JPS6251600B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は、グルタチオンの製造法に関する。 グルタチオンは肝疾患治療剤、解毒剤など、医
薬として広く使用されている。 従来知られているグルタチオンの製造法の一つ
に、γ−グルタミル−システイン シンセターゼ
（６・３・２・2L−glutamate：Ｌ−cysteineγ−
ligase（ADP））（以下「GCS」と記す）とグルタ
チオン シンセターゼ（６・３・２・３γ−Ｌ−
glutamyl−Ｌ−cysteine：glycine ligase
（ADP））（以下「GS」と記す）の作用により、水
性反応液中にてＬ−グルタミン酸、Ｌ−システイ
ンおよびグリシンからグルタチオンを製造する方
法が知られている。（特公昭47−26514号公報
ら）。 しかしながら従来方法は、原料である３種のア
ミノ酸に対するグルタチオンの収率が低く、工業
的に適用するまでには至つていない。 本発明者らは叙上の従来のグルタチオンの製造
法を改善すべく、グルタチオンの生成機構を詳し
く検討した結果、グルタチオンの収率が低い原因
の一つに、グルタチオンがGCSの作用を阻害す
ることが考えられた。そこで、グルタチオンによ
るGCSの作用の阻害を解除すべく、更に鋭意研
究したところついにGCSを水性反応液に添加す
るに先立ち、SH基修飾試薬に接触せしめれば、
目的が達せられることを見い出した。 GCSおよびGSとしては、精製酵素標品のみな
らず、これらの酵素以外の成分をも含有した粗標
品をも使用出来る。また、GCSおよびGSはいず
れの起源の酵素でも可能である。すなわち、
GCSおよびまたはGS活性を有することが知られ
ているもの、例えば、ハト肝臓、ブタ肝臓などの
動物起源のもの、マメ胚芽、コムギ胚芽などの植
物起源のもの、サツカロマイセス、セレビシエ
ATCC7752、サツカロマイセス・カールスベルゲ
ンシスATCC9080などのサツカロマイセス属、キ
ヤンデイダ・ユーテイリスATCC15239などのキ
ヤンデイダ属、シゾサツカロマイセス・ポンペ
IAM4779などのシゾサツカロマイセス属、トル
ロプシス・パーサテイリスNRRL Ｙ−6652など
のトルロプシス属、その他、ピキア属、ブレタノ
マイセス属、マイコトルラ属、ハンゼヌラ属、エ
ンドマイセス属などの酵母起源のもの、シユード
モナス・エルギノサATCC10145などのシユード
モナス属、コリネバクテリウム・エクイ
ATCC6939などのコリネバクテリウム属、スタフ
イロコツカス・アウレウスATCC4012などのスタ
フイロコツカス属、エシエリヒア・コリ
ATCC11246などのエシエリヒア属、エンテロバ
クター・エロゲネスATCC13048などのエンテロ
バクター属、プロテウス・ブルガリスFERM−
P4795、プロテウス・ミラビリスIFO3849などの
プロテウス属、アルカリゲネス・フエカリス
ATCC8750などのアルカリゲネス属、バチルス・
サブチリスATCC13952、バチルス・ブレビス
ATCC8185などのバチルス属、ブレビバクテリウ
ム・アンモニアゲネスATCC6871などのブレビバ
クテリウム属、アグロバクテリウム・ラデイオバ
クターATCC4718などのアグロバクテリウム属、
アルスロバクター・シンプレツクスATCC6946な
どのアルスロバクター属、ミクロコツカス・リゾ
デイクチカスATCC4698などのミクロコツカス
属、エルビニア・ヘルビコラATCC21434などの
エルビニア属などのバクテリア起源のもの、ムコ
ア・ジヤバニカスATCC15242などのムコア属、
リゾープス・デルマーIFO4775などのリゾープス
属、アスペルギルス・オリーゼATCC15240など
のアスペルギルス属、ペニシリウム・ルテウム
ATCC9644などのペニシリウム属、ノイロスポ
ラ・クラツセATCC9277などのノイロスポラ属な
どのカビを起源としたもの、ストレプトマイセ
ス・フラデイアATCC10745などのストレプトマ
イセス属などの放線菌起源のものなど、いずれも
使用可能である。 GCSまたはGSとして動植物起源のものを使用
する場合にも組識を破砕してそのまま使用する
が、または適宜硫安分画、セルロースカラムクロ
マトグラフイーやバイオゲルカラムクロマトグラ
フイーなどを行つて酵素蛋白を精製するなどして
使用する。微生物起源のものを使用する場合には
以下の方法で調製すればよい。微生物の培養物ま
たは菌体を得る方法は特定の方法を用いることを
必要とせず、通常の培地を用いて通常の方法で培
養すればよい。GCSまたはGSとして、培養物を
そのまま用いても良いし、菌体、洗浄菌体、菌体
処理物（凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、トル
エン、界面活性剤等と接触せしめた菌体、リゾチ
ームで処理した菌体、超音波にさらした菌体、機
械的に破砕した菌体など）、これら菌体、または
菌体処理物から通常の酵素分画法によつて得られ
たGCSおよびまたはGS活性を有する酵素蛋白区
分、さらにはこれらの菌体の固定化物、菌体処理
物の不溶化物等いずれも使用できる。 SH基修飾試薬としては、ｐ−クロロマーキユ
リ安息香酸、ｐ−クロロマーキユリフエニルスル
ホン酸、サリルガン、酢酸フエニル水銀ヨウ化メ
チル水銀、臭化メチル水銀、２−クロロマーキユ
リ−４−ニトロフエノール、塩化第二水銀、硝酸
水銀、三酸化ヒ素、亜ヒ酸塩ヨード酢酸、ブロモ
酢酸、クロロ酢酸、ヨード酢酸アミド、ブロモ酢
酸アミド、クロロ酢酸アミド、Ｎ−（４−ヨード
フエニル）ヨードアセトアミド、４−ブロモアセ
トアミド−２−ニトロフエノール、２・2′−ジカ
ルボキシ4′−ヨードアセトアミド、α−ヨードプ
ロピオン酸、β−ブロモエチルアミンヨウ化メチ
ル、エチレンイミン、ω−クロロアセトフエノ
ン、メチル−ｐ−ニトロベンゼンスルホン酸、Ｎ
−エチルマレイミド、Ｎ−（４−ジメチルアミノ
−３・５−ジニトロフエニル）マレイミド、Ｎ・
N′−ヘキサメチレンビスマレイミド、ビス（Ｎ
−マレイミドメチル）エーテル、アクリロニトリ
ル、１−フルオロ−２・４−ジニトロベンゼン、
７−クロロ−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−
１・３−ジアゾール、ｏ−ヨードソ安息香酸、四
チタン酸ナトリウム、テトラニトロメタン、ヨウ
素、フエリシアン化カリ、ポルフイリンジン、過
酸化水素、５・５−ジチオビスニトロ安息香酸、
２・2′−および４・4′−ジチオピリジン、２・
2′−ジチオビス−（５−ニトロピリジン）、６・
6′−ジチオニコチン酸、β−ヒドロキシエチル−
２・４−ジニトロフエニルジスルフイド、シスチ
ン、酸化グルタチオン、システアミン、システア
ミンモノスルホキシド、アゾベンゼン−２−スル
フエニルブロミド、ｐ−ニトロフエニルスルフエ
ニルクロリドなどを用いることが出来るが、代表
的にはＮ−エチルマレイミド、モノヨード酢酸、
モノヨード酢酸アミド、ｐ−クロロマーキユリ安
息香酸などが用いられる。 GCSをSH基修飾試薬に接触せしめるには、
GCSを含有する区分を適当な緩衝液に懸濁し、
これにSH基修飾試薬を望ましくは0.01〜10ｍＭ
添加し、０゜〜50℃にて適当な時間保ち、ついで
適当な緩衝液にて透析（膜透析、ゲル濾過等）す
るか適当な沈澱剤でSH基修飾試薬を沈澱せしめ
て除けばよい。 GCSとGSとが共存するような酵素標品を使用
する場合にはGCSとGSとが分離することなく、
SH基修飾試薬と接触せしめ、そのままGCSおよ
びGSとして使用してもよいが、このような場
合、より望ましくはGSとしてSH基修飾試薬に接
触せしめていないGSを、あるいはSH基修飾試薬
に接触せしめていないGCSとGSとが共存するよ
うな酵素標品を補つて使用してもよい。 SH基修飾試薬で処理したGCSと、GSとを用い
てＬ−グルタミン酸、Ｌ−システインおよびグリ
シンからグルタチオンを生成せしめる反応は望ま
しくは10℃から70℃の範囲の適当な温度およびPH
４から10の範囲の適当なPHに調節しながら行い、
水性反応液中で行う。水性反応液中に抗酸化剤、
界面活性剤などを添加すれば好ましい結果が得ら
れる場合が多い。また反応中、必要ならば反応液
に原料であるアミノ酸を追補添加してもよい。反
応液は特に強い撹拌をする必要はないが、必要に
より適宜撹拌してもよい。 本発明の方法によれば、従来の方法に比べて高
い収率でＬ−グルタミン酸、Ｌ−システインおよ
びグリシンからグルタチオンを生成せしめること
ができ、また、反応液よりグルタチオンを単離精
製するには通常の方法が適用出来る。 実施例 １ 培養：１当り、グルコース10ｇ、
MgSO₄・7H₂O0.2ｇ、KH₂PO₄10ｇ、
NaNH₄HPO₄10ｇ、クエン酸１水和物7.0ｇ、Ｌ
−スレオニン25mg、Ｌ−ロイシン50mg、Ｌ−プ
ロリン25mg、Ｌ−アルギニン50mg、Ｌ−ヒスチ
ジン10mg、サイアミン1.0mgおよびペプトン10
ｇを含み、PH8.0に調節した培地200mlずつ２
容フラスコ５本に入れて加熱殺菌した。これに
あらかじめ、ブイヨン培地にて前培養したプロ
テウス・ミラビリスIFO3849を接種し、28℃に
て36時間振揺培養した。一方、100容ジヤー
フアーメンターに上記と同じ組成の培地25を
入れ、殺菌後、上記フラスコ５本の培養液を入
れた。培養は好気的条件下にて28℃で24時間培
養を行つた。このようにして得られた培養液を
20000r.p.m.にて連続遠心処理後、湿重量750ｇ
の菌体を得た。これを−20℃にて凍結保存し
た。 γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイン合成酵
素の調製 (1) 無細胞抽出液： 凍結した菌体750ｇを融解後0.01Mリン酸
緩衝液（PH7.0、５ｍＭ MgCl₂含有）にて
全量４とし、「ダイノミル」にて細胞膜を
破砕し、遠心分離後、無細胞抽出液を3.8
得た。 (2) 硫安分画： 無細胞抽出液を硫安40〜80％にて分画した
後、0.01Mリン酸緩衝液にて40℃で透析を行
つた。 (3) プロタミン分画： 塩基性蛋白質および核酸類を除くために総
蛋白の約10％のプロタミン硫酸を加え、遠心
分離により生成した沈澱物を除去した。 (4) DEAE−セルロースカラム処理分画： この上澄液を0.01Mリン酸緩衝液（PH
7.0、５ｍＭ MgCl₂含有）にて平衡にした
DEAE−セルロースカラムを用いてクロマト
グラフイーを行つた。0.05M NaCl溶出液の
活性部位を硫安80％にし、約10日間静置後、
遠心分離を行い、沈澱した酵素蛋白質を
0.01Mリン酸緩衝液に溶かし酵素液を得た。 (5) ヒドロキシアパタイトカラム処理分画： DEAE−セルロースカラムクロマトグラフ
イーにて得られた酵素液を0.001Mリン酸緩
衝液（２ｍＭ MgCl₂含有）にて充分透析し
た後、ヒドロキシアパタイトカラムクロマト
グラフイーを行い、50ｍＭと100ｍＭのリン
酸緩衝液溶出液より活性部分を得た。 (6) セフアクリルＳ−200カラム処理分画： ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラ
フイーで得られた酵素液を0.05Mトリス・塩
酸緩衝液（PH8.0）にて透析後、同緩衝液で
平衡化したセフアクリルＳ−200カラムにて
クロマトグラフイーを行つた。 (7) セフアデツクスＧ−100カラム処理分画： セフアクリルＳ−200カラムクロマトグラ
フイーで得られた酵素液をセフアデツクスＧ
−100カラムにてクロマトグラフイーを行
い、諸性質を検討して精製酵素とした。第１
表に精製の手順と比活性等をまとめた。

【表】 γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイン合成酵
素の活性測定および生成物の同定 このようにして得られた酵素液を用いて第２
表に示した組成の反応液を用いて37℃にて30分
反応せしめて生成したγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ
−システインの量を測定した。反応液中のγ−
Ｌ−グルタミルシステインの定量は液体クロマ
トグラフイーにかけ、ニンヒドリン発色法およ
び210nｍの吸光度分析（カルボキシル基の測
定） 第２表 反応液組成 アデノシントリリン酸・２ナトリウム塩 30mg MgSO₄・7H₂O 0.5mg KCl 1.0mg Ｌ−グルタミル酸ナトリウム 40mg Ｌ−システイン塩酸塩 50mg 1.0M NH（CH₂CH₂OH）₂HCl緩衝液（PH9.15）
0.4ml 酵素液 0.5ml全液量 4.0ml によつて定量した。また反応生成物の同定は上
記組成にて12時間反応した反応液から液体クロ
マト法によつて分取して、おおよその分子量を
測定し、次にこれを酸分解してＬ−グルタミン
酸、Ｌ−システインからなるジペプチドである
ことを確認した。またＣ末端をヒドラジン分解
法、およびＮ末端をDNP法によつてこのジペ
プチドがγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイン
であることを確認した。 SH基修飾試薬によつて処理されたGCSと未
処理GCSに対するグルタチオンの阻害度： γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイン合成酵
素をトリス−塩酸緩衝液（0.05M PH8.0）に
蛋白質１mg／mlになるように溶解し、これに対
して各種SH基修飾試薬を１ｍＭ添加し、30℃
にて90分間インキユベートしたのち、0.05Mト
リス−塩酸緩衝液（PH8.0）にて４℃にて透析
を行つた。残存活性およびグルタチオン12.5ｍ
Ｍ存在下でGCS活性を比活性測定の場合と同
様に測定し、未処理酵素の残存活性を100とし
て相対活性を求めた。その結果、SH基修飾試
薬であるＮ−エチルマレイミド、ヨード酢酸ア
ミド、ヨード酢酸、ｐ−クロロ水銀ベンゾエー
トがグルタチオンの阻害を解除するのに有効で
あることが認められた。その結果を第３表に示
した。

【表】 GSの調製 GCSの調製の場合と同様に行い、無細胞抽
出液を得て、これを硫安分画、プロタミン分画
を行い、DEAE−セルロースカラム処理を行つ
て酵素分画区分を得た。活性測定は第４表に示
す反応液組成を用いて37℃で30分反応を行つ
た。第５表に精製手順と比活性とをまとめた。 反応液中のグルタチオンの定量は液体クロマ
トグラフイーにかけニンヒドリン発色法、およ
び210nｍに吸光度分析（カルボキシル基の測
定）によつて定量した。またニトロプルシツド
法 第４表 反応組成物 アデノシントリリン酸・２ナトリウム塩 30mg MgO₄・7H₂O 0.5mg KCl 1.0mg γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイン 12mg グリシン ８mg 1.0M NH（CH₂CHOH）₂HCl緩衝液（PH9.15）
0.4ml 酵素液 0.5ml全液量 ４ml

【表】 およびテトラチオネート法により定量を行つ
たが、いずれも一致した値を示した。 Ｎ−エチルマレイミド処理したGCSとGSを
用いてのＬ−グルタミン酸、Ｌ−システインお
よびグリシンからのグルタチオンの製造 前記のようにして調製したＮ−エチルマレイ
ミド処理GCS5mgとGS100mgとを1.0M NH
（CH₂CH₂OH）₂HCl緩衝液（PH9.15）50mlに溶
解して酵素液として第６表に示す反応液400ml
にて反応した。反応は37℃にて12時間行つた。
またＮ−エチルマレイミドで処理しないGCS
を用いて同様に反応を行つた。反応液中に生成
したグルタチオンをテトラチオネート法によつ
て定量した。その結果を第７表に示した。 第６表 反応液組成 アデノシントリリン酸・２ナトリウム塩 30mg MgO₄・7H₂O 0.5mg KCl 1.0mg Ｌ−グルタミン酸ナトリウム 40.mg Ｌ−システイン塩酸塩 50.mg グリシン 80.mg 1.0M NH（CH₂CH₂OH）₂HCl緩衝液（PH9.15）
0.4ml 酵素液 0.5ml全液量 ４ml

【表】 実施例 ２ グルコース10ｇ／、KH₂PO₄2ｇ／、
MgSO₄・7H₂O1ｇ／、ペプトン10ｇ／、酵
母エキス10ｇ／（PH7.0（KOH中和））からな
る培地50mlを肩付フラスコ（500ml容）に分注
し、115℃にて15分間殺菌し、放冷した。これに
あらかじめ、ブイヨン培地で前培養していた第８
表に示す微生物をそれぞれ接種し、31℃にて24時
間振盪培養した。得られた培養液をそれぞれ遠心
分離処理して菌体を集め、超音波処理により、そ
れぞれ破砕して、更に遠心分離処理して、それぞ
れ無細胞抽出液を得た。 その抽出液の半量を実施例１の方法と同様に、
Ｎ−エチルマレイミド処理した。処理した抽出液
と未処理の抽出液を１：１に混合した酵素液と未
処理のそのままを酵素液として使用し、実施例１
と同様にグルタチオン生成反応を行つた。その結
果を第８表に示した。

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ γ−グルタミル−システイン シンセターゼ
   （６・３・２・2L−glutamate：Ｌ−cysteineγ−
   ligase（ADP））およびグルタチオン シンセタ
   ーゼ（６・３・２・３γ−Ｌ−glutamyl−Ｌ−
   cvsteine：glycine ligase（ADP））の作用によ
   り、水性反応液中にてＬ−グルタミン酸、Ｌ−シ
   ステインおよびグリシンからグルタチオンを製造
   する方法において、γ−グルタミル−システイン
   シンセターゼを水性反応液に添加するのに先立
   ち、SH基修飾試薬に接触せしめることを特徴と
   するグルタチオンの製造法。