【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
〔産業上の利用分野〕
本発明は、薬学、医学、工学等の各分野におい
て注目され、有用性が認められつつある生体膜蛋
白質を、生体機能を損うことなく分離精製する方
法に関するものである。
〔従来の技術〕
生体膜は、極性脂質と膜蛋白質を主成分として
構成されるものである。このうち、膜蛋白質が生
体機能を維持しているが、これは極性脂質、特に
その大部分を占めるリン膜質の２重膜中の挿入さ
れた状態にある。そこで、生体膜蛋白質、例えば
大腸菌外膜ポーリン、チトクロムb5、（Na+、
K+）−ATPase、（Ca2+）−ATPase、（H+）−
ATPaseなどを分離精製する場合には、これらの
多くがそれ自身難水溶性であり、水溶性球状蛋白
質とは異なるので、分離精製の第一段階として膜
蛋白質を可溶化する必要がある。
膜蛋白質の可溶化には、脂質二重層と類似の環
境を持つ媒質が必要であり、各種の有機溶媒、界
面活性剤水溶液が用いられている。有機溶媒の代
表例としてはアセトン、ブタノール、エタノール
およびピリジン等であり、界面活性剤としては、
ドデシル硫酸ナトリウムに代表されるアニオン性
界面活性剤、トリメチルドデシルアンモニウムク
ロリドに代表されるカチオン性界面活性剤、ポリ
オキシエチレンドデシルエーテルに代表される非
イオン性界面活性剤がある。
しかし有機溶媒の多くは蛋白質に対して強力な
変性剤として働くために、生体機能を損なうこと
なく膜蛋白質を分離精製することが困難になる場
合が多い。又、従来から生化学分野で用いられて
いるアニオン性界面活性剤の一つであるドデシル
硫酸ナトリウム（以後SDSと略称する）は強力な
蛋白質変性剤として働くので、この界面活性剤を
用いても生体機能を損なうことなく膜蛋白質を分
離精製するのが困難になる場合が多い。
そこで、蛋白質性能の低い非イオン性界面活性
剤を、可溶化のための媒質として用いることが試
みられている。しかし多くの非イオン性界面活性
剤は、臨界ミセル濃度が低く、分離精製後蛋白質
に結合した界面活性剤を、透析によつて除去する
ことが困難になるという欠点がある。
一方、蛋白質変性能の低いアニオン性界面活性
剤として、胆汁酸塩類を用いることは可能である
が、これらは生体界面活性剤物質に属するもので
高価であり、工業的に多量使用できないという致
命的欠陥がある。又、カチオン性界面活性剤は、
むしろ生体膜を構成する脂質との結合が他の界面
活性剤より強く、蛋白質に対する変性作用も弱く
ないので、殺菌剤として用いられることは多い
が、膜蛋白質の分離製に成功した例は少なく適用
範囲の広い界面活性剤とはいえない。
これらに対して、蛋白質自身の物理的化学的特
性に着目した分離精製法として、熱あるいはPH処
理法、分画沈澱法、吸脱着法、イオン交換体によ
るクロマトグラフイー法、等電点分画法、密度勾
配遠心法、電気泳動法、アフイニテイクロマトグ
ラフイー法、分子ふるい法、二層分配法、結晶化
法があるがこれらは、いずれも一長一短があつて
満足すべきものではなかつた。
〔発明が解決しようとする問題点〕
本発明は、生体膜蛋白質を変性させることなく
可溶化し、生体機能を損なうことなく、純度よく
分離精製する方法を提供するものである。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明は、対イオンとして分子内に少なくとも
１個の窒素原子を有する陽イオンをもつアルキル
（アルキルフエニル）硫酸エステル塩型アニオン
性界面活性剤の存在下、低温でゲル電気泳動を行
うと、特有な現象として上記の問題点を解消でき
るとの知見に基づくものである。
すなわち、本発明は、一般式ROSO3M（式中Ｒ
は炭素数６〜22のアルキル基又はアルキルフエニ
ル基であり、Ｍは窒素原子を少なくとも１個以上
有する陽イオンである）で示されるアニオン性界
面活性剤の共存下、15℃以下でゲル電気泳動を行
うことを特徴とする生体蛋白質の分離精製法を提
供する。
本発明で用いるアニオン性界面活性剤は上記一
般式で表わされるものであるが、式中、Ｒとして
は炭素数８〜16の直鎖状アルキル基又は炭素数６
〜14の分枝状アルキルフエニル基が好ましく、特
に好ましくは炭素数10〜14の直鎖状アルキル基又
は炭素数８〜12の分枝状アルキルフエニル基であ
る。一方、式中、Ｍとしてはアンモニウム又は炭
素数１〜６の炭化水素基を分子内に少なくとも１
個を有する第４級アンモニウム（各々、界面活性
能を有しないもの）が好ましい。Ｍとして具体的
には、アンモニウム、モノメチルアンモニウム、
ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウ
ム、テトラメチルアンモニウム、モノエチルアン
モニウム、ジエチルアンモニウム、トリエチルア
ンモニウム、テトラエチルアンモニウム、モノエ
タノールアンモニウム、ジエタノールアンモニウ
ム、トリエタノールアンモニウム、テトラエタノ
ールアンモニウム、トリス（ヒドロキシメチル）
メチルアンモニウム、トリス（ヒドロキシエチ
ル）メチルアンモニウム、モノイソプロパノール
アンモニウム、ジイソプロパノールアンモニウ
ム、トリイソプロパノールアンモニウム、テトラ
イソプロパノールアンモニウム、ピリジニウム、
モルホリニウムが例示される。
本発明のアニオン性界面活性剤として特に好ま
しくは、デシル硫酸、ドデシル硫酸、テトラデシ
ル硫酸、ヘキサデシル硫酸のトリス（ヒドロキシ
メチル）メチルアンモニウム塩、トリエタノール
アミン塩、トリイソプロパノールアミン塩であ
る。
尚、本発明で用いるアニオン性界面活性剤は、
式中Ｒの炭素数が６〜22である必要があるが、こ
れはＲの炭素数が未満の場合には界面活性能が劣
り、膜蛋白質を効率よく可溶化できないからであ
り、一方、炭素数が22を越えると水溶性が悪くな
り、目的を達することが困難になるからである。
本発明は、上記アニオン性界面活性剤の存在
下、15℃以下において、ゲル電気泳動法を用いる
ことを特徴とするものである。ゲル電気泳動法と
しては、公知の方法が使用されるが、次の方法に
よるのがよい。
(イ) ゲル電気泳動法の支持体
デンプンゲル、アガロースゲル、ポリアクリ
ルアミドゲルなどが使用できる。ポリアクリル
アミドゲルは化学的に安定なこと、ゲル濃度、
架橋度を自由にコントロールすることができる
こと、即ちポアサイズを目的に応じて自由に変
えられること、電気浸透性がなくPHおよび温度
変化による変形も少なく、自由な型に成型でき
ること及び再現性が非常によいことなど多くの
利点を有しているので好ましい。
(ロ) 装置と器具
ポリアクリルアミドゲルなどのゲルを支持す
る容器と、その両端に緩衝液を満たすための槽
を使用するのがよく、その容量、長さ等は分離
精製する蛋白質の種類、量により任意に設定す
ることができる。尚、ゲル電気泳動を０〜15℃
で行う場合には、空冷又は水冷装置を使用する
のが望ましい。
(ハ) 電源装置
直流電流を用い、定電流・定電圧発生装置を
用いると分離精製能およい再現性が向上するの
で特に好ましい。
(ニ) 泳動用ポリアクリルアミドゲルの調整
アクリルアミドを１〜30重量％、Ｎ，N′−
メチレンビスアクリルアミドをアクリルアミド
に対し0.05〜10重量％および本発明の界面活性
剤を０〜１重量％含有する水溶液を調製した
後、重合反応により上記水溶液をゲル化させて
用いるのがよい。好ましいゲル濃度は、アクリ
ルアミドとＮ，N′−メチレンビスアクリルア
ミドの総量が３〜15重量％（以下、％と略称す
る）でしかもＮ，N′−メチレンビスアクリル
アミドがアクリルアミドに対して１〜５％の範
囲である。又、界面活性剤濃度は0.05〜0.2％
が特に好ましい。なお上記水溶液に重合用触
媒、重合促進剤、PH緩衝剤、防腐剤等を混合し
てゲル化することも可能である。光重合用触媒
としてリボフラビンなどを、あるいはラジカル
重合用触媒として、過硫酸アンモニウムなどを
任意の量で、好ましくは0.04〜0.12％で使用で
きる。重合促進剤として、例えばＮ，Ｎ，N′，
N′−テトラメチルエチレンジアミンを任意の
量で、好ましくは0.03〜５％、特に好ましくは
0.03〜0.12％で使用することができる。溶存酸
素がゲル化を阻害する場合があるので、脱気あ
るいはゲル化時にアクリルアミド水溶液の上部
を水で覆い、空気を遮断するのが望ましい。PH
緩衝剤としては、本発明で用いるアニオン性界
面活性剤の対イオンＭと同一のイオン種を含む
ものが使用でき、目的とするPHでゲル電気泳動
をすることができる。又、リン酸ナトリウム系
などのPH緩衝剤も使用できるが、本来の効果は
減少する傾向にある。PH緩衝剤濃度は10〜500
ｍＭ、好ましくは50〜200ｍＭ、特に好ましく
は100ｍＭである。
(ホ) 分離精製時の温度及びPH
分離精製における温度は、０〜15℃が好まし
く、特に好ましくは０〜10℃であり、PHは４〜
９が好ましく、特に好ましくは７である。温度
が０℃より低くなるとゲル中の水分が凍る場合
があり、泳動が出来なくなり、又15℃を越える
と膜蛋白質集合体が変性し機能を損なう場合が
あるので好ましくないからである。又、PHが４
未満や９を越えると、酸・アルカリ変性が起き
る場合があり、やはり好ましくないからであ
る。本発明のアニオン性界面活性剤は、低温、
つまり0゜〜15℃で用いても析出することがない
ので、この温度でゲル電気泳動を行うと蛋白質
集合体の変性を抑えることができる。特に好ま
しくは０℃でゲル電気泳動を行うのがよい。
(ヘ) 緩衝液槽内の水溶液
泳動用ポリアクリルアミドゲルの両端を緩衝
液で満たすのがよい。この緩衝液は、ポリアク
リルアミドゲル作成用の水溶液に含まれる緩衝
剤、界面活性剤および水から構成される。緩衝
剤濃度は、ポリアクリルアミドゲル作成用水溶
液におけるものと同一であることが望ましい。
(ト) 分離精製される膜蛋白質を含む水溶液
本水溶液中には、膜蛋白質以外に本発明の界
面活性剤が0.01〜５％、好ましくは0.1〜３％、
特に好ましくは0.5〜２％含まれる。又、分離
精製能を向上させる目的でグリセリン等の粘稠
な液を１〜30％加えることができるが、好まし
くは５〜20％である。
又、この水溶液には、ゲルおよび緩衝液中の
緩衝剤を含むことができ、その濃度は、500ｍ
Ｍ以下でしかも緩衝液中の緩衝剤濃度如何であ
ることが好ましい。特に好ましくは緩衝液中の
緩衝剤濃度の1/2〜1/20の濃度である。
更にこの水溶液には、相対移動度を算出する
ため水溶性の陰イオン性染料、色素例えばブロ
モフエノールブルー等を、又、界面活性剤ミセ
ルの位置を示すために、ミセルに可溶で水不溶
性の色素、例えば油溶性色素であるイエロー
OB等を混合することも可能である。又、陽イ
オン性の色素、例えばマラカイトグリーン等は
ドデシル硫酸イオンと不溶性の複合体を作り、
ドデシル硫酸ミセルに可溶化されてミセルとと
もに泳動するのでミセルの移動度を求めるには
好都合である。これらの濃度は任意の範囲で使
用できるが、好ましくは前者の場合0.001〜
0.05％、後者の場合0.01〜0.5％である。
この水溶液を、泳動用ポリアクリルアミドゲ
ル上端部に置くことにより、電気泳動が開始さ
れる。膜蛋白質はゲル中でデイスク状に分離精
製される。デイスク状に分離された膜蛋白質は
染料によつて染色され、着色したバンドとして
認められる。ここで用いられる染料は、例えば
アミドブラツク、クマシーブリリアントブルー
などであり常法（例えば林勝哉著、瓜谷郁三・
志村憲助・中村道徳・船津勝二編集、“生化学
実験法−蛋白質の電気的性質”学会出版センタ
ー）に従つて膜蛋白質の分離精製の確認するこ
とができる。又、チラコイド膜蛋白質をクロロ
フイルを含むので染料による染色をなくして
も、緑色のバンドとして確認することができ
る。
(チ) 対象物
本発明の方法によつて分離精製できる対象物
は、動物臓器、培養細胞、微生物細胞、植物細
胞等から抽出、可溶化される生体膜蛋白質すべ
てを包含する。
(リ) 分離精製
可溶化された膜蛋白質成分すべてを含む上清
を、そのまま本発明の方法によつて分離精製す
ることができる。また、さらに可溶化液に対し
て除核酸等の通常行われる処理を施した溶液あ
るいはさらに分画沈澱、密度勾配遠心法等、目
的に応じて精製の初期段階を経た溶液を高度に
分離精製することも可能である。この場合、本
発明の分離精製を行う前段階の粗い分離精製に
おいては、膜蛋白質が生体機能を損なうことな
く又たとえ変性が生じても変性を引き起こす要
因を取り除いて可逆的に活性を取り戻させ得る
方法を採用するのが望ましい。以上のように本
発明による生体膜蛋白質の分離精製法は、あら
ゆる生体膜蛋白質に対し適用可能であるととも
にいずれの精製段階においても適用可能である
ので、商業上有利である。
〔発明の効果〕
(1) 本発明に用いるアニオン性界面活性剤は、胆
汁酸塩類とは異なり、工業的に安価でかつ容易
に合成されるので商業上有利である。
(2) 本発明に用いるアニオン性界面活性剤は低温
で析出することなく使用でき、膜蛋白質に作用
させるとそれらを構成する成分（サブユニツ
ト）に分解させない特性を有するので、生の状
態のまま分離精製できて有利である。
(3) 上記アニオン性界面活性剤によつて可溶化さ
れた膜蛋白質にはそれぞれ固有量のアニオン性
界面活性剤が結合しており、それぞれ異なる陰
電荷数を有する蛋白質−界面活性剤複合体とな
つている。これらが電気泳動支持体中を陽極に
向つてそれぞれ固有の速度で移動する。その際
支持体による分子ふるい効果も加わるので、単
なる分子ふるい効果しか期待できないゲル濾過
法に較べて、はるかに分離精製能が向上する。
(4) 界面活性剤で可溶化された膜蛋白質のゲル濾
過法による分離精製の第二の欠点は、大量の溶
媒が必要なことである。本発明による分離精製
法ではその必要がなく有利である。
(5) 非イオン性界面活性剤は臨界ミセル濃度が低
いため、膜蛋白質に結合した非イオン性界面活
性剤を透析によつて除去することが困難な場合
が多い。本発明による分離精製法では、使用す
る界面活性剤の臨界ミセル濃度が非イオン性界
面活性剤に較べ高いために透析、さらには電気
透析によつて容易に界面活性剤の除去がいおこ
なえる。
次に実施例により本発明を説明するが、本発明
はこれらに限定されるものではない。
〔実施例〕
ホウレン草チラコイド膜蛋白質に対し、本発明
による方法を適用したので以下に実施例、比較例
をあげて説明する。尚、ゲル電気泳動は下記のよ
うにして行つた。
Γゲル電気泳動
ゲル電気泳動は報文・成書に解説されている
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に準
じて行つた。〔例えば、J.V.Maizel、Jr.、
“Methods in Virology”、Academic Press.
（1971）、P.179：高木俊夫、三宅淳、“新実験化
学講座 20巻 生物化学（日本化学会編）”
丸善（1978）、P.109〕但し、SS結合解裂剤は
加えず、SDSを本発明における界面活性剤に、
又緩衝液は本発明における界面活性剤の対イオ
ンを含むものに読み替えた。ゲル組成、及び緩
衝液組成を表−１、表−２に示した。電気泳動
中のゲル内温度は、ゲルの周囲を氷泳で冷却す
ることにより、ほぼ０℃に制御した。
表−１ ゲル組成
アクリルアミド ５％
Ｎ，N′−メチレンビスアクリルアミド（アク
リルアミドに対して） 2.7％
過硫酸アンモニウム 0.07％
Ｎ，Ｎ，N′，N′−テトラメチルエチレンジアミ
ン 0.12％
緩衝液（PH７） 100ｍＭ
界面活性剤 0.1％
水 バランス
表−２ 緩衝液組織
緩衝液（PH７） 100ｍＭ
界面活性剤 0.1％
水 バランス
実施例 １
ホウレン草から分画したチラコイド膜懸濁液
（クロロフイルとして1.5mg／ml濃度）を６％の
[Field of Industrial Application] The present invention relates to a method for separating and purifying biological membrane proteins, which have been attracting attention and whose usefulness is being recognized in various fields such as pharmacy, medicine, and engineering, without impairing biological functions. be. [Prior Art] Biological membranes are composed mainly of polar lipids and membrane proteins. Among these, membrane proteins maintain biological functions, and these are inserted into the bilayer membrane of polar lipids, especially phosphorus membranes, which make up the majority of them. Therefore, biomembrane proteins such as E. coli outer membrane porin, cytochrome b 5 , (Na + ,
K + )−ATPase, (Ca 2+ )−ATPase, (H + )−
When separating and purifying ATPase, etc., it is necessary to solubilize membrane proteins as the first step of separation and purification, since many of these are poorly water-soluble and different from water-soluble globular proteins. Solubilization of membrane proteins requires a medium with an environment similar to that of a lipid bilayer, and various organic solvents and aqueous surfactant solutions are used. Representative examples of organic solvents include acetone, butanol, ethanol, and pyridine, and examples of surfactants include:
There are anionic surfactants represented by sodium dodecyl sulfate, cationic surfactants represented by trimethyldodecyl ammonium chloride, and nonionic surfactants represented by polyoxyethylene dodecyl ether. However, since many organic solvents act as strong denaturants for proteins, it is often difficult to separate and purify membrane proteins without impairing biological functions. In addition, sodium dodecyl sulfate (hereinafter abbreviated as SDS), an anionic surfactant traditionally used in the biochemical field, acts as a strong protein denaturant, so even if this surfactant is used, It is often difficult to separate and purify membrane proteins without impairing biological functions. Therefore, attempts have been made to use nonionic surfactants with low protein performance as media for solubilization. However, many nonionic surfactants have a drawback in that their critical micelle concentration is low, making it difficult to remove the surfactant bound to proteins by dialysis after separation and purification. On the other hand, it is possible to use bile salts as anionic surfactants with low protein denaturing properties, but these belong to biological surfactant substances, are expensive, and have the fatal disadvantage of not being able to be used in large quantities industrially. There is a flaw. In addition, cationic surfactants are
Rather, it is often used as a bactericidal agent because it has a stronger bond with the lipids that make up biological membranes than other surfactants and does not have a weak denaturing effect on proteins, but there are few cases where membrane proteins have been successfully isolated and applied. It cannot be said to be a broad-spectrum surfactant. In contrast, separation and purification methods that focus on the physical and chemical properties of proteins themselves include thermal or PH treatment methods, fractional precipitation methods, adsorption/desorption methods, chromatography methods using ion exchangers, and isoelectric point fractionation. method, density gradient centrifugation method, electrophoresis method, affinity chromatography method, molecular sieve method, two-layer partition method, and crystallization method, but all of these methods have advantages and disadvantages and are not satisfactory. [Problems to be Solved by the Invention] The present invention provides a method for solubilizing biological membrane proteins without denaturing them and separating and purifying them with high purity without impairing biological functions. [Means for Solving the Problems] The present invention provides an alkyl (alkyl phenyl) sulfate salt type anionic surfactant having a cation having at least one nitrogen atom in the molecule as a counter ion. This is based on the knowledge that performing gel electrophoresis at low temperatures can solve the above problems as a unique phenomenon. That is, the present invention provides the general formula ROSO 3 M (in the formula R
is an alkyl group or alkylphenyl group having 6 to 22 carbon atoms, and M is a cation having at least one nitrogen atom. Provided is a method for separating and purifying biological proteins, which is characterized by performing electrophoresis. The anionic surfactant used in the present invention is represented by the above general formula, where R is a linear alkyl group having 8 to 16 carbon atoms or 6 carbon atoms.
-14 branched alkyl phenyl groups are preferred, particularly preferred are linear alkyl groups having 10 to 14 carbon atoms or branched alkyl phenyl groups having 8 to 12 carbon atoms. On the other hand, in the formula, M represents at least one ammonium or a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms in the molecule.
Preferred is a quaternary ammonium having 1 or more (each without surface-active ability). Specifically, M includes ammonium, monomethylammonium,
Dimethylammonium, trimethylammonium, tetramethylammonium, monoethylammonium, diethylammonium, triethylammonium, tetraethylammonium, monoethanolammonium, diethanolammonium, triethanolammonium, tetraethanolammonium, tris(hydroxymethyl)
Methyl ammonium, tris(hydroxyethyl) methyl ammonium, monoisopropanol ammonium, diisopropanol ammonium, triisopropanol ammonium, tetraisopropanol ammonium, pyridinium,
An example is morpholinium. Particularly preferred as the anionic surfactant of the present invention are tris(hydroxymethyl)methylammonium salt, triethanolamine salt, and triisopropanolamine salt of decyl sulfate, dodecyl sulfate, tetradecyl sulfate, and hexadecyl sulfate. In addition, the anionic surfactant used in the present invention is
In the formula, the number of carbon atoms in R must be 6 to 22. This is because if the number of carbon atoms in R is less than 6 to 22, the surfactant ability will be poor and membrane proteins cannot be efficiently solubilized. This is because if the number exceeds 22, water solubility deteriorates, making it difficult to achieve the purpose. The present invention is characterized by using gel electrophoresis at 15° C. or lower in the presence of the above-mentioned anionic surfactant. Although known methods can be used for gel electrophoresis, the following method is preferred. (a) Support for gel electrophoresis Starch gel, agarose gel, polyacrylamide gel, etc. can be used. Polyacrylamide gel is chemically stable, gel concentration,
The degree of crosslinking can be freely controlled, that is, the pore size can be changed freely according to the purpose, there is no electroosmosis, there is little deformation due to pH and temperature changes, it can be molded into any mold, and it is highly reproducible. It is preferable because it has many advantages. (b) Apparatus and equipment It is best to use a container that supports a gel such as polyacrylamide gel and a tank that fills both ends with a buffer solution.The capacity and length of the container should be determined depending on the type and amount of the protein to be separated and purified. It can be set arbitrarily. In addition, gel electrophoresis was performed at 0 to 15℃.
When using air cooling, it is preferable to use air or water cooling equipment. (c) Power supply device It is particularly preferable to use a constant current/constant voltage generator using direct current because separation and purification performance and reproducibility are improved. (d) Preparation of polyacrylamide gel for electrophoresis 1 to 30% by weight of acrylamide, N, N'-
After preparing an aqueous solution containing 0.05 to 10% by weight of methylenebisacrylamide and 0 to 1% by weight of the surfactant of the present invention based on the acrylamide, it is preferable to use the aqueous solution by gelling it by a polymerization reaction. The preferred gel concentration is such that the total amount of acrylamide and N,N'-methylenebisacrylamide is 3 to 15% by weight (hereinafter abbreviated as %), and the N,N'-methylenebisacrylamide is 1 to 5% of the acrylamide. is within the range of Also, the surfactant concentration is 0.05-0.2%
is particularly preferred. Note that it is also possible to gel the aqueous solution by mixing a polymerization catalyst, a polymerization promoter, a PH buffer, a preservative, etc. with the aqueous solution. Riboflavin or the like can be used as a photopolymerization catalyst, or ammonium persulfate or the like can be used as a radical polymerization catalyst in any amount, preferably 0.04 to 0.12%. As a polymerization accelerator, for example, N, N, N',
N'-tetramethylethylenediamine in any amount, preferably 0.03 to 5%, particularly preferably
Can be used at 0.03-0.12%. Since dissolved oxygen may inhibit gelation, it is desirable to cover the top of the acrylamide aqueous solution with water to block air during degassing or gelation. PH
As the buffer, one containing the same ionic species as the counter ion M of the anionic surfactant used in the present invention can be used, and gel electrophoresis can be performed at the desired pH. PH buffers such as sodium phosphate may also be used, but their original effects tend to decrease. PH buffer concentration is 10-500
mM, preferably 50-200mM, particularly preferably 100mM. (E) Temperature and PH during separation and purification The temperature during separation and purification is preferably 0 to 15°C, particularly preferably 0 to 10°C, and the PH is 4 to 15°C.
9 is preferred, and 7 is particularly preferred. This is because if the temperature is lower than 0°C, the water in the gel may freeze, making migration impossible, and if it exceeds 15°C, membrane protein aggregates may denature and their functionality may be impaired, which is undesirable. Also, the PH is 4
If it is less than or exceeds 9, acid/alkali denaturation may occur, which is also undesirable. The anionic surfactant of the present invention can be used at low temperatures,
In other words, it does not precipitate even when used at 0° to 15°C, so performing gel electrophoresis at this temperature can suppress denaturation of protein aggregates. Particularly preferably, gel electrophoresis is performed at 0°C. (f) Aqueous solution in buffer tank It is best to fill both ends of the polyacrylamide gel for migration with buffer solution. This buffer solution is composed of a buffer, a surfactant, and water contained in an aqueous solution for producing polyacrylamide gel. The buffering agent concentration is preferably the same as that in the aqueous solution for preparing polyacrylamide gel. (G) Aqueous solution containing the membrane protein to be separated and purified. In addition to the membrane protein, this aqueous solution contains 0.01 to 5%, preferably 0.1 to 3%, of the surfactant of the present invention.
It is particularly preferably contained in an amount of 0.5 to 2%. Further, for the purpose of improving the separation and purification ability, a viscous liquid such as glycerin can be added in an amount of 1 to 30%, preferably 5 to 20%. The aqueous solution may also contain a gel and a buffer in a buffer solution, the concentration of which is 500 m
It is preferable that the concentration of the buffer is not more than M and the concentration of the buffer in the buffer solution is arbitrary. Particularly preferably, the concentration is 1/2 to 1/20 of the buffer concentration in the buffer solution. Furthermore, in this aqueous solution, a water-soluble anionic dye or dye such as bromophenol blue was added to calculate the relative mobility, and a water-insoluble dye soluble in the micelles was added to indicate the position of the surfactant micelles. Pigments, such as yellow, which is an oil-soluble dye
It is also possible to mix OB etc. In addition, cationic dyes such as malachite green form insoluble complexes with dodecyl sulfate ions,
It is convenient for determining the mobility of micelles because it is solubilized in dodecyl sulfate micelles and migrates with the micelles. These concentrations can be used in any range, but preferably from 0.001 to 0.001 in the former case.
0.05%, and in the latter case 0.01-0.5%. Electrophoresis is started by placing this aqueous solution on the upper end of the polyacrylamide gel for electrophoresis. Membrane proteins are separated and purified into discs in the gel. Membrane proteins separated into discs are stained with a dye and are recognized as colored bands. The dyes used here include, for example, Amido Black and Coomassie Brilliant Blue, and are conventional dyes (for example, Katsuya Hayashi, Ikuzo Uriya,
Separation and purification of membrane proteins can be confirmed according to "Biochemical Experimental Methods - Electrical Properties of Proteins" edited by Kensuke Shimura, Noriyoshi Nakamura, and Katsuji Funatsu (Society Publishing Center). Furthermore, since the thylakoid membrane protein contains chlorophyll, it can be confirmed as a green band even if staining with a dye is omitted. (h) Target Object Targets that can be separated and purified by the method of the present invention include all biological membrane proteins extracted and solubilized from animal organs, cultured cells, microbial cells, plant cells, and the like. (li) Separation and Purification The supernatant containing all the solubilized membrane protein components can be separated and purified as is by the method of the present invention. In addition, the solubilized solution can be subjected to conventional treatments such as nucleic acid removal, or the solution can be highly separated and purified through the initial stages of purification, such as fractional precipitation or density gradient centrifugation, depending on the purpose. It is also possible. In this case, in the rough separation and purification step prior to the separation and purification of the present invention, membrane proteins can be reversibly restored to their activity without impairing their biological functions and even if denaturation occurs, the factors that cause the denaturation are removed. It is desirable to adopt this method. As described above, the method for separating and purifying biological membrane proteins according to the present invention is commercially advantageous because it is applicable to all biological membrane proteins and can be applied at any purification stage. [Effects of the Invention] (1) Unlike bile salts, the anionic surfactant used in the present invention is commercially advantageous because it is industrially inexpensive and easily synthesized. (2) The anionic surfactant used in the present invention can be used at low temperatures without precipitating, and when it acts on membrane proteins, it has the property of not decomposing them into their constituent components (subunits), so they can be separated in their raw state. It is advantageous because it can be purified. (3) Each membrane protein solubilized by the anionic surfactant has a specific amount of anionic surfactant bound to it, and each protein-surfactant complex has a different number of negative charges. It's summery. They each move at their own speed through the electrophoretic support towards the anode. At this time, since the molecular sieving effect of the support is also added, the separation and purification ability is much improved compared to the gel filtration method, which can only expect a simple molecular sieving effect. (4) The second drawback of separating and purifying membrane proteins solubilized with surfactants by gel filtration is that a large amount of solvent is required. The separation and purification method according to the present invention is advantageous in that this is not necessary. (5) Because nonionic surfactants have a low critical micelle concentration, it is often difficult to remove nonionic surfactants bound to membrane proteins by dialysis. In the separation and purification method of the present invention, since the critical micelle concentration of the surfactant used is higher than that of nonionic surfactants, the surfactant can be easily removed by dialysis or even electrodialysis. Next, the present invention will be explained with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto. [Example] The method according to the present invention was applied to spinach thylakoid membrane protein, and will be described below with reference to Examples and Comparative Examples. Incidentally, gel electrophoresis was performed as follows. Gel electrophoresis Gel electrophoresis is explained in reports and books.
It was performed according to the SDS-polyacrylamide gel electrophoresis method. [For example, JVMaizel, Jr.
“Methods in Virology”, Academic Press.
(1971), P.179: Toshio Takagi, Jun Miyake, “New Experimental Chemistry Course Volume 20: Biological Chemistry (edited by the Chemical Society of Japan)”
Maruzen (1978), P.109] However, without adding the SS bond cleavage agent, SDS is used as the surfactant in the present invention,
In addition, the buffer solution was replaced with one containing the counter ion of the surfactant in the present invention. The gel composition and buffer composition are shown in Table-1 and Table-2. The internal temperature of the gel during electrophoresis was controlled to approximately 0° C. by cooling the surrounding area of the gel with ice swimming. Table-1 Gel composition Acrylamide 5% N,N'-methylenebisacrylamide (relative to acrylamide) 2.7% Ammonium persulfate 0.07% N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine 0.12% Buffer (PH7) 100mM Interface Active agent 0.1% Water Balance Table 2 Buffer tissue buffer (PH7) 100mM Surfactant 0.1% Water Balance Example 1 Thylakoid membrane suspension fractionated from spinach (1.5mg/ml concentration as chlorophyll) at 6% of
【式】で可溶
化し、直接ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
けた。チラコイド膜の可溶化および電気泳動は０
℃で行つた。その結果、５本（以後移動度の順に
CP1、CP2、CP3、CP4、CP5と略す）のシヤー
プな緑色のクロロフイルバンドと１本の幅広い遊
離クロロフイルバンドが得られた。５本のクロロ
フイルバンドを切り取り、切り取つたそれぞれの
バンドについて、SDSより強力な蛋白質変性剤で
あるリチウムドデシル硫酸（以後LDSと略す）
存在下でさらにポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行つた。LDSはポリアクリルアミドに対して
親和性（結合）を示すので、蛋白質に正常に電気
泳動させるため、ゲル組成および緩衝液組成中の
LDS濃度はそれぞれ１％、0.4％とした。その結
果、CP1とCP2では10〜13本の、CP3では１本
の、CP4では５〜６本の、CP5では５本の主な蛋
白質ポリペプチドバンドが得られた。また切り取
つた５本のクロロフイルバンドについて、再度It was solubilized using the formula and directly subjected to polyacrylamide gel electrophoresis. Solubilization and electrophoresis of thylakoid membranes are 0
I did it at ℃. As a result, five (hereinafter in order of mobility)
Sharp green chlorophyll bands (abbreviated as CP1, CP2, CP3, CP4, CP5) and one broad free chlorophyll band were obtained. Cut out the five chlorophyll bands and treat each band with lithium dodecyl sulfate (hereinafter abbreviated as LDS), which is a stronger protein denaturant than SDS.
Further polyacrylamide gel electrophoresis was performed in the presence of LDS exhibits affinity (binding) for polyacrylamide, so in order to perform normal electrophoresis on proteins, it is necessary to
The LDS concentrations were 1% and 0.4%, respectively. As a result, 10 to 13 major protein polypeptide bands were obtained for CP1 and CP2, 1 for CP3, 5 to 6 for CP4, and 5 for CP5. Also, regarding the five chlorophyll bands that were cut out,
【式】存在下
でポリアクリル電気泳動を行つたところ、CP4以
外のそれぞれのクロロフイルは一本のバンドとし
て、一回目の電気泳動と同じ移動度を示し、クロ
ロフイルの解離は殆んど認められなかつた。即
ち、本発明による方法で得られたクロロフイルバ
ンドは、クロロフイル−蛋白質分子集合体のバン
ドであり、さらに再度の電気泳動の結果から明ら
かなように０℃において蛋白質分子集合体を変性
させないことがわかつた。緑色植物の光合成の構
造単位は、これまでの研究で光化学系、光化学
系、そして光化学的に不活性な集光性クロロフ
イル−蛋白質複合体（LHCP）の３者に大別され
ている。（佐藤公行、“蛋白質・核酸・酵素、別冊
No.21光合成の機作”共立出版（1979）、p.40−51）
光化学系のクロロフイル−蛋白質分子集合体の
構築についてはよく研究されており（C.Bengin
and N.Nelson、J.Biol.Chem.、252、4564−4569
（1977）；J.E.Mullet、J.J.Burke and C.J.
Arntzen、Plant Physiol.、65、814−822、823−
827（1980））、本発明で得られたCP1は蛋白質ポリ
ペプチド鎖組成、クロロフイルａ／ｂ比および吸
収スペクトルの測定から、光化学系のクロロフ
イル−蛋白質分子集合体であると確認できた。
LHCPについては、これを構成するポリペプチ
ド鎖が１種（R.R.J.Hoarau and J.C.Leclerc、
Photochem.Photobiol.、26、151−158（1977）；
K.Satoh、Plant Cell Physiol.、20、499−512
（1979））であるとする報文と３〜５種（J.J.
Burke、K.E.Steinback and C.J.Arntzen、
Plant Physiol.、63、237−243（1979）；B.
Andersson、J.M.Anderson and I.J.Ryrie、Eur.
J.Biochem.、123、465−472（1982））であるとす
る報文が見られる。しかし本発明の結果からする
とLHCPに相当するポリペプチド鎖は二種存在
し、ポリペプチド鎖数、クロロフイルａ／ｂ比そ
して吸収スペクトル測定からCP3が前者に、CP5
が後者に対応すると考えられる。
光化学系については、現在のところ統一的な
記述はないが、ポリペプチド組成からCP4が光化
学系のクロロフイル−蛋白質分子集合体である
可能性が強い。
比較例 １
実施例１の界面活性剤をLDSに置き換えて、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行つたとこ
ろ、全てのクロロフイルは一本の幅広いバンドと
して泳動した。この結果は全てクロロフイルが蛋
白質分子集合体から解離したことを示している。
又、染色によつて検出した蛋白質バンドの泳動パ
ターンは、あらかじめ熱変性させた試料に対する
泳動パターンと同一であつた。これは０℃におい
てもLDSによつてクロロフイル−蛋白質分子集
合体が完全に変性していることを示すものであ
る。LDSの使用では、クロロフイル−蛋白質分
子集合体状態（生の状態）での分離精製は不可能
である。
比較例 ２
実施例１と同様の操作を25℃で行つた。その結
果を３種類のクロロフイル−蛋白質分子集合体と
して分離された。実施例１で得られたクロロフイ
ル−蛋白質分子集合体CP1は全く変性され解離し
て、これに相当するクロロフイルバンドおよび蛋
白質バンドは消失した。変性解離したCP1はCP2
とCP5の位置にほとんどが泳動していた。即ち本
操作によつて得られるバントは本来の姿から大き
く掛け離れたクロロフイル−蛋白質分子集合体の
寄り集まりといえる。従つて純度よい分離精製は
不可能である。When polyacrylic electrophoresis was performed in the presence of [Formula], each chlorophyll except CP4 showed the same mobility as the first electrophoresis as a single band, and almost no dissociation of chlorophyll was observed. Ta. That is, the chlorophyll band obtained by the method of the present invention is a band of a chlorophyll-protein molecule assembly, and as is clear from the results of repeated electrophoresis, the protein molecule assembly is not denatured at 0°C. Ta. Previous research has divided the structural units of photosynthesis in green plants into three groups: photosystems, photosystems, and photochemically inactive light-harvesting chlorophyll-protein complexes (LHCPs). (Kimiyuki Sato, “Proteins, Nucleic Acids, Enzymes, Special Edition
No.21 Mechanism of photosynthesis” Kyoritsu Shuppan (1979), p.40-51)
The construction of chlorophyll-protein molecular assemblies in photosystems has been well studied (C. Bengin
and N. Nelson, J. Biol. Chem., 252 , 4564−4569.
(1977); JEMullet, JJBurke and CJ
Arntzen, Plant Physiol., 65 , 814−822, 823−
827 (1980)), CP1 obtained in the present invention was confirmed to be a photochemical chlorophyll-protein molecule assembly from measurements of the protein polypeptide chain composition, chlorophyll a/b ratio, and absorption spectrum. Regarding LHCP, there is only one type of polypeptide chain (RRJHoarau and JCLeclerc,
Photochem.Photobiol., 26 , 151-158 (1977);
K. Satoh, Plant Cell Physiol., 20 , 499−512.
(1979)) and 3-5 types (JJ
Burke, K. E. Steinback and C. J. Arntzen,
Plant Physiol., 63 , 237-243 (1979); B.
Andersson, JMAnderson and IJRyrie, Eur.
J.Biochem., 123 , 465-472 (1982)). However, according to the results of the present invention, there are two types of polypeptide chains corresponding to LHCP, and CP3 is the former, and CP5 is the former based on the number of polypeptide chains, chlorophyll a/b ratio, and absorption spectrum measurements.
is considered to correspond to the latter. Although there is currently no unified description of the photosystem, there is a strong possibility that CP4 is a chlorophyll-protein molecule assembly of the photosystem based on the polypeptide composition. Comparative Example 1 The surfactant in Example 1 was replaced with LDS,
When polyacrylamide gel electrophoresis was performed, all chlorophylls migrated as one broad band. All of these results indicate that chlorophyll was dissociated from the protein molecule assembly.
Furthermore, the electrophoresis pattern of the protein band detected by staining was the same as the electrophoresis pattern for the sample that had been heat denatured in advance. This shows that the chlorophyll-protein molecular assembly is completely denatured by LDS even at 0°C. When using LDS, it is impossible to separate and purify the chlorophyll-protein molecule aggregate state (raw state). Comparative Example 2 The same operation as in Example 1 was carried out at 25°C. The results were separated into three types of chlorophyll-protein molecular aggregates. The chlorophyll-protein molecular assembly CP1 obtained in Example 1 was completely denatured and dissociated, and the corresponding chlorophyll band and protein band disappeared. Denatured and dissociated CP1 becomes CP2
and most of them migrated at the CP5 position. In other words, the bunt obtained by this operation can be said to be a collection of chlorophyll-protein molecular aggregates that differ greatly from their original appearance. Therefore, separation and purification with high purity is impossible.