JPS62501818A - 酵素によつて触媒されて電子を放出するかまたは吸収することができる化合物を検出する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素によって触媒されて電子を放出するかまたは吸収することができる化合物を 検出する方法本発明は、酵素によって触媒されて電子を吸収するかまたは放出す ることができる化合物を、ＨＰＬＣおよび電気化学的検出法の使用下に検出する 方法に関する。

まさに医学的分野においては、極めて僅かな濃度で血液中、尿中、他の体液中ま たは溶液中に存在する化合物を検出することが必要とされる。屡々最も僅少量の 化合物により既に体内での生理的経路が指摘され、この生理的Ｂ路から医師は、 さらに物質代謝の疾患または支障を推論することができる。従って、化合物をピ コグラム範囲以下にまで検出することができることが必要とされる。しかし、ま さに体液内には、同様に構成されている極めて多数の化合物が存在する。。従っ て、極めて正確な検出法を使用することが必要なだけでなく、極めて特異的な検 出法を使用することも必要である。この場合には、ＨＰＬＣが極めて正確で良好 な分離法であることが証明されている。ＨＰＬＯによれば、物質は、極めて微細 に極めて迅速に分離することができる。

更に、酵素分析により特定の化合物を特異的に検出することができることは知ら れているので、ボッター（Ｐｏｔｔｅｒ　）他によってジャーナルーオブ拳ニュ ーロケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　） 、第４１巻、４１（１９８３）、第１８８頁〜第１９４頁に提案されたように、 アセチルコリンおよびコリンば、アセチルコリンおよびコリンを含有する溶液を まずＨＰＬＣ−カラム上に供給し、引続きＨＰＬＣ！−カラムから来る溶出液中 でｐｉ（を新たに調節し、酵素を添加し、かつ数分間継続させた酵素反応後に反 応コイルを去る溶液中に形成されたＨ２Ｏ２を電気化学的に検出することにより 検出された。この場合、コリンおよびアセチルコリンの検出限界は１ないしは２ ピコモルである。

しかし、コリンおよびアセチルコリンのような物質ならびに他の化合物の検出限 界は、検出の特異性に影響を及ぼすことなしになおさらに最小にするのが望まし い。従って、本発明の目的は、極めて特異的でありかつなおこれまで可能であっ たよりも遥かに僅かな濃度で化合物を検出することができる方法を得ることであ った。

この目的は、酵素によって触媒されて電子を吸収するかまたは放出することがで きる化合物を、ＨＰＬＣおよび電気化学的検出法の使用下に検出する方法によっ て達成され、この方法は、測定すべき１種類またはそれ以上の化合物を含有する 試料をＥＰＬＣ−カラム上に供給し、次に溶出液を、不動態化された酵素および 場合によっては他の酵素が結合している担体物質で充填されたミ二カラムに導通 し、この場合溶出液の−は不変となり、引続きこのミ二カラムを去る溶液中で酵 素によって酸化されたかまたは還元された化合物を電気化学的検出により定量的 に測定することを特徴とする。

この本発明方法によれば、意外なことに、酵素によって触媒されて電子を吸収す るかまたは放出することができる化合物を０．１ピコモルの濃度にまで検出する ことが可能である。このことは、これまで公知の方法に比して係数１０〜１５だ げの改善を意味する。このためには、２０〜１５０μｌのみの床容積を有する極 めて小型のミ二カラムを利用することで十分である。

この方法は、ＨＰＬＣによって分離することができかつ酵素によって触媒されて 電子を吸収するかまたは放出することができかつ酵素反応後に電気化学的に検出 することができる全部の化合物に使用することができる。この場合、有利には酸 化還元反応を触媒する酵素として酸化酵素が使用される。

ＨＰＬＣｊ上で分離することは、自体公知の方法で行なわれる。この場合、カラ ム充填物および溶離剤は、分離すべき化合物に応じて選択される。相当する充填 物および溶離剤は、この分野の当業者には周知である。

更に、ＨＰＬＣ−カラムからの溶出液は、約２〜８Ｘ０．０５〜０−１　ｃｍの 寸法を有することができるミ二カラム中に直接に導通され、この場合このミ二カ ラムは、不動態化された酵素および場合によっては他の酵素が結合されている担 体物質で充填されている。この場合、担体物質としてはアガロースが特に好適で ある。しかし、他の自体公知の担体物質を使用することができる。

担体物質には、検出すべき化合物に望ましい反応を特異的に触媒する１つの酵素 が結合されている。また、反応を触媒する他の酵素または酵素の組合せ物を結合 することも可能であり、この反応により電子を吸収するかまたは放出することが できかつ次いで不動態化された酸化酵素によってさらに反応される化合物が導か れる。すなわち、例えばＨＰＬＣ−カラム中で１つの化合物の種々の誘導体を分 離することができる。更に、この化合物およびその順次に溶離された誘導体は、 酵素的に酸化酵素によって酸化されたかまたは還元された検出化合物上で、個々 の誘導体が１つの酵素によって先にこの化合物に変換された場合には電気化学的 に検出することができる。

その次に、酵素によって反応された溶液中で、酵素によって酸化されたかまたは 還元された化合物は、電気化学的な検出によって定量的に測定することができる 。そのためには、自体公知の電気化学的方法が適当である。すなわち、例えば形 成されたＨ２０□を白金電極で定量的に測定することは可能である。全く同様に 、形成されたＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨば、電気化学的検出により定量的に検出 することができる。

本発明方法の１つの好ましい実施態様の場合、アセチルコリンおよびコリンは互 いに検出される。そのために、アセチルコリンおよびコリンを含有する溶液は、 ＨｐＬｃ−カラム上に与えられる。アセチルコリンおよびコリンは、ＨＰＬＣ− カラム中で分離され、かつ順次に溶離される。溶出液は、アガロースで充填され たミ二カラムに導通される。アガロースには、アセチルコリンエステラーゼおよ びコリンオキシダーゼが結合されている。最初に溶離されたコリンは、コリンオ キシダーゼによって反応され、Ｈ２Ｏ２およびベタインに変わる。

生成されたＨ２Ｏ２ば、白金電極およびＡｇ／ＡｇＣ１−参照電極を装備してい る電気化学的検出器で検出される。

その後に溶離されたアセチルコリンは、アセチルコリンエステラーゼによって酢 酸およびコリン中で分解される。コリンは、コリンオキシダーゼによって酸化さ れ、その際形成されたＨ２Ｏ。は、再び電気化学的に検出される。

本発明方法のもう１つの好ましい実施態様の場合には、コレステリンおよびコレ ステリンエステル力検出される。この場合には、ＨＰＬＣ上でコレステリンおよ びコレステリンエステルが分離される。コレステリンエステラーゼおよびコレス テリンオキシダーゼが結合しているアガロースで充填されたミ二カラム中でコレ ステリンは酸化される。更に、溶離されたコレステリンエステルは、酵素加水分 解され、次いで生成されたコレステリンは酸化される。次に、酸化反応で生成さ れたＨ２Ｏ２は、再び電気化学的に検出される。

本発明方法によれば、例えば神経伝達物質、ロイコトリエン、ステロイドホルモ ン、コレステリンおヨヒコレステリンエステルならびに還元酵素の基質を検出す ることが可能である。本発明方法には、Ｈ２Ｏ２を供給する酸化酵素の基質であ る物質が特に好適である。

本発明方法の利点は、朽めて簡単に実施することかできることにある。ＨＰＬＣ ！−カラムからの溶出液は、不変のままミ二カラム中に導入され、かつそこから 不変のまま電気化学的検出に導くことができる。絹を変化させることは、意外な ことに不必要なことである。これまで、溶離および酵素反応は、声価が異なる際 に起こるに相違ないと思われていた。それというのも、２つの方法には一般に異 なるＰＨ−最適値が定められているからである。しかし、意外なことに、同じ… 範囲を全ての方法で使用する場合には検出限界を係数１０〜１５だけ改善するこ とができたことは明らかであり、この場合には、特異性がそれによって劣化され ることはないであろう。すなわち、本発明によれば、物質は、これまで不可能で あったのだけれども、特異的に敏感に検出することが可能である。

本発明によれば、殊に体液中の化合物を極めて簡単に迅速に正確に敏感に検出す ることができる方法が提供される。勿論、本発明方法は、例えば食料品、プラス チック等中の特定の化合物を検出することのような一般的の分析方法にも適当で ある。

更に、本発明を実施例によって詳説する。

実施例１ モルモットの脳からの組織、シビレエイの組織およびシビレエイの隔離されたシ ナプス小胞を冷たい０．４モルのＨＣｌ０．中で均質化し、次に１モルのＫＯＨ で声を５．０に調節し、かつ　１００００．ｌｉ’／ｍｉｎと一緒に遠心分離し た。上溌液（２０μｌ）を直接使用した。

アセチルコリンペルクロレートおよびコリンクロリドからなる標準溶液を週１回 新しく製造し、−２０°Ｃで凍結させ；５．０のＰＨで貯蔵し、かつ使用する直 前にそのつど融かした。

ＨＰＬＣ−装置にｈｍｍ正圧力使用され、それによって窒素シリンダを通じての 一定の貫流が保証された。このカラム（１５Ｘｏ−２ｃｒＩＬ）は、５ｏ３Ｈ基 を有する球状シリカデルで充填した。粒径は５μであった。

７００μｌ／ｍｉｎおよび１００バールの一定の圧力で溶出を行なった。溶離剤 としては、ナトリウムホスフェート５０ミリモルおよびテトラメチルアンモニウ ムクロリド３ミリモルを水中に含有しかつ７．６の−を有する緩衝液を使用した 。

エレクトロホルス・エレクトリクス（Ｅ１θｃｔｒ：ｏｐｈｏｒｕｓθ１ｅｃｔ ｒｉｃｕθ）からのアセチルコレステリンエステラーゼ（２００単位）およびア ルトロバクチル・クロビフオルミス（Ａｒｔｈｏｂａｃｔｅｒ　ＣＩＯＣｌｏｂ ｉｆＯｒ　）からのコリンオキシダーゼ（５０Ｕ）を予め膨潤させた、ＣＮＢｒ で活性化されたアがロース５　ｍｌに結合させた。懸濁液の一部を３回溶出緩衝 液で洗浄し、次にＨＰＬＣ−カラムの流出口と接続された、セラミックフィルタ ーを有するガラス製ミ二カラム（４Ｘ　０．１　ｃｍ、容積１２５μＡりに導入 した。

電気化学的検出器として白金電極およびＡｇ／ＡｇＣ１−参照電極を使用した。

検出器をｓ　ｏ　ｏ　ｍｖで駆動した。

得られた結果を、アセチルコリン生物学的定量で水蛭の背筋の使用下に得られた 結果と比較した。

アセチルコリンおよびコリンをまずＨＰＬＣ！によって分離し、次に不動態化さ れたアセチルコリンエステラーゼおよびコリンオキシダーゼが結合したミ二カラ ム上に供給した。この場合、アセチルコリンを加水分解してコリンおよび酢酸に 変えた。次に、コリンを酸化酵素によってベタインおよびＨ２Ｏ２に変換し、次 いで電気化学的検出器によって５００　ｍｖの定電圧で検出する。コリンおよび アセチルコリンの検出限界は、約０゜１ピコモルである。

実施例２ ヒトの血液からのコレステリン含有試料を常法でＨＰＬ（！による分析のために 調製した。

次に、試料を実施例１の場合と同様にＨＰＬＣ！により分離し、かつミ二カラム 上に供給した。このミ二カラムは、Ｃ！ＮＢｒで活性化されたアガロースを包含 するガラス製ミ二カラム（４ＸＯ−０５ｃｍ、容積３０μｌ）であり、このミ二 カラムには、ノカルディアス・エリトロポリス（Ｎｏｃａｒｄｉａｓ　ｅｒｙｔ ｈｒｏｐｏｌｉｓ　）からのコレステリンオキシダーゼ５単位および豚の膵臓か らのコレステリンエステラーゼ５単位が結合していた。

コレステリ／およびエステルをＨＰＬＣ！−カラム上で分離した後、エステルの 加水分解およびコレステリンの酸化をミ二カラム中で行ない；次に、生成された Ｈ２Ｏ。

を電気化学的に検出した。測定を較正するために、コレステリン標準を使用した 。

分析を実施するために、それぞれ血液２０μｌを使用した。この場合、検出限界 は、試料中のコレステリン０．１ピコモルであった。

国際調査報告 １１７“＾す″””””　ＰＣＴ／ＥＰ１３６７０Ｑ４９４ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　 Ｔ（Ｅ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯｈｌＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯＲＴ　ＯＮ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. １．酵素によって触媒されて電子を吸収するかまたは放出することができる化合 物をＨＰＬＣおよび電気化学的検出法の使用下に検出する方法において、測定す べき１種類またはそれ以上の化合物を含有する試料をＨＰＬＣ−カラム上に供給 し、適当な溶離剤で溶離させ；次にこの溶出液を不動態化された酸化酵素および 場合によっては他の酵素が結合されている担体物質で充填されたミニカラムに導 通し、この場合溶出液のｐＨは不変となり、引続きこのミニカラムを去る溶液中 で酵素によって酸化されたかまたは還元された化合物を電気化学的検出により定 量的に測定することを特徴とする、酵素によって触媒されて電子を放出するかま たは吸収することができる化合物を検出する方法。
2. ２．酸化還元反応を触媒する酵素として酸化酵素を使用する、請求の範囲第１項 記載の方法。
3. ３．アセチルコリンおよびコリンをＨＰＬＣおよび電気化学的検出法の使用下に 検出する方法において、アセチルコリンおよびコリンを含有する試料をＨＰＬＣ −カラムを介して分離し、緩衝液と一緒にｐＨ７で溶離させ、次にこの溶出液を 不動態化されたアセチルコリアエステラーゼおよびコリンオキシダーゼが結合さ れている担体物質で充填されたミニカラムに導通し、引続きこのミニカラムを去 る溶液中でコリンから形成されたＨ２Ｏ２を電気化学的に定量測定することを特 徴とする、アセチルコリンおよびコリンを検出する方法。
4. ４．検出すべき化合物はコレステリンおよびコレステリンエステルであり、かつ 不動態化された酵素としてコレステリンオキシダーゼおよびコレステリンエステ ラーゼが使用される、請求の範囲第１項記載の方法。