JPS6222796A - Separation and purification of biomembrane protein - Google Patents
Separation and purification of biomembrane proteinInfo
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- JPS6222796A JPS6222796A JP60163230A JP16323085A JPS6222796A JP S6222796 A JPS6222796 A JP S6222796A JP 60163230 A JP60163230 A JP 60163230A JP 16323085 A JP16323085 A JP 16323085A JP S6222796 A JPS6222796 A JP S6222796A
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
し産業上の利用分野〕
本発明は、薬学、医学、工学等の各分野において注目さ
れ、有用性が認められつつある生体膜蛋白質を、生体機
能を損うことなく分離精製する方法に関するものである
。[Detailed Description of the Invention] Industrial Application Fields] The present invention is directed to the production of biomembrane proteins, which have been attracting attention and whose usefulness is being recognized in various fields such as pharmacy, medicine, and engineering, without impairing their biological functions. This invention relates to a method of separation and purification.
生体膜は、極性脂質と膜蛋白質を主成分として構成され
るものである。このうち、膜蛋白質が生体機能を維持し
ているが、これは極性脂質、特に°その大部分を占める
リン膜質の2重膜中に挿入された状態にある。そこで、
生体膜蛋白質、例えば大腸菌外膜ポーリン、チトクロノ
Jb5 、(Na+ 、K” )−ΔT Pa5e
’、 (Ca” ) −A T Pa5e、(t(
” ) ’−ATPaseなどを分離精製する場合には
、これらの多くがそれ自身難水溶性であり、水溶性球状
蛋白質とは異なるので、分離精製の第一段階として膜蛋
白質を可溶化する必要がある。Biological membranes are mainly composed of polar lipids and membrane proteins. Among these, membrane proteins maintain biological functions, and these are inserted into the bilayer membrane of polar lipids, especially phosphorus membranes, which make up the majority of the membrane proteins. Therefore,
Biological membrane proteins, such as E. coli outer membrane porin, cytochronoJb5, (Na+, K'')-ΔT Pa5e
', (Ca”) −A T Pa5e, (t(
When separating and purifying ATPase, etc., it is necessary to solubilize membrane proteins as the first step in separation and purification, as most of these are poorly water-soluble and are different from water-soluble globular proteins. be.
膜蛋白質の可溶化には、脂質二重層と類似の環境を持つ
媒質が必要であり、各種の有機溶媒、界面活性剤水溶液
が用いられている。有機溶媒の代表例としてはアセトン
、ブタノール、エタノールおよびピリジン等であり、界
面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウムに代表され
るアニオン性界面活性剤、1〜リメチルドデシル了ンモ
ニウトクロリドに代表されるカチオン性界面活性剤、ポ
リオキシエチレンドデシルエーテルに代表される非イオ
ン性界面活性剤がある。Solubilization of membrane proteins requires a medium with an environment similar to that of a lipid bilayer, and various organic solvents and aqueous surfactant solutions are used. Typical examples of organic solvents include acetone, butanol, ethanol, and pyridine, and examples of surfactants include anionic surfactants such as sodium dodecyl sulfate and 1 to 3-dimethyldodecylmonium chloride. There are cationic surfactants and nonionic surfactants typified by polyoxyethylene dodecyl ether.
しかし有機溶媒の多くは蛋白質に対して強力な変性剤と
して働くために、生体機能を損なうことなく膜蛋白質を
分離精製することが困難になる場合が多い。又、従来か
ら生化学分野で用いられているアニオン性界面活性剤の
一つであるドデシル硫酸ナトリウl、(以後SDSと略
称する)は強力な蛋白質変性剤として働くので、この界
面活性剤を用いても生体機能を損なうことなく膜蛋白質
を分離精製するのが困難になる場合が多い。However, since many organic solvents act as strong denaturants for proteins, it is often difficult to separate and purify membrane proteins without impairing biological functions. In addition, sodium dodecyl sulfate (hereinafter abbreviated as SDS), which is one of the anionic surfactants conventionally used in the biochemical field, acts as a strong protein denaturing agent. However, it is often difficult to separate and purify membrane proteins without impairing biological functions.
そこで、蛋白変性能の低い非イオン性界面活性剤を、可
溶化のための媒質として用いることが試みられている。Therefore, attempts have been made to use nonionic surfactants with low protein denaturation properties as a solubilization medium.
しかし多くの非イオン性、界面活性剤は、臨界ミセル濃
度が低く、分離精製後膜蛋白質に結合した界面活性剤を
、透析によって除去することが困5難になるという欠点
がある。However, many nonionic surfactants have a drawback that their critical micelle concentration is low, making it difficult to remove the surfactant bound to membrane proteins by dialysis after separation and purification.
一方、蛋白質変性能の低いアニオン性界面活性剤として
、lIO汁酸塩酸塩類いることは可能であるが、J−れ
らは生体界面活性物質に属するもので高価であり、工業
的に多量使用できないという致命的欠陥がある。又、カ
チオン性界面活性剤は、むしろ生体膜を構成する脂質と
の結合が他の界面活性剤より強く、蛋白質に対する変性
作用も弱くないので、殺菌剤として用いられることは多
いが、膜蛋白質の分離精製に成功した例は少なく適用範
囲の広い界面活性剤とはいえない。 ・これらに対し
て、蛋白質自身の物理的化学的特性に着目した分離精製
法として、熱あるいはpl+処理法、分画沈澱法、吸脱
着法、イオン交換体によるクロマトグラフィー法、等電
点分画法、密度勾配遠心法、電気泳動法、了フイニテイ
クロマトクラフィー法、分子ふるい法、二相分配法、結
晶化法があるがこれらは、いずれも−長−短があって満
足すべきものではなかった。On the other hand, it is possible to use lIO sulfate salts as anionic surfactants with low protein denaturation ability, but they belong to biosurfactants and are expensive, so they cannot be used in large quantities industrially. There is a fatal flaw. In addition, cationic surfactants are often used as bactericidal agents because they bond more strongly with the lipids that make up biological membranes than other surfactants, and their denaturing effects on proteins are not weak. There are few examples of successful separation and purification, and it cannot be said that it is a surfactant with a wide range of applications.・In contrast, separation and purification methods that focus on the physical and chemical properties of proteins themselves include thermal or PL+ treatment methods, fractional precipitation methods, adsorption/desorption methods, chromatography methods using ion exchangers, and isoelectric point fractionation. method, density gradient centrifugation method, electrophoresis method, chromatography method, molecular sieve method, two-phase partition method, and crystallization method, but all of these methods have advantages and disadvantages and are not satisfactory. There wasn't.
[発明が解決しようとする問題点]
本発明は、生体膜蛋白質を変性させることなく可溶化し
、生体機能を損なうことなく、純度よく分離精製する方
法を提供するものである。[Problems to be Solved by the Invention] The present invention provides a method for solubilizing biological membrane proteins without denaturing them and separating and purifying them with high purity without impairing biological functions.
本発明は、対イオンとして分子内に少なくとも1個の窒
素原子を有する陽イオンをもつアルキル(アルキルフェ
ニル)硫酸エステル塩型アニオン性界面活性剤の存在下
、低温でゲル電気泳動を行うと、特有な現象として」−
記の問題点を解消できるとの知見に基づくものである。The present invention shows that when gel electrophoresis is performed at low temperature in the presence of an alkyl (alkylphenyl) sulfate salt type anionic surfactant having a cation having at least one nitrogen atom in the molecule as a counterion, as a phenomenon.”
This is based on the knowledge that the above problems can be resolved.
すなわち、本発明は、一般式RO8’DJ (式中Rは
炭素数6〜22のアルキル基又はアルキルフェニル基セ
あり、Mは窒素原子を少なくとも1個以上有する陽イオ
ンである)で示されるアニオン性界面活性剤の共存下、
15℃以下でゲル電気泳動を行うことを特徴とず、る生
体膜蛋白質の分離精製法を提供する。That is, the present invention provides an anion represented by the general formula RO8'DJ (wherein R is an alkyl group having 6 to 22 carbon atoms or an alkylphenyl group, and M is a cation having at least one nitrogen atom). In the coexistence of a surfactant,
Provided is a method for separating and purifying biological membrane proteins, characterized in that gel electrophoresis is performed at 15° C. or lower.
本発明で用いるアニオン性界面活性剤は」二記一般式で
表わされるものであるが、式中、Rとしては炭素数8〜
16の直鎖状アルキル基又は炭素数6〜14の分枝状ア
ルキルフェニル基が好ましく、特に好ましくは炭素数1
0〜14の直鎖状アルキル基又は炭素数8〜12の分枝
状アルキルフェニル基である。一方、式中、Mとしては
アンモニラl、又は炭素数1〜6の炭化水素基を分子内
に少なくとも1個有する第4級アンモニウム(各々、界
面活性能を有しないもの)が好ましい。Mとして具体的
には、アンモニウム、モノメチルアンモニウム、ジメチ
ルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、テトラメチ
ルアンモニウム、モノエチルアンモニウム、ジエチルア
ンモニウム、トリエチルアンモニウム、テトラエチルア
ンモニウム、モノエタノールアンモニウム、ジェタノー
ルアンモニウム、トリエタノールアンモニウム、テトラ
エタノールアンモニウム、トリス(ヒドロキシメチル)
メチルアンモニウム、トリス(ヒドロキシエチル)メチ
ルアンモニウム、モノイソプロパツールアンモニウム、
ジイソプ口パノールアンモニウム、トリイソプロパツー
ルアンモニウム、テトライソプロパノールアンモニウム
、ピリジニウム、モルホリニウJ、が例示される。The anionic surfactant used in the present invention is represented by the general formula 2, where R has 8 to 8 carbon atoms.
A linear alkyl group having 16 carbon atoms or a branched alkylphenyl group having 6 to 14 carbon atoms is preferred, and particularly preferably a C 1 straight-chain alkyl group.
It is a linear alkyl group having 0 to 14 carbon atoms or a branched alkylphenyl group having 8 to 12 carbon atoms. On the other hand, in the formula, M is preferably ammonia l or quaternary ammonium having at least one hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms in the molecule (each having no surface-active ability). Specifically, M includes ammonium, monomethylammonium, dimethylammonium, trimethylammonium, tetramethylammonium, monoethylammonium, diethylammonium, triethylammonium, tetraethylammonium, monoethanolammonium, jetanolammonium, triethanolammonium, and tetraethanolammonium. , tris(hydroxymethyl)
Methylammonium, tris(hydroxyethyl)methylammonium, monoisopropanol ammonium,
Examples include diisopropanol ammonium, triisopropanol ammonium, tetraisopropanol ammonium, pyridinium, and morpholinium J.
本発明のアニオン性界面活性剤として特に好ましくは、
デシル硫酸、ドデシル硫酸、テトラデシル硫酸、ヘキシ
デシル硫酸のトリス(ヒドロキシメチル)メチルアンモ
ニウム塩、トリエタノールアミン塩、トリイソプロパツ
ールアミン塩である。Particularly preferred as the anionic surfactant of the present invention are:
These are tris(hydroxymethyl)methylammonium salt, triethanolamine salt, and triisopropanolamine salt of decyl sulfate, dodecyl sulfate, tetradecyl sulfate, and hexidecyl sulfate.
尚、本発明で用いるアニオン性界面活性剤は、式中Rの
炭素数が6〜22である必要があるが、これはRの炭素
数が6未満の場合には界面活性能が劣り、膜蛋白質を効
率よく可溶化できないからであり、一方、炭素数が22
を越えると水溶性が悪くなり、目的を達することが回能
になるからである。In the anionic surfactant used in the present invention, the number of carbon atoms in R in the formula must be 6 to 22, but this is because when the number of carbon atoms in R is less than 6, the surfactant ability is poor and the film This is because proteins cannot be solubilized efficiently, and on the other hand, proteins with a carbon number of 22
This is because if the amount exceeds this amount, the water solubility deteriorates, making it difficult to achieve the desired purpose.
本発明は、上記アニオン性界面活性剤の存在下、15℃
以下において、ゲル電気泳動法を用いることを特徴とす
るものである。ゲル電気泳動法としては、公知の方法が
使用されるが、次の方法によるのがよい。In the present invention, in the presence of the above-mentioned anionic surfactant,
The following is characterized by using gel electrophoresis. Although known methods can be used for gel electrophoresis, the following method is preferred.
(イ)ゲル電気泳動法の支持体
デンプンゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲ
ルなどが使用できる。ポリアクリルアミドゲルは化学的
に安定なこと、ゲル濃度、架橋度を自由にコントロール
することができること、即ちポアサイズを目的に応じて
自由に変えられること、電気浸透性がなくpllおよび
温度変化による変形も少なく、自由な型に成型できるこ
と及び再現性が非常によいことなど多くの利点を有して
いるので特に好ましい。(a) Support for gel electrophoresis Starch gel, agarose gel, polyacrylamide gel, etc. can be used. Polyacrylamide gel is chemically stable, the gel concentration and degree of crosslinking can be freely controlled, that is, the pore size can be freely changed according to the purpose, and it is not electroosmotic and does not deform due to PLL or temperature changes. It is particularly preferable because it has many advantages such as being able to be molded into any mold with a small amount and having very good reproducibility.
(ロ)装置と器具
ポリアクリルアミドゲルなどのゲルを支持する容器と、
その両端に緩衝液を満たすための槽を使用するのがよく
、その容量、長さ等は分離精製する蛋白質の種類、量に
より任意に設定することができる。尚、ゲル電気泳動を
0〜15℃で行う場合には、空冷又は水冷装置を使用す
るのが望ましい。(b) Apparatus and equipment A container for supporting gel such as polyacrylamide gel;
It is preferable to use a tank for filling both ends with a buffer solution, and the capacity, length, etc. of the tank can be arbitrarily set depending on the type and amount of the protein to be separated and purified. In addition, when performing gel electrophoresis at 0 to 15° C., it is desirable to use an air cooling or water cooling device.
(ハ)電源装置
直流電流を用い、定電流・定電圧発生装置を用いると分
離精製能および再現性が向」二するので特に好ましい。(c) Power supply device It is particularly preferable to use direct current and a constant current/constant voltage generator because separation and purification performance and reproducibility are improved.
(ニ)泳動用ポリアクリルアミドゲルの調整アクリルア
ミドを1〜30重量%、N、N’−メチレンビスアクリ
ルアミドをアクリルアミドに対し005〜10重指%お
よび本発明の界面活性剤を0〜1重量%含有する水溶液
を調製した後、重合反応により上記水溶液をゲル化させ
て用いるのがよい。好ましいゲル濃度は、アクリルアミ
ドとN、N′−メチレンビスアクリルアミドの総量が3
〜15重量%(以下、%と略称する)でしかもN、N’
−メチレンビスアクリルアミドがアクリルアミドに対し
て1〜5%の範囲である。又、界面活性剤濃度は0.0
5〜0.2%が特に好ましい。(d) Preparation of polyacrylamide gel for electrophoresis Contains 1 to 30% by weight of acrylamide, 005 to 10% of N,N'-methylenebisacrylamide to the acrylamide, and 0 to 1% by weight of the surfactant of the present invention. After preparing an aqueous solution, it is preferable to use the aqueous solution by gelling it by a polymerization reaction. The preferred gel concentration is such that the total amount of acrylamide and N,N'-methylenebisacrylamide is 3.
~15% by weight (hereinafter abbreviated as %) and N, N'
- Methylenebisacrylamide is in the range of 1 to 5% relative to acrylamide. Also, the surfactant concentration is 0.0
Particularly preferred is 5 to 0.2%.
なお」1記水溶液に重合用触媒、重合促進剤、p++緩
衝剤、防腐剤等を混合してゲル化することも可能である
。光重合用触媒としてリボフラビンなどを、あるいはラ
ジカル重合用触媒として、過硫酸アンモニウムなどを任
意の量で、好ましくは0.04〜0.12%で使用でき
る。重合促進剤として、例えばN、N、N’、N’−テ
トラメチルエチレンジアミンを任意の量で、好ましくは
0.03〜5%、特に好ましくは0.03〜0.12%
で使用することができる。溶存酸素がゲル化を阻害する
場合があるので、脱気あるいはゲル化時にアクリル了ミ
ド水溶液の上部を水で覆い、空気を遮断するのが望まし
い。p■緩衝剤としては、本発明で用いるアニオン性界
面活性剤の対イオンMと同一のイオン種を含むものが使
用でき、目的とするpHでゲル電気泳動することができ
る。又、リン酸すトリウム系などのρ11緩衝剤も使用
できるが、本来の効果は減少する傾向にある。p)I緩
衝剤濃度は10〜500mM、好ましくは50〜200
mM、特に好ましくは100m、Mである。Note that it is also possible to gel a polymerization catalyst, a polymerization accelerator, a p++ buffer, a preservative, etc. by mixing the aqueous solution described in 1 above. Riboflavin or the like can be used as a photopolymerization catalyst, or ammonium persulfate or the like can be used as a radical polymerization catalyst in any amount, preferably 0.04 to 0.12%. As a polymerization accelerator, for example, N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine in an arbitrary amount, preferably 0.03 to 5%, particularly preferably 0.03 to 0.12%.
It can be used in Since dissolved oxygen may inhibit gelation, it is desirable to cover the top of the acrylamide aqueous solution with water to block air during degassing or gelation. As the p■ buffer, one containing the same ionic species as the counter ion M of the anionic surfactant used in the present invention can be used, and gel electrophoresis can be performed at the desired pH. Additionally, ρ11 buffers such as thorium phosphate may also be used, but their original effects tend to decrease. p) I buffer concentration 10-500mM, preferably 50-200mM
mM, particularly preferably 100mM.
(ホ)分離精製時の温度及びρ11
分離精製における温度は、0〜r5tが好ましく、特に
好ましくは0〜10℃であり、pllは4〜9が好まし
く、特に好ましくは7である。温度が0℃より低くなる
とゲル中の水分が凍る場合があり、泳動が出来なくなり
、又15℃を越えると膜蛋白質集合体が変性し機能を損
なう場合があるので好ましくないからである。又、p+
+が4未満や9を越えると、酸・アルカリ変性が起きる
場合があり、やはり好ましくないからである。本発明の
アニオン性界面活性剤は、低温、つまりO°〜15℃で
用いても析(10−ることがないので、この温度でゲル
電気泳動を行うと蛋白質集合体の変性を抑えることがで
きる。特に好ましくは0℃でゲル電気泳動を行うのがよ
い。(e) Temperature and ρ11 during separation and purification The temperature during separation and purification is preferably 0 to r5t, particularly preferably 0 to 10°C, and pll is preferably 4 to 9, particularly preferably 7. This is because if the temperature is lower than 0°C, the water in the gel may freeze, making migration impossible, and if the temperature exceeds 15°C, the membrane protein aggregate may denature and its function may be impaired, which is undesirable. Also, p+
If + is less than 4 or more than 9, acid/alkali denaturation may occur, which is also undesirable. The anionic surfactant of the present invention does not cause precipitation (10-) even when used at low temperatures, that is, 0° to 15°C. Therefore, when gel electrophoresis is performed at this temperature, denaturation of protein aggregates can be suppressed. It is particularly preferable to perform gel electrophoresis at 0°C.
くべ)緩衝液槽内の水溶液
泳動用ポリアクリルアミドゲルの両端を緩衝液で満たず
のがよい。この緩衝液は、ポリアクリルアミドゲル作成
用の水溶液に含まれる緩衝剤、界面活性剤および水から
構成される。緩衝剤濃度は、ポリアクリルアミドゲル作
成用水溶液におけるものと同一であることが望ましい。) It is best not to fill both ends of the polyacrylamide gel for aqueous solution migration in the buffer tank with buffer solution. This buffer solution is composed of a buffer, a surfactant, and water contained in an aqueous solution for producing polyacrylamide gel. The buffering agent concentration is preferably the same as that in the aqueous solution for preparing polyacrylamide gel.
(ト)分離精製される膜蛋白質を含む水溶液本水溶液中
には、膜蛋白質以外に本発明の界面活性剤が0.01〜
5%、好ましくは0.1〜3%、特に好ましくは0.5
〜2%含まれる。又、分離精製能を向上させる目的でク
リセリン等の粘稠な液を1〜30%加えることもできる
が、好ましくは5〜20%である。(g) Aqueous solution containing the membrane protein to be separated and purified. In addition to the membrane protein, the surfactant of the present invention is contained in an amount of 0.01 to
5%, preferably 0.1-3%, particularly preferably 0.5
Contains ~2%. Further, for the purpose of improving the separation and purification ability, a viscous liquid such as chrycerin can be added in an amount of 1 to 30%, but preferably 5 to 20%.
又、この水溶液には、ゲルおよび緩衝液中の緩衝剤を含
むことができ、その濃度は、5 (10m M以下でし
かも緩(Φ【液中の緩衝剤S8度以下であることが好ま
しい。特に好ましくは緩衝液中の緩衝剤濃度の1/2〜
1/20の濃度である。Further, this aqueous solution can contain a gel and a buffer in a buffer solution, and the concentration thereof is preferably 5 (10 m M or less) and a mild (Φ) buffer agent in the solution 8 degrees or less. Particularly preferably 1/2 to 1/2 of the buffer concentration in the buffer solution
The concentration is 1/20.
更にこの水溶液には、相対移動度を算出するため水溶性
の陰イオン性染料、色素例えばブロモフェノールブルー
等を、又、界面活性剤ミセルの位置を示すために、ミセ
ルに可溶で水不溶性の色素、例えば油倦性色素であるイ
エローOB等を混合することも可能である。又、陽イオ
ン性の色素、例えばマラカイトグリーン等はドデシル硫
酸イオンと不溶性の複合体を作り、ドデシル硫酸ミセl
しに可溶化されてミセルとともに泳動するのでミセルの
移動度を求めるには好都合である。これらの濃度は任意
の範囲で使用できるが、好ましくは前者の場合0.00
1〜0.05%、後者の場合0.01〜0.5%である
。Furthermore, in this aqueous solution, a water-soluble anionic dye, pigment such as bromophenol blue was added to calculate the relative mobility, and a water-insoluble dye soluble in the micelles was added to indicate the position of the surfactant micelles. It is also possible to mix dyes such as yellow OB, which is an oily dye. In addition, cationic dyes such as malachite green form insoluble complexes with dodecyl sulfate ions, resulting in dodecyl sulfate micelles.
Since it is immediately solubilized and migrates with micelles, it is convenient for determining the mobility of micelles. These concentrations can be used within any range, but preferably 0.00 in the former case.
1 to 0.05%, and in the latter case 0.01 to 0.5%.
この水溶液を、泳動用ポリアクリルアミドゲル」二端邪
に置くことにより、電気泳動が開始される。Electrophoresis is started by placing this aqueous solution on both ends of a polyacrylamide gel for electrophoresis.
膜蛋白質はゲル中でディスク状に分離精製される。Membrane proteins are separated and purified into disk shapes in the gel.
ディスク状に分離された膜蛋白質は染料によって染色さ
れ、着色した′)ンンドとして認められる。ここで用い
られる染料は、例えばアミドプラ・ツク、クマシーブリ
リアントブルーなどであり、常法(例えば林勝哉著、瓜
谷郁三・寅村憲助・中村道徳・船津勝二編集、″生化学
実験法−蛋白質の電気的性質″′□学会出版センター)
に従って膜蛋白質の分離精製の程度を確認することがで
きる。又、料による染色をしなくても、緑色のノインド
としてfffl、δ忍することができる。Membrane proteins separated into disks are stained with a dye and are recognized as colored particles. The dyes used here are, for example, Amidopura Tsuku, Coomassie Brilliant Blue, etc., and conventional methods (for example, Katsuya Hayashi, Ikuzo Uriya, Kensuke Toramura, Noriyoshi Nakamura, Katsuji Funatsu, editors, "Biochemical Experimental Methods - Protein Electrical properties''′□Society Publishing Center)
The degree of separation and purification of membrane proteins can be confirmed according to the following. Moreover, it is possible to dye fffl, δ as a green color without dyeing with dye.
本発明の方法によって分離精製できる対象物は、動物臓
器、培養細胞、微生物細胞、植物細胞等から抽出、可溶
化される生体膜蛋白質すべてを包含する。Objects that can be separated and purified by the method of the present invention include all biological membrane proteins extracted and solubilized from animal organs, cultured cells, microbial cells, plant cells, etc.
(す)分離精製
可溶化された膜蛋白質成分ずべてを含む上清を、そのま
ま本発明の方法によって分離精製することができる。ま
た、さらに可溶化液に対して除核酸等の通常行われる処
理を施また溶液あるいはさらに分画沈澱、密度勾配遠心
法等、目的に応じて精製の初期段階を経た溶液を高度に
分離精製することも可能である。この場合、本発明の分
離精製を行う前段階の粗い分離精製においては、膜蛋白
質が生体機能を損なうことなく又たとえ変性が生じても
変性を引きゃこす要因を取り除いて可逆的に活性を取り
戻させ得る方法を採用するのが望ましい。以上のように
本発明による生体膜蛋白質の分離精製法、は、あらゆる
生体膜蛋白質に対し適用可能であるとともにいずれの精
製段階においても適用可能であるので、商業」二有利で
ある。。(I) Separation and Purification The supernatant containing all of the solubilized membrane protein components can be directly separated and purified by the method of the present invention. In addition, the solubilized solution is subjected to conventional treatments such as nucleic acid removal, and the solution or the solution that has gone through the initial stages of purification is highly separated and purified depending on the purpose, such as fractional precipitation or density gradient centrifugation. It is also possible. In this case, in the rough separation and purification step prior to the separation and purification of the present invention, the membrane protein can be reversibly restored to its activity without impairing biological functions and even if denaturation occurs, the factors that bring about the denaturation are removed. It is desirable to adopt a method that allows for As described above, the method for separating and purifying biological membrane proteins according to the present invention is applicable to all biological membrane proteins and can be applied at any purification stage, so it is commercially advantageous. .
(1) 本1発明に、用いるアニオン性界面活性剤は
、胆汁酸塩類とは異なり、工業的に安価にかつ容易に合
成されるので、商業上有利である。(1) Unlike bile salts, the anionic surfactant used in the present invention is commercially advantageous because it can be synthesized industrially at low cost and easily.
(2)本発明に用いるアニオン性界面活性剤は低温で析
出することなく使用でき、膜蛋白質に作用させるとそれ
らを構成する成分(刃ブユニット)に分解させない特性
を有するので、生の状態のまま分離精製できて有利であ
る。(2) The anionic surfactant used in the present invention can be used at low temperatures without precipitating, and when it acts on membrane proteins, it does not decompose into its constituent components (blade units), so it can be used in its raw state. It is advantageous because it can be separated and purified.
(3)上記アニオン性界面活性剤によって可溶化された
膜蛋白質にはそれぞれ固有量のアニオン性界面活性剤が
結合しており、それぞれ異なる陰電前数を有する蛋白質
−界面活性剤複合体となっている。これらが電気泳動支
持体中を陽極に向ってそれぞれ固有の速度で移動する。(3) Each membrane protein solubilized by the anionic surfactant has a specific amount of anionic surfactant bound to it, and each protein-surfactant complex has a different number of negative charges. ing. They each move at their own speed through the electrophoretic support toward the anode.
その際支持体による分子ふるい効果も加わるので、単な
る分子ふるい効果しか期待できないゲル濾過法に較べて
、はるかに分離精製能が向上する。At this time, since the molecular sieving effect of the support is also added, the separation and purification ability is much improved compared to the gel filtration method, which can only expect a simple molecular sieving effect.
(4) 界面活性剤で可溶化された膜蛋白質のゲル濾
過法による分離精製の第二の欠点は、大量の溶媒が必要
なことである。本発明による分離精製法ではその必要が
なく有利である。(4) The second drawback of separating and purifying membrane proteins solubilized with surfactants by gel filtration is that a large amount of solvent is required. The separation and purification method according to the present invention is advantageous in that this is not necessary.
(5)非イオン性界面活性剤は臨界ミセル濃度が低いた
め、膜蛋白質に結合した非イオン性界面活外削を透析に
よって除去することが困難な場合が多い。本発明による
分離精製法では、使用する界面活性剤の臨界ミセル濃度
が非イオン性界面活性剤に較べ高いために透析、さらに
は電気透析によって容易に界面活性剤の除去がおこなえ
る。(5) Since nonionic surfactants have a low critical micelle concentration, it is often difficult to remove nonionic surfactant particles bound to membrane proteins by dialysis. In the separation and purification method of the present invention, the critical micelle concentration of the surfactant used is higher than that of nonionic surfactants, so the surfactant can be easily removed by dialysis or even electrodialysis.
次に実施例により本発明を説明するが、本発明はこれら
に限定されるものではない。Next, the present invention will be explained with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
ホウレン草チラコイド膜蛋白質に対し、本発明による方
法を適用したので以下に実施例、比較例をあげて説明す
る。尚、ゲル電気泳動は下記のようにして行った。The method according to the present invention was applied to spinach thylakoid membrane protein, and will be described below with reference to Examples and Comparative Examples. Incidentally, gel electrophoresis was performed as follows.
0ゲル電気泳動
ゲル電気泳動は報文・底置に解説されている5DS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法に準じて行った。〔例
えば1.■、V、 Maizel、 Jr、。0 Gel Electrophoresis Gel electrophoresis was performed according to the 5DS-polyacrylamide gel electrophoresis method described in the paper. [For example, 1. ■, V. Maizel, Jr.
″ Methods in Virology
Il、 Academic Press。″Methods in Virology
Il, Academic Press.
(197])、P、179 :高木俊夫、三宅淳、゛′
新実験化学講座 20巻 生物化学■(日本化学会組)
パ丸善(1978)、P、、109)但し、SS結合解
裂剤は加えず、S、DSを本発明における界面活性剤に
、又緩衝液は本発明、における界面活性剤の対イオンを
含むものに読み替えた。ゲル組成、及び緩衝液組成を表
−11表−2に示した。(197]), P, 179: Toshio Takagi, Jun Miyake, ゛′
New Experimental Chemistry Course Volume 20 Biological Chemistry ■ (Chemical Society of Japan)
Pamaruzen (1978), P., 109) However, no SS bond cleavage agent is added, S and DS are used as the surfactants in the present invention, and the buffer contains counterions of the surfactants in the present invention. I changed it to something. The gel composition and buffer composition are shown in Table 11 and Table 2.
電気泳動中のゲル内温度は、ゲルの周囲を氷水で冷却す
ることにより、はぼ0℃に制御した。The internal temperature of the gel during electrophoresis was controlled at approximately 0° C. by cooling the gel with ice water.
表−1ゲル組成
アクリルアミド 5%N
、N’−メチレンビスアクリルアミド(アクリルアミド
に対して) 2.7%過硫酸アンモニウム
0.07%N、N、N’、N、’−
テトラメチレンジアミン0.12%
緩衝液(pH7) 100mM界
面活性剤 0.1%水
バランス丁 7
表−2緩衝液組織
緩衝液(pH?) 100mM界
面活性剤 0.1%水
バランス実施例1
ホウレン草から分画したチラコイド膜懸濁液(クロロフ
ィルとして1.5mg/mj2濃度〉を6%直接ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけた。Table-1 Gel composition Acrylamide 5%N
, N'-Methylenebisacrylamide (relative to acrylamide) 2.7% ammonium persulfate 0.07% N,N,N',N,'-
Tetramethylenediamine 0.12% buffer (pH 7) 100mM surfactant 0.1% water
Balance Ding 7 Table-2 Buffer Tissue buffer (pH?) 100mM surfactant 0.1% water
Balance Example 1 A thylakoid membrane suspension (1.5 mg/mj2 concentration as chlorophyll) fractionated from spinach was directly subjected to 6% polyacrylamide gel electrophoresis.
チラコイド膵の可溶化および電気泳動は0℃で行った。Solubilization and electrophoresis of thylakoid pancreas was performed at 0°C.
その結果、5本(以後移動度の順にCF2、CF2、C
F2、CF2、CF2と略す)のシャープな緑色のクロ
ロフィルバンドと1木の幅広い遊離クロロフィルバンド
が得られた。5本のクロロフィルバンドを切り取り、切
り取ったそれぞれのバンドについて、SDSより強力な
蛋白質変性剤であるリチウムドデシル硫酸(以後1.、
D Sと略す)存在下でさらにポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行った。1.、 D Sはポリアクリルア
ミドに対して親和性(結合)を示すので、蛋白質を正常
に電気泳動させるため、ゲル組成および緩衝液組成中の
11136度はそれぞれ1%、0.4%とした。その結
甲、CPIとCe2では10〜13本の、Ce3では1
本の、Ce4では5〜6木の、Ce5では5本の主な蛋
白質ポリペプチドバンドが得られた。また切り取った5
本のクロロフィルハンドについて、再度
リアクリル電気泳動を行ったところ、Ce4以外のツレ
ぞれのクロロフィルは一本のバンドとして、−回目の電
気泳動と同じ移動度を示し、クロロフィルの解離は殆ん
ど認められなかった。即ち、本発明による方法で得られ
たクロロフィルバンドは、クロロフィル−蛋白質分子集
合体のバンドであり、さらに再度の電気泳動の結果から
明らかなように0℃において蛋白質分子集合体を変性さ
せないことがわかった。緑色植物の光合成の構造中位は
、これまでの研究で光化学系■、光化学系■、そして光
化学的に不活性な集光性クロロフィル−蛋白質複合体(
L l−I Cp )の3者に大別されている。As a result, 5 wires (CF2, CF2, C
A sharp green chlorophyll band (abbreviated as F2, CF2, CF2) and a broad free chlorophyll band were obtained. Five chlorophyll bands were cut out, and each band was treated with lithium dodecyl sulfate (hereinafter referred to as 1), which is a stronger protein denaturant than SDS.
Polyacrylamide gel electrophoresis was further performed in the presence of DS (abbreviated as DS). 1. , DS exhibits an affinity (binding) for polyacrylamide, so in order to perform normal electrophoresis of proteins, 11136 degrees in the gel composition and buffer composition were set to 1% and 0.4%, respectively. The tubercles are 10 to 13 in CPI and Ce2, and 1 in Ce3.
Five to six major protein polypeptide bands were obtained for Ce4 and five major protein polypeptide bands for Ce5. I cut it out again 5
When the chlorophyll hand in the book was subjected to rearyl electrophoresis again, the chlorophylls of each strand other than Ce4 showed the same mobility as a single band as in the -th electrophoresis, and almost no dissociation of chlorophyll was observed. I couldn't. That is, the chlorophyll band obtained by the method of the present invention is a band of a chlorophyll-protein molecule assembly, and furthermore, as is clear from the results of repeated electrophoresis, it has been found that the protein molecule assembly does not denature at 0°C. Ta. Previous research has shown that the structural intermediates of photosynthesis in green plants include the photosystem ■, the photosystem ■, and the photochemically inactive light-harvesting chlorophyll-protein complex (
It is roughly divided into three types: L l-I Cp).
(佐藤公行、“蛋白質・核酸・酵素、別冊N0121光
合成の機作゛′共立出版(] 979)、p、4O−5
1)光化学系■のクロロフィル−蛋白質分子集合体の構
築についてはよく研究されており([’:、 Hen乙
1nand N、Ne1son、 、J、 l1iol
、 Chem、、 252.4564−4569(19
77): 、J、E、Mullet、J、J、Bur
ke and C,,1,八rntzen。(Kiyuki Sato, “Proteins, Nucleic Acids, Enzymes, Separate Volume N0121 Mechanism of Photosynthesis” Kyoritsu Shuppan (] 979), p. 4O-5
1) The construction of the chlorophyll-protein molecular assembly of the photosystem has been well studied.
, Chem, 252.4564-4569 (19
77): , J.E., Mullet, J.J., Bur.
ke and C,,1,8rntzen.
Plant Physiol、、 15,814−
822 .823−827(1980)) 、本発明で
得られたCPIは蛋白質ポリペプチド鎮組成、クロロフ
ィルa/bl:ヒおよび吸収スペクトルの測定から、光
化学系Iのクロロフィル−蛋白質分子集合体であると確
認できた。Plant Physiol, 15,814-
822. 823-827 (1980)), the CPI obtained in the present invention was confirmed to be a chlorophyll-protein molecule assembly of photosystem I from the measurement of the protein polypeptide composition, chlorophyll a/bl:H, and absorption spectrum. Ta.
L HCPについては、これを構成するポリペプチド鎖
が1種(R,RlJ、Hoarau and 、1.
C1Leclerc。Regarding L HCP, there is one type of polypeptide chain that constitutes it (R, RlJ, Hoarau and 1.
C1 Leclerc.
Photochem、Photobiol、、 26
.151−158(1977) ;に、5atoh、P
lant Ce1l Physiol、。Photochem, Photobiol, 26
.. 151-158 (1977); 5atoh, P.
lant Ce1l Physiol.
20.499−512 (1979))であるとずる報
文と3〜5種(J、 、1. Burke、 K、 B
、 5teinback andC,,1,Arntz
en、 Plant Physiol、、 63.
237−2 4 3 (1979); B、Ande
rsson、J、M、八nderson andl、
、1.Ryrie、I!ur、 J、Biochem
、、1 2 3、465−472 (19B2> )で
あるとする報文が見られる。しかし本発明の結果からす
るとL HCPに相当するポリペプチド鎖は二種存在し
、ポリペプチド鎖数、クロロフィルa/b比そして吸収
スペクトル測定からCe3 が前者に、Ce5が後者に
対応すると考えられる。20.499-512 (1979)) and 3-5 types (J, , 1. Burke, K, B
, 5teinback and C,, 1, Arntz
Plant Physiol, 63.
237-2 4 3 (1979); B, Ande
rsson, J.M., anderson andl.
, 1. Ryrie, I! ur, J., Biochem.
, 1 2 3, 465-472 (19B2>). However, according to the results of the present invention, there are two types of polypeptide chains corresponding to L HCP, and based on the number of polypeptide chains, chlorophyll a/b ratio, and absorption spectrum measurements, it is thought that Ce3 corresponds to the former and Ce5 corresponds to the latter.
光化学系■については、現在のところ統一的な記述はな
いが、ポリペプチド組成からCe4が光化学系Hのクロ
ロフィル−蛋白質分子集合体である可能性が強い。Although there is currently no unified description of photosystem ①, there is a strong possibility that Ce4 is a chlorophyll-protein molecule assembly of photosystem H based on the polypeptide composition.
比較例1
実施例1の界面活性剤をL D Sに置き換えて、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ、全てのク
ロロフィルは一本の幅広いバンドとして泳動した。この
結果は全てのクロロフィルが蛋白質分子集合体から解離
したことを示している。又、染色によって検出した蛋白
質バンドの泳動パターンは、あらかじめ熱変性させた試
料に対する泳動パターンと同一であった。これは0℃に
おいてもL D Sによってクロロフィル−蛋白質分子
集合体が完全に変性していることを示すものである。Comparative Example 1 When polyacrylamide gel electrophoresis was performed by replacing the surfactant in Example 1 with LDS, all the chlorophylls migrated as one broad band. This result indicates that all chlorophyll was dissociated from the protein molecule assembly. Furthermore, the electrophoresis pattern of the protein band detected by staining was the same as the electrophoresis pattern for the sample that had been heat denatured in advance. This shows that the chlorophyll-protein molecular assembly is completely denatured by LDS even at 0°C.
L D Sの使用では、クロロフィル−蛋白質分子集合
体状態°(生の状態)での分離精製は不可能である。When using LDS, it is impossible to separate and purify the chlorophyll-protein molecule aggregate state (raw state).
比較例2
実施例1と同様の操作を25℃で行った。その結果3種
類のクロロフィル−蛋白質分子集合体として分離された
。実施例1で得られたクロロフィル−蛋白質分子集合体
CPIは全く変性され解離して、これに相当するクロロ
フィルバンドおよび蛋白質バンドは消失した。変性解離
したCPIはCe2とCe5の位置にほとんどが泳動し
ていた。Comparative Example 2 The same operation as in Example 1 was performed at 25°C. As a result, three types of chlorophyll-protein molecular aggregates were separated. The chlorophyll-protein molecular assembly CPI obtained in Example 1 was completely denatured and dissociated, and the corresponding chlorophyll band and protein band disappeared. Most of the denatured and dissociated CPI migrated at Ce2 and Ce5 positions.
即ち本操作によって得られるバンドは本来の姿から大き
く掛は離れたクロロフィル−蛋白質分子集合体の寄り集
まりといえる。従って純度よい分離精製は不可能である
。In other words, the band obtained by this operation can be said to be a collection of chlorophyll-protein molecular aggregates that are far removed from their original appearance. Therefore, separation and purification with high purity is impossible.
Claims (1)
キル基又はアルキルフェニル基であり、Mは窒素原子を
少なくとも1個以上有する陽イオンである)で示される
アニオン性界面活性剤の共存下、15℃以下でゲル電気
泳動を行うことを特徴とする生体膜蛋白質の分離精製法
。In the coexistence of an anionic surfactant represented by the general formula ROSO_3M (wherein R is an alkyl group or alkylphenyl group having 6 to 22 carbon atoms, and M is a cation having at least one nitrogen atom), A method for separating and purifying biological membrane proteins, characterized by performing gel electrophoresis at 15°C or lower.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60163230A JPS6222796A (en) | 1985-07-24 | 1985-07-24 | Separation and purification of biomembrane protein |
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6222796A true JPS6222796A (en) | 1987-01-30 |
JPH0529040B2 JPH0529040B2 (en) | 1993-04-28 |
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JP (1) | JPS6222796A (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111566210A (en) * | 2018-01-12 | 2020-08-21 | 安捷伦科技有限公司 | Use of trihydroxy and tetrahydroxy quaternary ammonium compounds as resolving agents for electrophoretic separations |
-
1985
- 1985-07-24 JP JP60163230A patent/JPS6222796A/en active Granted
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CN111566210A (en) * | 2018-01-12 | 2020-08-21 | 安捷伦科技有限公司 | Use of trihydroxy and tetrahydroxy quaternary ammonium compounds as resolving agents for electrophoretic separations |
JP2021510811A (en) * | 2018-01-12 | 2021-04-30 | アジレント・テクノロジーズ・インクAgilent Technologies, Inc. | Use of tri- and tetra-hydroxyl quaternary ammonium compounds as decomposition agents for electrophoresis separation |
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US11815488B2 (en) | 2018-01-12 | 2023-11-14 | Agilent Technologies, Inc. | Use of tri- and tetra-hydroxyl quaternary ammonium compounds as resolving agents for electrophoretic separations |
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---|---|
JPH0529040B2 (en) | 1993-04-28 |
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