JPS62245963A

JPS62245963A - 過酸化水素の酵素的高感度簡易測定法

Info

Publication number: JPS62245963A
Application number: JP8920386A
Authority: JP
Inventors: Shizuo Uno; 宇野　静夫; Masatsune Kurono; 昌庸黒野; Mari Miama; 美甘　麻里; Shinobu Itou; 伊藤　志のぶ; Kiichi Sawai; 喜一澤井
Original assignee: Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd
Current assignee: Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd
Priority date: 1986-04-19
Filing date: 1986-04-19
Publication date: 1987-10-27

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は過酸化水素の酵素的高感度簡易測定法に係り、
この発明は臨床検査領域において利用されることができ
る。

（従来の技術）過酸化水素の酵素的測定は、臨床検査の領域において現
在日常的なものとなっている。何故ならば、生体試料例
えは血清や尿を検体として生化学物質や酵素を定量する
場合に、基質特異性を利用する酵素的測定法の内で酸化
酵素を用いて先ず過酸化水素を生成させる反応を利用す
る方法が最も頻繁に用いられているからである。この種
の臨床検査項目における過酸化水素生成反応例を示せば
下記の通シである。

グルコース（Ｇｌｕ　） α−Ｄ−ダルコース β−Ｄ−ダルコース尿酸（ＵＡ　）Ｈ７ラントインＲＣＯＯＨ＋ＡＴＰ＋Ｃ６ＡＣＯＯＨＣ０ＯＨＣＯＯＨアセチルリン酸ＡＣ８ニアシルＣｏＡスインセターゼＭＫ：ばオキナーゼＰＫ　　：ピルビン酸キナーゼｐｏｐ　：ぎルピン酸オキシダーゼＴＰＰ　：チアミンピロリン酸コレステロールエステルコレステロールコレステロール Δ４−コレステノンＧＯＴ　　：ＧＰＴ　　：Ｃ０ＯＨＣ００ＨＬ！アラニン　　α−ケトグルタル酸　　ピルビン酸　
　グルタミン酸アセチルリン酸（ＨＯ−Ｃ）Ｉ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ，）、”］］＋Ｏ
Ｈ−コリンプリンベタイントリグリセライド　　　　　　グリセリンＣＨ２０ＨＣ
Ｈ２０Ｈグリセリン−３−リン酸ジヒドロキシアセトンリン酸ＬＰＬ　：　　リフ１？プロテインリノ讐−ゼＧＫ：グ
リセ口キナーゼＧＰＯ：　　グリセロール−３−リン酸オキシダーゼコ
リン　　　　　　　　安息香酸Ｃ１（０−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ”（ＣＩ、）、）ＯＨ−
＋２０□コリンオキシダーゼーーーーー→２Ｈ２０□＋−００Ｃ−Ｃ）Ｉ２−Ｎ”（
ＣＨ，）３ベタイン上記反応で生成するような過酸化水素を酵素的に測定す
る方法としては、酸化酵素として下記のようにペルオキ
シダーゼ（ＰＯＤ）又はカタラーゼを用いて、上記の生
成過酸化水素を呈色反応に導き。

その呈色度に基き過酸化水素を算出している。

ＰＯＤを用いる方法Ｈ２０□＋ＤＨ２−一→Ｄ　＋　２Ｉ（２０（ＤＩ２：
色原体）カタラーゼを用いる方法例えばメタノールを過酸化水素で酸化して生成したホル
ムアルデヒドに、アセチルアセトンとアンモニウム塩と
を加え、ノ１ンツ（Ｈａｎｋｓ　）反応により縮合呈色
させる方法があり、この方法は次の反応式で示される。

）Ｉ２０□＋Ｃ）１．ＯＨ−一→ＨＣＩ（Ｏ＋　２Ｈ２
０ＨＣＨＯ＋　２ＣＨ，ＣＯＣＨ２ＣＯＣＨ２＋ＮＨ。

これらの両方法の内でカタラーゼを用いる方法は測定時
間が長く、自動化が困難なこともちゃ、従ってＰＯＤを
用いる方法が一般的に用いられている。そこでＰＯＤ系
の呈色法について言及すれば、大別して、下記の４種の
方法が開発されている。

ａ）　　ｏ−シアニジン又はｏ−）リジンを用いる方法これらの方法は、生成する色素の安定性や発癌性に問題
があるために、現在あまシ適用されていない。

ｂ）４−アミノアンチピリンと７エノール類とを併用す
る方法この方法は、１９６９年にトリンダー（Ｔｒｌｎｄｅｒ
）が発表したものであり、現在汎用されている方法であ
って、下記反応により赤色キノン色素を生成させ、その
呈色度を５００　ｎｍ付近で泗１定する方法であシ、フ
ェノール類としてはｐ−ヒドロキシ安息香ｍ％　ｐ−ク
ロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、４，６
−ジクロロ−ｏ−クレゾール、２．４−ジブロモフェノ
ール、４，６−ジプロモー〇−クレゾール等が用いられ
ている。

２Ｈ，Ｏ，＋　４−アミノアンチピリン＋フェノール類
ｃ）　　４−アミノアンチピリンとアニリン類とを併用
する方法この方法は、上記す方法から発展した方法であシ、アニ
リン類としてはジメチルアニリン、ジエチルアニリン等
を用い生成する色素の呈色度を更に高波長の領域（５０
０〜ｇＯ（Ｊａｍ）で測定する方法である。

ｄ）その他上記以外の呈色法としては例えば下記のような諸方法が
提案されている。

３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）ＣＲ２インダミン色素（５００ｎｍ）＋４Ｈ２０２．２′−アジノジ（３−エチルベンゾチアゾリン−６
−スルホン酸（ＡＢＴＳ）（４２０ｎｍ）（発明が解決しようとする問題点及び発明の目的）試料
中の過酸化水素を呈色反応に導き、その呈色度に基いて
過酸化水素を算出測定するためには酸化酵素としてＰＯ
Ｄを用いる上述の４方法が現在採用されている。これら
の従来法は過酸化水素含有試料が正常原検体から導かれ
たものである場合には有効であるが、原検体が高ビリル
ビン検体、乳び検体、溶血検体等の異常検体である場合
には呈色度がその影響を受け、これが測定誤差をもたら
す点に問題がある。

尚、現在多用される薬剤の１つであるアスコルビン酸に
関しても、これが試料検体中に高濃度（約５８９７ｄｔ
以上）存在すると測定値に負誤差をもたらすことが知ら
れているが、これについては例えば４−アミノアンチピ
リンの濃度を高めたシ、ＰＯＤの濃度を下げたシ、或い
はアスコルビン酸を２＋Ｃｕ　　イオン、過沃素酸、アスコルＶン酸酸化酵素等
によシ酸化させる等の措置を講じて対処している。

従りて、本発明の目的は、過酸化水素含有試料が高ビリ
ルビン検体、乳び検体、溶血検体等の異常検体を基原と
するものであっても測定誤差が生しない又は該誤差を極
めて低く抑えることができる、過酸化水素の酵素的高感
度簡易測定法を提供することＫある。

（問題点を解決し、目的を達成するための手段及び作用
）異常検体を基原とする、過酸化水素含有試料中の過酸化
水素を従来法により酵素的に測定する場合に測定誤差が
生じるのは、呈色度の測定波長に基因するものと推定さ
れる。伺故ならばビリルビンの極大吸収は４６５　ｎｍ
にあり、ヘモグロビンは４３０　ｎｍ及び５３０〜５７
０　ｎｍにそれぞれ吸収を有しておシ、−刃孔びの吸収
は全波長に亘るが。

殊に短波長な程大きな吸光度となるに対し、従来法で採
用されている測定波長は生成する色素の関連からいずれ
も６００　ｎｍ以下だからである。

従りて、測定波長が６００　ｎｍ以上の測定系を確立す
れば誤差の導入を回避し得るとの仮定の下に。

本発明者等は鋭意研究を重ねた結果、水酸基を、有する
芳香族化合物と、ジアミン化合物と、酸化酵素とを試料
中に添加して反応させれば有色のキノン色素が生成し、
この色素の測定波長は約６５０ｎｍとなシ、返金ビリル
ビン、乳ひ、ヘモグロビン等が存在してもこれらが測定
値に与える影響を着るしく抑え得ることを見出して本発
明を完成するに至りた。

従って、本発明による過酸化水素の酵素的高感度簡易測
定法は、過酸化水素を含有する試料中に、水酸基を有す
る芳香族化合物と、ジアミン化合物と、酸化酵素とを添
加して反応させ、生成する有色のキノン色素の呈色度を
測定する工程を具備していることを特徴としている。

本発明方法において使用される、水酸基を有する芳香族
化合物としては式（式中Ｘ１及びＸ２は水素、ハロゲン、アルキル又はニ
トロを意味する）にて示されるフェノール類及び式Ｙ２（式中Ｙ及びＹ２は水素、）・ログン、ニトロ。

スルホン又はアシルを意味する）にて示されるナフトール類を挙げることができ、具体的
にはフェノール類としてフェノール、ｐ−ヒドロキシ安
息香酸、ｐ−クロロフェノール、２，４−ゾク００フェ
ノール、４，６−ジクロロ−〇−クレゾール、２，４−
ジブロモフェノール、４．６−ゾプロモー０−クレゾー
ル等を挙げることができ、又ナフトール類としてはα−
ナフトール、１−ナフトール−２−スルホン酸等を挙げ
ることができる。ジアミン化合物としては、式（式中Ｚ　及びｚ２はアルキル、スルホン又はアシルを
意味し、或いは２．及びｚ２は一緒にて且つ隣接する窒
素原子と共に複素環を形成し７ていることができ、ｚ５
及びｚ４は水素、ハロゲノ、アルキル又はアシルを意味
する）にて示されるアニリン類を挙げることができ、こ
れらのアニリン類の内で殊に有利なものとしてはｐ−ア
ミノジエチルアニリンを挙げることができる。酸化酵素
としてはＰＯＤ　、カタラーゼ等を挙げることができる
が、ＰＯＤを用いるのが適当であシ、このＰＯＤとして
は植物基原のもの例えば西洋ワサビ、大根等から抽出精
製されたものを使用することができ、又動物酸いは微生
物基原のものであっても精製度が充分高いものであれは
使用に支障はない。

水酸基を有する芳香族化合物としてフェノール、α−ナ
フトール又は１−ナフトールスルホン酸を用イ、ジアミ
ン化合物としてｐ−アミノジエチルアニリンを用い、又
酸化酵素としてＰＯＤを用いた場合の反応を例示すれば
以下の通シである。

（すべて有色のキノン色素、約６５０　ｎｍで吸光度測定）（実施例等）次に、実施例に関連して本発明を更に詳細に説明する。

実施例（１）試薬ａ）燐酸緩衝液１００　ｒｒＭ／ｌの燐酸−水素す）　ＩＪウム水溶液
と、１００　ｒｒＭ７１の燐酸二水素カリウム水溶液と
を混合し、ＰＨ７，０に調整したもの。

ｂ）水酸基を有する芳香族化合物４　ｒｒＭ／ｌの１−ナフトール−２−スルホン酸カリ
ウム水溶液を用いる。

Ｃ）ジアミン化合物５　Ｋ　ｍＵｌ／ｌ箇市層ｉ−丁９ノぴ工争ル了ニリン
水溶液を用いる。

ｄ）ＰＯＤ西ドイツ固在、ペーリンガー・マンハイム社裂ノ被ルオ
キシダーゼ（グレードｎ）を蒸留水テ０．３単位／−に
稀釈したものを用いる。

（ｎ）測定操作ａ）過酸化水素を含有する試料溶液（Ｔ）　、ｓ　ｏμ
ＶＶＩの過酸化水素標準液（Ｓｔ）及び盲検としての精
製水をそれぞれ５０μｌ宛試験管に入れる。

ｂ）上記の各試験管に燐酸緩衝液２，０ｒｔｌ、芳香族
化合物溶液０．１５−及びジアミン化合物溶液０．１５
ｍ１をそれぞれ添加し混和する。

Ｃ）加温し、３７℃に５分間保つ。

ｄ）波長６７５　ｎｍでの吸光度Ｅｏ（Ｔ）及びＥｏ　
（Ｓｔ）を、盲検を対照として測定する。

ｅ）次いで、ＰＯＤ溶液ｏ、１ｒｔｔｔを添加して混和
する。

ｆ）加温し、３７℃に５分間保つ。

ｇ）波長６７５　ｎｎｌでの吸光度Ｅ　ｆ　（Ｔ）及び
Ｅｆ（ＳＬ）を、盲検を対照として測定する。

（ＩＩ１）定量計算上記の測定で得た吸光度値を次式に代入して試料溶液中
の過酸化水素濃度（μＭ／ｌ）を算出する。

Ｃ：過酸化水素濃度（μＭ／１）Ｅｏ（Ｔ）　：　ＰＯＤ添加前における試料溶液の吸光
度Ｅ、（ｓｔ）：ｐｏＤ添加前における標準液の吸光度
Ｅｔ　（Ｔ）　：　ＰＯＤを添加し反応させた後におけ
る試料溶液の吸光度Ｅｆ（Ｓｔ）：ＰＯＤを添加し反応させた後における標
準液の吸光度以上により試料溶液中の過酸化水素濃度をθ〜２００μ
Ｍａｌ迄定量することができた。

（発明の効果）本発明方法によれば、試料中の過酸化水素濃度を極めて
高感度に測定することができる。この測定は生成するキ
ノ／色素の呈色度測定を介して行われ、その測定波長は
６００　ｎｍ以上、殊に約６５０　ｎｍ付近であシ、従
りて過酸化水素含有試料が高ビリルビン検体、乳び検体
、溶血検体等の異常検体を基原とするものであっても測
定誤差を極力抑え得ると云う効果を有している。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）過酸化水素を含有する試料中に、水酸基を有する
芳香族化合物と、ジアミン化合物と、酸化酵素とを添加
して反応させ、生成する有色のキノン色素の呈色度を測
定する工程を具備していることを特徴とする、過酸化水
素の酵素的高感度簡易測定法。
（２）水酸基を有する芳香族化合物がフェノール類及び
ナフトール類から選ばれた化合物であることを特徴とす
る、特許請求の範囲第１項に記載の過酸化水素の酵素的
高感度簡易測定法。
（３）フェノール類が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｘ＿１及びＸ＿２は水素、ハロゲン、アルキル又
はニトロを意味する）にて示される化合物であることを特徴とする、特許請求
の範囲第１又は２項に記載の過酸化水素の酵素的高感度
簡易測定法。
（４）フェノール類がフェノールであることを特徴とす
る、特許請求の範囲第１、２又は３項に記載の過酸化水
素の酵素的高感度簡易測定法。
（５）ナフトール類が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｙ＿１及びＹ＿２は水素、ハロゲン、ニトロ、ス
ルホン又はアシルを意味する）にて示される化合物であることを特徴とする、特許請求
の範囲第１又は２項に記載の過酸化水素の酵素的高感度
簡易測定法。
（６）ナフトール類がα−ナフトール又は１−ナフトー
ル−２−スルホン酸であることを特徴とする、特許請求
の範囲第１、２又は５項に記載の過酸化水素の酵素的高
感度簡易測定法。
（７）ジアミン化合物が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｚ＿１及びＺ＿２はアルキル、スルホン又はアシ
ルを意味し、或いはＺ＿１及びＺ＿２は一緒にて且つ隣
接する窒素原子と共に複素環を形成していることができ
、Ｚ＿３及びＺ＿４は水素、ハロゲン、アルキル又はア
シルを意味する）にて示されるアニリン類であることを特徴とする、特許
請求の範囲第１項に記載の過酸化水素の酵素的高感度簡
易測定法。
（８）ジアミン化合物がｐ−アミノジエチルアニリンで
あることを特徴とする、特許請求の範囲第１又は７項に
記載の過酸化水素の酵素的高感度簡易測定法。
（９）酸化酵素がペルオキシダーゼであることを特徴と
する、特許請求の範囲第１項に記載の過酸化水素の酵素
的高感度簡易測定法。