JPS62190098A - 感光性化合物および光フィルター層を含む分析要素ならびにその使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、臨床化学に関し、更に詳しくは、多層分析要
素および臨床上重要な酵素検体、例えば、リパーゼ、タ
レアチンキナーゼまたはそのイソ酵素（イソエンチーム
）の測定方法に関する。

〔先行技術〕

化学的または生物学的物質（本明細書では検体とする）
の測定のための種々の流体の比色検定は、よく知られて
いる。このような検定は、人および動物の病気を迅速か
つ経済的に診断および治療するための医学および獣医学
の職業的努力として、臨床化学において特に重要である
。その結果として、研究者は絶えず、このような検定を
行なうためのさらに高感度でありより費用の少ない方法
を探究している。

かかる臨床化学技術に対する比較的最近の貢献は、例え
ば米国特許第３．９９２．１５８号および同第４．１４
４，３０６号に開示されているものの如き、薄膜多層分
析要素の開発であった。これらの要素は、一般に、非多
孔質支持体上に設けられた多孔質展開層、試薬層および
記録層を有すると記載されている。支持体は、特定の波
長で検出し得る種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の測定を容易にす
るために、入射輻射線（又は放射線）の全部または一部
を通過するよう設計されている。

この技術における他の重要な進歩は、米国特許第４．０
８９，７４７号に記載されている。この文献には、過酸
化水素または、検体の存在の結果として過酸化水素が発
生するグルコース、尿酸および他の検体用の検定に非常
に有用になって来ている、ある種のトリアリールイミダ
ゾールロイコ染料が記載されている。

ヒトの血清中のクレアチンキナーゼ（本明細書ではＣＫ
と略記する、しかし、タレアチンホスホキナーゼＣＰＫ
またはＡＴＰ：クレアチンホスホトランスフェラーゼＥ
、Ｃ，２，７，３，２，としても知られている）の活性
の測定は、青筋の疾患および心筋の疾患の診断のための
最も高感度のある実験室的方法の１つと考えられている
。ＣＫの測定は、例えば、進行性筋ジストロフィー、皮
膚筋炎および特に心筋梗塞に有用である。ＣＫの３つの
イソ酵素の１つであるＣＫ−ＭＢの測定は、心臓梗塞の
場合での心臓に対する損傷の評価のために重要である。

クレアチンキナーゼを含む多くの検体の最も標準的な検
定は、一般に光吸収における変化を測定する。試験試料
上の光入射は、光学装置および使用する方法に依存し、
広帯域輻射線または透過輻射線である。

〔解決すべき問題点〕

しかしながら、このような検定に使用されるある種の化
合物は、感光性即ちこれら化合物は光に応答して早過ぎ
る変化を起したり、または変化を促進させたりする。特
に、検定に有用なある染料または染料プレカーサー（例
えば、上記トリアリールイミダゾールロイコ染料）は、
ＣＫまたは他の酵素のための検定を含む種々の検定で望
ましくない感光性を示す、その結果として、該染料また
はそのプレカーサーは、検定において、望ましくない光
学濃度の変化および高割合（ｈｉｇｈ　ｒａｔｅ）のバ
ックグランド生成を与えるのが早過ぎる。換言すれば、
望ましくない検出可能な割合変化がある。

この問題は、検体からの応答が望ましくないバックグラ
ンドよりもはるかに大きいために、高濃度で存在する検
体の検定においては認められない。

しかしながら、この問題は、検体が比較的低濃度で存在
する場合には顕著になってくる。高割合又は高速度での
バックグランド生成は、検定感度および精度を著しく低
下させる。

多（の感光性染料および染料プレカーサーが低レベルの
検体の検定に有用であるが、これらの使用はその感光性
のために制限される。

ｃ問題を解決する手段〕 上記の問題は、臨床上重要な酵素検体に応答する検出可
能な光学濃度の変化を与えることができる感光性化合物
を含有する分析要素によって克服される。

この要素は、また、少なくとも１種のフィルター染料（
又は色素）を含み、濃度変化を検出するための入射輻射
線が、感光性化合物上に入射する前に、フィルター層を
通過するように要素中に位。

置されたフィルター層を有する。さらに、臨床上重要な
酵素検体の測定方法は、 Ａ、臨床上重要な酵素検体を含むと思われる液体の試料
を、検体に応答して検出可能な光学濃度変化を与えるこ
とができる感光性化合物を含有し、また、少なくとも１
種のフィルター染料からなり、濃度変化を検出するため
の入射輻射線が感光性化合物上に入射する前にフィルタ
ー層を通過するように要素中に位置されたフィルター層
を有する分析要素と接触せしめ、そして、 Ｂ、検体の存在によって生ずる光学濃度の変化を測定す
る、 ことを含んでなる。

以下ｇ、白 〔実施態様〕 本発明は、分光光度的に測定することができる広範囲の
臨床上重要な酵素検体のあらゆるものの測定（定性また
は定量測定）に関する。このような検体は、一般に、試
験流体中に低レベル、例えば、１５０１．Ｕ、／ｄ！未
満、特に５０１．Ｕ、／ｄ１未満で存在する。これらに
は、クレアチンキナーゼまたはそのイソ酵素、リパーゼ
、ラクテートデヒドロゲナーゼ、アルドラーゼ、トラン
スアミナーゼ、および当業者に知られている他のものが
含まれる。

本発明は、水性液体中の全クレアチンキナーゼまたはク
レアチンキナーゼイソ酵素の比色測定に特に有用である
。

本発明は、あらゆる水性流体を検定するために使用する
ことができる。それは、特に動物または人の生物学的流
体の検定に有用である。このような流体には、全血液、
血漿、血清、リンパ液、胆汁、尿、背髄液、唾液、汗、
便分泌物などが含まれるが、これらに限定されるもので
はない。また、骨動、心臓、腎臓、肺臓、脳、骨髄また
は皮膚の如き大または動物組織の流体標本を検定するこ
とも可能である。本発明の好ましい用途は、ヒト血清中
の検体を測定することである。試験試料は稀釈するかま
たは稀釈しないでできる。

好適な実施態様において、本発明は、ＣＫ−ＭＭおよび
ＣＫ−ＢＢも含有する可能性のある生物学的流体中のク
レアチンキナーゼ、例えば、クレアチンキナーゼ−ＭＢ
のイソ酵素を選択的に測定するための免疫化学的方法に
関する。他のイソ酵素も同様に測定することができる。

一般に、本発明の方法は、検定されるべき液体を本発明
の分析要素と適当に接触させることからなり、その詳細
は以下に述べる。この接触の前または接触と同時にイソ
酵素の検定のために、液体試料を、関心のないイソ酵素
−例えば、試料中に存在するＣＫ−ＭＭおよびＣＫ−Ｍ
Ｂイソ酵素中のＭサブユニット−と優先的に反応するか
、または関心のないイソ酵素の酵素活性を抑制すること
のできる１種または２種以上の抗体と接触させる。この
例において、ＣＫ−ＭＢイソ酵素のＢサブユニットは、
抗体の存在によって理想的に影響されず、そのために、
検出可能な光学濃度の変化を生ずる多くの反応系列にお
いて反応しない。ＣＫ−ＢＢの量は、一般的にこのよう
な検定において無視し得ると考えられる。それで、生じ
た濃度変化は、流体試料中のＣＫ−ＭＢイソ酵素の量に
直接関係している。

本発明の方法は、検体を、濃度変化を生ずるに十分な試
薬と接触または混合した時、検体の存在の結果として生
ずる光学濃度の変化を測定することによって行なわれる
。ある場谷には、ここに記載した感光染料（又は色素）
または染料プレカーサーのみが、光学濃度の変化を与え
るために必要である。好ましい態様において、追加の試
薬は、１つまたは２つ以上の反応を通して、検体の存在
下に光学濃度の変化を与える相互作用組成物の形で要素
中に存在する。

望ましくない感光効果に関係なく、本発明の方法で使用
することのできる感光性化合物には、電磁輻射線に応答
して、ある方法で変化する有機または無機化合物が含ま
れる。例えば、この化合物は、入射輻射線を伴なう光学
濃度中で変化する感光性染料または染料プレカーサーで
ある。また、この化合物は、電磁輻射線に応答して、変
化し、反応しまたは変化をひき起こす電子移動剤、補足
因子、基質、緩衝剤、活性化剤、抗酸化剤等である。

本発明の実施に有用な感光性染料または染料プレカーサ
ーには、検出のための特徴ある波長を吸収または発生す
る能力を有する全ての有機化合物、または、そのような
種に転換し得る全ての有機化合物が含まれる。これらの
物質は、逆に、！磁軸射線、特に２００〜７００し請の
範囲内の電磁スペクトルに対し感光性であり、この輻射
線に応答して光学濃度の変化を示す。

有用な感光性染料およびプレカーサーの種類には、シア
ニン、アロポーラ−シアニン、トリアリールメタンおよ
びイミダゾール、特に、上記米国特許第４．０８９，７
４７号、ヨーロッパ特許出願第１２２．６４１号および
日本特許公報５８−４５．５５７号に記載されているよ
うなジーおよびトリアリールイミダゾールロイコ染料が
含まれる。米国特許第４．０８９．７４７号のトリアリ
ールイミダゾールロイコ染料は、本発明の実施に好まし
い。

本発明の詳細の残りの部分は、それをタレアチンキナー
ゼまたはそのイソ酵素の検定に応用したとき示す。しか
しながら、本発明は、これら実施態様の範囲に限定され
ない。

タレアチンキナーゼの測定のための濃度ｉ化は、分光光
度的に検出され、クレアチンホスフェートの反応または
反応（１）に従う進行方向におけるその反応生成物から
得られる光学濃度を意味する。

この最も簡単な形において、検定はクレアチンホスフェ
ートの消失またはクレアチンの出現のいずれかを測定で
きる。

しかしながら、一般に、反応（１）は、ＡＴＰまたはそ
の反応生成物のさらに次の反応の結果として光学濃度の
変化を与える１つまたは２つ以上の他の酵素反応と組み
合わせられる。光学濃度の変化は比色的、螢光光度的、
測光的であり、無色から着色への変化、着色から無色へ
の変化、光学濃度における増加または減少のレートの変
化、または、１つの波長から他の波長への吸収のシフト
のいずれかである。

さらに特に、全ＣＫまたはイソ酵素、例えばＣＫ−ＭＢ
は、比色法によって測定され、光学濃度の変化は２００
と９００ｎｍの間の波長で測定される。

この実施態様において、光学濃度の変化は、検体と相互
作用組成物との反応の副生物と反応する感光性染料また
は染料プレカーサーによって与えられる。

本発明の好ましい実施態様において、全ＣＫまたはＣＫ
−ＭＢ活性は、次の一連の反応によって（１）　クレア
チンホスフェート十ＡＤＰ−→クレアチン＋ＡＴＰ Ｌ−α−グリセロホスフェート＋ＡＤＰ（３）Ｌ−α−
グリセロホスフェート＋電子受容体ジヒドロキシアセト
ンホスフェート＋中間体種（例えばＨ，Ｏ□） （４）中間体種子感光性染料または染料プレカーサー　
　　　　比色法的測定可能種 この好ましい実施態様の実施における全タレアチンキナ
ーゼまたはそのイソ酵素の定量化は、電子受容体として
の酸素、過酸化活性を有する物質および感光性色原体を
使用して達成される。このような場合に、反応（３）で
は、ジヒドロキシアセトンホスフェートおよび過酸化水
素が生成する。

この一連の反応の詳細は米国特許第４．５４７．４６１
号に記載されている。

有用な過酸化性物質にはパーオキシダーゼ（天然に存在
するものおよび合成のものの両方）が含まれる。パーオ
キシダーゼは、過酸化水素が他の物質を酸化する反応に
触媒作用をする酵素である。

パーオキシダーゼは一般に、鉄ポルフィリンを含む複合
蛋白質である。パーオキシダーゼはセイヨウワサビ（ｈ
ｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）、ポテト、イチジク樹液および
カブ中に（植物パーオキシダーゼ）、牛乳中に（ラクト
パーオキシダーゼ）並びに白血球中に（ベルドパーオキ
シダーゼ）存在する。それは微生物中にも存在し、発酵
によって生成され得る。

好ましいパーオキシダーゼはセイヨウワサビから得られ
るものである。

本発明において有用な過酸化水素およびパーオキシダー
ゼの存在下に色生成をもたらす感光性色原体は前に記載
されている。ロイコ染料は、上記引用例に記載されたも
のを含んでいて特に有用である。特に有用なロイコ染料
には、２−（３，５−シメトキシー４−ヒドロキシフェ
ニル）−４゜５−ビス（４−ジメチル−アミノフェニル
）イミダゾール、２−　（４−ヒドロキシ−３−メトキ
シフェニル）−４，５−ビス（ｐ−ジメチルアミノフェ
ニル）−１Ｈ−イミダゾール、２−（３−エトキシ−４
−ヒドロキシフェニル−４，５−ビス（ｐ−ジメチルア
ミノフェニル）−１Ｈ−イミダゾール、２−（４−ヒド
ロキシ−３，５−ジメトキシフェニル”）−４−（４−
（ジメチルアミノ）−フェニル）−５−（２−フリル）
イミダゾール、２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメト
キシフェニル）−４，５−ジ（２−フリル）イミダゾー
ル、２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニ
ル）−４−（４−（ジメチルアミノ）フェニル〕−５−
フェネチルイミダゾールおよび２−（３゜５−ジメトキ
シ−４−ヒドロキシフェニル）−４−（４−（ジメチル
アミノ）フェニル〕−５−ベンジルイミダゾールなどが
含まれる。

感光性染料または染料プレカーサーを含む、本発明の実
施に有用な試薬、基質および酵素の量は、試料中の酵素
検体（例えば、タレアチンキナーゼまたはイソ酵素）の
広範囲の濃度、検出装置の性能および生ずる検出可能な
変化に依存する。その量は、上記引用例の教示を有する
臨床化学における当業者によって容易に測定できる。

本発明の分析要素には、ＣＫ活性化剤、アデニル酸キナ
ーゼ抑制剤、金属イオン補足因子（例えば、マグネシウ
ム、カルシウムおよび鉄イオン）、溶剤、緩衝剤または
界面活性剤を含む、全ＣＫまたはＣＫイソ酵素測定に一
般に使用される他の試薬または付加物もまた含まれ得る
。全タレアチンキナーゼ活性を促進する１種または２種
以上のＣＫ活性化剤を含むことが、特に望ましい。この
ような活性化剤には、チオグルコース、ジチオスレイト
ール、ジチオエリスリト・−ル、メルカプトエタノール
、グルタチオン、Ｎ−アセチルシスティン、システィン
、チオグリセロールおよびチオグリコール酸の如きメル
カプト含有化合物（チオール含有またはスルフヒドリル
化合物）が、臨床化学における当業者に公知の量で含ま
れる。

ＣＫイソ酵素を測定するための、本発明の実施に有用な
抗体はＢまたはＭサブユニットのいずれかに特有であり
、公知の方法を使用する抗血清から生ずる。この抗体は
一般に、適当な担体上で使用される。本発明の検定にお
いて、１種または２種以上の抗体は、所望により追加の
担体物質なしに要素自体の中に固定されるか、または、
検定の間要素に試験試料を加える前かもしくは試料と同
時に加えることができる。ＣＫ−ＭＢ測定用に有用な抗
体および担体物質のさらに詳細なことは、例えば、米国
特許第４．２３７．０４４号および同第４．２６０．６
７８号中に与えられている。

本発明の要素は、少なくとも２層からなり、自己支持性
、即ち、検定の間元のままに留めるに十分な全体強度を
有するものである。さらに一般的には、それは、本明細
書に記載した感光性化合物を含有する第１の層とフィル
ター層とをその上に有する非多孔質支持体からなる。感
光性化合物を含有する層は、一般に、該化合物が分布し
ている１種または２種以上のバインダー物質からなる。

有用なバインダー物質は当業者に知られており、硬化も
しくは未硬化ゼラチンならびに他のコロイド物質、ポリ
サンカライドまたは天然ならびに合成ポリマーが含まれ
る。

その代わりに、感光性化合物は、要素の多孔質展開層（
上記した）中にあってもよい。

同様に、フィルター層は１種または２種以上のバインダ
ー物質中の１種または２種以上のフィルター染料（又は
色素）を含有する。使用されるフィルター染料は、その
バインダー中の溶解度、その吸光係数、吸収する波長お
よび当業者に公知の他のパラメータを基に選択される。

さらに特に、フィルター染料は感光性化合物に不利に影
響する輻射線を透過するよう選択され、該化合物が感受
性でない輻射線を透過しない。このような染料の混合物
が、所望の波長を吸収するために使用される。好ましい
実施態様において、フィルター染料は５００ｎｍより短
い波長を有する輻射線を取り除く。

有用な染料の例は、当該技術で公知の分散繊維染料、紫
外線吸収剤である。有用なフィルター染料の例には、Ｃ
，１，Ｄｉｓｐｅｒｓｅ　Ｒｅｄ　１３７、Ｃ，１，Ｄ
ｉｓｐｅｒｓｅＹｅｌｌｏｗ　５、Ｃ，１，Ｄｉｓｐｅ
ｒｓｅ　Ｏｒａｎｇｅ　３および２．２′−ジヒドロキ
シ−４，４′−ジメトキシベンゾフェノンおよび当該技
術で公知の他のものが含まれる。これらの染料は全て商
業的に利用可能である。

フィルター層中のフィルター染料の量は、当業者によっ
て容易に決定できる。使用される各染料の量は、染料の
吸光係数、使用されるバインダー中のその溶解度および
所望の波長を吸収するに必要な割合に依存する。これら
の量は、日常の実験で決定できる。

フィルター染料は、それを溶解し、要素に適当に通用さ
れるか他の方法で取り込まれる適当なバインダー物質中
で使用できる。一般に、バインダーは、合成または天然
の重合体またはコロイド状物質、例えば、ゼラチン、寒
天、コラーゲン、セルロースエステル（セルロースアセ
テートの如キ）、ポリスチレン、ポリウレタンまたはポ
リカーボネートである。

また、フィルター層は非多孔質支持体としても機能する
。フィルター層の唯一の重要な点は、それが感光性化合
物との関係で、光学濃度変化を検出するために使用され
る入射輻射線が感光性化合物に到達する前にフィルター
層を通過するように位置していることである。フィルタ
ー層は、他の層の調製と同時に要素中に取り込まれ得る
。その代わりに、他の層が最初に調製され、卓の後でフ
ィルター層がある方法、例えば、コーティングまたはラ
ミネーションによってそれに適用されることもできる。

さらに好ましくは、要素には最外層として多孔質展開層
も含まれる。イソ酵素測定のための試薬および／または
抗体は、吸収、浸透、コーティングまたは他の適当な技
術によって多孔質展開層中に取り込まれ得る。一般に、
抗体は既に被覆された層に吸収またはウオツシュコーテ
イングによって取り込まれるので、それらは被覆組成物
中に取り込まれる。多孔質展開層を作るための有用な吸
収性物質は、水または全血液または血清の如き生物学的
流体にさらされた時に、不溶性でありその元の構造を維
持している。有用な要素は、紙、多孔質微粒子構造物、
多孔質ポリマーフィルム、セルロース、木材、ガラス繊
維、編織および不織繊維製品（合成および非合成）なら
びに類似物から調製された展開層を有する。このような
層を作るための有用な物質および方法は当該技術でよく
知られている。

例えば、多孔質展開層は、米国特許第４．２９２．２７
２号、同第３．９９２．１５８号、同第４，２５８．０
０１号、同第４．４３０．４３６号および日本特許公報
５７−１０１７６０号に記載されたものを含む、適当な
繊維性もしくは非繊維性物質またはそのいずれかもしく
は両者の混合物から調製される。展開層は、多孔性が、
粒子、繊維または重合体ストランドの間の相互連結空間
または空孔によって生じた時、層中で各方向に同一であ
ることを意味する、等方性多孔質でな（ではならない。

支持体は、適当な、方向的に安定で非多孔質で、好まし
くは、２００ｎｍと９００ｎＩＩ＋の間の波長の電磁輻
射線を透過する透明（即ち、輻射線透過性）な物質であ
る。特定の要素のために選択する支持体は、意図する検
出方式（反射、透過または螢光分光）に適合させねばな
らない。有用な支持体は、紙、金属箔、ポリスチレン、
ポリエステル、ポリカーボネートまたはセルロースエス
テルから作ることができる。

本発明の要素は、多孔質展開層の下に記録層または試薬
層を有することができる。これらの層は、界面活性剤ま
たは緩衝剤の如き検定のために必要とされる１種または
２種以上の試薬または酵素を含有し得る。これらは、−
ｍに１種または２種以上の親水性バインダー物質（例え
ば、処理もしくは未処理ゼラチンおよび他のコロイド状
物質、ポリサッカライド、ビニルピロリドンポリマーま
たはアクリルアミドポリマー）を含有する。他のバイン
ダー物質の例は、当業者に公知である。好ましくは、こ
の層は標準硬化剤で硬化されたゼラチンを含有する。

要素は、１つまたは２つ以上の他の層、例えば追加の展
開層、放射線遮蔽もしくは透過層、下塗り層またはバリ
ヤ一層を有することができる。これらの層は互に、一般
に、流体、試薬および反応生成物が流体によって隣接層
の重なり合った帯域の間を通過または移動することを意
味する、流体接触の状態にある。

本発明の好ましい実施態様は、その片側面上に、次の順
序で流体接触で、本明細書に記載された感光性染料プレ
カーサー（ロイコ染料）および任意に他の試薬を含有す
る記録層、クレアチンホスフェート、ＡＭＰ　、ＡＤＰ
および他の所望の試薬を含有する試薬層、任意の下塗り
層および任意のＣＫ活性化剤もしくは少なくとも、１種
のＣＫのＭサブユニットのための抗体または両者を含有
する多孔質展開層を有する支持体からなるＣＫ−ＭＢを
測定するために有用な多層要素である。下塗り層は当業
者に公知の１種または２種以上の下塗り物質、例えば、
ビニルピロリドンまたはアクリルアミドポリマーからな
り得る。

上記の好ましい感光性染料プレカーサーが使用されると
き、記録層はまた、α−グリセロホスフェートオキシダ
ーゼを含み、試薬層はまた、グリセロールおよびグリセ
ロールキナーゼを含む。

支持体の他の側面には、上記の、入射光が記録層上に入
射する前に通過するフィルター層がある。

種々の異なった要素が、検定の方法に依存して、本発明
に従って調製できる。要素は、所望の幅の細長いテープ
、シート、スライドまたはチップを含む種々の形に形成
できる。

本発明の検定は、手動または自動でできる。一般に、乾
式要素を使用する場合は、検体測定は、供給ロール、チ
ップ包みまたは他の源から要素を取り出し、それを試験
すべき液体の試料（２００μｌまで）と物理的に接触さ
せ、そうして試料を要素中の試薬と混合することによっ
て行なわれる。このような接触は、あらゆる適当な方法
、例えば要素を試料中に浸漬することによって、好まし
くは、手動または機械により、適当な分配具を使用して
試料の滴で要素にスポット付けすることにより達成でき
る。

試料を適用した後、要素を、試験結果を得るのを促進ま
たは他のやり方で容易にするために望ましい、培養、加
熱または類似手段のような條件下に露出する。

ＣＫまたはイソ酵素の場合には、試験試料中のＣＫまた
はイソ酵素は、ＡＤＰとクレアチンホスフェート基質と
の反応に試料中に存在する検体の量に基くレートで触媒
作用をする。クレアチンホスフェートの反応または反応
生成（例えば、ＡＴＰ）の生成のいずれかに基く光学濃
度の変化（例えば、染料生成）のレートは、要素を通過
し、適当な反射または透過分光光度検出装置が存在する
帯域に達することによって定量可能である。適当な検出
装置および方法は当該技術で公知である。

本開示および特許請求の範囲に関して使用されるとき、
ｒ、ｕ、は、１　［０，が酵素のための標準のｐＨおよ
び温度條件下で１分間当り１マイクロモルの基質の転化
を触媒作用するに必要な酵素活性の量であるとして定義
される、酵素活性のための国際単位を表わす。

これらの実施例で、光学濃度における望ましくない変化
割合の量は、本発明の要素で測定した。

ＣＫ−ＭＢも貯蔵したヒト血清中でこの要素を使用して
測定した。本発明の検定は、本発明の範囲外である公知
の分析要素で行なわれた検定と比較した。

この比較で使用された要素は、下記に示す一般的な形式
および成分を有していた。しかしながら、対照要素はフ
ィルター層を持っていなかった。これらは、展開層中に
抗−ＣＫ−ＭＭ抗体も含有されているほかは、上記米国
特許第４，５４７，４６１号に記載された要素と同様に
調製した。本発明の要素。

は、下記に示す組成を有し、支持体の裏面に被覆された
フィルター層から成っていた。

ヤギ抗−ヒトＣＫ−ＭＭ　　　２２．９００Ｕ／ｎ？”
Ｔｉ１ｔ　　　　　　　　　　　　　　５０　ｇ　／　
ｎ？ナセルースアセテート　　　　　７ｇ／ボ展開Ｊｉ
　　　ＢＳＴＡＮＥ　５７１５樹脂　　　　　　２．５
　ｇ　／　ｒｄＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−４０５界面活性剤　
　１．７　ｇ　／　ｇゼラチン（硬化）　　　　　　　
　５．４ｇ／ｒｒｒ酢酸マグネシウム　　　　　　０．
６５　ｇ　／ボ試薬層ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−２００Ｂ界面
活性剤　　０．１１ｇ／ｎ（グリセロールキナーゼ　　
　４３２０１．Ｕ、／　ｒｒＩクレアチンホスフェート
　　　１．６ｇ／％グリセロール　　　　　　　　０．
２ｇ／耐ゼラチン（硬化）　　　　　　　　５．４　ｇ
　／　ｎ（ＡＬＫＡＮＯＬ　ＸＣ界面活性剤　　　０．
３ｇ／ｍ記録層　　パーオキシダーゼ　　　　３２，４
００１．Ｕ、／ｒｒｒアスコルビン酸オキシ ダーゼ　　　　　　　１０，８００１．Ｌｌ、　／　ｍ
Ｌ−α−グリセロホス フェートオキシダーゼ　３．２４０１．υ、／ｒｒｌグ
リコール酸　　　　　　　　０．３ｇ／ｍ５．５−ジメ
チル−１，３ 一シクロヘキサンジオン　　０．０５　ｇ　／　ｇＴＲ
ＩＴＯＮ　Ｘ−２００Ｅ界面活性剤　　０．１　ｇ　／
　ｒｄポリ　（エチレンテレフタレート） る単位（Ｕ）で与えられる：　（５０％抑制力価）　（
ｄｌｏ、０９３ｒｒ？）　＝　Ｕ／　ｒｄ。

本発明の要素は、支持体の他の要素層の反対側面に隣接
して被覆されたフィルター層からなる。

このフィルター層には、次の物質が含まれている：酢酸
セルロースバインダー（１０，７ｇ　／　ｒｒｒ）、Ｕ
ＶｌＮ０Ｌ　４９０紫外線フイルター染料（０，３ｇ　
／　ｍ）、Ｃ，１，Ｄｉｓｐｅｒｓｅ　Ｏｒａｎｇｅ　
３　（ＥＡＳＴＯＮＥ　Ｏｒａｎｇｅ　２Ｒ）フィルタ
ー染料（０，１５ｇ　／　ｎｒ）　、Ｃ，ｒ、ｆｌｉｓ
ｐｅｒｓｅＹｅｌｌｏｗ　５　（ＥＡＳＴＯＮＥ　Ｙｅ
ｌｌｏｗ　６ＧＮ）フィルタ・−染料（０，３５ｇ　／
　ｍ　）およびＣ，１，Ｄｉｓｐｅｒｓｅ　Ｏｒａｎｇ
ｅ　３（ＥＡＳＴＯＮＥ　Ｒｅｄ　２Ｂ−ＧＬＦ）フィ
ルター染料（０，１５ｇ／ｒｒｒ）　　。

要素（対照および本発明の両者）は、展開層に蒸留水ま
たは貯蔵ヒト血清のいずれかの試料１０Ｉを適用し、３
７℃で１２分間まで培養し、染料生成からの結果である
反射濃度における変化を分光光度計で測定することによ
って評価した。

反射濃度表示値を、Ｃ１ａｐｐｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ
変換器（Ｊ、Ｏｐｔ、Ｓｏｃ、Ａ＋＋＋、、４３　、５
９５（１９５３）に記載〕を使用して、透過濃度（Ｄ７
）表示値に変換した。各要素について、透過濃度対時間
のプロットを作った。

結果を第１図および第２図に示す。第１図は対照および
本発明の要素に蒸留水でスポット付けした時のバックグ
ランドレートを示し、一方、第２図は、要素に貯蔵ヒト
血清でスポット付けした時のバックグランドレートを示
す。対照要素（フィルター層なし）は高いバックグラン
ドレートを示し、−志木発明の要素は十分に低いバンク
グランドレートを示すことがわかる。両図は、対照要素
と本発明の要素との間のバックグランドレートの変化の
大きさを示している。

ＬＪの フィルター層を、記録層に隣接して支持体に適用したほ
かは、実施例１および２に示したと同様にして、本発明
の他の要素を調製した。この要素を実施例１に記載した
ようにして評価し、予め測定した量のＣＫ−ＭＢを有す
る試料を通用することによって、標準方法を使用して検
定曲線を作った。この曲線を第３図に示す。

４：フレアチンキ　−ゼーＭＢの ＣＫ−ＭＢの検定を、上記実施例１および２に記載した
要素および方法を使用して行なった。実施例１および２
の対照要素を同様に試験した。要素に、２つの試験溶液
：　ＣＫ−ＭＢを含有する貯蔵ヒト血清（約３００１．
Ｕ、／ｌのＣＫ−ＭＢ）および約２０００１．　Ｕ、　
／ｌのＣＫ−ＭＭおよび約４０１．Ｕ。

／ｌのＣＫ−ＭＢを含有するウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）溶液でスポット付けした。

得られた反射濃度の結果から、両検定の精度を両試験試
料について計算した。精度結果を下記第１表に示す。本
発明の検定が、対照要素を使用した検定よりも両試験試
料についてより精確であることが明らかである。

第一１−表 要　素　　試験溶液　早い表示値　遅い表示値％Ｃ０ν
、″　　　％Ｃ６シ、１ 対照例　　ヒト血清　　　２．５　　　　１．９対照例
　　Ｂ　Ｓ　Ａ　　　　１４．６　　　　１６．３実施
例４　ヒト血清　　　１．２　　　　０．８９％Ｃ，Ｖ
、＝％変動係数。早い表示値は検定中約４分後であり、
遅い表示値は検定巾 約５．６分後であった。

以下余白 〔発明の効果〕 本発明は、感光性化合物（例えば、染料またはプレカー
サー）を使用する、選択されたしｎ床上重要な酵素検体
のための高感度分光光度的検定を提供する。臨床上重要
な酵素検体は、人または動物の生物学的流体の臨床的評
価において重要である酵素に関して知られている技術専
門用語である。

これらの酵素は、一般に生物学的流体中に測定可能な量
で存在する。

本発明は、低レベルの酵素検体の検出に特に苛酷である
望ましくないバックグランドレートの問題を克服する。

イソ酵素、例えばタレアチンキナーゼ−ＭＢの測定は、
本発明により有利に実施できる。本発明の検定は、特に
ＣＫ−ＭＢの測定において改良された精度を提供する。

本発明の利益は、本発明の要素中にフィルター層を使用
することによって達せられる。この層には、要素中の感
光性化合物に不利な影響を与える望ましくない電磁輻射
線を吸収する１種または２種以上のフィルター染料が含
有されているＪそれによって、反応の望ましくないバッ
クグランドレートは減少し精度が改良される。要素保存
も、フィルター層を使用することによって改良される。

フィルター層は、検体反応の結果である光学濃度の変化
を検出するために使用される入射輻射線の通路に配置さ
れている限りにおいて、要素のどの位置にも置くことが
でき為。この入射輻射線は感光性化合物に達する前にフ
ィルター層を通過する。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、実施例１および実施例２に記載
されたバックグランドの早過ぎる形成の測定のための透
過濃度（Ｄア）対時間のグラフプロントである。 第３図は、実施例３に記載された、ＣＫ−ＭＢ濃度対反
応レートＸｌ０−’の検定曲線である。 以下余白 時間（秒） Ｔ 時間（秒）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、感光性化合物を含有して成り、濃度変化を検出する
   ための入射輻射線が、感光性化合物上に入射する前に、
   フィルター層を通過するように要素中に位置された、少
   なくとも一種のフィルター染料を含むフィルター層を有
   する分析要素。 ２、Ａ、臨床上重要な酵素検体を含むと思われる液体の
   試料を、感光性化合物を含有して成り、濃度変化を検出
   するための入射輻射線が、感光性化合物上に入射する前
   に、フィルター層を通過するように要素中に位置された
   、少なくとも一種のフィルター染料を含む、フィルター
   層を有する分析要素と接触させ、そして Ｂ、検体の存在によって生ずる光学濃度の変化を測定す
   る ことを含んでなる、臨床上重要な酵素検体の測定方法。