JPS62171684A - Immobilized glucose oxidase enzyme membrane and production thereof - Google Patents
Immobilized glucose oxidase enzyme membrane and production thereofInfo
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は、グルコースオキシダーゼを連続使用するた
めに必要であり、且つバイオセンサに適用できるグルコ
ースオキシダーゼ固定化酵素膜材料、同固定化酵素膜、
及びその製造方法に関するものである。[Detailed Description of the Invention] [Industrial Application Field] The present invention provides a glucose oxidase-immobilized enzyme membrane material, the immobilized enzyme membrane, which is necessary for continuous use of glucose oxidase and is applicable to biosensors.
and its manufacturing method.
酵素を触媒として工業的に利用することは、発酵工業な
どを中心に昔から行なわれていた。しかし、従来、酵素
は水溶液中に溶解あるいは分散させて反応に用いられ、
反応終了後は酵素は回収されず、−回の反応ごとに捨て
られていた。ところが、最近、酵素を安定でくり返し使
用を可能にす学物質の計測にまで利用することができる
ようになった。化学物質の計測手段としては、固定化酵
素膜としては膜厚が薄く、しかも膜面積が小さいものが
利用される。The industrial use of enzymes as catalysts has been practiced for a long time, mainly in the fermentation industry. However, conventionally, enzymes are dissolved or dispersed in an aqueous solution and used for reactions.
The enzyme was not recovered after the reaction was completed, and was discarded after every - reaction. However, recently it has become possible to use enzymes to measure chemical substances that are stable and can be used repeatedly. As a means for measuring chemical substances, an immobilized enzyme membrane that is thin and has a small membrane area is used.
バイオセンサは化学物質の計測に固定化酵素膜が利用さ
れた代表例である。このバイオセンサは固定化酵素膜と
、この膜内で消費あるいは生成する物質を検出し、これ
を電気信号に変換するトランスデユーサとから構成され
る。この場合、固定化酵素膜が果す役割は、測定したい
化学物質を識別することと、これをトランスデユーサが
検知できる物質の量的変化を生じさせることにある。Biosensors are a typical example in which immobilized enzyme membranes are used to measure chemical substances. This biosensor consists of an immobilized enzyme membrane and a transducer that detects substances consumed or produced within the membrane and converts them into electrical signals. In this case, the role of the immobilized enzyme membrane is to identify the chemical substance to be measured and to cause a quantitative change in the substance that can be detected by the transducer.
グルコースオキシダーゼを用いたバイオセンナとしては
、グルコースオキシダーゼ固定化酵素膜と酸素電極、グ
ルコースオキシダーゼ固定化酵素膜と過酸化水素電極、
グルコースオキシダーゼ固定化酵素膜とｐＨ電極をそれ
ぞれ組合せたものなどがある。グルコースオキシダーゼ
は、固定化酵素膜内で（１）式に従ってグルコースをグ
ルコン酸トＣＯＨ
ＯＣＨ
ＣＯＨ
ＣＯＨ
この反工６に伴う酵素の消費量を酸ぶ電極で、過酸化水
素の生成量を過酸化水素電極で、グルコン酸生成による
ｐＨの低下をｐＨ電極で検知することにより、グルコー
ス濃度が測定できる。Biosenna using glucose oxidase includes glucose oxidase immobilized enzyme membrane and oxygen electrode, glucose oxidase immobilized enzyme membrane and hydrogen peroxide electrode,
There is a combination of a glucose oxidase-immobilized enzyme membrane and a pH electrode. Glucose oxidase is produced by converting glucose into gluconate COH OCH COH COH within an immobilized enzyme membrane according to the formula (1). Glucose concentration can be measured by detecting a decrease in pH due to gluconic acid production using a pH electrode.
従来のグルコース測定用バイオセンサの固定化酵素膜と
しては、グルコースオキシダーゼと牛血清アルブミンを
グルタルアルデヒドで化学架橋して形成する方法が一般
的である。第２図は、基板あるいはトランスデユーサ上
に形成したグルコースオキシダーゼ固定化酵素膜の模式
図でおる。図において、（１）は表面にシランカップリ
ング剤でアミノ基を導入した基板あるいはトランスデユ
ーサ、（２）はグルコースオキシダーゼ、（，３）は牛
血清アルブミン、（りはグルタルアルデヒドである。The conventional immobilized enzyme membrane for a biosensor for measuring glucose is generally formed by chemically crosslinking glucose oxidase and bovine serum albumin with glutaraldehyde. FIG. 2 is a schematic diagram of a glucose oxidase-immobilized enzyme membrane formed on a substrate or a transducer. In the figure, (1) is a substrate or transducer on which amino groups have been introduced with a silane coupling agent, (2) is glucose oxidase, (, 3) is bovine serum albumin, and (and is glutaraldehyde).
このグルコースオキシダーゼ固定化酵素膜の製造方法は
、酵素であるグルコースオキシダーゼ（：２）と牛血清
アルブミン（３）をあらかじめ水溶液中に溶解し、これ
を適当な濃度のグルタルアルデヒド（＜＝）を含んだ溶
液と混ぜ合せ、基板（１）上に塗り付ける。そのまま放
置しておくと、グルタルアルデヒドにより酵素−酵素、
酵素−牛血清アルブミン、十崩清アルブミンー牛崩清ア
ルブミン、基板表面のアミン基−酵素あるいは牛血清ア
ルブミンが化学架橋され、第２図に示したように三次元
的な高分子膜の中に酵素が捕捉され、水に不溶となり固
定化される。This method for producing an enzyme membrane immobilized with glucose oxidase involves dissolving the enzymes glucose oxidase (2) and bovine serum albumin (3) in an aqueous solution in advance, and then dissolving this in an aqueous solution containing an appropriate concentration of glutaraldehyde (<=). Mix it with a solution and apply it on the substrate (1). If left as is, glutaraldehyde will cause enzyme-enzyme,
Enzyme - bovine serum albumin, ten-disintegrated albumin - bovine disintegrated albumin, amine group on the substrate surface - enzyme or bovine serum albumin are chemically cross-linked, and the enzyme is incorporated into a three-dimensional polymer film as shown in Figure 2. is captured, becomes insoluble in water, and becomes immobilized.
バイオセンサは、最近、微小化が要求されることから、
グルコースオキシダーゼ固定化酵素膜としても微小加工
が可能な材料及び製造方法が必要である。従来のグルコ
ースオキシダーゼ固定化酵で
素膜は、上記のような材料と製造方法が形成されている
ので、微小面積の固定化酵素膜を再現性良く形成するこ
とが不可能であるという問題点があった。Recently, biosensors have been required to be miniaturized.
Materials and manufacturing methods that can be microfabricated as glucose oxidase-immobilized enzyme membranes are also needed. Conventional glucose oxidase immobilized enzyme membranes are formed using the materials and manufacturing methods described above, so there is a problem in that it is impossible to reproducibly form an immobilized enzyme membrane with a small area. there were.
この発明は、かかる問題点を解決するためになされたも
ので、フォトリソグラフィー技術によシｅ小１グルコー
スオキシダーゼ固定化酵素膜を形成することができるグ
ルコースオキシダーゼ固定化酵素膜を得ることを目的と
する。The present invention was made to solve such problems, and an object of the present invention is to obtain a glucose oxidase-immobilized enzyme membrane that can be formed by photolithography technology. do.
また、この発明の別の発明は、上記目的に加えて、微小
面積で且つ膜強度の高い固定化酵素膜を再現性良く形成
することができるグルコースオキシダーゼ固定化酵素膜
の製造方法を得ることを目的とする。In addition to the above object, another invention of the present invention is to obtain a method for producing a glucose oxidase-immobilized enzyme membrane that can form an immobilized enzyme membrane with a small area and high membrane strength with good reproducibility. purpose.
この発明に係るグルコースオキシダーゼ固定化酵素膜は
、ポリビニルピロリドンとコ、タービス（ｌＩ／−アジ
ド−λ′−スルホベンザル）シクロペンタノンナ） Ｉ
Ｊウム塩を含む水溶性感光樹脂水溶液に、グルコースオ
キシダーゼと牛血清アルブミンとを溶解あるいは混合し
たものである。The glucose oxidase-immobilized enzyme membrane according to the present invention is composed of polyvinylpyrrolidone and terbis(lI/-azido-λ'-sulfobenzal)cyclopentanonna)I.
Glucose oxidase and bovine serum albumin are dissolved or mixed in a water-soluble photosensitive resin aqueous solution containing Jium salt.
また、この発明の別の発明に係るグルコースオキシダー
ゼ固定化酵素膜の製造方法は、上記のグルコースオキシ
ダーゼ固定化酵素膜を基板に塗布して紫外線により光硬
化した後、このグルコースオキシダーゼ固定化酵素膜を
グルタルアルデヒド水溶液で処理して酵素膜成分をさら
に化学架橋したものである。Further, in a method for producing a glucose oxidase-immobilized enzyme membrane according to another invention of the present invention, the glucose oxidase-immobilized enzyme membrane described above is coated on a substrate and photocured with ultraviolet rays, and then the glucose oxidase-immobilized enzyme membrane is coated on a substrate. The enzyme membrane components are further chemically crosslinked by treatment with an aqueous glutaraldehyde solution.
この発明においては、水溶性感光樹脂の存在によシフオ
ドリソグラフィー技術が適用でき、微小な面積のグルコ
ースオキシダーゼ固定化酵素膜が形成される。In this invention, the presence of a water-soluble photosensitive resin makes it possible to apply a shift lithography technique to form a glucose oxidase-immobilized enzyme membrane with a minute area.
また、この発明の別の発明においては、グルタルアルデ
ヒドによる化学架橋で酵素膜強度を高めたグルコースオ
キシダーゼ固定化酵素膜を製造することができる。In another aspect of the present invention, it is possible to produce a glucose oxidase-immobilized enzyme membrane whose strength is increased by chemical crosslinking with glutaraldehyde.
この発明によるグルコースオキシダーゼ固定化酵素膜は
、好適にはポリビニルピロリドン２〜２０重量％、コ、
タービス（ｌ′−アジド−λ′−スルホベンザル）シク
ロペンタノンナトリウム塩ｏり〜／１ｍｊ１％、グルコ
ースオキシダーゼ５．０〜７．り重量％、牛血清アルブ
ミンタル１０重量％、及び化学架橋剤例えばグルタルア
ルデヒドを含んだ水溶液である。The glucose oxidase-immobilized enzyme membrane according to the present invention preferably contains 2 to 20% by weight of polyvinylpyrrolidone,
Terbis(l'-azido-λ'-sulfobenzal) cyclopentanone sodium salt ~/1mj1%, glucose oxidase 5.0~7. 10% by weight of bovine serum albumin, and a chemical crosslinking agent such as glutaraldehyde.
また、この発明によるグルコースオキシダーゼ固定化酵
素膜の製造方法では、基板の全体にグルコースオキシダ
ーゼ固定化酵素膜を形成する場合、１０−２り％のグル
タルアルデヒド水溶液が好適に使用できる。一方、基板
の一部のみにグルコースオキシダーゼ固定化酵素膜を形
成する場合には、紫外線をグルコースオキシダーゼ固定
化酵素膜を必要とする部分にのみ照射した後、１〜５％
のグルタルアルデヒド水溶液で現像して光架橋した部分
の膜をさらに化学架橋し、光架橋しない部分の膜を溶解
して除去することにより製造することができる。In addition, in the method for producing a glucose oxidase-immobilized enzyme membrane according to the present invention, when forming a glucose oxidase-immobilized enzyme membrane on the entire substrate, a 10-2% glutaraldehyde aqueous solution can be suitably used. On the other hand, when forming a glucose oxidase-immobilized enzyme film only on a part of the substrate, after irradiating ultraviolet rays only on the part that requires the glucose oxidase-immobilized enzyme film,
It can be produced by further chemically crosslinking the photo-crosslinked portions of the film by developing it with an aqueous glutaraldehyde solution, and dissolving and removing the photo-crosslinked portions of the film.
次に、この発明によるグルコースオキシダーゼ固定化酵
素膜を図について説明する。Next, the glucose oxidase-immobilized enzyme membrane according to the present invention will be explained with reference to the drawings.
第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図はこの発明によるグ
ルコースオキシダーゼ固定化酵素膜の製造方法の一連の
手順を示す模式図である。第１Ａ図はグルコースオキシ
ダーゼ固定化酵素膜を基板上に塗布し、特定の部分に紫
外線を照射したグルコースオキシダーゼ固定化酵素膜の
模式図、第１Ｂ図は第１Ａ図で光架橋した後に水溶液で
現像したグルコースオキシダーゼ固定化酵素膜の模式図
、第１Ｃ図は第１］３図で形成された固定化酵素膜をさ
らにグルタルアルデヒドにより化学架橋して強度を高め
たグルコースオキシダーゼ固定化酵素膜の模式図である
。これらの図において、（１）〜（りは上記従来のグル
コースオキシダーゼ固定化＃素膜におけるものと同一で
ある。（夕）はポリビニルピロリドン、 （１，’）は
コ、タービス（ｑ′−アジド−２′−スルホベンザル）
シクロペンタノンナトリウム塩、（７）はグルコースオ
キシダーゼ固定化酵素膜を光架橋させるための紫外線、
（ｔ”）はフォトマスクである。FIG. 1A, FIG. 1B, and FIG. 1C are schematic diagrams showing a series of steps in the method for producing a glucose oxidase-immobilized enzyme membrane according to the present invention. Figure 1A is a schematic diagram of a glucose oxidase-immobilized enzyme membrane coated on a substrate and specific portions are irradiated with ultraviolet rays. Figure 1B is a schematic diagram of a glucose oxidase-immobilized enzyme membrane that is photo-crosslinked in Figure 1A and then developed with an aqueous solution. Figure 1C is a schematic diagram of the glucose oxidase-immobilized enzyme membrane obtained by further chemically cross-linking the immobilized enzyme membrane formed in Figure 3 with glutaraldehyde to increase its strength. It is. In these figures, (1) to (ri) are the same as those in the above-mentioned conventional glucose oxidase-immobilized #membrane. -2′-sulfobenzale)
cyclopentanone sodium salt, (7) is ultraviolet light for photocrosslinking the glucose oxidase-immobilized enzyme membrane;
(t'') is a photomask.
実施例 ／
分子量３Ａ万のポリビニルピロリドンを１９重量％含ん
だ水溶液に、ポリビニルピロリドンに対して１９重量％
のコ、５−ビス（ＩＩ／−アジド−Ｊ／−スルホベンザ
ル）シクロペンタノンナトリウム塩（東京応化工業株式
会社製）を含んだ水溶性感光樹脂を調製した。この水溶
性感光樹脂１００μｌにグルコースオキシダーゼ２５〜
、牛血清アｋ ７’ミン２り〜を溶解し酵素溶液とした
。γ−アミノプロピルトリエトキシシランでアミン基を
表面に導入した厚さ約ｔ０００にの熱酸化膜がついたシ
リコンウェハー基板上に、得られた酵素溶液をスピンナ
ーを用いて２００Ｏｒ９Ｂで２分間塗布した。Example / In an aqueous solution containing 19% by weight of polyvinylpyrrolidone with a molecular weight of 3A, 19% by weight of polyvinylpyrrolidone was added.
A water-soluble photosensitive resin containing 5-bis(II/-azido-J/-sulfobenzal)cyclopentanone sodium salt (manufactured by Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd.) was prepared. Glucose oxidase 25 ~ 100μl of this water-soluble photosensitive resin
, bovine serum amine 7' was dissolved to prepare an enzyme solution. The obtained enzyme solution was applied using a spinner at 200Or9B for 2 minutes on a silicon wafer substrate having a thermally oxidized film with a thickness of about t000 on which amine groups were introduced into the surface using γ-aminopropyltriethoxysilane.
この基板を２りＯＷの超高圧水銀灯で２分間露光し、２
５％グルタルアルデヒド水溶液に５分間浸漬した後、θ
／Ｍグリシン溶液で１５分間未反応のアルデヒド基を反
応させてグルコースオキシダーゼ固定化酵素膜を得た。This substrate was exposed to light for 2 minutes using a 2-OW ultra-high pressure mercury lamp.
After immersion in 5% glutaraldehyde aqueous solution for 5 minutes, θ
A glucose oxidase-immobilized enzyme membrane was obtained by reacting unreacted aldehyde groups with /M glycine solution for 15 minutes.
このグルコースオキシダーゼ固定化酵素膜は、表面に凹
凸が多いが、平均膜厚が約λμｍという薄膜として形成
できた。This glucose oxidase-immobilized enzyme membrane had many irregularities on the surface, but could be formed as a thin film with an average thickness of about λμm.
実施例 コ
実施例／と同様に調製した酵素溶液を、実施例１に示し
たものと同じ基板上に、スピンナーを用いて２０００ｒ
ｐ■で２分間回転塗布した。次に、この基板の特定の部
分のみに紫外線がめたるようなフォトマスクを介して、
２！ＯＷの超高圧水銀灯を用いて紫外線を露光すること
により、基板上の膜の一部だけを光硬化した（第１Ａ図
）。次に、蒸留水にて光硬化していない未硬化の部分の
膜を溶解除去して微小なグルコースオキシダーゼ固定化
酵素膜を得た（第１Ｂ図）。次に、この微小な固定化酵
素膜をさらに２５％グルタルアルデヒド水溶液で５分間
処理して化学架橋することにより、この固定化酵素膜の
強度を高めた（第１Ｃ図）。Example An enzyme solution prepared in the same manner as in Example 1 was placed on the same substrate as shown in Example 1 for 2000 rpm using a spinner.
It was spin-coated with p■ for 2 minutes. Next, through a photomask that allows ultraviolet rays to shine only on specific parts of the substrate,
2! Only a portion of the film on the substrate was photocured by exposure to ultraviolet light using an OW ultra-high pressure mercury lamp (FIG. 1A). Next, the uncured portion of the membrane that had not been photocured was dissolved and removed with distilled water to obtain a minute glucose oxidase-immobilized enzyme membrane (Fig. 1B). Next, this minute immobilized enzyme membrane was further treated with a 25% glutaraldehyde aqueous solution for 5 minutes to chemically crosslink it, thereby increasing the strength of this immobilized enzyme membrane (Figure 1C).
未反応のアルデヒド基は０．７ Ｍグリシンに／ｆｆ分
間浸漬することにより反応させた。Unreacted aldehyde groups were reacted by immersion in 0.7 M glycine for /ff minutes.
実施例 ３
実施例１と同様に調製した酵素溶液を、実施例１に示し
たものと同じ基板上に、スピンナーを用いて２０００１
９ｍでコ分間回転塗布した。次に、この基板の特定の部
分のみに２ＳθＷの超高圧水銀灯の紫外線があたるよう
なフォトマスクを介して露光することにより、基板上の
膜の一部だけを光硬化した（第１八図）。次に、この基
板を２％のグルタルアルデヒド水溶液に浸漬し、未硬化
の部分の膜を溶解除去すると同時に、光硬化した部分の
膜を化学架橋して微小なグルコースオキシダーゼ固定化
酵素膜を形成した（第１Ｃ図）。未反応のアルデヒド基
は、０．７ Ｍグリシンに７５分間浸漬することにより
反応させた。Example 3 An enzyme solution prepared in the same manner as in Example 1 was placed on the same substrate as shown in Example 1 using a spinner.
The coating was applied by spinning at a distance of 9 m. Next, only a portion of the film on the substrate was photocured by exposing only a specific portion of the substrate to ultraviolet rays from a 2SθW ultra-high pressure mercury lamp through a photomask (Figure 18). . Next, this substrate was immersed in a 2% glutaraldehyde aqueous solution to dissolve and remove the uncured portion of the film, and at the same time chemically crosslink the photocured portion of the film to form a minute glucose oxidase-immobilized enzyme film. (Figure 1C). Unreacted aldehyde groups were reacted by immersion in 0.7 M glycine for 75 minutes.
１００μｍピンチのラインアンドスペースパターンとい
う線幅にまで微小化することができた。We were able to miniaturize the line width to a 100 μm pinch line and space pattern.
実施例 ｑ
実施例３と同様に操作を行ない、基板を２％のグルタル
アルデヒド水溶液にて現像した後、さらに２ｊ％グルタ
ルアルデヒド水溶液中に夕分間浸学架橋して、グルコー
スオキシダーゼ固定化酵素膜を得た。Example q The same operation as in Example 3 was carried out, and after the substrate was developed with a 2% glutaraldehyde aqueous solution, it was further immersed in a 2j% glutaraldehyde aqueous solution for evening cross-linking to form a glucose oxidase-immobilized enzyme membrane. Obtained.
なお、上記実施例では基板として表面にアミノ基を導入
した基板を用いたが、トランスデユーサを用いても同様
の動作を期待できる。In the above embodiment, a substrate having amino groups introduced into the surface was used as the substrate, but a similar operation can be expected even if a transducer is used.
この発明は以上説明したとおり、分子量数万−数十万の
ポリビニルピロリドンと、２．ｒ−ビス（ｑ′−アシド
−λ′−スルホンベンザル）シクロペンタノンナトリウ
ム塩と、グルコースオキシダーゼと、牛血清アルブミン
と、化学架橋剤とを材料として構成したことにより、フ
ォトリソグラフィー技術の適用が可能であり、微小なグ
ルコースオキシダーゼ固定化酵素膜が形成できる効果が
ある。As explained above, this invention comprises polyvinylpyrrolidone having a molecular weight of tens of thousands to hundreds of thousands; By using r-bis(q'-acid-λ'-sulfonebenzal) cyclopentanone sodium salt, glucose oxidase, bovine serum albumin, and a chemical crosslinking agent as materials, it is possible to apply photolithography technology. This method has the effect of forming a minute glucose oxidase-immobilized enzyme membrane.
また、この発明の別の発明は、上記のグルコースオキシ
ダーゼ固定化酵素膜を基板上に塗布、乾燥してグルコー
スオキシダーゼ固定化酵素膜を形成し、得られたグルコ
ースオキシダーゼ固定化酵素膜に紫外線を照射すること
によシ光架橋した後、ルアルデヒド水溶液でさらに化学
架橋することにより、微小なグルコースオキシダーゼ固
定化酵素膜が形成でき、また、膜強度も高いことから、
小形のバイオセンサが得られる効果がある。Another invention of the present invention is to apply the above glucose oxidase-immobilized enzyme membrane onto a substrate, dry it to form a glucose oxidase-immobilized enzyme membrane, and irradiate the obtained glucose oxidase-immobilized enzyme membrane with ultraviolet rays. After photocrosslinking, a fine glucose oxidase-immobilized enzyme membrane can be formed by further chemical crosslinking with an aqueous solution of Raldehyde, and the membrane has high strength.
This has the effect of providing a small biosensor.
によるグルコースオキシダーゼ固定化酵素膜の製造方法
の一連の手順を示す模式図、第２図は従来のグルコース
オキシダーゼ固定化酵素膜の模式図である。FIG. 2 is a schematic diagram showing a series of steps for producing a glucose oxidase-immobilized enzyme membrane according to the method of the present invention, and FIG. 2 is a schematic diagram of a conventional glucose oxidase-immobilized enzyme membrane.
図において、（１）は基板、（２）はグルコースオキシ
ダーゼ、（３）は牛血清アルブミン、（りはグルタルア
ルデヒド、（！ｒ）はポリビニルピロリドン。In the figure, (1) is the substrate, (2) is glucose oxidase, (3) is bovine serum albumin, (ri is glutaraldehyde, and (!r) is polyvinylpyrrolidone.
（Ａ）は２，５−ビス（ｑ′−アジドーコ′−スルホベ
ンザル）シクロペンタノンナトリウム塩、（５）ハ紫外
線、（ｔ）はフォトマスクである。(A) is 2,5-bis(q'-azidoco'-sulfobenzal)cyclopentanone sodium salt, (5) C is ultraviolet light, and (t) is a photomask.
なお、各図中、同一符号は同一または相当部分を示す。In each figure, the same reference numerals indicate the same or corresponding parts.
手続補正書（自発） 昭和６で年３月１９日Procedural amendment (voluntary) March 19, 1933
Claims (5)
２，５−ビス（４′−アジド−２′−スルホベンザル）
シクロペンタノンナトリウム塩と、グルコースオキシダ
ーゼと、牛血清アルブミンと、化学架橋剤とを材料とし
て構成したことを特徴とするグルコースオキシダーゼ固
定化酵素膜。(1) Polyvinylpyrrolidone with a molecular weight of tens of thousands to hundreds of thousands,
2,5-bis(4'-azido-2'-sulfobenzal)
A glucose oxidase-immobilized enzyme membrane comprising cyclopentanone sodium salt, glucose oxidase, bovine serum albumin, and a chemical crosslinking agent.
ルピロリドン２〜２０重量％、２，５−ビス（４′−ア
ジド−２′−スルホベンザル）シクロペンタノンナトリ
ウム塩０．５〜１．５重量％、グルコースオキシダーゼ
５．０〜７．５重量％、及び牛血清アルブミン５〜１０
重量％を含んだ水溶液から作られたものである特許請求
の範囲第１項記載のグルコースオキシダーゼ固定化酵素
膜。(2) The immobilized enzyme membrane contains 2 to 20% by weight of polyvinylpyrrolidone with a molecular weight of tens of thousands to hundreds of thousands, and 0.5 to 20% of 2,5-bis(4'-azido-2'-sulfobenzal)cyclopentanone sodium salt. 1.5% by weight, glucose oxidase 5.0-7.5% by weight, and bovine serum albumin 5-10
The glucose oxidase-immobilized enzyme membrane according to claim 1, which is made from an aqueous solution containing % by weight.
求の範囲第１項記載のグルコースオキシダーゼ固定化酵
素膜。(3) The glucose oxidase-immobilized enzyme membrane according to claim 1, wherein the chemical crosslinking agent is glutaraldehyde.
２，５−ビス（４′−アジド−２′−スルホベンザル）
シクロペンタノンナトリウム塩と、グルコースオキシダ
ーゼと、牛血清アルブミンとを含むグルコースオキシダ
ーゼ固定化酵素膜を基板上に塗布、乾燥してグルコース
オキシダーゼ固定化酵素膜を形成し、得られたグルコー
スオキシダーゼ固定化酵素膜に紫外線を照射することに
より光架橋した後、該グルコースオキシダーゼ固定化酵
素膜をグルタルアルデヒド水溶液でさらに化学架橋する
ことを特徴とするグルコースオキシダーゼ固定化酵素膜
の製造方法。(4) polyvinylpyrrolidone with a molecular weight of tens of thousands to hundreds of thousands,
2,5-bis(4'-azido-2'-sulfobenzal)
A glucose oxidase-immobilized enzyme film containing cyclopentanone sodium salt, glucose oxidase, and bovine serum albumin is coated on a substrate and dried to form a glucose oxidase-immobilized enzyme film. A method for producing a glucose oxidase-immobilized enzyme membrane, which comprises photo-crosslinking the membrane by irradiating the membrane with ultraviolet rays, and then further chemically crosslinking the glucose oxidase-immobilized enzyme membrane with an aqueous glutaraldehyde solution.
必要とする部分にのみ照射した後、１〜５％のグルタル
アルデヒド水溶液で現像して光架橋した部分の膜をさら
に化学架橋し、光架橋しない部分の膜を溶解して除去す
ることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載のグルコ
ースオキシダーゼ固定化酵素膜の製造方法。(5) After irradiating ultraviolet rays only to the parts that require the glucose oxidase-immobilized enzyme membrane, it is developed with a 1-5% glutaraldehyde aqueous solution to further chemically cross-link the photo-crosslinked parts of the membrane, and the parts that are not photo-crosslinked. 5. The method for producing a glucose oxidase-immobilized enzyme membrane according to claim 4, wherein the membrane is dissolved and removed.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61013900A JPS62171684A (en) | 1986-01-27 | 1986-01-27 | Immobilized glucose oxidase enzyme membrane and production thereof |
| US06/942,797 US4894339A (en) | 1985-12-18 | 1986-12-17 | Immobilized enzyme membrane for a semiconductor sensor |
| EP86309931A EP0228259B1 (en) | 1985-12-18 | 1986-12-18 | Enzyme immobilized membrane for a semiconductor sensor and method for producing same |
| DE8686309931T DE3687790T2 (en) | 1985-12-18 | 1986-12-18 | IMMOBILIZED ENZYME MEMBRANE FOR A SEMICONDUCTOR DETECTOR AND THEIR PRODUCTION METHOD. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61013900A JPS62171684A (en) | 1986-01-27 | 1986-01-27 | Immobilized glucose oxidase enzyme membrane and production thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62171684A true JPS62171684A (en) | 1987-07-28 |
| JPH0528104B2 JPH0528104B2 (en) | 1993-04-23 |
Family
ID=11846043
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61013900A Granted JPS62171684A (en) | 1985-12-18 | 1986-01-27 | Immobilized glucose oxidase enzyme membrane and production thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62171684A (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02248852A (en) * | 1989-03-22 | 1990-10-04 | Nok Corp | Glucose sensor |
| JP2017501716A (en) * | 2013-12-23 | 2017-01-19 | ヴェリリー ライフ サイエンシズ エルエルシー | Double layer analyte sensor |
| CN112868912A (en) * | 2021-02-02 | 2021-06-01 | 北京东方天合过瘤胃技术研究院有限公司 | Preparation method of novel rumen-bypass glucose oxidase |
-
1986
- 1986-01-27 JP JP61013900A patent/JPS62171684A/en active Granted
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02248852A (en) * | 1989-03-22 | 1990-10-04 | Nok Corp | Glucose sensor |
| JP2017501716A (en) * | 2013-12-23 | 2017-01-19 | ヴェリリー ライフ サイエンシズ エルエルシー | Double layer analyte sensor |
| CN112868912A (en) * | 2021-02-02 | 2021-06-01 | 北京东方天合过瘤胃技术研究院有限公司 | Preparation method of novel rumen-bypass glucose oxidase |
| CN112868912B (en) * | 2021-02-02 | 2022-05-10 | 北京东方天合过瘤胃技术研究院有限公司 | Preparation method of rumen-bypass glucose oxidase |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0528104B2 (en) | 1993-04-23 |
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