JPS62248500A - Reagent for determination of enzymatic activity - Google Patents
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、医学上、臨床検査その他に有用な、血清中の
酵素活性測定に使用される試薬に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (Industrial Field of Application) The present invention relates to a reagent used for measuring enzyme activity in serum, which is useful for medical purposes, clinical tests, and other purposes.
（従来技術）
従来、血清中の酵素活性の測定は、医学的診断において
重要な役割を分担するものとして重用されているが、そ
の測定方法の一つとして、色素とある種の物質とを結合
させたもの（基質）を用い、その結合が酵素の有する作
用により、解離され、その結果、遊離する色素の量を、
吸光度測定により、経時的に測定し、その際の単位時間
あ比りの吸光度の増加速度を求めて、酵素活性を表わす
方法が用いられている。(Prior art) Measuring enzyme activity in serum has traditionally been used to play an important role in medical diagnosis, but one of the measurement methods is to combine a dye with a certain substance. Using a substance (substrate), the bond is dissociated by the action of the enzyme, and as a result, the amount of liberated dye is
A method is used in which enzyme activity is expressed by measuring absorbance over time and determining the rate of increase in absorbance per unit time.
例えば、血清中の酵素として、α−アミラーゼあるいは
ｒ−グルタミルトランスフェラーゼを例にとって言えば
、従来から、血清中のα−アミラーゼあるいはγ−グル
タミルトランスフェラーゼの活性を測定するには、その
基質として、４−ニドｃ１フェノール、２−クロル−４
−二トロフェノール、４−ニトロアニリン、３−カルボ
キシ−４−ニトロアニリン等（Ｄ４００ｎｍ〜Ａ ５０
ｎｍに吸光度を有する物質に、多糖類やアミノ酸を結
合させた化合物が用いられている。For example, taking α-amylase or r-glutamyltransferase as an enzyme in serum, conventionally, in order to measure the activity of α-amylase or r-glutamyltransferase in serum, 4- nido c1 phenol, 2-chloro-4
-Ditrophenol, 4-nitroaniline, 3-carboxy-4-nitroaniline, etc. (D400nm ~ A50
Compounds in which polysaccharides and amino acids are bonded to substances that have absorbance at nm are used.
α−アミラーゼの活性測定を行なう際、用いられる基質
としては、２−クロル−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−
マルトヘプタオシド（後掲式ａ−１参照；以下（）７−
ＧＮＰと略記する）、４−二トロフェニル丞？−マルト
へブタオシド（ｆｆ１ｍ式ａ−２参照；以下Ｇ７− Ｐ
ＮＰと略記する）、２−クロル−４−二トロフェニルー
β−Ｄ−マルトば／タオシド（後掲式ａ−３参照；以下
Ｇ５− ＣＮＰと略記する）が有名である。When measuring α-amylase activity, the substrate used is 2-chloro-4-nitrophenyl-β-D-
Maltoheptaoside (see formula a-1 below; hereinafter ()7-
(abbreviated as GNP), 4-nitrophenyl? - Maltohebutaoside (see ff1m formula a-2; hereinafter G7-P
NP) and 2-chloro-4-nitrophenyl-β-D-maltoba/taoside (see formula a-3 below; hereinafter abbreviated as G5-CNP) are famous.
また、γ−グルタミルトランスフェラーゼの活性測定を
行なう際用いられる基質としては、Ｌ−γ−グルタミル
ー４−ニトロアニリド（後掲式ｂ−１参照；以下Ｇｔｕ
−４−ＮＡと略記する）及びＬ−γ−グルタミルー３
−カルボキシー４−ニトロアニリド（後掲式ｂ−２参照
；以下０Ｌｕ−ＣＮＡと略記する）が有名である。In addition, as a substrate used when measuring the activity of γ-glutamyltransferase, L-γ-glutamyl-4-nitroanilide (see formula b-1 below; hereinafter Gtu
-4-NA) and L-γ-glutamyl-3
-Carboxy 4-nitroanilide (see formula b-2 below; hereinafter abbreviated as 0Lu-CNA) is famous.
式ａ−１： （Ｇ７−ＣＮＰ）
式ａ−２： （Ｇ７−ＰＮＰ）
式ａ−３： （Ｇ５−ＣＮＦ）
式ｂ−１（Ｒ＝Ｈ）： （Ｇｔｕ−４ＮＡ）式ｂ−２（
Ｒ−ＣＯＯＨ） ： （（Ｍｕ−ＣＮＡ）これらの基質
を用いて、α−アミラーゼ又はγ−グルタミルトランス
フェラーゼの活性測定を行なう場合、まずα−アミラー
ゼ活性測定では、Ｇ７−ＣＮＰ、 Ｇ７−ＰＮＰ又は、
Ｇ５−ＣＮＰから生じた２−クロル−４−二トロフェノ
ール又は、４．。Formula a-1: (G7-CNP) Formula a-2: (G7-PNP) Formula a-3: (G5-CNF) Formula b-1 (R=H): (Gtu-4NA) Formula b-2 (
R-COOH): ((Mu-CNA) When measuring the activity of α-amylase or γ-glutamyltransferase using these substrates, first, in the α-amylase activity measurement, G7-CNP, G7-PNP, or
2-chloro-4-ditrophenol produced from G5-CNP or 4. .
ニトロフェノールの波長４００〜４５０ ｎｍ域での時
間経過による（経時的な）吸光度の増加すなわち、吸光
度の増加速度を求め、α−アミラーゼ活性値を算出する
。また、γ−グルタミルトランスフェラーゼ活性測定で
は、（Ｍｕ−４−ＮＡ又はＧＡｕ−ＣＮＡから生じた４
−ニトロアニリン又は３−カルボキシ−４−ニトロアニ
リンノ波長４００〜４５０ ｎｍ域での吸光度の増加速
度を求め、γ−グルタミルトランスフェラーゼ活性値を
算出する。The increase in absorbance of nitrophenol over time in the wavelength range of 400 to 450 nm, that is, the rate of increase in absorbance is determined, and the α-amylase activity value is calculated. In addition, in the measurement of γ-glutamyl transferase activity, (4 generated from Mu-4-NA or GAu-CNA)
- The rate of increase in absorbance of nitroaniline or 3-carboxy-4-nitroaniline in the wavelength range of 400 to 450 nm is determined, and the γ-glutamyltransferase activity value is calculated.
このような酵素活性の求め方は、レートアッセイと呼ば
れているが、このレートアッセイを詳細に説明すると以
下の如くである。This method of determining enzyme activity is called a rate assay, and this rate assay will be explained in detail as follows.
酵素活性（Ｕ／Ｌ’）の算出方法
吸光度の時間経過による経時的な変化（上昇又は下降）
な測定し、その測定結果より酵素活性を求める方法は、
レートアッセイと呼ばれている。Calculation method of enzyme activity (U/L') Change in absorbance over time (increase or decrease)
The method for determining enzyme activity from the measurement results is as follows:
It is called a rate assay.
酵素活性Ｉ Ｕ／ｌとは、１分間に１μｍＯＬ／ｌの反
応を触媒する酵素量と定義されており、吸光度（Ｂ）の
経時的変化から酵素活性を求めるためには、吸光度の経
時的変化（４）から１分間当りの吸光度変化（ａ／＋）
を算出し、さらに次式に代入して酵素活性（Ｕ／ｌ）と
する方法がとられている。Enzyme activity IU/l is defined as the amount of enzyme that catalyzes a reaction of 1 μmOL/l per minute.In order to determine the enzyme activity from the change in absorbance (B) over time, it is necessary to Absorbance change per minute (a/+) from (4)
A method is used to calculate the enzyme activity (U/l) by substituting it into the following equation.
Ｒｖ：測定に使用した試薬（溶液）の液量８ｖ；測定に
使用した試料の液量
１ ：吸光度を測定する物質の分子吸光係数ところで、
これらの方法を用いて、血清中のα−アミラーゼ又はｒ
−グルタミルトランスフェラーゼの活性を測定を行なう
際の欠点として、血清を作製する時に生ずる溶血作用に
より、測定したα−アミラーゼやｒ−グルタミルトラン
スフェラーゼの活性値に負の誤差を生ずるという現象が
ある（日本臨床検査自動化学会誌■。ｔ。Rv: Volume of reagent (solution) used for measurement: 8v; Volume of sample used for measurement: 1: Molecular extinction coefficient of the substance whose absorbance is to be measured.
Using these methods, α-amylase or r
- A drawback of measuring the activity of glutamyltransferase is that the hemolytic effect that occurs when preparing serum causes negative errors in the measured activity values of α-amylase and r-glutamyltransferase (Japanese Clinical Journal of the Society of Inspection and Automation ■.t.
９補冊Ｐ１４１、Ｐ１４５ （１９８４） ）。9 supplementary volume P141, P145 (1984)).
この現象は、溶血作用により生ずるヘモグロビン及びそ
の誘導体が、測定試薬中で、光や熱により徐々に分解し
、波長域４００〜４５０ ｎｍでの経時的な吸光度の減
少を引き起こし、α−アミラーゼやγ−グルタミルトラ
ンスフェラーゼの活性測定の際に測定する４００〜ｄ
５０ ｎｍの波長域での経時的な吸光度の増加すなわち
吸光度の増加速度を低下させてしまうものである。そし
て、その結果、測定したα−アミラーゼや、ｒ−グルメ
ミルトランスフェラーゼの活性値において負の誤差を生
じてしまうこととなる。This phenomenon occurs because hemoglobin and its derivatives produced by hemolytic action are gradually decomposed by light and heat in the measurement reagent, causing a decrease in absorbance over time in the wavelength range of 400 to 450 nm, and α-amylase and γ -400-d measured when measuring the activity of glutamyl transferase
This reduces the increase in absorbance over time in the 50 nm wavelength range, that is, the rate of increase in absorbance. As a result, negative errors occur in the measured activity values of α-amylase and r-glumemyltransferase.
（発明が解決しようとする問題点）
本発明は、従来技術における、上記の如き波長域４００
〜４５０ ｎｍでの吸光度測定において溶血作用により
生ずるヘモグロビン及びその誘導体によって引き起こさ
れる酵素活性測定値の低下現象を防止しようとするもの
である。(Problems to be Solved by the Invention) The present invention solves the problem in the wavelength range 400 as described above in the prior art.
This is intended to prevent a decrease in enzyme activity measurements caused by hemoglobin and its derivatives caused by hemolytic action in absorbance measurements at ~450 nm.
（発明の開示）
本発明者らは、溶血作用により生ずるヘモグロビン及び
その誘導体によって引き起こされる酵素活性測定値の低
下現象を、試薬中にチオ尿素を用いることにより防止し
得ることを見出した。(Disclosure of the Invention) The present inventors have discovered that the phenomenon of decrease in enzyme activity measurements caused by hemoglobin and its derivatives caused by hemolysis can be prevented by using thiourea in the reagent.
本発明は、かかる知見に基づいてなされたものであり、
したがって、本発明は、血清中の酵素活性を測定するた
めに、４００ ｎｍ〜４５０ ｎｍの領域で吸光度を測
定する方法に使用する酵素活性測定用試薬において、チ
オ尿素を含有せしめたことを特徴とする血清中の酵素活
性測定用試薬を提供するものである。The present invention was made based on this knowledge,
Therefore, the present invention is characterized in that a reagent for measuring enzyme activity used in a method of measuring absorbance in a region of 400 nm to 450 nm contains thiourea in order to measure enzyme activity in serum. The present invention provides a reagent for measuring enzyme activity in serum.
本発明につき、以下に詳細に説明する。The present invention will be explained in detail below.
本発明においては、酵素活性測定用試薬中において、チ
オ尿素を用いることが特徴とされるが、酵素活性の測定
を行う試薬の溶液中で０．０１重量％以上の濃度で用い
られる。この濃度によって、溶血によって引き起こされ
る酵素活性測定値の負誤差を防止する効果（以下この効
果を抗溶血効果と記載する）が発揮される。チオ尿素の
濃度の増加に従って、抗溶血効果も増大するが、チオ尿
素の濃度が必要以上に増加すると、酵素の活性を阻害し
てしまうため、通常は０．２〜０．２５重量係の濃度で
用いるのが望ましい。The present invention is characterized in that thiourea is used in the reagent for measuring enzyme activity, and is used at a concentration of 0.01% by weight or more in the solution of the reagent for measuring enzyme activity. This concentration exhibits the effect of preventing negative errors in enzyme activity measurements caused by hemolysis (hereinafter this effect will be referred to as anti-hemolytic effect). As the concentration of thiourea increases, the anti-hemolytic effect also increases, but if the concentration of thiourea increases more than necessary, it will inhibit the activity of the enzyme, so the concentration is usually between 0.2 and 0.25% by weight. It is desirable to use it in
使用するチオ尿素の濃度については、検体としての血清
の条件、使用する基質の種類、その他使用条件下におけ
る種々の要素により、適宜任意の至適濃度を決定すれば
よく、特に限定されることはない。Regarding the concentration of thiourea to be used, an arbitrary optimal concentration may be determined depending on the conditions of the serum as a specimen, the type of substrate used, and various other factors under the conditions of use, and there are no particular limitations. do not have.
本発明の試薬の調製ならびにそれを用いての酵素活性の
測定の方法についてはチオ尿素を使用することを除き従
来の慣用技術に従って行われる。The preparation of the reagent of the present invention and the method for measuring enzyme activity using the same are carried out according to conventional conventional techniques, except for the use of thiourea.
以下に本発明の実施例を掲げ、本発明をさらに具体的に
説明する。EXAMPLES The present invention will be described in more detail below with reference to Examples.
以下の各実施例、比較例中においては、基準となる血清
として、α−アミラーゼ１００ Ｕ／ｌを含有し、血清
中のヘモグロビンをシアンメトヘモグロビン法で測定し
た結果ヘモグロビンを含有していなかった血清（８Ｑと
略記する）が用いられでいる。In each of the following Examples and Comparative Examples, serum serving as a standard contains 100 U/l of α-amylase, and as a result of measuring hemoglobin in the serum by the cyanmethemoglobin method, serum did not contain hemoglobin. (abbreviated as 8Q) is used.
実施例１〜５
（４）試薬の調製：
塩化カリウム０．０５Ｍ、アジ化ナトリウム０．１重量
係を含有する０、０５Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７，０）に
チオ尿素を溶解させてα２重量係溶液とする。Examples 1 to 5 (4) Preparation of reagent: Thiourea was dissolved in a 0.05M phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.05M potassium chloride and 0.1% sodium azide to give α2wt. Let it be a related solution.
本溶液１ｔにα−グルコシダーゼ７０ ＫＵ及びβ−グ
ルコシダーゼ１０ＫＵを添加溶解し、さらにＧ７−ＣＮ
Ｐを２．５ ｍＭとなるように加えて溶解し、α−アミ
ラーゼ活性測定用試薬とした（溶液Ａ）。70 KU of α-glucosidase and 10 KU of β-glucosidase were added and dissolved in 1 ton of this solution, and then G7-CN
P was added and dissolved at 2.5 mM to prepare a reagent for measuring α-amylase activity (solution A).
の） ヘモグロビン含有血清の調製：
前記血清Ｓｏを５等分し、それぞれの血清に、溶血より
生じたヘモグロビンを加え、それぞれの血清中に含有さ
れるへそグロビン濃度が０．１俤、０．２％、 ０．３
％、 ０．４％、０．５％となるよう４Ｃ溶Ｍし、それ
らの血清をＳｌ、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５とし九実施例
１
前記の溶液Ａ３．０−に、試料として８１０．０５−を
混合して、３７℃で波長４ Ｑ ５ ｎｍにおける経時
的な吸光度の上昇を測定し、吸光度の１分間当りの上昇
度を求めた。求めた１分間当りの上昇度の値を次式に代
入し、α−アミラーゼ活性を求めた。) Preparation of hemoglobin-containing serum: Divide the serum So into 5 equal parts, add hemoglobin produced by hemolysis to each serum, and adjust the concentration of navel globin contained in each serum to 0.1 and 0.2. %, 0.3
%, 0.4%, and 0.5%, and their serums were prepared as Sl, S2, S3, S4, and S5. 05- was mixed, and the increase in absorbance over time at a wavelength of 4 Q 5 nm was measured at 37° C., and the degree of increase in absorbance per minute was determined. The obtained value of the rate of increase per minute was substituted into the following formula to obtain the α-amylase activity.
α−アミラーゼ活性（Ｕ／Ｌ）
実施例２
試料としてＳ２を用い、実施例１と同様の操作でα−ア
ミラーゼ活性を測定した。α-Amylase Activity (U/L) Example 2 Using S2 as a sample, α-amylase activity was measured in the same manner as in Example 1.
実施例３
試料としてＳ３を用い、実施例１と同様の操作でα−ア
ミラーゼ活性を測定した。Example 3 Using S3 as a sample, α-amylase activity was measured in the same manner as in Example 1.
実施例４
試料としてＳ４を用い、実施例１と同様の操作でα−ア
ミラーゼ活性を測定した。Example 4 Using S4 as a sample, α-amylase activity was measured in the same manner as in Example 1.
実施例５
試料としてＳ５を用い、実施例１と同様の操作でα−ア
ミラーゼ活性を測定した。Example 5 Using S5 as a sample, α-amylase activity was measured in the same manner as in Example 1.
添付図面第１図において、実施例１〜５の各結果が、−
〇−として実施例番号を付して示されている。In FIG. 1 of the accompanying drawings, the results of Examples 1 to 5 are -
The example numbers are indicated as 〇-.
比較例１〜５
実施例１〜５で使用した前記溶液Ａの成分中からチオ尿
素のみを除いた組成を有する溶液（溶液Ａ′）を調製し
、それをα−アミラーゼ活性測定試薬として以下の比較
例１〜５に用いた。Comparative Examples 1 to 5 A solution (solution A') having a composition excluding only thiourea from the components of the solution A used in Examples 1 to 5 was prepared, and it was used as a reagent for measuring α-amylase activity as follows. It was used in Comparative Examples 1 to 5.
比較例１
溶液Ａ′３．０−に、試料として前記８１０．０５ｍを
混合し、５７℃で波長４０５ ｎｍにおける経時的な吸
光度の上昇を測定し、実施例１と同様の方法でα−アミ
ラーゼ活性を求めた。Comparative Example 1 The above 810.05m was mixed as a sample into solution A'3.0-, and the increase in absorbance over time at a wavelength of 405 nm was measured at 57°C. Activity was determined.
比較例２
試料として前記Ｓ２を用い、比較例１と同様の操作でα
−アミラーゼ活性を測定した。Comparative Example 2 Using the above S2 as a sample, α
-Amylase activity was measured.
比較例３
試料として前記Ｓ３を用い、比較例１と同様の操作でα
−アミラーゼ活性を測定した。Comparative Example 3 Using the above S3 as a sample, α was obtained by the same operation as Comparative Example 1.
-Amylase activity was measured.
比較例４
試料として前記Ｓ４を用い、比較例１と同様の操作でα
−アミラーゼ活性を測定した。Comparative example 4 Using the above S4 as a sample, α was obtained by the same operation as in comparative example 1.
-Amylase activity was measured.
比較例５
試料として前記Ｓ５を用い、比較例１と同様の操作でα
−アミラーゼ活性を測定した。Comparative Example 5 Using the above S5 as a sample, α was obtained by the same operation as Comparative Example 1.
-Amylase activity was measured.
各比較例の結果は、添付第１図において、−・−として
比較例番号を付して示されている。The results of each comparative example are shown in the attached FIG. 1 with the comparative example number attached as --.-.
第１図から明らかなように、Ｇ７−ＧＮＰを基質として
用いるα−アミラーゼの活性測定において、本発明によ
り、溶血によるヘモグロビンの影響が解消されることが
示されている。As is clear from FIG. 1, the present invention has been shown to eliminate the influence of hemoglobin caused by hemolysis in α-amylase activity measurement using G7-GNP as a substrate.
実施例６〜１０
囚 試薬の調製：
塩化ナトリウム０．０５ Ｍ、 Ｃ）７−ＰＮＰ １．
５ ｍＭ、アジ化ナトリウム０．１チ及びα−グルコシ
ダーゼ５０ＫＵ／ｌを含有する０、１Ｍりん酸緩衝液（
ｐＨ７，０）にチオ尿素を加え０．２％となるようにし
、α−アミラーゼ活性測定試薬とする（溶液Ｂ）。Examples 6-10 Preparation of reagents: Sodium chloride 0.05 M, C) 7-PNP 1.
5 mM, 0.1 M phosphate buffer containing 0.1 T of sodium azide and 50 KU/l of α-glucosidase (
Add thiourea to 0.2% (pH 7.0) and use it as a reagent for measuring α-amylase activity (solution B).
の） ヘモグロビン含有血清
前記実施例１〜５、の）に記載したＳｌ、Ｓ２、Ｓ３、
Ｓ４、Ｓ５を用いる。) Hemoglobin-containing serum Sl, S2, S3, as described in Examples 1 to 5 above,
Use S4 and S5.
実施例６
前記の溶液Ｂ３．０−に試料として実施例１で使用した
８１０．０５−を混合し、３７℃で波長４０５ｎｍにお
ける経時的な吸光度の上昇を測定し、吸光度の１分間当
りの上昇度を求めた。求めた１分間当りの上昇度の値を
次式に代入し、α−アミラーゼ活性を求めた。Example 6 The above solution B3.0- was mixed with 810.05- used in Example 1 as a sample, and the increase in absorbance over time at a wavelength of 405 nm was measured at 37°C, and the increase in absorbance per minute was measured. I asked for degree. The obtained value of the rate of increase per minute was substituted into the following formula to obtain the α-amylase activity.
α−アミラーゼ活性（Ｕ／ｌ ）
実施例７
試料として実施例２で使用したＳ２を用い、実施例６と
同様の操作でα−アミラーゼ活性を測定した。α-Amylase Activity (U/l) Example 7 Using S2 used in Example 2 as a sample, α-amylase activity was measured in the same manner as in Example 6.
実施例８
試料として、実施例３で使用したＳ３を用い、実施例６
と同様の操作でα−アミラーゼ活性を測定した。Example 8 Using S3 used in Example 3 as a sample, Example 6
α-amylase activity was measured in the same manner as above.
実施例９
試料として、実施例４で使用したＳ４を用い、実施例６
と同様の操作でα−アミラーゼ活性な測定した。Example 9 Using S4 used in Example 4 as a sample, Example 6
α-Amylase activity was measured using the same procedure as above.
実施例１０
試料として、実施例５で使用したＳ５を用い、実施例６
と同様の操作でα−アミラーゼ活性を測定した。Example 10 Using S5 used in Example 5 as a sample, Example 6
α-amylase activity was measured in the same manner as above.
実施例６〜１０の各結果は、添付図面第２図に、−・−
として実施例番号を付して示されている。The results of Examples 6 to 10 are shown in FIG. 2 of the attached drawings.
Example numbers are given as follows.
第２図から明らかなように、Ｇ７− ＰＮＰを基質とし
て用いるα−アミラーゼ活性測定においても、本発明に
より、溶血によるヘモグロビンの影響が解消されること
が示されている。As is clear from FIG. 2, the present invention also shows that the influence of hemoglobin caused by hemolysis is eliminated in α-amylase activity measurement using G7-PNP as a substrate.
実施例１１〜１５
（ト）試薬の調＃！ニ
ゲリシルグリシン２０９を８００−の蒸留水に溶解し、
１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を加えて−を７９とする
。本溶液にＧｔｕ−ＣＮＡ ２．０８ ？。Examples 11-15 (g) Preparation of reagent #! Dissolve nigericylglycine 209 in 800-g distilled water,
Add 1N aqueous sodium hydroxide solution to bring - to 79. Gtu-CNA 2.08? .
アジ化ナトリウム１ｆ及びチオ尿素２．５ｔを加えて溶
解し、蒸留水を加えて全量を１Ｌとし、γ−グルタミル
トランスフェラーゼの活性測定試薬とする（溶液Ｃ）。1f of sodium azide and 2.5t of thiourea are added and dissolved, and distilled water is added to bring the total volume to 1L, which is used as a reagent for measuring the activity of γ-glutamyltransferase (solution C).
Ｃｌ５）ヘモグロビン含有血清の調製
基準となる血清としてγ−グルタミルトランスフェラー
ゼ１００ Ｕ／／、を含有し、シアンメトヘモグロビン
法で、血清中のヘモグロビンを測定した結果、ヘモグロ
ビンを含有していなかった血清（’ｒ（１と略記する）
を使用した。Ｔｏを５等分し、それぞれの血清に、溶血
より生じたヘモグロビンを加え、それぞれの血清中に含
有されるヘモグロビン濃度が０．１％、０．２チ、α３
％、０．４チ、ｏ、 ５ ％となるように溶解し、それ
ぞれの血清をＴ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５とした。Cl5) As a standard serum for the preparation of hemoglobin-containing serum, it contained 100 U// of γ-glutamyl transferase, and as a result of measuring hemoglobin in the serum by the cyanmethemoglobin method, it was found that the serum did not contain hemoglobin (' r (abbreviated as 1)
It was used. Divide To into 5 equal parts, add hemoglobin generated from hemolysis to each serum, and calculate the hemoglobin concentration contained in each serum to be 0.1%, 0.2%, α3
%, 0.4%, o, and 5%, and the respective serums were designated as T1, T2, T3, T4, and T5.
実施例１１
前記の溶液Ｃ３，０＋ｄに、試料としてＴ１０．０５ｍ
を混合し、３７℃で波長４１５ ｎｍにおける経時的な
吸光度の上昇を測定し、吸光度の１分間当りの上昇度を
求め次。求め′ｆｃ１分間当りの上昇度の値を次式に代
入し、γ−グルタミルトランスフェラーゼ活性を求めた
。Example 11 Add T10.05m as a sample to the above solution C3,0+d.
The increase in absorbance over time at a wavelength of 415 nm was measured at 37°C, and the increase in absorbance per minute was determined. The γ-glutamyltransferase activity was determined by substituting the value of the increase in fc per minute into the following equation.
γ−グルタミルトランスフェラーゼ活性（Ｕ／ｚ）実施
例１２
試料としてＴ２を用い、実施例１１と同様の操作でγ−
グルタミルトランスフェラーゼ活性を測定した。γ-glutamyl transferase activity (U/z) Example 12 Using T2 as a sample, γ-
Glutyl transferase activity was measured.
実施例１５
試料としてＴ３を用い、実施例１１と同様の操作でγ−
グルタミルトランスフェラーゼ活性を測定した。Example 15 Using T3 as a sample, γ-
Glutyl transferase activity was measured.
実施例１４
試料としてＴ４を用い、実施例１１と同様の操作でγ−
グルタミルトランスフェラーゼ活性を測定した。Example 14 Using T4 as a sample, γ-
Glutyl transferase activity was measured.
実施例１５
試料としてＴ５を用い、実施例１１と同様の操作でγ−
グルタミルトランスフェラーゼ活性を測定した。Example 15 Using T5 as a sample, γ-
Glutyl transferase activity was measured.
実施例１１〜１５の各結果は、添付図面第３図において
一〇−とじて実施例番号を付して示されている。The results of Examples 11 to 15 are shown in FIG. 3 of the accompanying drawings with example numbers 10-.
比較例６〜１０
実施例１１〜１５で使用し九溶液Ｃの成分中からチオ尿
素のみを除いた組成を有する溶液（溶液Ｃ／ ）を調製
し、それをｒ−グルタミルトランスフェラーゼ活性測定
用試薬として以下の比較例６〜１０に用いた。Comparative Examples 6 to 10 A solution (Solution C/) having a composition excluding only thiourea from the components of Solution C used in Examples 11 to 15 was prepared, and it was used as a reagent for measuring r-glutamyltransferase activity. It was used in Comparative Examples 6 to 10 below.
比較例６
溶液Ｃ’３．０ｍｌに、試料として前記Ｔ１０．０５ｍ
を混合し、３７℃波長４１５ｎｍにおける経時的な吸光
度の上昇を測定し、実施例１１と同様の方法でｒ−グル
タミルトランスフェラーゼ活性を求めた。Comparative Example 6 Add the above T10.05m as a sample to 3.0ml of solution C'.
were mixed, and the increase in absorbance over time at 37° C. and a wavelength of 415 nm was measured, and the r-glutamyltransferase activity was determined in the same manner as in Example 11.
比較例７
試料として前記Ｔ２を用い、比較例６と同様の操作でγ
−グルタミルトランスフェラーゼ活性を測定した。Comparative Example 7 Using the above T2 as a sample, γ was determined in the same manner as in Comparative Example 6.
- Measured glutamyl transferase activity.
比較例８
試料として前記Ｔ３を用い、比較例６と同様の操作でγ
−グルタミルトランスフェラーゼ活性を測定した。Comparative Example 8 Using the above T3 as a sample, γ was determined in the same manner as in Comparative Example 6.
- Measured glutamyl transferase activity.
比較例９
試料として前記Ｔ４を用い、比較例６と同様の操作でｒ
−グルタミルトランスフェラーゼ活性を測定した。Comparative Example 9 Using the above T4 as a sample, r
- Measured glutamyl transferase activity.
比較例１ａ
試料として前記Ｔ５を用い、比較例６と同様の操作でγ
−グルタミルトランスフェラーゼ活性を測定した。Comparative Example 1a Using the above T5 as a sample, γ was determined in the same manner as in Comparative Example 6.
- Measured glutamyl transferase activity.
比較例６〜１０の各結果は添付図面第３図において−・
−として比較例番号を付して示されている。The results of Comparative Examples 6 to 10 are shown in Figure 3 of the attached drawings.
Comparative example numbers are indicated as -.
比較例１０は負の値を示したため、図には表わされてい
ない。Comparative Example 10 showed a negative value and is therefore not shown in the figure.
′！Ｊ１３図から明らかなようにＧｔｕ−ＣＮＡを基質
として用いるγ−グルタミルトランスフェラーゼの活性
測定においても、本発明により、溶血によるヘモグロビ
ンの影響が解消されることが示されている。′! As is clear from Figure J13, even in the measurement of the activity of γ-glutamyltransferase using Gtu-CNA as a substrate, it has been shown that the influence of hemoglobin due to hemolysis is eliminated by the present invention.
添付図面、第１図は前述した本発明の実施例１〜５と比
較例１〜５とによる血清中のα−アミラーゼ活性測定結
果をグラフで表したものである。
同第２図は、前述した本発明の実施例６〜１０による血
清中のα−アミラーゼ活性測定結果をグラフで表したも
のである。
同第３図は、前述した本発明の実施例１１〜１５と比較
例６〜９とによる血清中のγ−グルタミルトランスフェ
ラーゼ活性測定結果をグラフで表したものである。The accompanying drawings and FIG. 1 are graphs showing the results of measuring α-amylase activity in serum according to Examples 1 to 5 of the present invention and Comparative Examples 1 to 5 described above. FIG. 2 is a graph showing the measurement results of α-amylase activity in serum according to Examples 6 to 10 of the present invention described above. FIG. 3 is a graph showing the measurement results of γ-glutamyltransferase activity in the serum of Examples 11 to 15 of the present invention and Comparative Examples 6 to 9 described above.
Claims (1)
４５０ｎｍの領域で吸光度を測定する方法に使用する酵
素活性測定用試薬において、チオ尿素を含有せしめたこ
とを特徴とする血清中の酵素活性測定用試薬。 ２、前記の酵素が、α−アミラーゼである特許請求の範
囲第１項記載の酵素活性測定用試薬。 ３、前記の酵素が、γ−グルタミルトランスフェラーゼ
である特許請求の範囲第１項記載の酵素活性測定用試薬
。[Claims] 1. For measuring enzyme activity in serum, from 400 nm to
1. A reagent for measuring enzyme activity in serum, which is used in a method for measuring absorbance in the 450 nm region, and contains thiourea. 2. The reagent for measuring enzyme activity according to claim 1, wherein the enzyme is α-amylase. 3. The reagent for measuring enzyme activity according to claim 1, wherein the enzyme is γ-glutamyl transferase.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61091318A JPH0612998B2 (en) | 1986-04-22 | 1986-04-22 | Reagent for measuring enzyme activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61091318A JPH0612998B2 (en) | 1986-04-22 | 1986-04-22 | Reagent for measuring enzyme activity |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62248500A true JPS62248500A (en) | 1987-10-29 |
| JPH0612998B2 JPH0612998B2 (en) | 1994-02-23 |
Family
ID=14023112
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0612998B2 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1386971A1 (en) * | 2001-04-17 | 2004-02-04 | International Reagents Corporation | Method of assaying biological component |
| US7407774B2 (en) | 2004-01-27 | 2008-08-05 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Method for reducing influence of hemoglobin with albumin in an assay |
| WO2010001619A1 (en) * | 2008-07-04 | 2010-01-07 | 積水メディカル株式会社 | Method for enhancing sensitivity or method for avoiding influence of hemoglobin in immunological measurement |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6035270A (en) * | 1983-08-05 | 1985-02-23 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Prevention of hemoglobin decomposition and reagent used therefor |
| JPH0356425A (en) * | 1989-07-24 | 1991-03-12 | Mect Corp | Carcinostatic composition |
-
1986
- 1986-04-22 JP JP61091318A patent/JPH0612998B2/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6035270A (en) * | 1983-08-05 | 1985-02-23 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Prevention of hemoglobin decomposition and reagent used therefor |
| JPH0356425A (en) * | 1989-07-24 | 1991-03-12 | Mect Corp | Carcinostatic composition |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1386971A1 (en) * | 2001-04-17 | 2004-02-04 | International Reagents Corporation | Method of assaying biological component |
| EP1386971A4 (en) * | 2001-04-17 | 2004-10-20 | Int Reagents Corp | Method of assaying biological component |
| US7407774B2 (en) | 2004-01-27 | 2008-08-05 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Method for reducing influence of hemoglobin with albumin in an assay |
| WO2010001619A1 (en) * | 2008-07-04 | 2010-01-07 | 積水メディカル株式会社 | Method for enhancing sensitivity or method for avoiding influence of hemoglobin in immunological measurement |
| JP5443355B2 (en) * | 2008-07-04 | 2014-03-19 | 積水メディカル株式会社 | Method for avoiding influence of hemoglobin in immunological measurement and reagent therefor |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0612998B2 (en) | 1994-02-23 |
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