JPS62289186A - 生物学的活性蛋白質固定膜及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ラングミュア・プロジェット（以下、Ｌ−Ｂ
と略記する）法を利用した、酵素等の生物学的活性蛋白
質固定超薄膜に関し、高感度なバイオセンサー、バイオ
リアクター等に利用することが出来る。

〔従来の技術〕

いわゆる酵素固定化法としては、水不溶性の担体に酵素
を結合させる担体結合法、酵素を２個以上の官能基を有
する試薬と反応させる架橋法、酵素をゲルの微細な格子
の中に包み込むが、半透膜性のポリマーの皮膜によって
被覆する包括法がある。担体結合法には共有結合法、イ
オン結合法、物理的吸着法がある。

また、いわゆるＬ−ＢＩＩ！は、清浄な水面上に有機分
子を展開して形成された単分子膜を圧縮し、これを基板
上に移し取る手法である。このＬ−Ｂ法を用いて生物学
的活性物質の超薄膜を得た例としては、チトクロムＣ１
キモトリプシン、牛の血清アルブミン、トリプシン等の
球状タンパク質からなる天然高分子のＬ−Ｂ膜が知られ
ている（特開昭５２−８６０７７号）。また、Ｌ−Ｂ膜
をセンサーとして利用した例としては、バクテリアロド
プシンとリン脂質の混合単分子膜をセルロースエステル
フィルター上に累積し、光に応答するプロトンポンプ（
シン　ソリッド　フィルムズ９９Ｓ　１９８３１年１３
３頁：Ｔｈ１ｎ　５ｏｌｉｄ　Ｆｉｌｎ＋ｓ）の例があ
る。

〔発明が解決しようとする問題点〕

共有結合法では、担体の官能基と酵素との反応条件の設
定が難しく、酵素の高次構造の変化や活性部位の損傷が
起こり易く、活性の畜い固定化物を得難いという欠点が
ある。また、イオン結合法、物理的吸着法、架橋法では
、担体と酵素との結合力が弱いため、緩衝液の種類やｐ
ｏの影響を受は易く、過激な条件のもとでは酵素が担体
からａｌｌするという欠点がある。また、包括法では、
酵素とゲル化物とは結合反応をしていないので、高い活
性を有する可能性が高いが、酵素の流出による固定膜の
失活が起こり易いという欠点がある。このように、従来
から行われている酵素固定法では、酵素の固定が十分で
なく高価な酵素を多量に消費したり、あるいは固定によ
る活性低下を補うため多量の酵素が必要である等の問題
がある。また、膜内での酵素の密度コントロールが出来
ず、しかも低密度の物しか得られない。更に、膜厚のコ
ントロールが難しく、サブミクロンの固定膜を再現性良
く得難い等の欠点がある。

また、Ｌ−Ｂ法を利用した前述の膜は、作製が大変困難
であり、単分子膜の耐圧縮性が低く、安定でかつ再現性
の良い単分子膜が出来にくい。

本発明は、従来の酵素固定膜の欠点を改良し、活性が高
く、密度、膜厚のコントロールが容易な、またその作製
が容易な、酵素等の生物学的活性蛋白質の固定膜を提供
することを目的とする。

〔発明を解決するための手段〕

本発明は、生物学的活性蛋白質を、固体表面上に形成さ
れた、親水性官能基を存する高分子化合物の圧縮単分子
膜によって固定してなる生物学的活性蛋白質固定膜及び
その製造方法である。

本発明において、生物学的活性蛋白質とは、酸化還元酵
素、転移酵素、加水分解酵素、付加酵素、異性化酵素、
合成酵素等の各種酵素、抗体、結合蛋白質、レクチン、
ホルモンのレセプター等特定の分子を識別し、その分子
に特異的な反応を触媒するとか、安定な結合体を形成す
るというような機能を持つ物質を表す。

高分子化合物としては、例えば、ポリオレフィン、ジエ
ンポリマー、ポリエーテル等を主骨格とし、その分子中
に１個以上の親水性官能基、例えば、ヒドロキシル基、
カルボキシル基、カルボニル基、アシル基、アミド基、
リン酸エステル基等の含酸素官能基、アミン基、シアノ
基等の含窒素官能基、メルカプト基、スルホン基等の含
硫黄官能基等を導入した合成高分子が使用される。更に
、より強度の高い膜を得るためには、光硬化性官能基、
熱硬化性官能基等の反応性官能基が導入された高分子化
合物が好ましい。光硬化性官能基としては、オレフィン
、シンナモイル、シンナミリデンアセチル、ベンザルア
セトフェノン、スチリルピリジン、α−フェニレンマレ
イミド、フェニルアジド、スルフォニルアジド、カルボ
ニルアジド、ジアゾ、０−キノンジアジド、フリルアク
リロイル、クマリン等が挙げられる。

本発明の固定膜の作製は、通常のＬ−Ｂ法を応用するこ
とにより行う。以下にその一例を示す。

生物学的活性蛋白質と膜材料としての高分子化合物とを
溶媒に溶解又は分散させる。この液は均一溶液であるこ
とが望ましいが、エマルジョンの状態でも使用可能であ
る。反応性官能基として、光硬化性官能基を有する高分
子化合物を使用した場合、必要に応じ増感剤等を混合し
てもよい。この液をＬ−Ｂ累積装置において、水面上に
滴下し、展開させる。溶媒は気体中又は水中に拡散し、
気液界面には生物学的活性蛋白質と高分子化合物との混
合単分子膜が形成される。この膜を、膜が破壊される圧
力より低い表面圧力に圧縮保持し、これを基板に移し取
る。単分子膜の累積を行う場合は、なるべく高い表面圧
力に圧縮することが好ましい。このようにして本発明の
生物学的活性蛋白質固定膜の単層が得られる。必要に応
じこの操作を繰り返し、累禎膜を得ることが出来る。使
用する生物学的活性蛋白質としては、数種類のものを同
時に混合しても良いし、また、一つの生物学的活性蛋白
質を含む混合単分子膜と他の生物学的活性蛋白質を含む
混合単分子膜とを交互に累積することもできる。更に、
３種類以上の混合単分子膜の累積も同様に可能である。

前記の方法は、本発明の固定膜作製方法の一例として示
したものであるが、その他種々の態様が可能である。例
えば、前記の膜作製操作において、高分子化合物のみを
使用した基板上への膜形成と生物学的活性蛋白質のみを
使用した基板上への膜形成とを交互に行ったり、前記の
混合単分子膜形成と生物学的活性蛋白質のみを使用した
膜形成とを交互に行い累積膜を作製しても良い。これら
の方法の場合、累積膜の表面となる膜は、高分子化合物
又は高分子化合物を含む膜とすることが好ましい。前記
の種々の方法のうち、最も好ましい方法は、混合単分子
膜を累積する方法である。

用いた高分子化合物が反応性官能基を有するものであれ
ば、得られた重層膜又は累積膜を光硬化、熱硬化等の処
理を行うことにより、より機械的強度の高い膜とするこ
とが出来る。

−Ｃに、生物学的活性蛋白質は、その大きさが５〜２０
ｎｍと大きく、これを含む安定な混合単分子膜を作るた
めには、これと同じ長さを存する化合物を膜材料とする
ことが好ましい。Ｌ−Ｂ膜の作製に一般的に使用される
ステアリン酸、アラキン酸等の脂肪酸では、２〜３ｎｍ
の膜厚しか得られず、安定な再現性の良い混合単分子膜
は得られない。この点、ポリオレフィン、ジエンポリマ
ー、ポリエーテルを主骨格とする裔分子化合物誘導体は
、重合度を任意に選ぶことができ、望む膜厚の単分子膜
が得られる点で有利である。更に、反応性官能基の導入
が容易であるという利点もある。

〔作用〕

前述の如く、本発明の生物学的活性蛋白質固定膜におい
ては、生物学的活性蛋白質の分子が、高分子化合物の単
分子膜の中に埋め込まれた混合単分子膜の形で、あるい
は、生物学的活性蛋白質の単分子膜が、高分子化合物の
単分子膜又は高分子化合物と生物学的活性蛋白質との混
合単分子膜によって被覆された形で、生物学的活性蛋白
質が固定されている。

生物学的活性蛋白質及び高分子化合物の種類、組み合わ
せによっては、前記混合単分子膜の作製操作により、生
物学的活性蛋白質の単分子膜と高分子化合物の単分子膜
とが積層した２分子膜となる場合もある。この場合は、
単にこの方法を繰り返じ累積膜を形成させることにより
、生物学的活性蛋白質の単分子膜が、高分子化合物の単
分子膜により被覆されて固定されることになる。

以下実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説明する。

実施例１゜ グルコースオキシダーゼ水ン容液（４０ｍｇ／ｍ　ｉ１
！　）　　１ｍｊ、ＥＮＴＢイソプロピルアルコール８
＋＋＋ｇ／ｍｊり　ｌ　ｍｌ、ヘンゾインエチルエーテ
ルイソフ゛ロピルアルコールン容液（１ｍｇ／ｍ　＋２
）０．　１ｍ　ｌｔ　’ｃ　ヨく混合した。この混合液
は１力月以上も安定なエマルジョンとなる。

この液の４０μｌを、Ｌ−Ｂ膜装置の清浄な水面上にマ
イクロンリンジを用いて展開させた。この混合単分子膜
のＦ−Ａ曲線は第１図に示す通りであり、２０ｍＮ／ｍ
の表面圧力で、酸素電極用テフロン製隔膜（２５μＩＩ
＋）上に、水平吸着法により１５層累積した。

この累積膜に３６６ｎｍのＵＶ光を５分間照射した後、
第２図に示すように、２ｍｍφの金力ソードと恨−塩化
銀アノードからなる酸素電極へ装着した。第３図に示す
回路及び装置を用いて、グルコース濃度に対するこのグ
ルコースオキシダーゼを固定した酸素電極から得られる
出力を測定した結果、０．８６ｍＭのグリコース水／８
液をＱ，５＋ｎ　１　／ｍｉｎの流量で注入し、２２℃
でｏ．ｏｓｏμＡの出力を得た。

測定結果は、０．１ｍＭ〜１０ｍＭのグルコース溶液に
対し直線性を再現性良く示し、この直線性は測定開始後
８０日を経過しても失われず、また、出力は初期値の８
０％を維持した。

ＣＢ＊　　ＣＬ　　　　　　ＣＨｚ Ｒ：ＣＨｘｌＩＣＨＯＣＯＣｔＨ４０ＣＯＮ）ＩＣＩｌ
ｇ−、ｎ：約２３比較例。

グルコースオキシダーゼを９．５　ｍＮ／Ｉｌで５層、
１５゜５＋ａＮ／ｍで１層、１８　ａ＋Ｎ／ｍで１０層
、合計１６層、水平吸着法で累積したテフロン製隔膜を
酸素電極上に装着し、実施例１と同様に測定を行ったと
ころ、１３日目で出力が約１０％に低下した。

〔発明の効果〕

本発明の生物学的活性蛋白質固定膜は、超薄膜であり、
固定された生物学的活性蛋白質の活性が効率良く発揮さ
れ、また活性成分の流出による活性低下も少なく、また
機械的強度も高い。また本発明の膜の作製、その膜厚の
コントロールも容易であり、種々の生物学的活性蛋白質
固定膜の作製が可能であるため、高感度なバイオセンサ
ー、バイオリアクター、その他種々の用途への利用が期
待出来る。

【図面の簡単な説明】

第１図　混合単分子膜のＦ−Ａ曲線 第２図　本発明固定膜を装着した酸素電極第３図　本発
明固定膜を装着した酸素電極をグルコースセンサーとし
た測定回路 図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）生物学的活性蛋白質を、固体表面上に形成された
   、親水性官能基を有する高分子化合物の圧縮単分子膜に
   よって固定してなる生物学的活性蛋白質固定膜
2. （２）親水性官能基を有する高分子化合物と生物学的活
   性蛋白質の有機溶媒溶液若しくは分散液を水面上に滴下
   展開し、形成された膜を、膜が破壊される圧力より低い
   表面圧力に圧縮保持し、固体表面に移し取ることを特徴
   とする生物学的活性蛋白質固定膜の製造方法