ヘラ「Ｊペプチドは、好都合には、シスチン中の千オ
括の存在から生じろジスルフィドとして製造し、貯蔵才
ろ。一つシ）で、該ビス−ヘラ・［ｌペプチド（Ｊ、適
当な還元剤、例えば、ノザオトレイＩ・−ルを用いてそ
の場でモノ体に変換できろ。

小規模研究について、好適な条（ｌＩは、該ザイタラー
セの細胞不含抽出物（５−２０ｍｇの蛋白／ｍのを、’
ｌ　Ｏｍ１ｖＩ　ｌ・リス−ＩＩ　Ｃｌ緩衝液（Ｔ）１
１７．５−８．１）１４〜６ｍＭ　　ＤＴＴ、Ｏ，１，
−０，５ｍＭ　　Ｐｅ５ｏ４１〜３ｍＭアスコルビン酸
す）・リウムおよび０２〜３ｍＭビス　へテロペプチド
の反応混合物のような適当な緩衝反応混合物中、２０〜
３７°Ｃにて０〜１２０分間インキコベー１・する。該
反応はメタノールの添加により停止できろ。

ペニシリンの形成はバイオアッセイ法を用いて、例えば
、感受性細菌を接種した寒天上に該試料を平板塗布−４
″ろことにより検定できる。該反応生成物は、ＨＰ　Ｌ
　Ｃおよび他の公知のクロマトグラフィー法により容易
に同定できる。

さらに、該ペニシリン誘導体は、例えば、遊離酸の塩化
」；た（Ｊエステル化により塩またはエステルとして製
造できろ。

分離したペニシリンは、常法にて医薬担体と処方でき、
適当な投与形態を提供する。

杢−発１′！ＩＩｐ１υ艇偽 実施例のために、ペニシリンＮ（純度９５重量％）、ヘ
ンシルペニシリンのカリウム塩（＋５８０Ｕ／ｍｇ）、
イー・コリからのベニシリンアンラーゼおよび（Ｉ７−
α−アミノ−δ−アジピル）−■。

−システイニル−■〕−バリン（ΔＯＶ）は、スペイン
、　レオン、　アンチビオチコス・ニス・ア（Ａｎｔｉ
ｂｉｏｔｉｃｏｓ　　Ｓ、　　Ａ、　　、　１．ｅｏｎ
、　５ｐａｉｎ）より一周達した。ンヂオ）・レイトー
ル（１）１′■゛）、）・リス、硫酸プロタミンおよび
ウシ血清アルジミンは、シグマ・ケミカル・カンパニー
（セント・ルイス、ニー・ニス・ニーＸＳ　ｉｇｍａ　
　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏ、　（Ｓ　ｔＬｏｕｉｓ、　Ｕ　、
　　Ｓ　、Δ　））から人手した。使用した他の化学薬
品は、試薬級またはｒ−■ｐ　ｒ、　ｃグレードである
。ストレプトミセス・クラブリゲルス・エーティーティ
ーン−（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｌａｖｕｌ　ｉ
ｇｃｒｕｓＡＴＴＣ）２７０５４お３）：びミクロ＝ト
ップＪス・ルテウス・エーティーンーシー（Ｍ　１ｃｒ
ｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ　　ΔＴＣＣ）９３４１は
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入
手した。

実施例１ フゴニルアセヂルー１７−シスチニルー１）−バリン（
ＰＣＶ）の合成 ツヤ−ナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソ→ノ・エ
ティ−（Ｊ、Δｍｃｒ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、　
）９０　：　１６５１−１６５２に記載されているＮ−
工１〜ギノカルポニル−２−工トギシ−１，２ノヒド〔
１ギルイン技術（１’＞　Ｅ　Ｔ）　Ｑ　）をＩＴＩい
て、−１ｊニルアセチル−８−トリイル　■７−ノスう
＝イン（予め、塩化）よニルアセニｆ　、７しをδ９−
トリチル−し−ノステインと反応さ且ろごとニ、１、＋
１）　、Ｊｊｌ製）Ｊ’；　ヨヒｐ　−１−）’ｖエン
スルポン酸Ｉ〕−バリンーベンズヒドリルエステルから
、フェニルアセチ几−Ｌ−ンスデイニル−Ｉ）　バリン
（ＰＣＶ）を合成オろ。この方法により、保護ｐ　ｖ　
ｃ、を合成１１、最終的に加水分解によりビスー用ＮＣ
■グイマーを１−）ろ。この））ＣＶを遊離チオールと
して用いろか、あるいは、ジスルフィドダイマーをジヂ
オ）・レイト−ル（ＤＴ’ＦＴ）でモノマーに還元する
。

ヒス−Ｐ　ＣＶのサンプルを真空封＋ｌ　した試験管中
、０１％（ｖ／ｖ）フェノールを含ｆ］４゛ろ、、５９
Ｍ　ＩＩＣＱ（：う回、ＥＡｍ）で２５時間加水分解し
て、Ｉ〕ＣＶの組成をｉＪ３定オろ。この処理の後、サ
ンプルをデシケータ−中で、Ｎ　ａＯＨで乾燥１２、水
（２回蒸留）で２回洗浄し、Ｄ　ｕｒｒｕｍ　Ｌ）　−
５００アミ、ノ酸白動分析機で分に一！ｌ’ろ。同時に
、ンステインのサンプルを同じ条（ｆｉて処理ｌ７１−
か、この分子は分解されなか−）ノこ。ンスう゛イン４
３よびバリンは、理論に等しい割合で？Ｉ在喝゛ろ４、
残存−４る生成物を、ゴｊスクロマ）・クラフィーによ
１）、フェニル酢酸と同定する（ヒコーレッ）・−バラ
カード（Ｉｉｅｗｌｅｔｔ　−Ｔ）ａｃｋａｒｄ）ガス
クロマ）・タク゛ラフイー（′）エチレングリ−ルーコ
ハク酸エステル（２０％）、１７０°Ｃ使用）。

また、ＰＣＶを、つ］ルフゴおよびジ三１−キンネン、
カナディアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Ｗｏ
ｌｆｃ　ａｎｃｌ　Ｊｏｋｉｎｃｎ　ｉｎ　Ｃａｎ、　
　Ｊ　、　　Ｃｈｅｍ。

）５７：１３８８〜＋３９６（＋９７９）により記載さ
れている方法に従い、Ｌ−α−アミノアジピン酸σ）か
イ′）りに、フェニル酢酸を用いて合成オろ。

Ｔ〕ＣＶの物理的性質は、次のとおりである。

融点　１９０℃（分解） 旋光度　「δ１２５−−−７３　、０５　（５０ｍＭリ
ン酸■〕 緩衝液、ｐｒ１８．０） ＩＩえ　（ＫＢｒ）ｃｍ’　　３４００（ＮＩＩ）、３
３００（ｂｒ、酸の０−１（）、＋７５０（アミド、Ｃ
−〇）、１６７０および１５５０（フェニル基）、１３
５５および＋　４０　（Ｈ（ＣＩｌ＋）２−ＣＴＩ］Ｕ
Ｖ　　λｍａｘ　２１０．２５０．２５６．２６４ＮＭ
Ｒ：　　’ＩＩ　　ＮＭＲ（８０Ｍｌ１ｚ、　ＣＩ）　
ＪＯＤ）　δ＊ ０８５および０．９０（Ｈｍ　　、Ｕｎ、２ｄ、６，８
Ｉｔ　Ｚ）、　　２　　、　０　７　　（）］’（！、
　　ｍ）、　　３　　、　０　６　　（１−１ｇ、　　
　Ｈｈ、　　ｍ）、３　、５７　（１−Ｉ　ｅ、　ｓ）
、４．２８（Ｈｊ、（１，５，４，Ｈｚ）、７．２７（
Ｈφ、　　Ｓ） ＊水素原子の位置は、前記ＰＣＶの式において示（、た
アルファヘットにより表示 口ＣＮＭＴえ（２０、ＩＭｚ、　Ｉ）　２０、ｐＨ９，
０（ＮａＯＨ））δ１７５．４３またｆ；１１７５．４
８（＊＊ Ｃｉ　　　、Ｃｋ、２ｓ）、］　７２．９（Ｃｊ、　ｓ
）Ｉ　３００１またｌＪ：１３０．２２（Ｃｃ、Ｃｃ’
　、ＣａＸｄｄ、ｓ）、　　１２８．１８Ｊ二　カニは
　１　２　８．　　４　０　　　（Ｃｄ、　　　Ｃｂ。

Ｃｂ’　、３ｄ）、６１．６７　　（ＣＬ　ｄ　）、５
９．８４（Ｃｇ、　　ｄ）、　４３　２３まノ：二は４
　３．３　０（Ｃｅ、　　Ｃｂ、２　［）、　　３１．
７９（Ｃｒ２、　ｄ）、　　１　８．１　８　　ま　ノ
：ｌＪ：１９９９（Ｃｍ、　　Ｃｎ、　　２ｑ） ＊＊炭素原子の位置は、前記ＰＣＶの式において示（７
たアルファベットにより表示 実施例２ ストレブ）・ミセス・クラブリゲルス（Ｓ　ｔｒｃ１３
ｔｏｍｙｃｃｓ　Ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）からのイ
ソペニンリンＮンンセターセの調製、およびＰＣＶおよ
びａｖｃを基質として用いた環化活性および反応生成物
の測定、 ストレプトミセス・クラブリゲルス（ （Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｃｓ　Ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒ
ｕｓ）Ａ　Ｔ　ＣＣ２７０６４を、オザリバンら、バイ
オケミカル・ジャーナル（０’　５ｕｌｌｉｖａｎ　ｃ
ｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、）、１７９・４７
〜５２（１９７９）により記載されているのと同様に（
−で保存ｊ７、増殖させる。培養物２５０ｍＱを、１１
００００ｘにて５分間遠心分離することにより回収し、
食塩水で洗浄し、前記と同様にして遠心分離する。沈澱
したセルを、Ｏ、ｌ　ｍＭｌ）　１’　１’を含有才ろ
５０ｍＭトリス−１−Ｉ　ＣＣ緩衝液（ＴＤ緩衝液、ｐ
Ｈ７，５）２５ｉ中に再懸濁し、ジャーナル・オブ・ア
ンチビオティクス（ＪＡｎｔｉｂｉｏｔ、）３５　：４
８３〜４９０（］　９８２）に記載されているのと同様
にして、ブランソン・ソニファイヤー・セル・ディスラ
ブター（Ｂ　ｒａｎｓｏｎＳｏｎｉｆｉｃｒ　Ｃｅ１ｌ
　ＤｉｓｒｕｐｔｏｒＸＢ　−１２）を用いて、音波処
理にイ」ず。破壊セル懸濁液を、１０００００　Ｘｇに
て９０分間超遠心操作に付しくＢ　ｅｃｋｍａｎＬ５−
６５Ｂ）、０　、２　（ｗ／　ｖ）％硫酸プロタミンで
処理し、透明な抽出物を、硫酸アンモニウムで沈澱させ
る（３０〜８０飽和、たとえば、５０〜８０％飽和）。

得られた沈澱をＴＤ緩衝液３ｍｆ２中に再懸濁し、セフ
ァデクス（商標）（，２５、ＰＤ−１０カラム（ファー
マシア（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ））にイ」ず。１ｍρず
つ集め、イソペニシリンＮシンセターゼ（サイクラーゼ
）活性に関して分析する。最大活性を有するフラクショ
ン４および５を混合し、反応に用いる。サイクラーゼ抽
出物を一２０℃にて凍結保存する。ローリ−ら、ジャー
ナル・才ブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｌｏｗｒ
ｙ　ｅｔ　　ａｌ。

、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、　）、＋　９３：２
６５−２７３（１９５１）により記載されている方法に
より、タンパク質を測定する。

サイクラーゼのＡＣＶまたはＰＣＶに関する環化活性は
、ジエンセンら、ジャーナル・オブ・アンチビオティク
ス（Ｊｅｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ａｎｔｉｂｉ
ｏｔ。

）３５：４８３〜４９０　（１９８２）　）およびアン
チビオティクス・アンド・アザ−・セカンダリ−・メタ
ボライソ（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ａｎｄ　０１ｈｅ
ｒ　ＳｅｃｏｎｄａｒｙＭｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ）ｐｌ
　４　］　〜ｐｌ　６４アカデミツク・プレス（Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）により記載されている方法を
若干変更して分析した。反応混合物は、最終反応容積０
．５ｍρ中、３０ｍＭトリス−ＨＣρ緩衝液ｐＨ７，５
；０．５ｍＭ　ＦｅＳＯ４；］］ｍＭビスーΔＣまたは
３ｍＭビス−ＰＣＶ；４ｍＭ　ＤＴＴ；　３ｍＭアスコ
ルヒン酸ナトリウムおよび酵素（タンパク質１０ｍｇ）
を含有する。反応混合物を２５°Ｃにて９０分間インキ
コベートし、メタノール０５ｍρ添加することにより停
止させる。

種々の実験において、ストレプトミセス・・クラブリゲ
ルスから抽出されたイソペニシリンＮシンセターゼによ
るトリペプチドＡＣＶの環化によりイソペニシリンＮが
生成し、一方、ＰＣＶの環化により、ベンジルペニシリ
ンが得られることが示された。

イソペニシリンＮおよびペンジルペニシリンの形成は、
バイオケミカル・ジャーナル（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍＪ）、
１０３・８７７〜８９０（１９６７）に記載のポール・
プレート法にしたがって、エム・ルテウス（Ｍ、　Ｌｕ
ｔｅｕｓ）ＡＴ　ＣＣ９３４１に対する生物検定により
測定する。ペニシリンＮおよびベンジルペニシリンを商
標として用いる。微生物（ペニシリンＮまたはペンシル
ペニシリン）１単位により、エム・ルテウスＡＴＣＣ９
３４１を試験微生物として用いて、ｌｌ１ｇのペニシリ
ンＮまたは１゜５８μｇのベンジルペニシリンに相当す
る阻止帯が得られる。

ＰＣＶの環化により、エム・ルテウスＡＴＣＣ９４３１
に対し、活性で、かつ、バシルス・カレウス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｃａｒｅｕｓ）（ディフコ（Ｄ　１ｒｃｏ）
）由来のβ−ラクタマーゼ■に対し、感受性の分子が形
成される（第１表）。

ＰＣＶの環化生成物は、ペニシリン・アシラーゼ２１．
Ｕ　　とともに３０℃にてＩＯ分間インキコベートした
場合、その抗菌活性の９０％以上を失う。一方、ＡＣＶ
の環化により得られるイソペニシリンＮは、ペニシリン
・アシラーゼに対して感受性でない（第１表参照）。

第　　　１　　　表 ニス・クラブリケルフ、・規イクラーゼによろタンパク
質のペニシリンへの中云換 １、−、、、−、十−！β−り久夕／ニセｊ　　、−−
０−馬凹−−，−，，Ｊ１　イソペニシリンは、ペニシ
リンＮを標準として用いて４１１＋定 ２　ヘンシルペニシリンは、ベンジルペニシリンを標準
として用いてｔｌ１１］定 反Ｕし混合物中、各々、Ｊ：（質（１）ＣＶ）を含まな
い−（′行な−・た対照試験Ｊ、；よび酵素を含まない
で行なり）−χ・１照試験（ｊ、陰性であった１、この
結果を第２表（こ］ｉぐ４゛。

第　　　２　　　表 完ヤ反応混合物　　　　　０．１５ ＰＣＶなし　　　　　　　００ サイクラーゼを用し）た環化の速度論を研究しノニ、。

第１図より、Ｐ　ＣＶかＬつのペニシリンＧの形成は、
遅い時間依存性経路に従−・て形成されるのて、Ａから
のイソペニシリンの合成の方か、４゛−１とはやいこと
がわかる。［１［１把環化条件ドて、ヘンシルペニシリ
ンＯ、ｌ　５　Ｕ／ｍｆ！が生成し、一方、同様の条件
１・で、イソペニシリンＮ　４．　ＯｔＪ　／　ｍ夕（
ペニシリンＮとしてｋｌ′価）が？、）られろ。

該反応混、）物からｊＩＩたイソペニシリンＮを、ン４
、ンセンら、ジャーナル・才ブ・アンチビオティ１７ス
（Ｊ　ｃｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ａｎｔｉｂ
ｉｏｔ、）３５　：　１０２６〜＋　０３２（＋　９８
２）により記載されている条件下で、同定した。ｒ’ｃ
ｖの環化ｊ−り得たヘンシルペニシリンを、以下の方法
により同定し７ｋ。、Ｉ″ＣＶを活性として用い、反応
（２００ｍＣ）を５回行なって、同定用に十分な反応生
成物を甲部する５、インギコヘーンヨンの後、レピラら
、ン〜・−ナル・オシ・アノヂビオイ゛イクス（Ｒｃｖ
ｉｌｌａ　ｅｔ　ａｔ、。

Ｊ、　ＡｎＬｉｂｉｏｔｉｃ、）、３７：７８１−７８
９に、Ｌり記載されている方法に１−たか−・て、各反
応混合物を、リン酸（８３％（ｖ／ｖ）、密１ｔ１．７
）２．２ｍＱを含有上ろ冷酢酸アミル３０ｍρて激しく
抽出４゛る。抽出（７た生成物を５０ｍＭリン酸緩衝液
ｐｌ−１７、０１０［ｎＱに加え、リン酸１０７ｉを含
ｇ４゛る醋酸アミル３ＩＩｌρで再抽出セろ。イｆ機相
中の生成物を、再び５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＩ−１７．
０　　Ｉｍｐに加え、冷蔵庫中で保存４゛る６、５つの
処理済ザンプルを混合し、リン酸８１ｔＱを合資ｊずろ
＾′［酸アミル２ｍθで再抽出し、リン酸緩衝液７５０
ｍ（２に添加する。この方法により、約１００７１ｇの
ヘンシルペニシリンが得られろ。該ペニシリンの精製は
、パーギン・エルマー・りａ　７　ｐクラツ・ンリーズ
（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｃｒ　Ｃ’、　ｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈ　Ｓ　ｃｒｉｅｓ）　３　Ｂ　（Ｌ　Ｃ−分光
光度検出器およびシグマＩＯＢクロマトグラフィ一・デ
ータ・ステーション）を用いてＨＰ　Ｌ　Ｃにより？ｊ
なう、３０ｃｍのμｍボンダバック（μｍＢｏｎｄａｐ
ａｃｋ）　ＣＩ　８カラム（つ（−ターズ・アソノ山−
ツ・インコーボレイテノ！’　（ＷａｔｅｒｓＡｓｓｏ
ｃｉａｔｅｓ　　ｌ　ｎｃ、　））および８３％（ｖ／
ｖ）の０゜１Ｍ酢酸すトリウム／′酢酸ｐＴ−１・１　
、５および１７％（Ｖ／　Ｖ）のアセトニトリルからな
る移動相を用いろ。

この条件下でのベンジルペニシリンの保持時間は、１２
．３分である。

また、ヘンシルペニシリンを、つぎの様な溶媒奈を用い
た下降式ペーパークロマ）・グラフィー（１０％クエン
酸すｌ・リウムてｔ）Ｈ３、７に緩衝したワッｐマン（
Ｗｈａｔｍａｎ）７２紙Ｎｏ、Ｉ）：Ｉ）ピリジン・ｎ
−ブタノール水（１１・１）ｎ）Ｎ−ブタノールエタノ
ール、水（４：Ｉ：５、−ヒ相）、ピリジン酢酸水（Ｉ
・ＩＯ：］３５）中薄層電気泳動（１１１−１３、５，
３００ｖ／ｃｍ、２時間）；および濾紙電気泳動法（１
３ｖ／ｃｍ、　コリノン、酢酸緩衝液（０，０５Ｍ）中
、ｒｏｌ１７０．３時間）により同定（、た。ロペツー
ニ−（・（Ｌｏｐｅｚ−Ｎ　１ｅｔｏ）の博士論文（サ
ラマン力大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓａｌａ
ｍａｎｃａ、　５ｐａｉｎ）７７頁に記載の如く、濾紙
また（Ｊ薄層に０．５ＭＮａＯＨ１次いでヨウ化デンプ
ンを吹き付（Ｊて、ペニシリンおよびその転位生成物ペ
ニソロン酸（β−ラクタマーゼとともにインキュベート
することにより、ピー・セレウス（Ｂ　、　ｃｅｒｅｕ
ｓ）Ｕ　Ｌ　＋から得ろ）のスポットを得る。

実施例３ ペニシリウム・クリソゲヌムからのイソペニンリンＮシ
ンセターセの調製、および基質としてＰＣＶおよびＡ　
ＣＶを用いた環化活性および反応生成物の測定 高産生株ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐ　ｅｎｉｃｉ
ｌｉｕｍ　ＣｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍΔＳ　−１）−７８
、レンガら、ジャーナル・オブ・アンチビオテックス（
Ｌｕｅｎｇｏ　　ｅｔ　　ａｔ、、　　Ｊ、　　八ｎｔ
ｉｂｉｏｔ、）Ｉ　　４　４　　：　８　６　９−８７
６）参照）から抽出したイソペニシリンＮシンセターゼ
を用いる以外（Ｊ、実施例２と同じ操作を行なう。

ジャーナル・オブ・アンチビオデックス（、Ｊ。

Ａｎｔｉｂｉｏｔ、　）Ｉ　４４　：８６９〜８７　Ｇ
に記載の如く、高いイソペニシリンＮシンセターゼ活性
を有するセルが２段階で得られる。ラモスら、アンデミ
クロバイアル・エーンエンツ・アンド・ケモセラピー（
Ｒａｍｏｓ　　ｅｔ　ａｌ、、　　Δｎｔｉｍｉｃｒｏ
ｂ、　Ａｇｅｎｔｓ。

Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、）２７（３）：３８０〜３８７に
より記載の如く、セルを含まない抽出物が得られる。ベ
ニツリウム・クリソゲヌム菌糸をセファロスポリン産生
培地（ＣＰ培地）中で２４時間培養後回収し、０　、１
　ｍＭジヂオトレイト−ル（ＤＴＴ）を含有する３０ｍ
Ｍトリス−Ｉ−Ｉ　Ｃρ緩衝液１）Ｉ（８、０中に再懸
澗する。該菌糸を、５分間音波処理して破裂させる。

抽出物を１０００００×ｇ、４°Ｃにて１時間、ベック
マンＬＢ−７０超遠心分離機で遠心分離し、得られた粗
抽出物を一２０°Ｃにて保存する。前記アンチミクロバ
イアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピー、２７（
３）：３８０〜３８７と同様にして、イソペニシリンＮ
シンセターゼを精製する。

実施例２と同様に、抽出した酵素を用いると、ＡＣＶが
環化して、イソペニシリンＮとなり、ＰＣ■が環化して
、ベンジルペニシリンになる。該反応生成物は両方とも
、ペニシリウムセにより完全に不活化される。ＰＣＶを
基質として用いた場合、反応生成物は、ペニシリン・ア
ンラーゼにより不活化される。ペニシリン・アシラーゼ
による反応生成物の不活化は、ＡＣＶを基質として用い
た場合は起こらない。

エイ・クリソゲヌム（Ａ、　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）
のサイクラーゼを用いた０、２ｍＭＡＣＶまたは０．２
ｍＭＰＣＶの環化により形成されるイソペニシリンＮお
よびベンジルペニシリンを、以下の生物検定法により分
析した。反応をメタノールで停止させた後、３つの同等
なサンプル５０μＱを、ミクロコッカスルテウス（Ｍｉ
ｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　　ｌｕｔｅｕｓ）（６００ｎｍに
お０る光学密度が１０である培養物０゜５ｍρ）を接種
したトリプヂック・ソイ・アガー（ＴＳＡ）培地（Ｄ　
１ｒｃｏ）　１５　ｍρを含有するプレートの直径７ｍ
ｍのウェルに加える。純粋なイソペニシリンＮまたはベ
ンジルペニシリンの対照サンプルを、本反応のサンプル
と同様の方法でメタノールで処−２Ｆ、− 理する。分析プレート中のサンプルを３時間、４°Ｃに
保ち、拡散させ、３０°Ｃにて１２時間インキコベー１
・する。

第２図は（ａ）純粋なベンジルペニシリン（保持時間１
２３分）＋　（ｂ）溶媒抽出の後、ピー・クリソゲヌム
（Ｐ、　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）サイクラーゼを用い
へＰＣＶ環化反応生成物：および（Ｃ）ペニシリン・ア
ンラーゼで処理し、溶媒で抽出したＰＣＶ環化反応生成
物のＩ（Ｐ　Ｌ、　Ｃ溶出パターンを示す。

ピー・クリソゲヌムの抽出物を用いたＰＣＶの環化によ
り得られた抗生物質のクロマトグラフィーの後の位置は
、クロマトグラフィー用濾紙を１５Ｘ０．５ｃｍに切断
し、各試験片を、予め、イー・コリ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ
）またはエム・ルテウス（Ｍ。

１ｕｔｅｕｓ）の菌叢で接種したＴＳＡのプレート上で
テストすることにより確認する。両微生物に対する活性
はＲＦ＝０．６７（ベンジルペニシリン）の位置にある
。ＡＣＶがサイクラーゼの基質であるサンプルについて
同様の実験を行なった場合、生活性は第１および第２領
域（ＲＦ＝０．０６）に位１１１′昌４−ろう 実施例４ アう７レモエｒンノ、・クリソゲヌノ２、がらの？ソペ
ニノリンＮノンセターゼのＪＪ製、およびＰＣＶおよび
／＼ＣＶを基質として用いた環化活性お、１、び反応生
成物の測定 高１；【牛（朱）翼！し石Ｊコクノー、・クリソヶ゛ヌ
！、（Ａｃｒｃｍｏｎｉｕｍ　　ｃｈｒｙｓｏ　ｇｃｎ
ｕｍ　　ＣＩ　　Ｏ、エイ　・　エノし・デフツイン（
Ａ　丁、、Ｄｃｍａｉｎ）より入手、可能）がら抽出１
刀こイソペニノリンＮンンセターゼを用いる以外は、実
施例２と同様の操作を行なう。

ジャー１′ル・オブ・アンチビオティクス（ＪＡｎｔｉ
ｂｉｏｔ、　）Ｉ　４４　：８　Ｇ　９〜８７６に記載
の如く、高いｆソベニノリンＮシンセターゼ活性をｆｊ
゛オろセルが２段階で得られろ。ユーイ・クリソゲヌノ
、培谷抹を、接種培地中４１−１間発育させ、これを用
いて、化学的に決定１−１たセファ［１スポリン産土［
音地（ＣＰ培地）６０ｍρに接種する。ラモスら、アン
子ミク覧＝１ベイアル・上−ノＳンッ・アント・ケーＣ
゛セラビーｆＪｊａｍｏｓ　　ｃｊ　　ａｌ、、　　Ａ
ｎｔｉｍｉｃｒｏｂ。

Ａｇｅｎｔｓ　　Ｃｈｃｍｏｔｈｃｒ、　　）２７（３
）、３８０−３８７により記載の如く、セルを含ｉ：す
い抽出物がｆ’Ｊられる６、エイ・クリソノアヌムの菌
糸を、０Ｐ（ｊ１地中で２４時間ｉ’Ａ　Ｎ　ｉ＆に回
収１２．０．１ｍｌ’ｖ１）壬第１・トイト−ル（ＤＴ
Ｔ）を含￥ｒ　ｔろ３０ｍＭｈリス１１ＣＱ援イΦ丁液
ｐＨ８、０中に懸濁４′ろっ該菌糸を２分間？゛１波処
理により破裂させろ。抽出物を１０００００　ｘｇ、４
°Ｃにて１時間ベックマレＬ８−７０超遠心分離機で１
セ心分離Ｉ２、ｊすら机た粗抽出物を一２０℃にて保（
ｊする。前記）′ンヂミクＬ１・ぐイアル・エーノＪン
ツ・アント・ケモセラビー、２７（３）：３８０〜３８
７と同様にして、（ソペニシリンＮシンセターゼを精製
Ａ′ろ３、実施例２よ；よび３と同様に、抽出（、ノニ
酵累にＪ’−リ、Ａ、　ＣＶが環化してイ゛ノベニノリ
ンＮになり、ＰＣＶが環化１．てベンジルペニシリンに
なる。該生成物は両刀とらベユシｌ）ナーゼにより完老
に不活化されるか、Ｆ′ＣＶ＋ａ（質と１．用いた場合
にだ（＋反応生成物はペニシリン・アンラーセに、１′
り不活化される。

工（・クリソゲヌム・サイタラーゼにより形成さ、ｉｌ
；′ｌイソペニシリンＮおよびベンジルペニシリンＮの
生物検定を、実施例３において、ピー・クリソゲヌノ・
から抽出しカニサイイアラーゼにより産生されたペニシ
リンの分＋１１に関し゛ζ記載１−７へのと同様の方法
で行な一″）４、 ユ、イ・クリソゲヌノ−・の抽出物でＰＣＶを環化ずろ
ことにより得られろ抗生物質のクロマトグラフィー後の
位置は、実施例３と同様にして実証され、同様の♀−１
果が得られろ。

実施例５ ペニシリウム・クリソゲヌムからのイソペニンリンＮシ
ンセクーゼの調製、およびｐｏｃｖを基質と１．て用い
た環化活性および反応生成物の測定ＰＣ■のかわりにフ
ーｒノキンアセヂルーＬ−ンスティ、：〜ルー利）　バ
リン（１’０ｃＶ）を用いる以外は実施例３と同様の操
作をｉｊなう。

Ｐ　ＯＣＶは、ボールドウィンら、ジャーナル・オブ・
リーミカル・ソサエデｆ−・パーギン・トランスアクノ
ヨン・オブ・１１９８１２２５３（Ｂａｌｄｗｉｎ　ｅ
ｔ　ａｌ、、　　、Ｊ　、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、
　　ＰｅｒｋｉｎＴｒａｎｓ、　　ｌ　Ｉ　９８１２２
５３）により記載されている標学的力ｌ去によろか、ま
たは、ノスティンをＮ−アノル化し、次いで１．２−ジ
ヒドロ−２−エトキノ−Ｉ−ギノリンカルボン酸エヂル
（Ｅトコ１）Ｑ）を、バリンベンズヒドリルエステルと
カップリングし、）・リフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ　’
）で脱保護し、ヘテロペプチードのジスルフィドを得ろ
、二と１こより調製する。。

ピー・クリソゲヌノ、ＡＳ−Ｐ　７８（タンパク質５〜
２０ｍｇ／ｍののセルを含まない抽出物を、３０　ｍＭ
　）−リス−ＨＣＣ緩衝液ｐＩ−１８、１，０，１ｍ〜
ＩＦ’ｅＳＯい　６ｍＭ　Ｉ）Ｔ’Ｔ、３ｍＭアスニ１
ルピン酸十）・リウムおよび３ｍＭ１’ＯＣＶを告白す
る反応混合物中、２５℃にて３０分間インキ、べ−１・
４゛ろ。ｐｌ−１を２０に調製する。

ピー・クリソゲヌＪ１から抽出（７たイソペニンリンＮ
ノンセターセによるＰ　（’ｌ　ＣＶの環化により、ペ
ニシリン■が生成オろ。

基質（ＰＯＣＶ）を用いずに行なった対照試験および酵
素を用いずに行なった対照試験は陰性であった。結果を
以下の第３表に示す。

第　　　３　　　表 実施例６ アクレモニウム・クリソゲヌムからのイソペニシリンＮ
シンセターゼの調製、およびｐｏｃｖを基質として用い
た環化活性および反応生成物の測定 ＰＣＶのかわりにｒ’ｏｃｖを基質とし用いる以外は実
施例４と同様の操作を繰り返す。実施例５に記載されて
いるのと同様にして、ＰＯＣＶを調製オろ。エイ・クリ
ソゲヌムＡＳ−Ｃ−８０からサイクラーゼを抽出し、実
施例５に記載した反応混合物中でインキュベートする。

ただし、トリス緩衝液のｐｒ−ｒを７８とする。

サイクラーゼをｐｏｃｖとともにインキュベートした結
果を第４表に示す。

第　　　４　　　表 ペニシリンＶ（Ｕ／ｍの た他のクロマトグラフィー技術により、反応生成物をペ
ニシリン■と同定した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、それぞれス）・レプトミセス・クラブリゲル
ス（Ｓ　ｔｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ　ｃｌａｖｕｌｉｇｅ
ｒｕｓ）から抽出した酵素を用いたＰＣＶおよびＡＣＶ
からのペンジルペニノリン合成およびイソペニシリンＮ
合成の時間を示したグラフである。 第２図は、（ａ）純粋ベンジルペニシリン、（ｂ）ペニ
シリウム・クリソゲヌム（Ｐ、　ｃｈｒｙｓｏｇｃｎｕ
ｍ）サイクラーゼを用いたＰＣＶ環化の反応生成物およ
び（Ｃ）ペニシリン・アンラーセにて処理したＰＣＶ３
５− ■環化の反応生成物のＨＰ　Ｌ　Ｃ分析を示す÷ｖ−ド
ア”ｌ）　３゜特許出願人アンチビオヂコス・ソシェダ
ード・アノニマ 代　理　人弁理士　前出　葆ほか２名 （１山／ｎ）Ｎ　ｆ−どｃく、二。Ｘ／／、ｋ（山ｕｔ
１ｇ２）Ｍｌ　　′Ｉｉｄ 図

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）フェニルアセチル−Ｌ−システイニル−Ｄ−バリ
   ン（ＰＣＶ）およびフェノキシアセチル−Ｌ−システイ
   ニル−Ｄ−バリン（ＰＯＣＶ）ならびにそれらの同族体
   から選択されるアリールアシル−システイニル−バリン
   ヘテロペプチド。
2. （２）ビス体である前記第（１）項のヘテロペプチド。
3. （３）サイクラーゼを用いたアリールアシル−システイ
   ニル−バリンヘテロペプチドの環化からなることを特徴
   とするペニシリンの製造法。
4. （４）該サイクラーゼがサイクラーゼ産生微生物の細胞
   不含抽出物として提供される前記第（３）項の方法。
5. （５）該サイクラーゼ産生微生物がアクレモニウム・ク
   リソゲヌム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅ
   ｎｕｍ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉ
   ｌｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）およびストレプ
   トミセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
   　ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）からなる群から選択され
   る前記第（４）項の製造法。
6. （６）該製造法により生産された該ペニシリンがペニシ
   リンＶおよびペニシリンＧからなる群から選択される前
   記第（３）項の製造法。
7. （７）該製造法により生産された該ペニシリンがペニシ
   リンＶおよびペニシリンＧからなる群から選択される前
   記第（５）項の製造法。
8. （８）該アリールアシル−システイニル−バリンヘテロ
   ペプチドがビス−ヘテロペプチドの還元によりその場で
   形成される前記第（３）項の製造法。
9. （９）該アリールアシル−システイニル−バリンヘテロ
   ペプチドがビス−ヘテロペプチドの還元によりその場で
   形成される前記第（５）項の製造法。