JPS62151186A - ネコ白血病ウイルスワクチン - Google Patents
ネコ白血病ウイルスワクチンInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
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- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
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- C12N2740/13022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は組換ＤＮＡ工学及びネコ白血病の免疫予防の
分野に属する。さらに詳しくは、この発明は、ネコ白血
病ウィルス（ＦｅＬＶ）のウィルス性エンベロープ蛋白
質に対する免疫反応を生じさせる、白血病に対する感染
性組換ウィルスワクチンに関する。
分野に属する。さらに詳しくは、この発明は、ネコ白血
病ウィルス（ＦｅＬＶ）のウィルス性エンベロープ蛋白
質に対する免疫反応を生じさせる、白血病に対する感染
性組換ウィルスワクチンに関する。
ネコ白 ｒウィルス（ＦｅＬＶ）
ＦｅＬＶはネコにおいて悪性疾患及び非悪性疾患の両者
を惹起する伝染性の発癌性ＲＮＡウィルスの１群である
。感染されたネコはしばしば免疫抑制され、そして多く
が二次感染に罹る（ Ｈａｒｄｙ等、Ｆｅ１ｉｎｅ Ｌ
ｅｕｋｅｎ＋ｉａ Ｖｉｒｕｓ （ｂ９８０）） ｅ
ＦｅＬＶ惑染は感染の病気関連死の主要原因である。Ｆ
ｅＬＶの複製の間、ウィルスＲＮＡゲノムのＤＮＡコピ
ーが作られ、そして感染された細胞のＤＮＡ中に挿入さ
れる。組み込まれたＦｅＬＶ−ＤＮＡは感染された細胞
から撒き散らされた一層多くのウィルスをコードする。
を惹起する伝染性の発癌性ＲＮＡウィルスの１群である
。感染されたネコはしばしば免疫抑制され、そして多く
が二次感染に罹る（ Ｈａｒｄｙ等、Ｆｅ１ｉｎｅ Ｌ
ｅｕｋｅｎ＋ｉａ Ｖｉｒｕｓ （ｂ９８０）） ｅ
ＦｅＬＶ惑染は感染の病気関連死の主要原因である。Ｆ
ｅＬＶの複製の間、ウィルスＲＮＡゲノムのＤＮＡコピ
ーが作られ、そして感染された細胞のＤＮＡ中に挿入さ
れる。組み込まれたＦｅＬＶ−ＤＮＡは感染された細胞
から撒き散らされた一層多くのウィルスをコードする。
宿主の遺伝子との組換によってネコ肉腫ウィルス（Ｆｅ
ＳＶ）を生じさせることにより、このウィルスは細胞形
質転換を惹起することができる。
ＳＶ）を生じさせることにより、このウィルスは細胞形
質転換を惹起することができる。
ＦｅＬＶゲノムは、６０〜７０Ｓの単鎖ＲＮＡダイマー
であって、内部ウィルス蛋白質をコードす剣Ｌ１且遺伝
子、ウィルスＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵
素）をコードす薊Ｌｌ上遺伝子、並びにウイルスエンヘ
ロープ蛋白質ｇｐ７ｏ及びｐ１５Ｅをコードするｅｎｖ
遺伝子から成る。ＦｅＬＶｅｎｖ遺伝子は前駆体糖蛋白
質ｇｐｓｓをコードしており、このｇｐ８５が蛋白質分
解的にプロセシングされて成熟ｇｐ７０蛋白質及びｐ１
５Ｅ蛋白質が生ずる。これらの蛋白質はジスルフィド結
合を介して複合体となり、そして感染された細胞及びピ
リオンの膜二に存在する。主要エンベロープ糖蛋白質ｇ
ｐ１０が宿主−リセブター認識及び結合に関与する。
であって、内部ウィルス蛋白質をコードす剣Ｌ１且遺伝
子、ウィルスＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵
素）をコードす薊Ｌｌ上遺伝子、並びにウイルスエンヘ
ロープ蛋白質ｇｐ７ｏ及びｐ１５Ｅをコードするｅｎｖ
遺伝子から成る。ＦｅＬＶｅｎｖ遺伝子は前駆体糖蛋白
質ｇｐｓｓをコードしており、このｇｐ８５が蛋白質分
解的にプロセシングされて成熟ｇｐ７０蛋白質及びｐ１
５Ｅ蛋白質が生ずる。これらの蛋白質はジスルフィド結
合を介して複合体となり、そして感染された細胞及びピ
リオンの膜二に存在する。主要エンベロープ糖蛋白質ｇ
ｐ１０が宿主−リセブター認識及び結合に関与する。
はとんどの膜蛋白質は疎水性領域を含有し、この領域は
脂質膜に挿入されておりそしてこれによって該蛋白質を
該膜に付着していると信じられる。
脂質膜に挿入されておりそしてこれによって該蛋白質を
該膜に付着していると信じられる。
疎水性ｐ１５Ｂ蛋白質はこのような膜付着蛋白質である
と思われる。Ａく庖性口内炎ウィルス（ＶＳＶ） Ｇ蛋
白質及びヘルペスシンプレックスｇＤ蛋白質からのこの
ような領域の除去は、もはや膜に結合せずそして細胞培
養上滑中に分泌される分子をもたらす〔それぞれ、Ｒｏ
ｓｅ等、伽旦、３０ニア５３−７６２（ｂ９８２） ；
Ｌａ５ｋｅｙ等、Ｂｉｏ／ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ 、
２ （６）：５２７−５３２（ｂ９８４） ）。免疫グ
ロブリン発現細胞の進展において、ＩｇＭ発現は膜付着
蛋白質から分泌形蛋白質に前進する。このような形の変
化は、１ｇＭ蛋白質から疎水性トランスメンプランセグ
メントを除去するＲＮＡスプライシング事象を介して生
ずる（ Ａｌｔ等、釦旦、２０ ： ２９３−３０１
（ｂ９８０）； Ｅａｅｌｙ等、蝕旦、皿：３１３−３
１９ （ｂ９８０））。
と思われる。Ａく庖性口内炎ウィルス（ＶＳＶ） Ｇ蛋
白質及びヘルペスシンプレックスｇＤ蛋白質からのこの
ような領域の除去は、もはや膜に結合せずそして細胞培
養上滑中に分泌される分子をもたらす〔それぞれ、Ｒｏ
ｓｅ等、伽旦、３０ニア５３−７６２（ｂ９８２） ；
Ｌａ５ｋｅｙ等、Ｂｉｏ／ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ 、
２ （６）：５２７−５３２（ｂ９８４） ）。免疫グ
ロブリン発現細胞の進展において、ＩｇＭ発現は膜付着
蛋白質から分泌形蛋白質に前進する。このような形の変
化は、１ｇＭ蛋白質から疎水性トランスメンプランセグ
メントを除去するＲＮＡスプライシング事象を介して生
ずる（ Ａｌｔ等、釦旦、２０ ： ２９３−３０１
（ｂ９８０）； Ｅａｅｌｙ等、蝕旦、皿：３１３−３
１９ （ｂ９８０））。
ＦｅＬＶｅｎｖ遺伝子のＰ１５Ｅ蛋白質はＬｅＬＶ疾患
に関連する免疫抑制に関連付けられている（Ｍａ ｔｈ
ｅｓ等、Ｎａ ｔｕｒｅ、２７４：６８７−６８９ （
ｂ９７Ｂ）） 、不活、性化されたＦｅＬＶはインビト
ロでリンパ球の増殖を阻害することが報告されており（
Ｈｅｂｅｂｒａｎｄ等、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ
、 ３７ ： ４５３２−４５３３ （ｂ９７７））
、そしてこの効果はＦｅＬＶｐＬ５Ｂ蛋白質に起因する
ものとされている（Ｍａ ｔｈｅｓ等、前掲〕。
に関連する免疫抑制に関連付けられている（Ｍａ ｔｈ
ｅｓ等、Ｎａ ｔｕｒｅ、２７４：６８７−６８９ （
ｂ９７Ｂ）） 、不活、性化されたＦｅＬＶはインビト
ロでリンパ球の増殖を阻害することが報告されており（
Ｈｅｂｅｂｒａｎｄ等、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ
、 ３７ ： ４５３２−４５３３ （ｂ９７７））
、そしてこの効果はＦｅＬＶｐＬ５Ｂ蛋白質に起因する
ものとされている（Ｍａ ｔｈｅｓ等、前掲〕。
ｅｎｖ遺伝子のＤＮＡ配列はＪ、 Ｖｉｒｏｌ。
（ｂ９８３）観： ８７１−８８０に記載されている。
ＰＣＴ／ＵＳ／８４１０１９６３ （ｂ９８５年１２月
１８日公開）は、ＦｅＬＶのガードナー−アルンスタイ
ン（Ｇａｒｄｎｅｒ−Ａｒｎｓｔｅｉｎ；ＧＡ）系のｅ
ｎｖ遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列、及びこれか
ら推定されるアミノ酸配列を記載している。ウィルスの
インターフェレンス試験及び中和試験は、エンベロープ
抗原の３つのサブグループ（Ａ、Ｂ及びＣと称する）が
存在し、これらは類似しているがしかし相互に異り、そ
して３種類の認識されるＰｅＬＶサブグループ（やはり
Ａ、Ｂ及びＣと称する）をもたらすことを示した。
１８日公開）は、ＦｅＬＶのガードナー−アルンスタイ
ン（Ｇａｒｄｎｅｒ−Ａｒｎｓｔｅｉｎ；ＧＡ）系のｅ
ｎｖ遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列、及びこれか
ら推定されるアミノ酸配列を記載している。ウィルスの
インターフェレンス試験及び中和試験は、エンベロープ
抗原の３つのサブグループ（Ａ、Ｂ及びＣと称する）が
存在し、これらは類似しているがしかし相互に異り、そ
して３種類の認識されるＰｅＬＶサブグループ（やはり
Ａ、Ｂ及びＣと称する）をもたらすことを示した。
サブグループＡウィルスはこのウィルスグループのエコ
トロピック（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）構成員である。
トロピック（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）構成員である。
サブグループＢのウィルスは、エコトロピックサブグル
ープＡウィルスとネコのゲノム内の内生ＦｅＬＶ一様配
列との間のインビボ組換現象に由来すると信じられる（
Ｓｔｅｗａｒｔ等、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 、５８（３
） ：８２５−８３４（ｂ９８６年６月）〕。ササブグ
ループＣウィルスびサブグループＣウィルスがサブグル
ープＡウィルスと関連してのみ見出される点において、
サブグループはそれらの自然の分布を異にする［ Ｊａ
ｒｒｅｔｔ等、Ｉｎｔ、 Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ、、２１
： ３３４−３３７（ｂ９７８） ）。異るサブグル
ープのウィルス間に共通の抗原決定基が存在するが、感
染性及び疾患進行に関して特異的な差異が認められてい
る（Ｊａｒｒｅｔｔ等、Ｉｎｔ、 Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ
、 ２１ ： ４６６−４７２（ｂ９７Ｂ） ） 、サ
ブグループＡウィルスが感染の伝播に必須であることが
、すべてのＦｅＬＶウィルス血症動物においてこのウィ
ルスが見出され、他方、サブグループＣウィルス及び／
又はサブグループＣウィルスは動物のおよそ５０％にお
いて見出されるがしかしサブグループＡウィルスと関連
してのみ見出される（Ｊａｒｒｅｔｔ等、 Ｉｎｔ、
Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ、 ２１： ３３４−３３７（ｂ９
７８） ］ という観察により証明されている。
ープＡウィルスとネコのゲノム内の内生ＦｅＬＶ一様配
列との間のインビボ組換現象に由来すると信じられる（
Ｓｔｅｗａｒｔ等、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 、５８（３
） ：８２５−８３４（ｂ９８６年６月）〕。ササブグ
ループＣウィルスびサブグループＣウィルスがサブグル
ープＡウィルスと関連してのみ見出される点において、
サブグループはそれらの自然の分布を異にする［ Ｊａ
ｒｒｅｔｔ等、Ｉｎｔ、 Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ、、２１
： ３３４−３３７（ｂ９７８） ）。異るサブグル
ープのウィルス間に共通の抗原決定基が存在するが、感
染性及び疾患進行に関して特異的な差異が認められてい
る（Ｊａｒｒｅｔｔ等、Ｉｎｔ、 Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ
、 ２１ ： ４６６−４７２（ｂ９７Ｂ） ） 、サ
ブグループＡウィルスが感染の伝播に必須であることが
、すべてのＦｅＬＶウィルス血症動物においてこのウィ
ルスが見出され、他方、サブグループＣウィルス及び／
又はサブグループＣウィルスは動物のおよそ５０％にお
いて見出されるがしかしサブグループＡウィルスと関連
してのみ見出される（Ｊａｒｒｅｔｔ等、 Ｉｎｔ、
Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ、 ２１： ３３４−３３７（ｂ９
７８） ］ という観察により証明されている。
ＦｅＬＶに暴露されたネコの運命は、ＦｅＬＶに対する
、特にＦｅＬＶエンベロープ抗原に対するその免疫反応
に依存するであろう。暴露された集団の約４０％は抗−
ＦｅＬＶエンベロープ抗体の高い力価を生成して免疫と
なり、約３０％は適切に反応せずそして永続的に感染を
受けるようになり、そして約３０％は感染されず免疫も
されないが感受性であり続けることが研究により示され
ている。感染された集団のかなりの部分が自然免疫を得
るという事実が研究者をして種々の材料をＦｅＬＶに対
するワクチンとして試みさせた。不活性化されたウィル
スは高投与量の場合以外無効であることが見出された。
、特にＦｅＬＶエンベロープ抗原に対するその免疫反応
に依存するであろう。暴露された集団の約４０％は抗−
ＦｅＬＶエンベロープ抗体の高い力価を生成して免疫と
なり、約３０％は適切に反応せずそして永続的に感染を
受けるようになり、そして約３０％は感染されず免疫も
されないが感受性であり続けることが研究により示され
ている。感染された集団のかなりの部分が自然免疫を得
るという事実が研究者をして種々の材料をＦｅＬＶに対
するワクチンとして試みさせた。不活性化されたウィル
スは高投与量の場合以外無効であることが見出された。
精製されたｇｐ７０もまたワクチンとして一般に無効で
あることが報告された。死腫瘍細胞は白血病を予防する
ためには有効であるがウィルス血症の予防のためには有
効でないことが報告されている。
あることが報告された。死腫瘍細胞は白血病を予防する
ためには有効であるがウィルス血症の予防のためには有
効でないことが報告されている。
ＦｅＬＶで形質転換されたセルライン（ＰＬ−７４）の
組織培養培地から得られた可溶性腫瘍細胞抗原も試みら
れ、そしてＦｅＬＶウィルス感染の誘導の予防のために
有効であることが見出された。１９８５年１２月１８日
に公表されたＰＣＴ／ＵＳ８４１０１９６３は微生物的
に製造された組換ＦｅＬＶ蛋白質を基礎にしたＦｅＬＶ
ワクチンを記載している。
組織培養培地から得られた可溶性腫瘍細胞抗原も試みら
れ、そしてＦｅＬＶウィルス感染の誘導の予防のために
有効であることが見出された。１９８５年１２月１８日
に公表されたＰＣＴ／ＵＳ８４１０１９６３は微生物的
に製造された組換ＦｅＬＶ蛋白質を基礎にしたＦｅＬＶ
ワクチンを記載している。
ウィルスワクチン
Ｍｏ５ｓ、 Ｂ、等 （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｇｅｎｅ Ａｍ １ｉｆｉｃａｔｉｏｎ 。
Ｇｅｎｅ Ａｍ １ｉｆｉｃａｔｉｏｎ 。
（エルセビール、化オランダ）Ｖｏｌ ３ 、ｐ２０２
−２１３（ｂ９８３） ： ＰＮＡＳ（ＵＳＡ） （ｂ
９８２） ７９ ： ７４１５−７４１９；ＰＮＡＳ（
那漫−（ｂ９８３）影し７１５５−７１５９： Ｊ、
Ｖｉｒｏｌ。
−２１３（ｂ９８３） ： ＰＮＡＳ（ＵＳＡ） （ｂ
９８２） ７９ ： ７４１５−７４１９；ＰＮＡＳ（
那漫−（ｂ９８３）影し７１５５−７１５９： Ｊ、
Ｖｉｒｏｌ。
（ｂ９８４）弧： ８５７−８６４．及びＰＣＴ／ＵＳ
８５１０１８６３．１９８４年７月公開、国際公開１１
ｋＬ賀０８４１０２０７７ ）は、ワクチニアウィルス
ゲノムへの異種性（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）遺伝子
の挿入を記載している。次に、これらの遺伝子は宿主内
でのウィルスの複製中に発現され、これらの遺伝子の産
物及びワクチニアに対する免疫反応が生ずる。この方策
を用いて、インフルエンザ（ＰＮＡＳ（ｂ９８３）８０
： ７１５５ ； Ｎａｔｕｒｅ （ｂ９８４） ３
１１ ：５７８〕、ヘルペス・シンプレックス（Ｓｃｉ
ｅｎｓｅ（ｂ９８５） ２２８ニア３７） 、肝炎Ｂ
（Ｍｏｓｓ等、Ｎａｔｕｒｅ（ｂ９８４）３１１ ：６
７ ） 、及びプラスモジウム・クノウレシ（Ｐｌａｓ
ｍｏｄｉｕｍｋｎｏｗｌｅｓｉ） （Ｓｃｉｅｎｃｅ
（ｂ９８４）２２４ ：３９７）を包含する種々の病
原体からのチャレンジに対する有意な免疫反応及び／又
は保護が示された。
８５１０１８６３．１９８４年７月公開、国際公開１１
ｋＬ賀０８４１０２０７７ ）は、ワクチニアウィルス
ゲノムへの異種性（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）遺伝子
の挿入を記載している。次に、これらの遺伝子は宿主内
でのウィルスの複製中に発現され、これらの遺伝子の産
物及びワクチニアに対する免疫反応が生ずる。この方策
を用いて、インフルエンザ（ＰＮＡＳ（ｂ９８３）８０
： ７１５５ ； Ｎａｔｕｒｅ （ｂ９８４） ３
１１ ：５７８〕、ヘルペス・シンプレックス（Ｓｃｉ
ｅｎｓｅ（ｂ９８５） ２２８ニア３７） 、肝炎Ｂ
（Ｍｏｓｓ等、Ｎａｔｕｒｅ（ｂ９８４）３１１ ：６
７ ） 、及びプラスモジウム・クノウレシ（Ｐｌａｓ
ｍｏｄｉｕｍｋｎｏｗｌｅｓｉ） （Ｓｃｉｅｎｃｅ
（ｂ９８４）２２４ ：３９７）を包含する種々の病
原体からのチャレンジに対する有意な免疫反応及び／又
は保護が示された。
この技法は、ワクチニアウィルスプロモーターから下流
に異種性遺伝子を含有するプラスミド挿入ベクターの造
成を含み、すべては該挿入ベクター中のワタチニアチミ
ジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子中に挿入される。ワクチニ
アウィルスに感染された細胞へのワクチニアＤＮＡ及び
挿入ベクターの同時トランスフェクションがウィルスＤ
ＮＡ中のＴＫ配列とプラスミドとの間の相同性組換を可
能にし、ワタチニアゲノムへの異種性遺伝子の挿入及び
ウィルスＴＫ遺伝子の中断をもたらす。組換体ウィルス
はそれらのＴＫ−マイナス表現型により選択することが
できる。
に異種性遺伝子を含有するプラスミド挿入ベクターの造
成を含み、すべては該挿入ベクター中のワタチニアチミ
ジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子中に挿入される。ワクチニ
アウィルスに感染された細胞へのワクチニアＤＮＡ及び
挿入ベクターの同時トランスフェクションがウィルスＤ
ＮＡ中のＴＫ配列とプラスミドとの間の相同性組換を可
能にし、ワタチニアゲノムへの異種性遺伝子の挿入及び
ウィルスＴＫ遺伝子の中断をもたらす。組換体ウィルス
はそれらのＴＫ−マイナス表現型により選択することが
できる。
生組換ヘルペス・シンプレックスＩ （Ｈ５Ｖ Ｉ ）
ウィルスが種々の目的のため、Ｒｏｉｚｍａｎ等〔並置
（ｂ９８１）…：２２７−２３２ ；釦旦（ｂ９８１）
旦：５５５−５６５ ；並置（ｂ９８０）２２：２４３
−２５５ ： Ｄｅｖ、 Ｂｉｏｌ、 ５ｔａｎｄａｒ
ｄｉｚａｔｉｏｎ（ｂ９８２）屓：２８７−３０４ ：
及びヨーロッパ特許０７４８０８Ａ２（ｂ９８２） ）
により、最初ヘルペスウィルスの遺伝的研究において使
用するために開発された方法であって後に上記のワクチ
ニアウィルスの研究において用いられたのと類似の方法
を用いて造成されている。１（ＳＶ Ｉ遺伝子中の特定
の変化を細菌プラスミド上でインビトロ操作することが
でき、そして次にこれらの配列を、ウィルスゲノム配列
及びプラスミド配列を含有するようにトランスフェクト
された細胞中での相同性組換によりＨＳＶ Ｉゲノム中
に挿入することができる。この方法、及び生組換ワクチ
ニアウィルスの造成において使用される方策と同様の方
策を用いて、５ｈｉｈ等（ＰＮＡＳ（ｂ９８４）８１：
５８６７−５８７０）は、挿入され操作された肝炎８表
面抗原（ＨＢＳＡｇ）遺伝子を発現する生組換ＨＳＶ
Ｉウィルスの造成を報告している。このＨＢＳＡｇ遺伝
子はＨ３Ｖプロモーターを用いる発現のために操作され
、そして細菌プラスミド中ＨＳＶ ＩのＴＫ遺伝子中に
挿入され、そしてＨＢＳＡｇ遺伝子を発現する組換Ｈ５
Ｖ Ｉウィルスの造成のために使用された。
ウィルスが種々の目的のため、Ｒｏｉｚｍａｎ等〔並置
（ｂ９８１）…：２２７−２３２ ；釦旦（ｂ９８１）
旦：５５５−５６５ ；並置（ｂ９８０）２２：２４３
−２５５ ： Ｄｅｖ、 Ｂｉｏｌ、 ５ｔａｎｄａｒ
ｄｉｚａｔｉｏｎ（ｂ９８２）屓：２８７−３０４ ：
及びヨーロッパ特許０７４８０８Ａ２（ｂ９８２） ）
により、最初ヘルペスウィルスの遺伝的研究において使
用するために開発された方法であって後に上記のワクチ
ニアウィルスの研究において用いられたのと類似の方法
を用いて造成されている。１（ＳＶ Ｉ遺伝子中の特定
の変化を細菌プラスミド上でインビトロ操作することが
でき、そして次にこれらの配列を、ウィルスゲノム配列
及びプラスミド配列を含有するようにトランスフェクト
された細胞中での相同性組換によりＨＳＶ Ｉゲノム中
に挿入することができる。この方法、及び生組換ワクチ
ニアウィルスの造成において使用される方策と同様の方
策を用いて、５ｈｉｈ等（ＰＮＡＳ（ｂ９８４）８１：
５８６７−５８７０）は、挿入され操作された肝炎８表
面抗原（ＨＢＳＡｇ）遺伝子を発現する生組換ＨＳＶ
Ｉウィルスの造成を報告している。このＨＢＳＡｇ遺伝
子はＨ３Ｖプロモーターを用いる発現のために操作され
、そして細菌プラスミド中ＨＳＶ ＩのＴＫ遺伝子中に
挿入され、そしてＨＢＳＡｇ遺伝子を発現する組換Ｈ５
Ｖ Ｉウィルスの造成のために使用された。
本発明の方法により創成された感染性組換ウィルスはネ
コ白血病ウィルスワクチンとして有用である。このよう
なワクチンは種々の経路により、例えば非経腸的に（特
に、皮下に、訪中に、眼窩内に、被膜内に（ｉｎｔｒａ
ｃａｐｓｕｌａｒｌｙ） 、らせん内に（ｉｎｔｒａｓ
ｐｉｒａｌｌｙ） 、静脈内に、鼻内に）、鼻内エーロ
ゾルにより、乱刺（ｓｃａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によ
り、又は経口的に投与することができる。組換ネコヘル
ペスウィルス（Ｆ ＨＶ）が使用される場合の好ましい
投与経路は皮下注射もしくは筋肉内注射によるか、又は
鼻内エーロゾルによる。組換ワクチニアウィルスが使用
される場合、好ましい投与経路は乱刺によるか、又は筋
肉内注射もしくは皮下注射による。
コ白血病ウィルスワクチンとして有用である。このよう
なワクチンは種々の経路により、例えば非経腸的に（特
に、皮下に、訪中に、眼窩内に、被膜内に（ｉｎｔｒａ
ｃａｐｓｕｌａｒｌｙ） 、らせん内に（ｉｎｔｒａｓ
ｐｉｒａｌｌｙ） 、静脈内に、鼻内に）、鼻内エーロ
ゾルにより、乱刺（ｓｃａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によ
り、又は経口的に投与することができる。組換ネコヘル
ペスウィルス（Ｆ ＨＶ）が使用される場合の好ましい
投与経路は皮下注射もしくは筋肉内注射によるか、又は
鼻内エーロゾルによる。組換ワクチニアウィルスが使用
される場合、好ましい投与経路は乱刺によるか、又は筋
肉内注射もしくは皮下注射による。
ゝ れたサブユニ・・ト クチン
ワクチンは非経腸ビヒクルと共に組換ウィルス自体から
実質上構成することができ、又は組換ウィルスにより感
染された細胞の調製物であって例えばホルマリンもしく
はｂ−プロピオラクトン（Ｂ Ｐ Ｌ）での処理により
不活性化されたものから誘導することができる。組換ワ
クチニアウィルスｖＦｅＬＶｅｎｖにより感染されたヒ
ト・ヒーラ（Ｈｅｌａ）細胞はその表面に、真正なＦｅ
ＬＶウィルスにより感染された細胞よりも実質的に多く
のＦｅＬＶｇｐ ７０を蓄積することが示された〔第５
図、及び例３（Ｂ）（２）における検討を参照のこと〕
。感染された細胞の全培養物、又はその手積製された両
分、例えば膜画分は当業界において知られている方法の
中でも特にホルマリン又はＢＰＬにより不活性化するこ
とができ、そしてこれをＦｅＬＶｇｏ ７０に対する抗
体を生じさせるためのサブユニットワクチンとして使用
し、これによってＦｅＬＶ感染に対してネコを保護する
ことができる。
実質上構成することができ、又は組換ウィルスにより感
染された細胞の調製物であって例えばホルマリンもしく
はｂ−プロピオラクトン（Ｂ Ｐ Ｌ）での処理により
不活性化されたものから誘導することができる。組換ワ
クチニアウィルスｖＦｅＬＶｅｎｖにより感染されたヒ
ト・ヒーラ（Ｈｅｌａ）細胞はその表面に、真正なＦｅ
ＬＶウィルスにより感染された細胞よりも実質的に多く
のＦｅＬＶｇｐ ７０を蓄積することが示された〔第５
図、及び例３（Ｂ）（２）における検討を参照のこと〕
。感染された細胞の全培養物、又はその手積製された両
分、例えば膜画分は当業界において知られている方法の
中でも特にホルマリン又はＢＰＬにより不活性化するこ
とができ、そしてこれをＦｅＬＶｇｏ ７０に対する抗
体を生じさせるためのサブユニットワクチンとして使用
し、これによってＦｅＬＶ感染に対してネコを保護する
ことができる。
膜蛋白質の粗調製物をウィルスに感染された細胞から単
離することができる。このような粗膜調製物の例は、下
記のＵ及１方迭のセクション、〔発明の開示〕 この発明は、ＦｅＬＶエンベロープ蛋白質の発現をコー
ドする生組換ウィルス、該ウィルスの製造手段、及び該
ウィルスに基礎を置＜ ＦｅＬＶワクチン又は該ウィル
スにより感染された細胞の不活性化調製物の形でのＦｅ
ＬＶワクチンを提供する。
離することができる。このような粗膜調製物の例は、下
記のＵ及１方迭のセクション、〔発明の開示〕 この発明は、ＦｅＬＶエンベロープ蛋白質の発現をコー
ドする生組換ウィルス、該ウィルスの製造手段、及び該
ウィルスに基礎を置＜ ＦｅＬＶワクチン又は該ウィル
スにより感染された細胞の不活性化調製物の形でのＦｅ
ＬＶワクチンを提供する。
従って、この発明の１つの観点は、免疫原性ネコ白血病
ウィルスエンベロープ蛋白質の発現をコードする組換形
ウィルスを製造するために哺乳動物細胞のトランスフェ
クションにおいて使用する挿入ベクターであって、 （ａ）レプリケータ−； （ｂ）前記ウィルスのゲノムの非必須領域の少なくとも
部分；及び （Ｃ）前記ウィルスに感染された細胞内で活性なプロモ
ーター、翻訳開始コドン、及び前記蛋白質をコードしそ
して該プロモーターの制御のもとにあるＤＮＡ配列を含
んで成る、前記非必須領域内に挿入されたキメラ遺伝子
； を含んで成るベクターに関する。
ウィルスエンベロープ蛋白質の発現をコードする組換形
ウィルスを製造するために哺乳動物細胞のトランスフェ
クションにおいて使用する挿入ベクターであって、 （ａ）レプリケータ−； （ｂ）前記ウィルスのゲノムの非必須領域の少なくとも
部分；及び （Ｃ）前記ウィルスに感染された細胞内で活性なプロモ
ーター、翻訳開始コドン、及び前記蛋白質をコードしそ
して該プロモーターの制御のもとにあるＤＮＡ配列を含
んで成る、前記非必須領域内に挿入されたキメラ遺伝子
； を含んで成るベクターに関する。
この発明の他の観点は、ネコ白血病ウィルスワクチンと
して有用な感染性組換ウィルスに関し、該ウィルスは該
ウィルスに感染されるべき細胞内で活性なプロモーター
、翻訳開始コドン、及び免疫原性ネコ白血病ウィルスエ
ンベロープ蛋白質をコードしそして前記プロモーターの
制御のもとにあるＤＮＡ配列を含んで成るキメラ遺伝子
を有し、そして該キメラ遺伝子は前記ウィルスのゲノム
の非必須領域中に挿入されていることを特徴とする。
して有用な感染性組換ウィルスに関し、該ウィルスは該
ウィルスに感染されるべき細胞内で活性なプロモーター
、翻訳開始コドン、及び免疫原性ネコ白血病ウィルスエ
ンベロープ蛋白質をコードしそして前記プロモーターの
制御のもとにあるＤＮＡ配列を含んで成るキメラ遺伝子
を有し、そして該キメラ遺伝子は前記ウィルスのゲノム
の非必須領域中に挿入されていることを特徴とする。
この発明のその他の観点は、上記の組換ウィルスにより
感染された宿主哺乳類細胞に関する。
感染された宿主哺乳類細胞に関する。
この発明の他の観点は、上記の組換体ウィルスにより感
染された細胞又はその画分の不活性化調製物を含んで成
るＦｅＬＶワクチンに関し、前記画分は免疫原性ネコ白
血病ウィルスエンベロープ蛋白質に対する免疫反応を生
じさせるのに十分な量の該蛋白質を含有する。この不活
性化された細胞調製物はさらに医薬として許容される非
経腸担体を含んで成ることができる。
染された細胞又はその画分の不活性化調製物を含んで成
るＦｅＬＶワクチンに関し、前記画分は免疫原性ネコ白
血病ウィルスエンベロープ蛋白質に対する免疫反応を生
じさせるのに十分な量の該蛋白質を含有する。この不活
性化された細胞調製物はさらに医薬として許容される非
経腸担体を含んで成ることができる。
この発明の他の観点は、宿主中でのワクチン感染及び複
製に際して前記蛋白質に対する免疫反応を惹起するのに
十分な量の前記組換ウィルス、及び医薬として許容され
る非経腸ビヒクルを含んで成るＦｅＬＶワクチンに関す
る。
製に際して前記蛋白質に対する免疫反応を惹起するのに
十分な量の前記組換ウィルス、及び医薬として許容され
る非経腸ビヒクルを含んで成るＦｅＬＶワクチンに関す
る。
この発明の他の観点は、前記のワクチンのいずれかの有
効量によりネコを予防免疫することを含んで成る、ネコ
におけるＦｅＬＶ感染を予防する方法に関する。
効量によりネコを予防免疫することを含んで成る、ネコ
におけるＦｅＬＶ感染を予防する方法に関する。
この明細書において、“ＦｅＬＶエンベロープ蛋白質”
なる語は、完全エンベロープ蛋白質（ｇｐ７０及びｐ１
５Ｅの両者）、ｇｐ７０蛋白質、ＦｅＬＶのｇｐ７０エ
ンベロープ蛋白質及び他の菌属からのトランスメンプラ
ン領域、又はその免疫原性断片を包含することが意図さ
れる。” ＦｅＬＶエンベロープ配列”なる語は上に定
義したＦｅＬＶエンベロープ蛋白質をコードするヌクレ
オチド配列として定義される。
なる語は、完全エンベロープ蛋白質（ｇｐ７０及びｐ１
５Ｅの両者）、ｇｐ７０蛋白質、ＦｅＬＶのｇｐ７０エ
ンベロープ蛋白質及び他の菌属からのトランスメンプラ
ン領域、又はその免疫原性断片を包含することが意図さ
れる。” ＦｅＬＶエンベロープ配列”なる語は上に定
義したＦｅＬＶエンベロープ蛋白質をコードするヌクレ
オチド配列として定義される。
これらの用語はサブグループ又は株に限定されない。
この明細書において使用する場合、“ゲノムの非必須領
域”なる語は、ウィルスの感染又は複製のために必須で
ないウィルスゲノムのＤＮＡ配列を意味する。
域”なる語は、ウィルスの感染又は複製のために必須で
ないウィルスゲノムのＤＮＡ配列を意味する。
挿入ベクターを製造するために種々のプラスミド、コス
ミド、又はファージを使用することができる。造成され
た後、ベクターはＦｅＬＶエンベロープ蛋白質をコード
するＤＮＡ配列、及びウィルスに感染された後の宿主哺
乳類細胞中で活性なプロモーターの下流の翻訳開始コド
ンを含有する。ウィルスプロモーターが好ましく、特に
、操作されるべきウィルスの天然ゲノム中に存在するプ
ロモーターが好ましい。ＦｅＬＶエンベロープ配列／開
始コドン／ウィルスプロモーターから成る造成物をこの
明細書中では“ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子発現カセッ
ト”と称する。ベクターはさらに、操作されるべきウィ
ルスのウィルス性ゲノムの非必須領域を含有する。好ま
しくは、非必須領域は組換体の選択を可能にするマーカ
ー機能を含む。すなわち、カセットの挿入による該領域
の中断は検出可能な表現型の変化を生じさせる。好まし
い非必須領域はチミジンキナーゼ（ｔ ｋ）遺伝子であ
る。
ミド、又はファージを使用することができる。造成され
た後、ベクターはＦｅＬＶエンベロープ蛋白質をコード
するＤＮＡ配列、及びウィルスに感染された後の宿主哺
乳類細胞中で活性なプロモーターの下流の翻訳開始コド
ンを含有する。ウィルスプロモーターが好ましく、特に
、操作されるべきウィルスの天然ゲノム中に存在するプ
ロモーターが好ましい。ＦｅＬＶエンベロープ配列／開
始コドン／ウィルスプロモーターから成る造成物をこの
明細書中では“ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子発現カセッ
ト”と称する。ベクターはさらに、操作されるべきウィ
ルスのウィルス性ゲノムの非必須領域を含有する。好ま
しくは、非必須領域は組換体の選択を可能にするマーカ
ー機能を含む。すなわち、カセットの挿入による該領域
の中断は検出可能な表現型の変化を生じさせる。好まし
い非必須領域はチミジンキナーゼ（ｔ ｋ）遺伝子であ
る。
この領域はウィルスゲノムから切り出され、精製され、
そしてカセットを受は入るべきベクターに挿入される。
そしてカセットを受は入るべきベクターに挿入される。
カセットを挿入するためにこの領域の便利な制限部位が
使用される。
使用される。
下記の例１は、ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）サブグ
ループＢのガードナーーアルンスタイン（Ｇａｒｄｎｅ
ｒ−ＡｒｎｓｔｅｉｎＨＧＡ）株のネコ白血病ウィルス
（ＦｅＬＶ）エンベロープ遺伝子の発現をコードする組
換ワクチニアウィルスの造成を詳述する。
ループＢのガードナーーアルンスタイン（Ｇａｒｄｎｅ
ｒ−ＡｒｎｓｔｅｉｎＨＧＡ）株のネコ白血病ウィルス
（ＦｅＬＶ）エンベロープ遺伝子の発現をコードする組
換ワクチニアウィルスの造成を詳述する。
例２は、ＦｅＬＶサブグループＡウィルスのＦｅＬＶエ
ンベロープ遺伝子がクローン化されている同様の造成物
を記載する。
ンベロープ遺伝子がクローン化されている同様の造成物
を記載する。
例３は、多数の異るタイプの実験により、例１に従って
造成されたサブグループＢの組換ワクチニアウィルスｖ
ＦｅＬＶｅｎνによるＦｅＬＶエンベロープ遺伝子の発
現を特徴付ける。
造成されたサブグループＢの組換ワクチニアウィルスｖ
ＦｅＬＶｅｎνによるＦｅＬＶエンベロープ遺伝子の発
現を特徴付ける。
第４図はネコ白血病に対する感染性組換ウィルスワクチ
ンの他の造成を例示し、この場合例１及び２のＦｅＬＶ
のｐ１５Ｂ ）ランスメンプラン領域が水庖性口内炎ウ
ィルス（ＶＳＶ） Ｇ蛋白質の疎水性トランスメンプラ
ン領域により喚き置えられている。
ンの他の造成を例示し、この場合例１及び２のＦｅＬＶ
のｐ１５Ｂ ）ランスメンプラン領域が水庖性口内炎ウ
ィルス（ＶＳＶ） Ｇ蛋白質の疎水性トランスメンプラ
ン領域により喚き置えられている。
例４の造成物は好ましい造成物を代表する。
前記の（背景）の部で示したように、ＦｅＬＶのｐ１５
Ｅ膜付着蛋白はＦｅＬＶ疾患に関連する免疫抑制に関連
付けられている。Ｒ４ｅｄｅｌ （Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、
、５４ ：２２４−２２８ （ｂ９８５））は、水庖
性口内炎ウィルス（ＶＳＶ） Ｇ蛋白質の又は家禽ベス
ト（ｆｏｗｌ ｐｌａｇｕｅ）ウィルス・ヘマグルチニ
ンの疎水性トランスメンプラン領域が他のウィルス蛋白
質、セムリキ森林（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ）ウ
ィルスＥ２蛋白質を細胞表面に向けることができること
を示した。従って、ＬｅＬＶウィルスの免疫原性を増強
するためには、この発明に従って１１製される感染性組
換ウィルスはＦｅＬＶのｐ１５Ｂ蛋白質以外のトランス
メンプラン蛋白質をコードする遺伝子を含有することが
好ましい。
Ｅ膜付着蛋白はＦｅＬＶ疾患に関連する免疫抑制に関連
付けられている。Ｒ４ｅｄｅｌ （Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、
、５４ ：２２４−２２８ （ｂ９８５））は、水庖
性口内炎ウィルス（ＶＳＶ） Ｇ蛋白質の又は家禽ベス
ト（ｆｏｗｌ ｐｌａｇｕｅ）ウィルス・ヘマグルチニ
ンの疎水性トランスメンプラン領域が他のウィルス蛋白
質、セムリキ森林（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ）ウ
ィルスＥ２蛋白質を細胞表面に向けることができること
を示した。従って、ＬｅＬＶウィルスの免疫原性を増強
するためには、この発明に従って１１製される感染性組
換ウィルスはＦｅＬＶのｐ１５Ｂ蛋白質以外のトランス
メンプラン蛋白質をコードする遺伝子を含有することが
好ましい。
例１及び２の造成において、ｐ１５Ｅを機能的に置き換
えるために多くの異る由来の疎水性トランスメンプラン
領域を使用することができる。例えば、他のトランスメ
ンプラン蛋白質には赤血球細胞蛋白質グリコホリン及び
繊維状バクテリオファージのコート蛋白質が含まれる。
えるために多くの異る由来の疎水性トランスメンプラン
領域を使用することができる。例えば、他のトランスメ
ンプラン蛋白質には赤血球細胞蛋白質グリコホリン及び
繊維状バクテリオファージのコート蛋白質が含まれる。
このような疎水性トランスメンプラン領域はｖｓｖ ｃ
蛋白質、ヘルペスシンプレックスｇＤ蛋白質、免疫グロ
ブリンＭもしくはＧ蛋白質、又は家禽ペストウィルスか
らのものであることが好ましい。
蛋白質、ヘルペスシンプレックスｇＤ蛋白質、免疫グロ
ブリンＭもしくはＧ蛋白質、又は家禽ペストウィルスか
らのものであることが好ましい。
このようなトランスノンプラン領域をコードする核酸配
列はサブグループＡ又はＢ ＦｅＬＶのｇｐ７０蛋白質
をコードする配列の狂Ａ １部位内に挿入することがで
きる。肛Ａ１部位は第２図及び第１０図中に示されてい
る。細菌プラスミドｐ ｔＧＡΔｆ１ｇｉ＾■の造成に
おいてはｇｐ７０遺伝子のＣ−末端近くの且■Ｈ１部位
を使用し、この場合且■Ａ１部位を一層便利な１匹ＲＩ
部位に転換した。このＥｃｏＲＩ部位の挿入により、Ｆ
ｅＬＶｇｐ８５前駆体が正常であればプロセシングされ
てｇｐ７０及びｐ１５Ｅをもたらす蛋白質開裂部位が除
去される。
列はサブグループＡ又はＢ ＦｅＬＶのｇｐ７０蛋白質
をコードする配列の狂Ａ １部位内に挿入することがで
きる。肛Ａ１部位は第２図及び第１０図中に示されてい
る。細菌プラスミドｐ ｔＧＡΔｆ１ｇｉ＾■の造成に
おいてはｇｐ７０遺伝子のＣ−末端近くの且■Ｈ１部位
を使用し、この場合且■Ａ１部位を一層便利な１匹ＲＩ
部位に転換した。このＥｃｏＲＩ部位の挿入により、Ｆ
ｅＬＶｇｐ８５前駆体が正常であればプロセシングされ
てｇｐ７０及びｐ１５Ｅをもたらす蛋白質開裂部位が除
去される。
プラスミドｐｔＧ＾ΔＨｇ１ＡＩにより形質転換された
Ｅ、コリ （Ｅ、ｃｏｌｉ） Ｋ−１２株ＭＭ２９４−
１のサンプルがアメリカン・タイプ・カルチエアー・コ
レクション（＾ＴＣＣ）、１２３０１パークラウンドラ
イブ、ロックビル、メリーランドに、１９８３年１２月
２日に受託番号ｍ３９，５３３として寄託された。
Ｅ、コリ （Ｅ、ｃｏｌｉ） Ｋ−１２株ＭＭ２９４−
１のサンプルがアメリカン・タイプ・カルチエアー・コ
レクション（＾ＴＣＣ）、１２３０１パークラウンドラ
イブ、ロックビル、メリーランドに、１９８３年１２月
２日に受託番号ｍ３９，５３３として寄託された。
これらの蛋白質ドメインの融合体を造成するための核酸
の操作は小プラスミド、例えばｐｔｃ＾ΔＨｇ１ＡＩ中
で便利に行うことができ、そして次にそれぞれ例１及び
２のｐＶＧＡ又はｐＶＧＡ−へのｅｎｖ遺伝子中に切り
替えることができる。
の操作は小プラスミド、例えばｐｔｃ＾ΔＨｇ１ＡＩ中
で便利に行うことができ、そして次にそれぞれ例１及び
２のｐＶＧＡ又はｐＶＧＡ−へのｅｎｖ遺伝子中に切り
替えることができる。
Ｍｓｔ １１部位はサブグループＡ ＦｅＬＶウィルス
及びサブグループＢ ＦｅＬＶウィルスの両者のｇｐ７
Ｏｆ＋Ｉ域中に保存された部位である。切り替え手順は
、ｇｐ７０のＭｓｔｌ［部位から任意の便利な遠位部位
に延びる断片を、前記の便利な小プラスミドから、完全
なＦｅＬＶｇｐ ８５ ＳＮ域を含有しそして匹敵する
断片（ＭｓｔｌＩから適当な遠位部位まで）が切除され
ている挿入ベクター、例えばｐＶＧＡに切り替えること
により達成される。例４はこのような手順を例示し、こ
の場合断片Ａ及びＢが切り替えられる断片を代表する（
さらに第１Ｏ図を参照のこと）。
及びサブグループＢ ＦｅＬＶウィルスの両者のｇｐ７
Ｏｆ＋Ｉ域中に保存された部位である。切り替え手順は
、ｇｐ７０のＭｓｔｌ［部位から任意の便利な遠位部位
に延びる断片を、前記の便利な小プラスミドから、完全
なＦｅＬＶｇｐ ８５ ＳＮ域を含有しそして匹敵する
断片（ＭｓｔｌＩから適当な遠位部位まで）が切除され
ている挿入ベクター、例えばｐＶＧＡに切り替えること
により達成される。例４はこのような手順を例示し、こ
の場合断片Ａ及びＢが切り替えられる断片を代表する（
さらに第１Ｏ図を参照のこと）。
ｇｐ７０ｅｎｖ遺伝子及びトランスメンプラン蛋白質を
コードする代替可能な遺伝子を有するカセットを適切な
挿入ベクター中に切り替えた後、例１ （Ｂ）において
後記する方法に類似する方法に従って組換ワクチニアウ
ィルスを調製することができる。
コードする代替可能な遺伝子を有するカセットを適切な
挿入ベクター中に切り替えた後、例１ （Ｂ）において
後記する方法に類似する方法に従って組換ワクチニアウ
ィルスを調製することができる。
最終的にカセットが導入されるウィルスはネコの細胞中
で高コピーレベルの複製を行うことができそしてネコの
細胞中での複製の間に異種性ＦｅＬＶエンベロープ遺伝
子の発現を可能にするものでなければならない。ネコに
正常に感染するウィルス、例えばネコ・ヘルペスウイル
ス（ＦＨＶ）を使用することができる。この明細書に記
載する要件に合致する限り他のウィルス、例えばワクチ
ニアウィルス及び他のポックスウィルスを使用すること
ができる。
で高コピーレベルの複製を行うことができそしてネコの
細胞中での複製の間に異種性ＦｅＬＶエンベロープ遺伝
子の発現を可能にするものでなければならない。ネコに
正常に感染するウィルス、例えばネコ・ヘルペスウイル
ス（ＦＨＶ）を使用することができる。この明細書に記
載する要件に合致する限り他のウィルス、例えばワクチ
ニアウィルス及び他のポックスウィルスを使用すること
ができる。
ワクチニアウィルスがネコ中で複製することができるこ
とが知られている（ Ｇａ５ｋｅｌ１等、シ１ユＲｅｃ
ｏｒｄ、旦２ ：１７１−１７２（ｂ９８３）） 、ネ
コにおいて複製するワクチニアウィルスの能力を定量す
るため、ネコ、ネズミ及びヒト由来の細胞（それぞれＣ
ＲＦＫ又はＦｃ ９ ；Ｌ９２９；及びヒーラ−又は１
４３Ｂ）に例１の組換ワクチニアウィルスを感染せしめ
、そしてウィルスの生産及びＦｅＬＶｅｎｖ蛋白質の蓄
積を測定した〔下記の例３（Ｃ）及び第８図を参照のこ
と〕。
とが知られている（ Ｇａ５ｋｅｌ１等、シ１ユＲｅｃ
ｏｒｄ、旦２ ：１７１−１７２（ｂ９８３）） 、ネ
コにおいて複製するワクチニアウィルスの能力を定量す
るため、ネコ、ネズミ及びヒト由来の細胞（それぞれＣ
ＲＦＫ又はＦｃ ９ ；Ｌ９２９；及びヒーラ−又は１
４３Ｂ）に例１の組換ワクチニアウィルスを感染せしめ
、そしてウィルスの生産及びＦｅＬＶｅｎｖ蛋白質の蓄
積を測定した〔下記の例３（Ｃ）及び第８図を参照のこ
と〕。
ワクチニアウィルス株ＷＲ及び誘導された組換ウィルス
の複製がネコ及びネズミ由来の細胞中で幾分制限される
ことが実験により示された。このようなウィルス生産の
減少は１ｏｏｏ倍のオーダーであり得る。インビトロで
、そしておそらくインビボで生産されるＦｅＬＶｇｐ
７０蛋白質の量の減少がウィルス生産のこのような減少
に随伴する。
の複製がネコ及びネズミ由来の細胞中で幾分制限される
ことが実験により示された。このようなウィルス生産の
減少は１ｏｏｏ倍のオーダーであり得る。インビトロで
、そしておそらくインビボで生産されるＦｅＬＶｇｐ
７０蛋白質の量の減少がウィルス生産のこのような減少
に随伴する。
インビボでのＰｅＬＶｇρ７０免疫原の生産レベルを上
昇せしめるために、ネコの細胞中で増強された複製を行
うウィルスベクターを使用するのが好ましい。ネコ細胞
中で増強された複製を行うこのようなウィルスベクター
を、この明細書においてはネコに馴化されたワクチンウ
ィルスベクター、又はネコが宿主である宿主域変異体と
称する。各場合において、この発明で使用されるウィル
スベクターはネコに馴化されていることが好ましい。こ
の発明において使用するために好ましいウィルスである
ネコ・ヘルペスウイルスが天然のネコに馴化されたウィ
ルスの１例である。
昇せしめるために、ネコの細胞中で増強された複製を行
うウィルスベクターを使用するのが好ましい。ネコ細胞
中で増強された複製を行うこのようなウィルスベクター
を、この明細書においてはネコに馴化されたワクチンウ
ィルスベクター、又はネコが宿主である宿主域変異体と
称する。各場合において、この発明で使用されるウィル
スベクターはネコに馴化されていることが好ましい。こ
の発明において使用するために好ましいウィルスである
ネコ・ヘルペスウイルスが天然のネコに馴化されたウィ
ルスの１例である。
その自然状態ではネコに馴化されない宿主域変異体を単
離するため、親ウィルスベクター、例えばワクチニアウ
ィルスベクターＷＲ株又は誘導された組換ウィルス、例
えばＣｈａｋｒａｂａｒｔｉ等〔勿ムＣｅ１ｌ Ｂｉｏ
ｌ、 ５ （ｂ２） ： ３４０３−３４９０（ｂ９
８５年１２月）のβ−ガラクトシダーゼ標識花ウつルス
（青色標識ウィルス；νＳＣ８又はｖＳＣ９）を、宿主
域変異体を生じさせるのに好都合な条件下でネコ細胞中
で繰り返し縫代する。ＭｃＧｕｉｒｅ等は、“ポックス
ウィルスの縫代中の宿主域変異体の発生に好都合な条件
”と題する彼等の論文（Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、
１９ ： ３０１−３１０ （ｂ９７３））中にこのよ
うな方法を十分に記載している。マウス細胞及びラビッ
ト細胞中で高効率で複製するＷＲワクチニアウィルスの
宿主域変異体が調製されている〔それぞれ、Ｄｕｎｌａ
ｐ等、Ｊ、 Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１． １００ （６）：１
３３５−１３３９（ｂ９６Ｂ）；及びＧａｎｇｅｍｉ等
、Ｖｉｒｏｌ、、７３ ： １６５−１７２ （ｂ９６
７））。
離するため、親ウィルスベクター、例えばワクチニアウ
ィルスベクターＷＲ株又は誘導された組換ウィルス、例
えばＣｈａｋｒａｂａｒｔｉ等〔勿ムＣｅ１ｌ Ｂｉｏ
ｌ、 ５ （ｂ２） ： ３４０３−３４９０（ｂ９
８５年１２月）のβ−ガラクトシダーゼ標識花ウつルス
（青色標識ウィルス；νＳＣ８又はｖＳＣ９）を、宿主
域変異体を生じさせるのに好都合な条件下でネコ細胞中
で繰り返し縫代する。ＭｃＧｕｉｒｅ等は、“ポックス
ウィルスの縫代中の宿主域変異体の発生に好都合な条件
”と題する彼等の論文（Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、
１９ ： ３０１−３１０ （ｂ９７３））中にこのよ
うな方法を十分に記載している。マウス細胞及びラビッ
ト細胞中で高効率で複製するＷＲワクチニアウィルスの
宿主域変異体が調製されている〔それぞれ、Ｄｕｎｌａ
ｐ等、Ｊ、 Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１． １００ （６）：１
３３５−１３３９（ｂ９６Ｂ）；及びＧａｎｇｅｍｉ等
、Ｖｉｒｏｌ、、７３ ： １６５−１７２ （ｂ９６
７））。
異種性ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子は、ウィルスＤＮＡ
と挿入ベクターとの哺乳類細胞への同時トランスフェク
ションにより、ウィルス中に導入される。用いられる特
定のウィルスに依存して、細胞は増殖性感染を達成する
ためにウィルスにより感染されなければならない。ヒト
細胞を含む色々な種の哺乳類細胞をワクチニアウィルス
と共に使用することができる。しかしながらネコヘルペ
スウィルスを用いるこの方法においてはネコ細胞のみを
使用することができる。同時トランスフェクションは非
必須領域（例えばＴＫ配列及びウィルスＤＮＡ及び挿入
ベクターの間の非相同性（ｈｅ ｔｅｒｏ ｌｏｇｏｕ
ｓ）組換を可能にし、ウィルスゲノムへのカセットの挿
入をもたらす。ウィルスＴＫ遺伝子を非必須領域として
使用する場合、挿入によりこの遺伝子が中断され、そし
て組換遺伝子をそのＴＫ−マイナス表現型に基いて、又
は発現可能なＥ、コリβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａ
ｌ）遺伝子がマーカーとして使用されるＣｈａｋｒａｂ
ａｒｔｉ等、前掲の方法による青から白への変化につい
てスクリーニングすることにより選択することができる
。
と挿入ベクターとの哺乳類細胞への同時トランスフェク
ションにより、ウィルス中に導入される。用いられる特
定のウィルスに依存して、細胞は増殖性感染を達成する
ためにウィルスにより感染されなければならない。ヒト
細胞を含む色々な種の哺乳類細胞をワクチニアウィルス
と共に使用することができる。しかしながらネコヘルペ
スウィルスを用いるこの方法においてはネコ細胞のみを
使用することができる。同時トランスフェクションは非
必須領域（例えばＴＫ配列及びウィルスＤＮＡ及び挿入
ベクターの間の非相同性（ｈｅ ｔｅｒｏ ｌｏｇｏｕ
ｓ）組換を可能にし、ウィルスゲノムへのカセットの挿
入をもたらす。ウィルスＴＫ遺伝子を非必須領域として
使用する場合、挿入によりこの遺伝子が中断され、そし
て組換遺伝子をそのＴＫ−マイナス表現型に基いて、又
は発現可能なＥ、コリβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａ
ｌ）遺伝子がマーカーとして使用されるＣｈａｋｒａｂ
ａｒｔｉ等、前掲の方法による青から白への変化につい
てスクリーニングすることにより選択することができる
。
他の方法として、ＤＮＡ−〇ＮＡハイブリタイゼーショ
ンを通して異種性遺伝子を検出することにより、又は細
胞中でのウィルスの複製を通して生産されるＦｅＬＶエ
ンベロープ蛋白質の存在を検出することにより組換体を
同定することができる。組換体の同定の後、常法に従っ
て純粋な組換体ウィルスを単離し、そしてこれを用いて
感受性宿主細胞に感染せしめて組換ウィルスの大ストッ
クを得ることができる。ウィルスを感染細胞から単離し
、そして種々の経路でネコに投与するために注射用ビヒ
クルと共に製剤化することができる。予防免疫において
使用する投与量及び投与方法はネコの体重及び齢に依存
して異るであろう。
ンを通して異種性遺伝子を検出することにより、又は細
胞中でのウィルスの複製を通して生産されるＦｅＬＶエ
ンベロープ蛋白質の存在を検出することにより組換体を
同定することができる。組換体の同定の後、常法に従っ
て純粋な組換体ウィルスを単離し、そしてこれを用いて
感受性宿主細胞に感染せしめて組換ウィルスの大ストッ
クを得ることができる。ウィルスを感染細胞から単離し
、そして種々の経路でネコに投与するために注射用ビヒ
クルと共に製剤化することができる。予防免疫において
使用する投与量及び投与方法はネコの体重及び齢に依存
して異るであろう。
（例）
次の例はこの発明をさらに説明するためのものであって
、この発明の範囲を限定するものではない。次の材料及
び方法を以下の例において使用した。
、この発明の範囲を限定するものではない。次の材料及
び方法を以下の例において使用した。
ＧＡ−ＦｅＬＶウィルス（Ｍｕｌｌｉｎｓ等、Ｊ、Ｖｉ
ｒｏｌ、、井： ６８８−７０３ （ｂ９８１））を生
産するヒトＲＤはＮ、Ｄａｖｉｄｓｏｎ（カルテツク）
から得た。分子クローン化ＧＡ−ＦｅＬνプロウイルス
ＣＭａｌｌｉｎｓ等、前掲〕を発現するイヌＣＦ−２細
胞はＪ、 Ｅｌｄｅｒ（ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔ
ｕｔｅ ｏｆ ５ｃｒｉｐｓ Ｃ１ｏｎｉｃ）から提供
された。
ｒｏｌ、、井： ６８８−７０３ （ｂ９８１））を生
産するヒトＲＤはＮ、Ｄａｖｉｄｓｏｎ（カルテツク）
から得た。分子クローン化ＧＡ−ＦｅＬνプロウイルス
ＣＭａｌｌｉｎｓ等、前掲〕を発現するイヌＣＦ−２細
胞はＪ、 Ｅｌｄｅｒ（ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔ
ｕｔｅ ｏｆ ５ｃｒｉｐｓ Ｃ１ｏｎｉｃ）から提供
された。
チミジンキナーゼ欠損ヒト・セルライン１４３Ｂ（Ｗｅ
ｉｒ等、 ＰＮＡＳ（ＵＳＡ） 、 ７９ ：
１２１０−１２１４（ｂ９８２） ）はに、 Ｈｕｅ
ｂｎｅｒ（Ｔｈｅ Ｗｉｓｔｅｒ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ
）から得、そしてネズミＬ−９２９細胞は１．Ｏｌｄ
（ＭｅｍｏｒｉａｌＳｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ
Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）から得た。
ｉｒ等、 ＰＮＡＳ（ＵＳＡ） 、 ７９ ：
１２１０−１２１４（ｂ９８２） ）はに、 Ｈｕｅ
ｂｎｅｒ（Ｔｈｅ Ｗｉｓｔｅｒ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ
）から得、そしてネズミＬ−９２９細胞は１．Ｏｌｄ
（ＭｅｍｏｒｉａｌＳｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ
Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）から得た。
ヒト・ヒーラ細胞及びネコＣＲＦＫｍ胞［Ｃｒａｎｄｅ
ｌｌ等、Ｉｎ Ｖｉｖｏ 、 ９ ： １７６−１８５
（ｂ９７３））はアメリカン・タイプ・カルチュアー
・コレクション（ＡＴＣＣ）から得た。ワクチニアウィ
ルスの野性型ＷＲ株はＢ、 Ｍｏ５ｓ（Ｎ Ｉ Ｈ）か
ら得た。
ｌｌ等、Ｉｎ Ｖｉｖｏ 、 ９ ： １７６−１８５
（ｂ９７３））はアメリカン・タイプ・カルチュアー
・コレクション（ＡＴＣＣ）から得た。ワクチニアウィ
ルスの野性型ＷＲ株はＢ、 Ｍｏ５ｓ（Ｎ Ｉ Ｈ）か
ら得た。
ＣＲＦＫ以外のすべてのセルラインは１０％ウシ胎児血
清（Ｆ Ｂ Ｓ）及びゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ
Ｈシエーリング）を補充されたドルベコ−イーグル培地
（ＤＭＥ ；イルビン・サイエンティフィック）中に増
殖せしめた。ＣＲＦＫ細胞は上記のように補充されたマ
ツコイ５Ａ（改変）培地（ギブユ）中に増殖せしめた。
清（Ｆ Ｂ Ｓ）及びゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ
Ｈシエーリング）を補充されたドルベコ−イーグル培地
（ＤＭＥ ；イルビン・サイエンティフィック）中に増
殖せしめた。ＣＲＦＫ細胞は上記のように補充されたマ
ツコイ５Ａ（改変）培地（ギブユ）中に増殖せしめた。
ワクチニアウィルスは標準的技法を用いて増殖せしめた
。細胞−関連ワクチニアウィルスを単離し、そしてＪｏ
ｋｌｉｋ、 Ｖｉｒｏｌ、、１８ ： ９−１８（ｂ９
６２）により記載されているようにしてシュークロース
勾配遠心により精製した。ウィルスＤＮＡは精製された
ピリオンからＮａｋａｎｏ等（ＰＮＡＳ（ＵＳＡ） 、
７９ ： １５９３−１５９６ （ｂ９８２） ）に記
載されているようにして調製した。ワクチニアウィルス
のプラークの定量及び単離のため、接種された細胞単層
（ヒーラ又は１４３ Ｂ ”）に０．６％アガロース、
２％ＦＢＳ及び５０μｇ／ｍｌｌのゲンタマイシンを含
有する培地を重層した。ｔｋ−ウィルスプラークの単離
のため、アガロース上層をさらに２５μｇ ／ Ｔｒｉ
１ブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）とした。永続
して感染されている細胞からのＦｅＬＶウィルスを培養
上清から、Ｆｒａｎｋｅｌ等、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 、
１８ ： ４８１−４９０（ｂ９７６）により記載され
ている方法を用いて部分精製した。
。細胞−関連ワクチニアウィルスを単離し、そしてＪｏ
ｋｌｉｋ、 Ｖｉｒｏｌ、、１８ ： ９−１８（ｂ９
６２）により記載されているようにしてシュークロース
勾配遠心により精製した。ウィルスＤＮＡは精製された
ピリオンからＮａｋａｎｏ等（ＰＮＡＳ（ＵＳＡ） 、
７９ ： １５９３−１５９６ （ｂ９８２） ）に記
載されているようにして調製した。ワクチニアウィルス
のプラークの定量及び単離のため、接種された細胞単層
（ヒーラ又は１４３ Ｂ ”）に０．６％アガロース、
２％ＦＢＳ及び５０μｇ／ｍｌｌのゲンタマイシンを含
有する培地を重層した。ｔｋ−ウィルスプラークの単離
のため、アガロース上層をさらに２５μｇ ／ Ｔｒｉ
１ブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）とした。永続
して感染されている細胞からのＦｅＬＶウィルスを培養
上清から、Ｆｒａｎｋｅｌ等、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 、
１８ ： ４８１−４９０（ｂ９７６）により記載され
ている方法を用いて部分精製した。
■■左且料
ワクチニアウィルス挿入ベクターｐＧｓ２０（Ｍａｃｋ
ｅｔｔ等、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 、４９ ： ８５７−
８６４（ｂ９８４） ）はＧ、Ｓｍ１ｔｈ及びＢ、 Ｍ
ｏ５ｓ（Ｎ Ｉ Ｈ）から提供された。
ｅｔｔ等、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 、４９ ： ８５７−
８６４（ｂ９８４） ）はＧ、Ｓｍ１ｔｈ及びＢ、 Ｍ
ｏ５ｓ（Ｎ Ｉ Ｈ）から提供された。
このプラスミドは、ワクチニアウィルスのゲノム中外来
性遺伝子の挿入及び発現を可能にするベクターとして機
能する。ｐＧｓ２０により形質転換されたＥ、コリ）１
８１０１のサンプルはＡＴＣＣ嵐３９ 、２４９として
１９８２年１１月３０日にＡＴＣＣに寄託された。この
寄託は、国際公開Ｉ’ｌ＆１Ｗ０８４１０２０７？（ｂ
９８４年６月７日公開；国際出願１１ｈＰＣＴ／ＵＳ８
３１０１８６３に基く）において言及されている。
性遺伝子の挿入及び発現を可能にするベクターとして機
能する。ｐＧｓ２０により形質転換されたＥ、コリ）１
８１０１のサンプルはＡＴＣＣ嵐３９ 、２４９として
１９８２年１１月３０日にＡＴＣＣに寄託された。この
寄託は、国際公開Ｉ’ｌ＆１Ｗ０８４１０２０７？（ｂ
９８４年６月７日公開；国際出願１１ｈＰＣＴ／ＵＳ８
３１０１８６３に基く）において言及されている。
分子クローン化ＧＡ−ＦｅＬＶ−Ｂプロウィルス（λＨ
Ｆ６０） （Ｍｕｌｌｉｎｓ等、前掲）はＡ、 Ｒｏａ
ｃｔｌ及びＮ、 Ｄａｖｉｄｓｏｎ（Ｃａｌｔｅｃ）に
よりｐＫＣ７由来プラスミドｐＫＨＲ−１の形で提供さ
れた。このプラスミドはトランスフェクション・アッセ
イにおいて感染性である。このプラスミドは、Ｌ■■に
よる消化後の再環化によりＦｅＬＶｅｎｖ遺伝子及び３
’ ＬＴＲのみを含有するように縮小された。この小
さいプラスミドρＧＡｐｖは、これらの研究において使
用されるＦｅＬＶｅｎｖ遺伝子配列を提供した。
Ｆ６０） （Ｍｕｌｌｉｎｓ等、前掲）はＡ、 Ｒｏａ
ｃｔｌ及びＮ、 Ｄａｖｉｄｓｏｎ（Ｃａｌｔｅｃ）に
よりｐＫＣ７由来プラスミドｐＫＨＲ−１の形で提供さ
れた。このプラスミドはトランスフェクション・アッセ
イにおいて感染性である。このプラスミドは、Ｌ■■に
よる消化後の再環化によりＦｅＬＶｅｎｖ遺伝子及び３
’ ＬＴＲのみを含有するように縮小された。この小
さいプラスミドρＧＡｐｖは、これらの研究において使
用されるＦｅＬＶｅｎｖ遺伝子配列を提供した。
ＦｅＬＶｇｐ ７０−特異的モノクローナル抗体、クロ
ーン２５．５はすでに記載されている（Ｌｕｔｚ等、Ｖ
ｅｔ。
ーン２５．５はすでに記載されている（Ｌｕｔｚ等、Ｖ
ｅｔ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、 ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏ ａｔｈ、
２：４２５−４４０（ｂ９８１）） −このＩｇＧＩ
抗体はＦｅＬＶ感染性を中和し、そしてＦｅＬＶｇｐ７
０中の定義された決定基を認識する［ Ｎｕｎｂｅｒｇ
等、ＰＮＡＳ （ＵＳＡ）、８１ ： ３６７５−３６
７９（ｂ９８４） ）。エンザイムーリンクド・イムノ
ソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のための抗体のホ
ースラディッショ・パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合体
は記載されているようにして調製した（Ｌｕｔｚ等、Ｊ
、 Ｉ＋＋ｕａｕｎｏ１． Ｍｅｔｈｏｄｓ 、 ５６
： ２０９−２２０ （ｂ９８３））。
２：４２５−４４０（ｂ９８１）） −このＩｇＧＩ
抗体はＦｅＬＶ感染性を中和し、そしてＦｅＬＶｇｐ７
０中の定義された決定基を認識する［ Ｎｕｎｂｅｒｇ
等、ＰＮＡＳ （ＵＳＡ）、８１ ： ３６７５−３６
７９（ｂ９８４） ）。エンザイムーリンクド・イムノ
ソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のための抗体のホ
ースラディッショ・パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合体
は記載されているようにして調製した（Ｌｕｔｚ等、Ｊ
、 Ｉ＋＋ｕａｕｎｏ１． Ｍｅｔｈｏｄｓ 、 ５６
： ２０９−２２０ （ｂ９８３））。
同じエピトープ（公表されていない）を認識する他のウ
ィルス中和モノクローナル抗体（ＣＩＩＤ８）（Ｇｒａ
ｎｔ等、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 、１３１：３０４２
−３０４８（ｂ９８３）はＣ，Ｇｒａｎｔ（Ｐａｃｉｆ
ｉｃ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｆｏｕ
ｎｄａ−ｔｉｏｎ）により提供された。このＩｇＧ２抗
体はスタフィロコッカス（Ｓｔａ ｈ １ｏｃｏｃｃｕ
ｓ）プロティンＡに結合する抗体を必要とする実験にお
いて使用した。
ィルス中和モノクローナル抗体（ＣＩＩＤ８）（Ｇｒａ
ｎｔ等、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 、１３１：３０４２
−３０４８（ｂ９８３）はＣ，Ｇｒａｎｔ（Ｐａｃｉｆ
ｉｃ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｆｏｕ
ｎｄａ−ｔｉｏｎ）により提供された。このＩｇＧ２抗
体はスタフィロコッカス（Ｓｔａ ｈ １ｏｃｏｃｃｕ
ｓ）プロティンＡに結合する抗体を必要とする実験にお
いて使用した。
皿換旦Σへ広
使用した組換ＤＮＡ法はＭａｎｉａｔｉｓ等［Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ（ｂ９８２） ）により記載された通りである。核酸
酵素はニューイングランドビオラプス又はベセスダリサ
ーチラボラトリーズから得られ、そして製造者により記
載された通りに使用した。
ｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ（ｂ９８２） ）により記載された通りである。核酸
酵素はニューイングランドビオラプス又はベセスダリサ
ーチラボラトリーズから得られ、そして製造者により記
載された通りに使用した。
組 ワクチニアウィルス法
組換ワクチニアウィルスを誘導するために使用した一般
的方法は記載されている（ Ｍａｃｈｅｔｔ等、前掲；
Ｍｏ５ｓ等、Ｇｅｎｅ Ａｍ 、 ａｎ虹Ａｎａ１．
、ｉ：２０１−２１３ （ｂ９８３））。ワクチニアウ
ィルスにより感染された１４３Ｂ細胞にワクチニアウィ
ルスＤＮＡ及びＦｅＬＶｅｎｖ遺伝子を含有するｐＧｓ
２０由来挿入ベクター（ｐＶＧＡ）をトランスフェクト
し、そして子孫ウィルスをＢＵｄＲ（２５μｇ／ｍｌ＞
の存在下で増殖せしめることにより組換体（ｔｋ−）ゲ
ノムについて選択した。ＢＵｄＲ−耐性ウィルスをプラ
ーク−精製し、そして挿入及びＰｅＬＶｅｎｖ遺伝子の
発現について次のようにしてスクリーニングした。ヒー
ラ細胞の単層に候補ウィルス単離体を感染せしめ、そし
て２日後に０． Ｉ Ｍ ＮａｚＣＯｓ（ｂ）Ｈ９）（
ＥＬＩＳＡコート緩衝液）中での細胞溶解により収得し
た。溶解物（ｌｙｓａｔｅ）の一部をＥＬＩＳＡアッセ
イにおいて直接使用することによりＦｅＬＶｇｐ７０を
検出した。溶解物を用いてミクロタイターウェルをコー
トし、そしてＨＲＰ−接合モツクローナル抗体（２５，
５）及び２．２′−アジノージ（３−エチルベンズチア
ゾリンスルホン酸） （ＡＢＴＳ ；シグマ）基質を用
いてＦｅＬＶｅｎｖ蛋白質を検出した（Ｌｕｔｚ等、Ｖ
ｅｔ。
的方法は記載されている（ Ｍａｃｈｅｔｔ等、前掲；
Ｍｏ５ｓ等、Ｇｅｎｅ Ａｍ 、 ａｎ虹Ａｎａ１．
、ｉ：２０１−２１３ （ｂ９８３））。ワクチニアウ
ィルスにより感染された１４３Ｂ細胞にワクチニアウィ
ルスＤＮＡ及びＦｅＬＶｅｎｖ遺伝子を含有するｐＧｓ
２０由来挿入ベクター（ｐＶＧＡ）をトランスフェクト
し、そして子孫ウィルスをＢＵｄＲ（２５μｇ／ｍｌ＞
の存在下で増殖せしめることにより組換体（ｔｋ−）ゲ
ノムについて選択した。ＢＵｄＲ−耐性ウィルスをプラ
ーク−精製し、そして挿入及びＰｅＬＶｅｎｖ遺伝子の
発現について次のようにしてスクリーニングした。ヒー
ラ細胞の単層に候補ウィルス単離体を感染せしめ、そし
て２日後に０． Ｉ Ｍ ＮａｚＣＯｓ（ｂ）Ｈ９）（
ＥＬＩＳＡコート緩衝液）中での細胞溶解により収得し
た。溶解物（ｌｙｓａｔｅ）の一部をＥＬＩＳＡアッセ
イにおいて直接使用することによりＦｅＬＶｇｐ７０を
検出した。溶解物を用いてミクロタイターウェルをコー
トし、そしてＨＲＰ−接合モツクローナル抗体（２５，
５）及び２．２′−アジノージ（３−エチルベンズチア
ゾリンスルホン酸） （ＡＢＴＳ ；シグマ）基質を用
いてＦｅＬＶｅｎｖ蛋白質を検出した（Ｌｕｔｚ等、Ｖ
ｅｔ。
Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１．．２ ：４２５−４４０（ｂ９８１
）） 、溶解物の残りを使用してドツトハイブリダイゼ
ーション分析用の高分子ＤＮＡを単離した。溶解物を０
．０５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，０） 、０．０１Ｍ Ｅ
ＤＴＡ 、 ０．５％ＳＤＳに１周整し、そしてＧｒｏ
ｓｓ−Ｂｅｌｌａｒｄ等、Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、、３６：３２−３８（ｂ９７３）により記載され
ているようにしてプロテイナーゼＫ（５０Ｍｇ／ｍｊ！
；シグマ）により処理した。フェノールによる抽出及び
エタノールによる沈澱の後、ＤＮＡを０． Ｉ Ｍ Ｎ
ａ０ＩＩ、０．０５Ｍ ＥＤＴＡに再溶解し、Ｋａ ｔ
ａ ｔｏｓ等、塾［＾ｃｉｄｓ Ｒｅｓ、、１ ：１５
４１−１５５２（ｂ９７９）により記載されているよう
にしてドツトハイブリダイゼーションのために使用した
。
）） 、溶解物の残りを使用してドツトハイブリダイゼ
ーション分析用の高分子ＤＮＡを単離した。溶解物を０
．０５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，０） 、０．０１Ｍ Ｅ
ＤＴＡ 、 ０．５％ＳＤＳに１周整し、そしてＧｒｏ
ｓｓ−Ｂｅｌｌａｒｄ等、Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、、３６：３２−３８（ｂ９７３）により記載され
ているようにしてプロテイナーゼＫ（５０Ｍｇ／ｍｊ！
；シグマ）により処理した。フェノールによる抽出及び
エタノールによる沈澱の後、ＤＮＡを０． Ｉ Ｍ Ｎ
ａ０ＩＩ、０．０５Ｍ ＥＤＴＡに再溶解し、Ｋａ ｔ
ａ ｔｏｓ等、塾［＾ｃｉｄｓ Ｒｅｓ、、１ ：１５
４１−１５５２（ｂ９７９）により記載されているよう
にしてドツトハイブリダイゼーションのために使用した
。
ＦｅＬＶｅｎｖ の の 膜蛋
白質を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
分析したＣＬａｅｍｍｌｉ ｓ Ｎａｔｕｒｅ （ロン
ドン） 、２２７ ： ６８０−６８５ （ｂ９７
０））。幾つかの実験においては、膜蛋白質の粗調製物
をウィルス感染細胞から次のようにして単離した。細胞
を９体積の冷低張緩衝液（０，０１Ｍ Ｔｒｉｓ （ｐ
Ｈ７，４） 、０．０１ ＭＮａＣｌ、Ｏ，ＯＯＩＭ
ＭｇＣＡ ｚ ）中で膨化し、ソシテＤｏｕｎｃｅ均質
化により破砕した。低速遠心（ｂ０００Ｘｇ、１０分間
）により核を除去し、そして次に２９．０００Ｘ ｇに
て６０分間の高速遠心により膜画分を単離した。Ｌｏｈ
ｒｙ 、、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、、１９３ ：
２６５−２７５（ｂ９５１）の方法により蛋白質含量を
決定した。
白質を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
分析したＣＬａｅｍｍｌｉ ｓ Ｎａｔｕｒｅ （ロン
ドン） 、２２７ ： ６８０−６８５ （ｂ９７
０））。幾つかの実験においては、膜蛋白質の粗調製物
をウィルス感染細胞から次のようにして単離した。細胞
を９体積の冷低張緩衝液（０，０１Ｍ Ｔｒｉｓ （ｐ
Ｈ７，４） 、０．０１ ＭＮａＣｌ、Ｏ，ＯＯＩＭ
ＭｇＣＡ ｚ ）中で膨化し、ソシテＤｏｕｎｃｅ均質
化により破砕した。低速遠心（ｂ０００Ｘｇ、１０分間
）により核を除去し、そして次に２９．０００Ｘ ｇに
て６０分間の高速遠心により膜画分を単離した。Ｌｏｈ
ｒｙ 、、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、、１９３ ：
２６５−２７５（ｂ９５１）の方法により蛋白質含量を
決定した。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離されそして
電気泳動的にニトロセルロース（ＢＡ−８５；シュライ
ケル及びシュエル）に移行された蛋白質に対してイムノ
プロット分析を行った （ｂ９７９） ）。すでに記載されているようにして（
Ｊｏｈｎｓｏｎ等、Ｇｅｎｅ Ａｎｏｌ、Ｔｅｃｈｎ、
、上：３−８（ｂ９８４） ：Ｎｕｎｂｅｒｇ等、前掲
〕プロットを抗体で処理しそしてこれと共にインキュベ
ートし、そして抗体−抗原複合体をＨＲＰ−接合第２抗
体（ラビット抗−マウス；アキュレートケミカルス）及
び酵素基質としての３，３′−ジアミノベンジジン（シ
グマ）を用いて可視化した（ Ｄｅ Ｂｉａｓ等、Ａｎ
ａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
電気泳動的にニトロセルロース（ＢＡ−８５；シュライ
ケル及びシュエル）に移行された蛋白質に対してイムノ
プロット分析を行った （ｂ９７９） ）。すでに記載されているようにして（
Ｊｏｈｎｓｏｎ等、Ｇｅｎｅ Ａｎｏｌ、Ｔｅｃｈｎ、
、上：３−８（ｂ９８４） ：Ｎｕｎｂｅｒｇ等、前掲
〕プロットを抗体で処理しそしてこれと共にインキュベ
ートし、そして抗体−抗原複合体をＨＲＰ−接合第２抗
体（ラビット抗−マウス；アキュレートケミカルス）及
び酵素基質としての３，３′−ジアミノベンジジン（シ
グマ）を用いて可視化した（ Ｄｅ Ｂｉａｓ等、Ａｎ
ａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
皿：２１４−２１９ （ｂ９８３） ）。
生細胞間接免疫蛍光実験（Ｍａｎｇｅｒ等、並置、築：
３２７−３３７ （ｂ９８４））を行ってワクチニアウ
ィルス感染細胞の表面上のＦｅＬＶｅｎｖ蛋白質の位置
を決定した。組織培養チャンバースライド（Ｌａｂ −
Ｔｅｋ）中に増殖した感染された細胞の単層をリン酸緩
衝化塩溶液（ＰＢＳ）によりおだやかに洗浄し、次に４
％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ中モ
ノクローナル抗体２５．５と共にインキュベートした。
３２７−３３７ （ｂ９８４））を行ってワクチニアウ
ィルス感染細胞の表面上のＦｅＬＶｅｎｖ蛋白質の位置
を決定した。組織培養チャンバースライド（Ｌａｂ −
Ｔｅｋ）中に増殖した感染された細胞の単層をリン酸緩
衝化塩溶液（ＰＢＳ）によりおだやかに洗浄し、次に４
％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ中モ
ノクローナル抗体２５．５と共にインキュベートした。
再度注意深く洗浄した後、フルオレッセインー接合第２
抗体（ラビット抗−マウスＩｇＧ。
抗体（ラビット抗−マウスＩｇＧ。
カッペルラボラトリーズ）との反応により免疫複合体を
可視化した。並行して調製した単層を冷（−２０℃）ア
セトン中で固定し、次に２５．５抗体と共にインキュベ
ートして全細胞ＦｅＬＶｅｎｖ抗原を検出した。
可視化した。並行して調製した単層を冷（−２０℃）ア
セトン中で固定し、次に２５．５抗体と共にインキュベ
ートして全細胞ＦｅＬＶｅｎｖ抗原を検出した。
細胞内に存在するＦｅＬＶｅｎｖ蛋白質と感染細胞の表
面上に存在するそれとをさらに区別するために免疫沈澱
実験を行った。感染された細胞を１９時間の増殖期間に
わたってメチオニン不含有ＤＭＥ培地に（” Ｓ ）−
メチオニン（６３ｕＣｉ／ｍ１； ニューイングランド
二二一りレア）を加えたものの中で代謝的にラベルした
。ワクチニアウィルス感染において、２時間のインキュ
ベーション期間の後に細胞がラベルされた。単層をＰＢ
Ｓで洗浄し、そしてＣ１１０８モノクローナル抗体（ｂ
ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＰＢＳ中）と共にインキ
ュベートして細胞の表面上のＦｅＬＶｅｎｖ抗原と反応
せしめた。次に、単層を十分に洗浄した後、ＰＢＳ中に
１％ＮＰ −４０，１％デオキシコール酸ナトリウム、
０．１％ＳＤＳ、０．ＯＩＭメチオニン、 ０．００５
Ｍ ＥＤＴ八０へ００５Ｍ ２−メルカプトエタノール
、１ｍｇ／ｍＪＢｓＡ、及び１００Ｕ／ｍＡ！アプロチ
ニン（べ一すンガーーマンハイム）を含有するＲＩＰＡ
Ｗ衝液により細胞溶解した。スタフィロコッカス・プロ
ティンＡ−セファロース（シグマ）を用いて免疫複合体
を沈澱せしめ、そして洗浄した。抗体とのインキュベー
ションの前に細胞溶解された培養物から並行免疫沈澱を
行った。免疫沈澱した蛋白質をポリアクリルアミドゲル
電気泳動により分離し、そしてフルオログラフィーによ
り可視化した。
面上に存在するそれとをさらに区別するために免疫沈澱
実験を行った。感染された細胞を１９時間の増殖期間に
わたってメチオニン不含有ＤＭＥ培地に（” Ｓ ）−
メチオニン（６３ｕＣｉ／ｍ１； ニューイングランド
二二一りレア）を加えたものの中で代謝的にラベルした
。ワクチニアウィルス感染において、２時間のインキュ
ベーション期間の後に細胞がラベルされた。単層をＰＢ
Ｓで洗浄し、そしてＣ１１０８モノクローナル抗体（ｂ
ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＰＢＳ中）と共にインキ
ュベートして細胞の表面上のＦｅＬＶｅｎｖ抗原と反応
せしめた。次に、単層を十分に洗浄した後、ＰＢＳ中に
１％ＮＰ −４０，１％デオキシコール酸ナトリウム、
０．１％ＳＤＳ、０．ＯＩＭメチオニン、 ０．００５
Ｍ ＥＤＴ八０へ００５Ｍ ２−メルカプトエタノール
、１ｍｇ／ｍＪＢｓＡ、及び１００Ｕ／ｍＡ！アプロチ
ニン（べ一すンガーーマンハイム）を含有するＲＩＰＡ
Ｗ衝液により細胞溶解した。スタフィロコッカス・プロ
ティンＡ−セファロース（シグマ）を用いて免疫複合体
を沈澱せしめ、そして洗浄した。抗体とのインキュベー
ションの前に細胞溶解された培養物から並行免疫沈澱を
行った。免疫沈澱した蛋白質をポリアクリルアミドゲル
電気泳動により分離し、そしてフルオログラフィーによ
り可視化した。
■上
この例は、ＦｅＬＶサブグループＢのガートナー−アル
ンスタイン株のＦｅＬＶエンベロープ遺伝子抗担持する
生組換ワクチニアウィルスの調製を記載する。
ンスタイン株のＦｅＬＶエンベロープ遺伝子抗担持する
生組換ワクチニアウィルスの調製を記載する。
Ａ、挿 ベクターの°告
１、二瓜前方迭
プラスミドＤＮＡの単離、制限酵素処理及び連結におい
て、並びに適当な細菌宿主の形質転換において使用され
る方法は組換ＤＮＡの分野における標準的方法であり、
そしてＭａｎｉａｔｉｓ等、前掲に記載されていること
が見出されよう。
て、並びに適当な細菌宿主の形質転換において使用され
る方法は組換ＤＮＡの分野における標準的方法であり、
そしてＭａｎｉａｔｉｓ等、前掲に記載されていること
が見出されよう。
プラスミドＤＮ、Ａベクターの造成において使用された
すべての酵素は二ニー・イングランド・ビオラプス、又
はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズのいずれかから
入手し、そして供給者の指示に従って使用した。
すべての酵素は二ニー・イングランド・ビオラプス、又
はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズのいずれかから
入手し、そして供給者の指示に従って使用した。
特にことわらない限り、制限消化は完全消化であり、１
μｇのＤＮＡ当り５〜１０ユニツトの酵素を用いて３７
℃にて６０分間行う。若干の消化は、目的により不完全
消化であり、これらは１μｇのＤＮＡ当り０．０５〜０
．５ユニツトの酵素を用いて３７℃にて１０〜６０分間
行い、これらの条件は実験的に決定される。
μｇのＤＮＡ当り５〜１０ユニツトの酵素を用いて３７
℃にて６０分間行う。若干の消化は、目的により不完全
消化であり、これらは１μｇのＤＮＡ当り０．０５〜０
．５ユニツトの酵素を用いて３７℃にて１０〜６０分間
行い、これらの条件は実験的に決定される。
連結反応は、６６ ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ７！（ｐＨ
７，６）、６．６ｍＭ ＭｇＣ１ｚ 、１０ｍＭジチオ
スレイトール（ＤＴＴ）；並びに接着末端連結のために
は０．１ｍＭＡＴＰ及び０．０１〜０．０５ｗｅｉｓｓ
ユニットのりガーゼ／２０μ１反応容積、又は平滑末端
連結のためには１．０ｍＭＡＴＰ及び１．０〜５． Ｏ
ｗｅｉｓｓ ：ｙ−ニットの酵素／１０μ１反応容積か
ら構成される緩衝液中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いる
。反応は１４℃にて６〜１２時間行った。分子間連結を
行うための反応は接着末端については１０〜１５０μｇ
のベクターＤＮＡを含み、そして平滑末端については１
００〜２００μｇのＤＮＡを含む。挿入ＤＮＡはベクタ
ーＤＮＡに対して１〜２０倍過剰に維持した。
７，６）、６．６ｍＭ ＭｇＣ１ｚ 、１０ｍＭジチオ
スレイトール（ＤＴＴ）；並びに接着末端連結のために
は０．１ｍＭＡＴＰ及び０．０１〜０．０５ｗｅｉｓｓ
ユニットのりガーゼ／２０μ１反応容積、又は平滑末端
連結のためには１．０ｍＭＡＴＰ及び１．０〜５． Ｏ
ｗｅｉｓｓ ：ｙ−ニットの酵素／１０μ１反応容積か
ら構成される緩衝液中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いる
。反応は１４℃にて６〜１２時間行った。分子間連結を
行うための反応は接着末端については１０〜１５０μｇ
のベクターＤＮＡを含み、そして平滑末端については１
００〜２００μｇのＤＮＡを含む。挿入ＤＮＡはベクタ
ーＤＮＡに対して１〜２０倍過剰に維持した。
分子内連結を含むための反応は１０〜２０μｇのベクタ
ーＤＮＡを含む。
ーＤＮＡを含む。
２、Ｇ５２０ ベクター炉−
相同性組換及びワクチニアウィルスゲノムへのＦｅＬＶ
ｅｎｖ遺伝子の挿入を中介するために使用されるプラス
ミドベクターはすでに記載されているプラスミドｐＧｓ
２０ （Ｍａｃｋｅｔｔ等、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 、
４９：８５７−８６４ （ｂ９８４））から導かれた。
ｅｎｖ遺伝子の挿入を中介するために使用されるプラス
ミドベクターはすでに記載されているプラスミドｐＧｓ
２０ （Ｍａｃｋｅｔｔ等、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 、
４９：８５７−８６４ （ｂ９８４））から導かれた。
ｐＧｓ２０プラスミドは、初期７、 ５ Ｋ Ｄ蛋白質
（Ｖｅｎｋａ ｔｅｓａｎ等、Ｃｅ１ｌ、門：８０５−
８１３ （ｂ９８１） ）をコードするワクチニアウィ
ルス遺伝子のプロモーター領域の挿入によって中断され
そして不活性化されたワクチニアウィルスチミジンキナ
ーゼ（ｔｋ）遺伝子を含有する。便利なポリリンカー配
列が７．５ Ｋ Ｄ遺伝子の転写開始部位から下流に挿
入されており、この位胃での異種性配列の分子クローニ
ングが促進される（第１図）。
（Ｖｅｎｋａ ｔｅｓａｎ等、Ｃｅ１ｌ、門：８０５−
８１３ （ｂ９８１） ）をコードするワクチニアウィ
ルス遺伝子のプロモーター領域の挿入によって中断され
そして不活性化されたワクチニアウィルスチミジンキナ
ーゼ（ｔｋ）遺伝子を含有する。便利なポリリンカー配
列が７．５ Ｋ Ｄ遺伝子の転写開始部位から下流に挿
入されており、この位胃での異種性配列の分子クローニ
ングが促進される（第１図）。
このプラスミドベクターをＢａｍＨＩにより完全消化し
た。消化及びＤＮＡの単離の後、線状プラスミドを１０
ＭＭずつの４種類のデオキシヌクレオチドトリホスフェ
ートの存在下でＰｏｌ Ｉ （Ｋｌｅｎｏｗ断片）と共
にインキュベートすることにより平滑末端を形成した。
た。消化及びＤＮＡの単離の後、線状プラスミドを１０
ＭＭずつの４種類のデオキシヌクレオチドトリホスフェ
ートの存在下でＰｏｌ Ｉ （Ｋｌｅｎｏｗ断片）と共
にインキュベートすることにより平滑末端を形成した。
次に、ＢａｍＨＩ消化プラスミドを２個の部位の内平均
１部位での消化をもたらすように設計された条件下でＥ
ｃｏＲＩにより部分消化した。ＤＮＡを精製し、そして
ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子の挿入のためのベクターと
して使用した。
１部位での消化をもたらすように設計された条件下でＥ
ｃｏＲＩにより部分消化した。ＤＮＡを精製し、そして
ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子の挿入のためのベクターと
して使用した。
プラスミドｐＧＡｐｖを、上記のベクターへの全ＦｅＬ
Ｖエンベロープ遺伝子配列源として使用した。
Ｖエンベロープ遺伝子配列源として使用した。
ｐＧＡｐｖはｐＫＨＲ−１（Ａ、 Ｒｏａｃｈ及びＮ、
Ｄａｖｉｄｓｏｎ）に由来し、このプラスミドは、プ
ラスミドｐＫＣ７（Ｒａ。
Ｄａｖｉｄｓｏｎ）に由来し、このプラスミドは、プ
ラスミドｐＫＣ７（Ｒａ。
及びＲｏｇｅｒｓ、 Ｇｅｎｅ（ｂ９７９） ７ ニア
９ ）のユニークＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングさ
れたＦｅＬＶ−Ｂ（第２図）〔ラムダＨＦ６０、Ｍｕｌ
ｌｉｎｓ等、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ。
９ ）のユニークＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングさ
れたＦｅＬＶ−Ｂ（第２図）〔ラムダＨＦ６０、Ｍｕｌ
ｌｉｎｓ等、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ。
（ｂ９８１）刹：６６８）のＧＡ株の分子クローン化さ
れたプロウィルスを含有するプラスミドである。
れたプロウィルスを含有するプラスミドである。
ｐＫｌｌＲ−１をＰｖｏ■で消化し、そして分子内反応
に好都合な条件下で再連結した。このＤＮＡを用いてＥ
、コリＭＭ２９４株をアンピシリン耐性に形質転換した
。完全エンベロープ遺伝子を含有するがしかしＦｅＬＶ
■Ｌ及び匪遺伝子のほとんど並びに細菌カナマイシン耐
性遺伝子を欠いている４、 ８ ｋ ｂプラスミドｐＧ
Ａｐｖを含む細胞を単離した（第３図）。
に好都合な条件下で再連結した。このＤＮＡを用いてＥ
、コリＭＭ２９４株をアンピシリン耐性に形質転換した
。完全エンベロープ遺伝子を含有するがしかしＦｅＬＶ
■Ｌ及び匪遺伝子のほとんど並びに細菌カナマイシン耐
性遺伝子を欠いている４、 ８ ｋ ｂプラスミドｐＧ
Ａｐｖを含む細胞を単離した（第３図）。
ｐＧＡｐｖをＰｓｔｌにより消化することにより、サブ
クローニングのためにＦｅＬＶエンベロープ遺伝子挿入
部を調製した。ＤＮＡをＰｏｌ Ｉ （Ｋｌｅｎｏｗ
断片）と共にインキュベートすることにより平滑末端を
生じさせ、単離し、そして次にＥｃｏＲＩにより消化し
た（第１図）。
クローニングのためにＦｅＬＶエンベロープ遺伝子挿入
部を調製した。ＤＮＡをＰｏｌ Ｉ （Ｋｌｅｎｏｗ
断片）と共にインキュベートすることにより平滑末端を
生じさせ、単離し、そして次にＥｃｏＲＩにより消化し
た（第１図）。
すでに調製したＢａｎ＋ＨＩ／旦ｃｏＲＩ（部分）−消
化ベクターｐＧＳ２０、及び挿入ＤＮＡを次のようにし
て連結した（第１図）。ＤＮＡを各１５０μｇ／ ｍ
ｌの濃度で、前記の接着末端条件下でＴ４ＤＮＡリガー
ゼと混合した。この混合物を１４℃にて６時間インキュ
ベートし、そして追加の酵素及びＡＴＰを添加してすで
に定義された平滑末端条件を与え、そしてインキュベー
ションを一夜続けた。得られたＤＮＡを用いてＥ、コリ
ＭＭ２９４株をアンピシリン耐性に形質転換した。
化ベクターｐＧＳ２０、及び挿入ＤＮＡを次のようにし
て連結した（第１図）。ＤＮＡを各１５０μｇ／ ｍ
ｌの濃度で、前記の接着末端条件下でＴ４ＤＮＡリガー
ゼと混合した。この混合物を１４℃にて６時間インキュ
ベートし、そして追加の酵素及びＡＴＰを添加してすで
に定義された平滑末端条件を与え、そしてインキュベー
ションを一夜続けた。得られたＤＮＡを用いてＥ、コリ
ＭＭ２９４株をアンピシリン耐性に形質転換した。
ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子を含有するプラスミドを有
するアンピシリン耐性コロニーをコロニーハイブリダイ
ゼーション法（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、前掲、ｐ３１２−
３２８）により位置決定した。ニトロセルロース濾紙デ
ィスクを５００〜８００個のアンピシリン耐性コロニー
を含むプレート（上記から）上に１き、そして方向付け
のために印を付した。これらのディスクを、０．５ Ｍ
ＮａＯＨ，１，５Ｍ ＮａＣ１により飽和されたワッ
トマン３ＭＭ紙にコロニーを上側にして移し、そして５
分間インキュベートして細胞を溶解した。ディスクを０
．５ Ｍ Ｔｒｉｓ−１ｆ（ｂ！ （ｐＨ７、４） 、
１．５ Ｍ ＮａＣＩＩにより飽和された紙上に移して
中和し、そして５分間インキュベートした。
するアンピシリン耐性コロニーをコロニーハイブリダイ
ゼーション法（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、前掲、ｐ３１２−
３２８）により位置決定した。ニトロセルロース濾紙デ
ィスクを５００〜８００個のアンピシリン耐性コロニー
を含むプレート（上記から）上に１き、そして方向付け
のために印を付した。これらのディスクを、０．５ Ｍ
ＮａＯＨ，１，５Ｍ ＮａＣ１により飽和されたワッ
トマン３ＭＭ紙にコロニーを上側にして移し、そして５
分間インキュベートして細胞を溶解した。ディスクを０
．５ Ｍ Ｔｒｉｓ−１ｆ（ｂ！ （ｐＨ７、４） 、
１．５ Ｍ ＮａＣＩＩにより飽和された紙上に移して
中和し、そして５分間インキュベートした。
濾紙を、０．３ Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ナ
トリウム（２ＸＳＳＣ）及び０．２％ドデシル硫酸ナト
リウム（Ｓ Ｄ Ｓ）中で５分間ずつ３回洗浄し、次に
２ＸＳＳＣのみの中で５分間ずつ３回洗浄した。
トリウム（２ＸＳＳＣ）及び０．２％ドデシル硫酸ナト
リウム（Ｓ Ｄ Ｓ）中で５分間ずつ３回洗浄し、次に
２ＸＳＳＣのみの中で５分間ずつ３回洗浄した。
この濾紙ディスクを、３ｔｐ−ラベル化ニック−トラン
スレーションＦｅＬＶエンベロープ遺伝子プローブへの
ハイプリダイゼーがヨンにより検索した。
スレーションＦｅＬＶエンベロープ遺伝子プローブへの
ハイプリダイゼーがヨンにより検索した。
エンベロープ遺伝子配列は、ＦｅＬＶプロウィルス（ｐ
ＫＨＲ−１中に含有される）をＸｈｏｌ及びＥｃｏＲＩ
によって消化することにより生成する２、 ８ ｋ ｂ
断片に由来した。この又橡■／旦並Ｒ１断片を１匹Ｒ１
及びＳａｌ Ｉで消化されたバクテリオファージＭ１３
Ｊ）８中にサブクローン化した。完全なＭ１３ｍｐ８組
換体をニックトランスレーションにおいて使用した。ハ
イブリダイゼーションは次のようにして行った。濾紙を
４２℃にて一夜、５０％ホルムアミド、５ Ｘ Ｓ Ｓ
Ｃ（ＬＸ ＝ ０．１５Ｍ ＮａＣｊ！ 、 ０．
０１５Ｍクエン酸ナトリウム） 、０．０５ｘＰＰ １
（ＩＸ−０，５ＭＮａ２ＨＰＯ４，０，５Ｍ ＮａＨｚ
ＰＯ４，０，０５Ｍ Ｎａ４Ｐ ｚ（＋＋）、０．１％
ＳＤＳ、０．１％ずつのＦｉｃｏｌｌ ４００、ウシ血
清アルブミン及びポリビニルピロリドン、並びに２００
Ｍｇ ／ ｍ ｌの変性サケ精子ＤＮＡから成る前ハイ
ブリダイゼーション溶液４ｍｆ／濾祇中でインキュベー
トした。濾紙を１０ ’ｃｐｍ／濾紙の二ツクトランス
レーションＦｅＬＶｅｎｖ配列（比活性１〜５ Ｘ １
０”ｃｐｍ／μｇ）により４２℃に て−夜、４ｍｌ／
濾紙の同じ前ハイブリダイゼーション溶液中で検索した
。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズしなか
ったプローブを２５℃にて１５分間４回、２ｘＳＳＣ１
０，１％ＳＤＳ中で洗浄し、次に６０℃にて０． Ｉ
Ｘ Ｓ Ｓ Ｃ１０，１％ＳＤＳ中で洗浄することによ
り除去した。フィルターを乾燥し、そしてハイブリダイ
ゼーションをオートラジオグラフィーにより可視化した
。
ＫＨＲ−１中に含有される）をＸｈｏｌ及びＥｃｏＲＩ
によって消化することにより生成する２、 ８ ｋ ｂ
断片に由来した。この又橡■／旦並Ｒ１断片を１匹Ｒ１
及びＳａｌ Ｉで消化されたバクテリオファージＭ１３
Ｊ）８中にサブクローン化した。完全なＭ１３ｍｐ８組
換体をニックトランスレーションにおいて使用した。ハ
イブリダイゼーションは次のようにして行った。濾紙を
４２℃にて一夜、５０％ホルムアミド、５ Ｘ Ｓ Ｓ
Ｃ（ＬＸ ＝ ０．１５Ｍ ＮａＣｊ！ 、 ０．
０１５Ｍクエン酸ナトリウム） 、０．０５ｘＰＰ １
（ＩＸ−０，５ＭＮａ２ＨＰＯ４，０，５Ｍ ＮａＨｚ
ＰＯ４，０，０５Ｍ Ｎａ４Ｐ ｚ（＋＋）、０．１％
ＳＤＳ、０．１％ずつのＦｉｃｏｌｌ ４００、ウシ血
清アルブミン及びポリビニルピロリドン、並びに２００
Ｍｇ ／ ｍ ｌの変性サケ精子ＤＮＡから成る前ハイ
ブリダイゼーション溶液４ｍｆ／濾祇中でインキュベー
トした。濾紙を１０ ’ｃｐｍ／濾紙の二ツクトランス
レーションＦｅＬＶｅｎｖ配列（比活性１〜５ Ｘ １
０”ｃｐｍ／μｇ）により４２℃に て−夜、４ｍｌ／
濾紙の同じ前ハイブリダイゼーション溶液中で検索した
。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズしなか
ったプローブを２５℃にて１５分間４回、２ｘＳＳＣ１
０，１％ＳＤＳ中で洗浄し、次に６０℃にて０． Ｉ
Ｘ Ｓ Ｓ Ｃ１０，１％ＳＤＳ中で洗浄することによ
り除去した。フィルターを乾燥し、そしてハイブリダイ
ゼーションをオートラジオグラフィーにより可視化した
。
ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子配列を含むコロニーを単離
し、そして増殖せしめ、そしてプラスミドを迅速アルカ
リ溶解法により単離した。所望のＥｃ。
し、そして増殖せしめ、そしてプラスミドを迅速アルカ
リ溶解法により単離した。所望のＥｃ。
Ｒ１部位における正しい挿入の存在をＢａｍＨＩ及びＥ
ｃｏＲＩによるプラスミドの消化により確認して診断的
３ｋｂ挿入断片を得た。
ｃｏＲＩによるプラスミドの消化により確認して診断的
３ｋｂ挿入断片を得た。
ワクチニアウィルスのＷＲ株（Ｂ、 Ｍｏ５ｓ ％ Ｎ
ＩＨから入手）をヒーラ細胞中で増殖せしめ、そして
ウィルスを細胞質抽出物からシュークロースグラジェン
ト遠心により精製した。Ｎａｋａｎｏ等、ＰＮＡＳ（ｂ
９８２）７９：１５９２に記載されている方法にわずか
の変更を加えてウィルスＤＮＡを調製した。要約すれば
、精製されたピリオンを１６．７ Ａ２６０／ｍＪの濃
度において０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ７，８
） 、０．０１ＭＥＤＴＡ、 ０． Ｉ Ｍ ＮａＣｌ
、０．５％Ｓ Ｄ Ｓ 、 ０．０５Ｍ２−メルカプト
エタノール中で溶解した。蛋白質を５０Ｍｇ／ｍｌのプ
ロテイナーゼにの存在下で３７℃にて２時間インキュベ
ートすることにより消化した。ＤＮＡを、０．ＯＯＩＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐ）１７．８）、０．００１Ｍ
ＥＤＴＡ 、 ０． Ｉ Ｍ ＮａＣｆｆ１により飽
和された同容量のフェノールの添加により抽出し、そし
て界面が清浄になるまで水相を再抽出した。ＤＮＡ溶液
を４℃にて０．ＯＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！ （ｐＨ７
，８）、０．０１Ｍ Ｉ！ＤＴＡに対してこれを２回交
換して一夜透析した。ＮａＣｌを０．２５Ｍになるよう
に加え、そして−２０℃の１００％エタノール２．５容
量を添加することによりＤＮＡを沈澱せしめた。沈澱し
たＤＮＡを溶液からパスツールピペット上に巻き取り、
８０％エタノール（−２０℃）に移し、１２．００Ｑｘ
ｇにて５分間遠心することによりペレット化し、そし
て乾燥した。このワクチニアＤＮＡを０．０１Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＦＩＣｊ！ （ｐＨ７，４）、０．００１Ｍ Ｅ
ＤＴＡ中に溶解し、そしてＡ２６０により濃度を決定し
た。
ＩＨから入手）をヒーラ細胞中で増殖せしめ、そして
ウィルスを細胞質抽出物からシュークロースグラジェン
ト遠心により精製した。Ｎａｋａｎｏ等、ＰＮＡＳ（ｂ
９８２）７９：１５９２に記載されている方法にわずか
の変更を加えてウィルスＤＮＡを調製した。要約すれば
、精製されたピリオンを１６．７ Ａ２６０／ｍＪの濃
度において０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ７，８
） 、０．０１ＭＥＤＴＡ、 ０． Ｉ Ｍ ＮａＣｌ
、０．５％Ｓ Ｄ Ｓ 、 ０．０５Ｍ２−メルカプト
エタノール中で溶解した。蛋白質を５０Ｍｇ／ｍｌのプ
ロテイナーゼにの存在下で３７℃にて２時間インキュベ
ートすることにより消化した。ＤＮＡを、０．ＯＯＩＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐ）１７．８）、０．００１Ｍ
ＥＤＴＡ 、 ０． Ｉ Ｍ ＮａＣｆｆ１により飽
和された同容量のフェノールの添加により抽出し、そし
て界面が清浄になるまで水相を再抽出した。ＤＮＡ溶液
を４℃にて０．ＯＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！ （ｐＨ７
，８）、０．０１Ｍ Ｉ！ＤＴＡに対してこれを２回交
換して一夜透析した。ＮａＣｌを０．２５Ｍになるよう
に加え、そして−２０℃の１００％エタノール２．５容
量を添加することによりＤＮＡを沈澱せしめた。沈澱し
たＤＮＡを溶液からパスツールピペット上に巻き取り、
８０％エタノール（−２０℃）に移し、１２．００Ｑｘ
ｇにて５分間遠心することによりペレット化し、そし
て乾燥した。このワクチニアＤＮＡを０．０１Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＦＩＣｊ！ （ｐＨ７，４）、０．００１Ｍ Ｅ
ＤＴＡ中に溶解し、そしてＡ２６０により濃度を決定し
た。
ヒーラ細胞及びヒト１４３ＢＴ Ｋ−マイナス細胞（Ｋ
、 Ｈｕｅｂｎｅｒ、 Ｗｉｓｔａｒ Ｉｎ５ｔｉｔｕ
ｔｅから入手）を１１０％のウシ胎児血清を補充された
ドルベコ−イーグル培地（ＤＭＥ）中で増殖せしめた。
、 Ｈｕｅｂｎｅｒ、 Ｗｉｓｔａｒ Ｉｎ５ｔｉｔｕ
ｔｅから入手）を１１０％のウシ胎児血清を補充された
ドルベコ−イーグル培地（ＤＭＥ）中で増殖せしめた。
ワクチニアウィルスのＴＫ−マイナス変異株の選択のた
め、１４３Ｂ細胞を追加の２５μｇ／ｍｌｌのブロモデ
オキシウリジン（ＢＵｄＲ）を含有する培地中で増殖せ
しめた。
め、１４３Ｂ細胞を追加の２５μｇ／ｍｌｌのブロモデ
オキシウリジン（ＢＵｄＲ）を含有する培地中で増殖せ
しめた。
１４３Ｂ細胞のコンフルエント単層にウィルスストック
の稀釈物を３７℃３時間にわたり間欠的な動揺を伴って
接種することによりプラークアッセイを行った。接種物
を除去し、細胞を一回洗浄し、そして単層に２％ウシ胎
児血清及び０．６％アガロースを含有するＤＭＥを重層
した。３７℃にて４８〜７２時間のインキュベーシヲン
の後、培養物をリン酸緩衝化塩溶液中Ｑ、ＱＯ５％ニュ
トラルレッドと共にインキュベートすることによりプラ
ークを可視化した。単離のため、よく分離したプラーク
をガラス製パスツールピペットにより拾い上げ１ｍ！！
の培地に移し、そしてアガロースゲルからウィルスを放
出せしめるため激し′くピペット処理した。この懸濁液
を用いて直径１６冒■のウェル中の１４３Ｂ細胞単層２
個に怒染せしめた。
の稀釈物を３７℃３時間にわたり間欠的な動揺を伴って
接種することによりプラークアッセイを行った。接種物
を除去し、細胞を一回洗浄し、そして単層に２％ウシ胎
児血清及び０．６％アガロースを含有するＤＭＥを重層
した。３７℃にて４８〜７２時間のインキュベーシヲン
の後、培養物をリン酸緩衝化塩溶液中Ｑ、ＱＯ５％ニュ
トラルレッドと共にインキュベートすることによりプラ
ークを可視化した。単離のため、よく分離したプラーク
をガラス製パスツールピペットにより拾い上げ１ｍ！！
の培地に移し、そしてアガロースゲルからウィルスを放
出せしめるため激し′くピペット処理した。この懸濁液
を用いて直径１６冒■のウェル中の１４３Ｂ細胞単層２
個に怒染せしめた。
野性型ワクチニアウィルスのＴＫ遺遺伝子へのＰｅＬＶ
エンベロープ遺伝子の組換を、Ｍａｃｋｅｔｔ等、ＰＮ
ＡＳ （ｂ９８２） ７９ ： ７４１５により記載さ
れているマーカーレスキｘ −（ｍａｋｅｒ ｒｅｓｃ
ｕｅ）技法を用いて行った（第４図）。要約すれば、１
４３ Ｂ Ｔ Ｋ−マイナス細胞のコンフルエント単層
を収容する６０鰭組織培養皿にワクチニアウィルスのＷ
Ｒ株を、細胞当り０．０５プラーク形成ユニツト（ｐｆ
ｕ）の感染倍率で感染せしめた。感染の２時間後、ワク
チニアウィルス感染細胞を挿入ベクターとワクチニアウ
ィルスＤＮＡの混合物を用いてリン酸カルシウム同時沈
澱法によりトランスフェクトした。トランスフェクショ
ンは次のようにして行った。ｌμｇずつのワクチニアウ
ィルスＤＮＡ及びｐＶＧ＾を５０μｌの容積中で２０Ｍ
ｇのキャリヤーサケ精子ＤＮＡと混合した。この溶液を
０，２５Ｍ ＣａＣβ２によりＱ、５ｍｌとし、そして
９．５ｍｌの２ｘＨＢＳ（２８０ｍＭ ＮａＣｌ Ｓｌ
ｍＭ ＫＣｆ 、 １．５ ｍＭ ＮａｚＨＰＯ４，
５、５ｍ Ｍデキストロース、２５ ｍ Ｍ Ｈｅｐｅ
ｓ、 ｐｔ１７．０５）に常に撹拌しながらゆっくりと
添加し、そして室温にて３０分間沈澱を形成せしめた。
エンベロープ遺伝子の組換を、Ｍａｃｋｅｔｔ等、ＰＮ
ＡＳ （ｂ９８２） ７９ ： ７４１５により記載さ
れているマーカーレスキｘ −（ｍａｋｅｒ ｒｅｓｃ
ｕｅ）技法を用いて行った（第４図）。要約すれば、１
４３ Ｂ Ｔ Ｋ−マイナス細胞のコンフルエント単層
を収容する６０鰭組織培養皿にワクチニアウィルスのＷ
Ｒ株を、細胞当り０．０５プラーク形成ユニツト（ｐｆ
ｕ）の感染倍率で感染せしめた。感染の２時間後、ワク
チニアウィルス感染細胞を挿入ベクターとワクチニアウ
ィルスＤＮＡの混合物を用いてリン酸カルシウム同時沈
澱法によりトランスフェクトした。トランスフェクショ
ンは次のようにして行った。ｌμｇずつのワクチニアウ
ィルスＤＮＡ及びｐＶＧ＾を５０μｌの容積中で２０Ｍ
ｇのキャリヤーサケ精子ＤＮＡと混合した。この溶液を
０，２５Ｍ ＣａＣβ２によりＱ、５ｍｌとし、そして
９．５ｍｌの２ｘＨＢＳ（２８０ｍＭ ＮａＣｌ Ｓｌ
ｍＭ ＫＣｆ 、 １．５ ｍＭ ＮａｚＨＰＯ４，
５、５ｍ Ｍデキストロース、２５ ｍ Ｍ Ｈｅｐｅ
ｓ、 ｐｔ１７．０５）に常に撹拌しながらゆっくりと
添加し、そして室温にて３０分間沈澱を形成せしめた。
ＤＮＡ沈澱物をワクチニアウィルス感染細胞単層に加え
、そして３７℃にて３０分間インキュベートした。５ｍ
／の増殖培地を加え、そして３７℃にて４〜６時間イン
キュベーションを続けた。ＤＮＡ溶液を除去し、単層を
１回洗浄し、そしてＤＭＥ中１５％グリセリン３ｍｌを
加え、そして室温にて３分間インキュベートした。グリ
セリン溶液を除去し、細胞を３回洗浄し、そして５ｍｌ
の増殖培地を加えた。感染の４８時間後、予想通りの細
胞変性効果を示す培養物を次のようにして収得した。細
胞を皿から振り離し、１１００ＱＸにて１０分間ペレッ
ト化し、そして１ｍｌの培地に再懸濁した。
、そして３７℃にて３０分間インキュベートした。５ｍ
／の増殖培地を加え、そして３７℃にて４〜６時間イン
キュベーションを続けた。ＤＮＡ溶液を除去し、単層を
１回洗浄し、そしてＤＭＥ中１５％グリセリン３ｍｌを
加え、そして室温にて３分間インキュベートした。グリ
セリン溶液を除去し、細胞を３回洗浄し、そして５ｍｌ
の増殖培地を加えた。感染の４８時間後、予想通りの細
胞変性効果を示す培養物を次のようにして収得した。細
胞を皿から振り離し、１１００ＱＸにて１０分間ペレッ
ト化し、そして１ｍｌの培地に再懸濁した。
ワクチニア感染細胞のトランスフェクションから単離さ
れたウィルスストックは大量の野性型ワクチニアウィル
スの存在下ＴＫ−マイナスウィルスの混合物を含んで成
る。ＴＫ−マイナス変異株（その内のいくらかは組換体
である）を単離するため、２５Ｍｇ／ｍｌのＢＵｄＲの
存在下ＴＫ−マイナスヒト１４３Ｂ細胞上で、前記のよ
うにしてストックにプラーク形成せしめた。これらの条
件下では、ＴＫ活性を欠くウィルスのみがプラークを形
成することができる。個々のよく分離したプラークをア
ガロース重層を通して拾い上げ、培地に懸濁し、そして
１４３Ｂ細胞の単層を収容する直径１６■■のウェルに
移した。これらのウィルスクローンをＢ（ＩｄＲの存在
下で増殖せしめ、そして感染された細胞を、後に記載す
るように、ＤＮＡハイブリダイゼーション及びエンザイ
ムーリンクド・イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）によるＦｅＬＶエンヘロープ遺伝子の存在及び発現
についてスクリーニングするための材料源として使用し
た。
れたウィルスストックは大量の野性型ワクチニアウィル
スの存在下ＴＫ−マイナスウィルスの混合物を含んで成
る。ＴＫ−マイナス変異株（その内のいくらかは組換体
である）を単離するため、２５Ｍｇ／ｍｌのＢＵｄＲの
存在下ＴＫ−マイナスヒト１４３Ｂ細胞上で、前記のよ
うにしてストックにプラーク形成せしめた。これらの条
件下では、ＴＫ活性を欠くウィルスのみがプラークを形
成することができる。個々のよく分離したプラークをア
ガロース重層を通して拾い上げ、培地に懸濁し、そして
１４３Ｂ細胞の単層を収容する直径１６■■のウェルに
移した。これらのウィルスクローンをＢ（ＩｄＲの存在
下で増殖せしめ、そして感染された細胞を、後に記載す
るように、ＤＮＡハイブリダイゼーション及びエンザイ
ムーリンクド・イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）によるＦｅＬＶエンヘロープ遺伝子の存在及び発現
についてスクリーニングするための材料源として使用し
た。
ＢＵｄＲの存在下でのプラーク精製により単離されるＴ
Ｋ−マイナスウィルスは、自然発生ＴＫ−マイナス変異
株と相同性組換によるウィルスＴＫ遺伝子へのＦｅＬＶ
エンベロープ逍伝子の挿入によるウィルス性ＴＫ−マイ
ナス変異株との混合物である。
Ｋ−マイナスウィルスは、自然発生ＴＫ−マイナス変異
株と相同性組換によるウィルスＴＫ遺伝子へのＦｅＬＶ
エンベロープ逍伝子の挿入によるウィルス性ＴＫ−マイ
ナス変異株との混合物である。
ＦｅＬＶ−含有ワクチニアウィルスをスクリーニングす
るために２つの方法を用いた。プラーク精製されたＴＫ
−マイナスワクチニアにより感染された細胞を、ＤＮＡ
ハイブリダイゼーションによりＦｅＬＶ配列の存在につ
いてアッセイした。要約すれば、Ｇｒｏｓｓ−Ｂｅｌｌ
ａｒｄ等、Ｅｕｒ、 Ｊ、旧ｏｃｈｅｍ、 （ｂ９７３
）共：３２の方法の変法により高分子ＤＮＡを調製した
。感染細胞を０．１ Ｍ Ｎ８２ＣＯ：＋（ｐＨ９，０
）中で可溶化した。１５０１の細胞溶解物（ｌ ｙ５ａ
ｔｅ）を２５０、ｃｚＡの０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−１
１ｃＪ （ｐＨ７、ｏ）、０．０ＩＭ ＥＤＴＡ、０．
５％ＳＤＳ及び５０Ｍｇ／ｍ７！ブロテイナーゼＫに加
えた。溶液を３７℃にて６０分間インキュベートし、そ
して次に同容量のフェノールを用いて２回抽出した。２
．５容量の１００％エタノールを添加することによりＤ
ＮＡを溶液から沈澱せしめた。ＤＮＡを１２，０００ｘ
ｇにて５分間ペレット化し、乾燥し、そして１００１
！の０． Ｉ Ｍ Ｎａ０ｔｌ、０．００５Ｍ ＥＤＴ
Ａ中に？岩屑した。ＤＮＡアリコール５０ｐＥをＫａｆ
ａｔｏｓ等、Ｎｕｃ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 （ｂ９
７６） ７ ：１５旧の方法によりニトロセルロース濾
紙に結合せしめた。濾紙を前記の前ハイブリダイゼーシ
ョン溶液中で３７℃にて一夜インキユベートし、そして
前記のＸｈｏ Ｉ ／ ＥｃｏＲＩ −ＦｅＬＶエンベ
ロープ遺伝子断片を含有する３Ｚｐ−ラベル化二ツクト
ランスレーションＭ１３ｍｐ８ Ｄ Ｎ Ａのｌ ０６
ｃｐｍ／濾祇の存在下で３７°Ｃにて２４時間インキュ
ベートした。
るために２つの方法を用いた。プラーク精製されたＴＫ
−マイナスワクチニアにより感染された細胞を、ＤＮＡ
ハイブリダイゼーションによりＦｅＬＶ配列の存在につ
いてアッセイした。要約すれば、Ｇｒｏｓｓ−Ｂｅｌｌ
ａｒｄ等、Ｅｕｒ、 Ｊ、旧ｏｃｈｅｍ、 （ｂ９７３
）共：３２の方法の変法により高分子ＤＮＡを調製した
。感染細胞を０．１ Ｍ Ｎ８２ＣＯ：＋（ｐＨ９，０
）中で可溶化した。１５０１の細胞溶解物（ｌ ｙ５ａ
ｔｅ）を２５０、ｃｚＡの０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−１
１ｃＪ （ｐＨ７、ｏ）、０．０ＩＭ ＥＤＴＡ、０．
５％ＳＤＳ及び５０Ｍｇ／ｍ７！ブロテイナーゼＫに加
えた。溶液を３７℃にて６０分間インキュベートし、そ
して次に同容量のフェノールを用いて２回抽出した。２
．５容量の１００％エタノールを添加することによりＤ
ＮＡを溶液から沈澱せしめた。ＤＮＡを１２，０００ｘ
ｇにて５分間ペレット化し、乾燥し、そして１００１
！の０． Ｉ Ｍ Ｎａ０ｔｌ、０．００５Ｍ ＥＤＴ
Ａ中に？岩屑した。ＤＮＡアリコール５０ｐＥをＫａｆ
ａｔｏｓ等、Ｎｕｃ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 （ｂ９
７６） ７ ：１５旧の方法によりニトロセルロース濾
紙に結合せしめた。濾紙を前記の前ハイブリダイゼーシ
ョン溶液中で３７℃にて一夜インキユベートし、そして
前記のＸｈｏ Ｉ ／ ＥｃｏＲＩ −ＦｅＬＶエンベ
ロープ遺伝子断片を含有する３Ｚｐ−ラベル化二ツクト
ランスレーションＭ１３ｍｐ８ Ｄ Ｎ Ａのｌ ０６
ｃｐｍ／濾祇の存在下で３７°Ｃにて２４時間インキュ
ベートした。
２ＸＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ中で２５℃にて５回洗浄し
た後、０．１ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で６０分間ず
つ２回洗浄した。濾紙をＸ−線フィルムに暴露してＦｅ
ＬＶエンベロープ遺伝子配列を含有するサンプルを同定
した。
た後、０．１ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で６０分間ず
つ２回洗浄した。濾紙をＸ−線フィルムに暴露してＦｅ
ＬＶエンベロープ遺伝子配列を含有するサンプルを同定
した。
次に、ＤＮＡハイブリダイゼーションにより陽性であっ
たウィルスクローンを、エンベロープ遺伝子の発現につ
いてＥＬＩＳＡにより測定した。感染細胞を激しいピペ
ット処理により直径１６■謙のウェルから取り出し、そ
して１２，０ＯＯＸ ｇにて１０分間ベペレットした。
たウィルスクローンを、エンベロープ遺伝子の発現につ
いてＥＬＩＳＡにより測定した。感染細胞を激しいピペ
ット処理により直径１６■謙のウェルから取り出し、そ
して１２，０ＯＯＸ ｇにて１０分間ベペレットした。
ペレットを２００μｌのＥＩＪＳＡコート緩衝液（０，
Ｉ Ｍ ＮａｚＣＯｚ 、０．０２％ＮａＮ、、ｐＨ９
，６）中に再懸濁しそして可溶化した。１：４から始ま
る一連の２倍稀釈物のアリコート１００μβずつをミク
ロタイタープレートのウェルに加えた。蛋白質を、３７
℃にて３時間インキュベートすることにより、プラスチ
ックウェルに結合せしめた。次に、プレートを３回洗浄
緩衝液（０，１５ＭＮａＣ１，０，０５％トウィーンー
２０）により洗浄し、そして過剰の液を除去した。Ｆｅ
ＬＶｇｐ７０蛋白質上の決定基を認識するモノクローナ
ル抗体クローン２５．５を用いてウェル中のＰｅＬＶエ
ンベロープ遺伝子生成物を検出した（ Ｌｕ ｔｚ等、
Ｖｅｔ、 Ｉｍｍｕｎｏ。
Ｉ Ｍ ＮａｚＣＯｚ 、０．０２％ＮａＮ、、ｐＨ９
，６）中に再懸濁しそして可溶化した。１：４から始ま
る一連の２倍稀釈物のアリコート１００μβずつをミク
ロタイタープレートのウェルに加えた。蛋白質を、３７
℃にて３時間インキュベートすることにより、プラスチ
ックウェルに結合せしめた。次に、プレートを３回洗浄
緩衝液（０，１５ＭＮａＣ１，０，０５％トウィーンー
２０）により洗浄し、そして過剰の液を除去した。Ｆｅ
ＬＶｇｐ７０蛋白質上の決定基を認識するモノクローナ
ル抗体クローン２５．５を用いてウェル中のＰｅＬＶエ
ンベロープ遺伝子生成物を検出した（ Ｌｕ ｔｚ等、
Ｖｅｔ、 Ｉｍｍｕｎｏ。
ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏ ａｔｈ、 （ｂ９８１） ２
： ４２５； Ｎｕｎｂｅｒｇ等、ハ易（ｂ９８４）別
、：３６７５）。ＩｇＧを腹水から精製し、（Ｌｕ ｔ
ｚ等、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ（ｂ９８
３）５６：２０９）、そしてレポーター分子としてのホ
ースラディツシュパーオキシダーゼと接合せしめた。こ
の接合体を緩衝液３ （０，１５Ｍ ＮａＣｆｆ、Ｏ，
ＯＯＩＭ ＥＤＴＡ、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ
（ｐＨ７，４） 、０．０５％トウィーンー２０，０
．１％ウシ血清アルブミン〕中に１０００倍に稀釈した
。１００μｌの抗体溶液を各ウェルに加え、そして抗体
を３７℃にて６０分間抗原と反応せしめた。洗浄緩衝液
によりウェルを３回洗浄することにより未結合抗体を除
去した。結合した抗体をウェル当り１００μｌの基質溶
液（ｂ２，５ＭＭ２．２−アジノージ−（３−エチルベ
ンズチアゾリンスルホン酸）（ＡＢＴＳ） 、０．００
０５％ＨｚＯ□、０．０５Ｍクエン酸、ｐＨ４，０）に
より検出した。室温にて２０分間、緑色を発色せしめた
。１００μｌの０．２Ｍ ＨＦを添加することにより
反応を停止し、そして４０５ｎｍの吸収を測定した。ワ
クチニアウィルス感染細胞の反応性を真正なＦｅＬＶに
より増殖的に感染されたヒト細胞のそれと比較した。エ
ンベロープ遺伝子生成物の強い発現を示すクローンをＢ
ＵｄＲの存在下で２回プラーク精製し、そしてＦｅＬＶ
エンベロープ蛋白質を発現する幾つかの組換ワクチニア
ウィルスクローンを単離し、そしてｖＰｅＬＶｅｎｖと
命名した。
： ４２５； Ｎｕｎｂｅｒｇ等、ハ易（ｂ９８４）別
、：３６７５）。ＩｇＧを腹水から精製し、（Ｌｕ ｔ
ｚ等、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ（ｂ９８
３）５６：２０９）、そしてレポーター分子としてのホ
ースラディツシュパーオキシダーゼと接合せしめた。こ
の接合体を緩衝液３ （０，１５Ｍ ＮａＣｆｆ、Ｏ，
ＯＯＩＭ ＥＤＴＡ、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ
（ｐＨ７，４） 、０．０５％トウィーンー２０，０
．１％ウシ血清アルブミン〕中に１０００倍に稀釈した
。１００μｌの抗体溶液を各ウェルに加え、そして抗体
を３７℃にて６０分間抗原と反応せしめた。洗浄緩衝液
によりウェルを３回洗浄することにより未結合抗体を除
去した。結合した抗体をウェル当り１００μｌの基質溶
液（ｂ２，５ＭＭ２．２−アジノージ−（３−エチルベ
ンズチアゾリンスルホン酸）（ＡＢＴＳ） 、０．００
０５％ＨｚＯ□、０．０５Ｍクエン酸、ｐＨ４，０）に
より検出した。室温にて２０分間、緑色を発色せしめた
。１００μｌの０．２Ｍ ＨＦを添加することにより
反応を停止し、そして４０５ｎｍの吸収を測定した。ワ
クチニアウィルス感染細胞の反応性を真正なＦｅＬＶに
より増殖的に感染されたヒト細胞のそれと比較した。エ
ンベロープ遺伝子生成物の強い発現を示すクローンをＢ
ＵｄＲの存在下で２回プラーク精製し、そしてＦｅＬＶ
エンベロープ蛋白質を発現する幾つかの組換ワクチニア
ウィルスクローンを単離し、そしてｖＰｅＬＶｅｎｖと
命名した。
ネコ白血病ウィルスエンベロープ遺伝子を発現するこの
組換ワクチニアウィルスは、１９８５年１０月１日に、
ＡＴＣＣ１ｌｈＶＲ２２１５としテＡＴＣＣニ寄託さレ
タ。
組換ワクチニアウィルスは、１９８５年１０月１日に、
ＡＴＣＣ１ｌｈＶＲ２２１５としテＡＴＣＣニ寄託さレ
タ。
この例は、ＦｅＬＶサブグループＡのＦｅＬＶエンベロ
ープ遺伝子を担持する生組換ワクチニアウィルスが例１
（Ａ）及び（Ｂ）と本質的に同じ手順に従って調製さ
れ得ることを示す。ガードナー−アルンスタイン株すブ
グループＢウィルスの代りに分子クローン化されたサブ
グループＡウィルス（Ｓｔｅｗａｒｔ等、Ｊ、Ｖｉｒｏ
ｌ、 、Ｖｏｌ、５８（３）：８２５−８３４（ｂ９８
６年６月）〕を使用する。
ープ遺伝子を担持する生組換ワクチニアウィルスが例１
（Ａ）及び（Ｂ）と本質的に同じ手順に従って調製さ
れ得ることを示す。ガードナー−アルンスタイン株すブ
グループＢウィルスの代りに分子クローン化されたサブ
グループＡウィルス（Ｓｔｅｗａｒｔ等、Ｊ、Ｖｉｒｏ
ｌ、 、Ｖｏｌ、５８（３）：８２５−８３４（ｂ９８
６年６月）〕を使用する。
ｐＶＧＡ中のサブグループＢ ｅｎＶ遺伝子のＢａｔ
Ｉ −Ｂａｌｌ断片は、成熟ｇｐ７０のアミノ酸ｌから
保存されたｐ１５Ｅ蛋白質内の１点までをコードする領
域にわたる〔第２図〕。このＢａｌ Ｉ −Ｂａｌ Ｉ
部位はサブグループＡウィルス及びサブグループＢウィ
ルスの両者中で保存された部位である（Ｓｔｅｗａｒｔ
等、上掲）。サブグループＢからの前記見計１一旦吋■
断片は当業者により知られている方法によりサブグルー
プＡウィルスからの同じ断片により置き換えてプラスミ
ドｐＶＧＡ−Ａを導くことができ、このプラスミドはＦ
ｅＬシサブグループＡの完全なｇｐ７０蛋白質及びｐｔ
ｓＥ蛋白質をコードする遺伝子を含有する。このような
造成は例１ （Ａ）のそれに木質的に類イ以する。
Ｉ −Ｂａｌｌ断片は、成熟ｇｐ７０のアミノ酸ｌから
保存されたｐ１５Ｅ蛋白質内の１点までをコードする領
域にわたる〔第２図〕。このＢａｌ Ｉ −Ｂａｌ Ｉ
部位はサブグループＡウィルス及びサブグループＢウィ
ルスの両者中で保存された部位である（Ｓｔｅｗａｒｔ
等、上掲）。サブグループＢからの前記見計１一旦吋■
断片は当業者により知られている方法によりサブグルー
プＡウィルスからの同じ断片により置き換えてプラスミ
ドｐＶＧＡ−Ａを導くことができ、このプラスミドはＦ
ｅＬシサブグループＡの完全なｇｐ７０蛋白質及びｐｔ
ｓＥ蛋白質をコードする遺伝子を含有する。このような
造成は例１ （Ａ）のそれに木質的に類イ以する。
ｐＶＧＡ−Ａを用いて、好ましくはベクターとしてネコ
に馴化されたワクチニアウィルスを用いて、組換体ワク
チニアウィルスを例１ （Ｂ）に記載したのと同じ方法
により造成することができる。
に馴化されたワクチニアウィルスを用いて、組換体ワク
チニアウィルスを例１ （Ｂ）に記載したのと同じ方法
により造成することができる。
組換ワクチニアウィルスジＦｅＬＶｅｎｖにより発現さ
れたＦｅＬＶエンベロープ遺伝子生成物の分子量を免疫
的（ウェスタン）分析により決定した。ヒーラ細胞単層
に、１ ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで、組換ｖＦｅＬＶｅｎ
ν又はワクチニアウィルスのＷＲ株を感染せしめた。感
染の２４時間後、細胞を培養容器からかき集めそして８
００Ｍｇにて１０分間ペレット化した。ペレットを５Ｏ
５−ＰＡＧＥサンプル緩衝液〔２％ＳＤＳ、０．１ Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐｔ１７．０ ）、０．１Ｍ
ＤＴＴ、１０％グリセリン、０．１％ブロノフェノ
ールブルー〕中に溶解し、３分間音波処理し、そして１
００℃にて１０分間加熱した。
れたＦｅＬＶエンベロープ遺伝子生成物の分子量を免疫
的（ウェスタン）分析により決定した。ヒーラ細胞単層
に、１ ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで、組換ｖＦｅＬＶｅｎ
ν又はワクチニアウィルスのＷＲ株を感染せしめた。感
染の２４時間後、細胞を培養容器からかき集めそして８
００Ｍｇにて１０分間ペレット化した。ペレットを５Ｏ
５−ＰＡＧＥサンプル緩衝液〔２％ＳＤＳ、０．１ Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐｔ１７．０ ）、０．１Ｍ
ＤＴＴ、１０％グリセリン、０．１％ブロノフェノ
ールブルー〕中に溶解し、３分間音波処理し、そして１
００℃にて１０分間加熱した。
真正なＦｅＬＶエンベロープ蛋白質サンプルは、あらか
じめＧＡ−ＦｅＬＶ Ｂにより感染されたヒトＲＤ細胞
の粗膜画分の調製により得られた。約１０”の細胞を８
００Ｍｇにて１０分間ペレット化し、リン酸緩衝化塩溶
液により１度洗浄し、そして９容積のＲＢ Ｓ （０，
ＯＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ （ｐＨ７，４） 、０．Ｏ
ＩＭＮａＣ！１０．００１Ｍ Ｍｇ（Ｊｚ ）中に再懸
濁し、そして４℃にて１０分間インキュベートした。細
胞を２０ストロークのダウンス（ｄｏｕｎｃｅ）ホモジ
ナイザーにより溶解した。懸濁液を１．６００Ｍｇにて
１０分間透明にし、そして上清を２９．ＯＯＯＸｇにて
６０分間遠心した。この粗膜ペレットを０．ＯＩＭ Ｔ
ｒｉｓ−Ｈ（ｂ（ｐＨ７，４）、０．ＯＯＩＭ ＥＤＴ
Ａ中に懸濁し、５ＯＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中に溶
解し、そして１００℃に１０分間加熱した。
じめＧＡ−ＦｅＬＶ Ｂにより感染されたヒトＲＤ細胞
の粗膜画分の調製により得られた。約１０”の細胞を８
００Ｍｇにて１０分間ペレット化し、リン酸緩衝化塩溶
液により１度洗浄し、そして９容積のＲＢ Ｓ （０，
ＯＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ （ｐＨ７，４） 、０．Ｏ
ＩＭＮａＣ！１０．００１Ｍ Ｍｇ（Ｊｚ ）中に再懸
濁し、そして４℃にて１０分間インキュベートした。細
胞を２０ストロークのダウンス（ｄｏｕｎｃｅ）ホモジ
ナイザーにより溶解した。懸濁液を１．６００Ｍｇにて
１０分間透明にし、そして上清を２９．ＯＯＯＸｇにて
６０分間遠心した。この粗膜ペレットを０．ＯＩＭ Ｔ
ｒｉｓ−Ｈ（ｂ（ｐＨ７，４）、０．ＯＯＩＭ ＥＤＴ
Ａ中に懸濁し、５ＯＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中に溶
解し、そして１００℃に１０分間加熱した。
蛋白質をアクリルアミドゲル上で電気泳動的に分離した
。分離の後、蛋白質を０．０５Ｍ酢酸す） ＩＪウム（
ｐＨ７，０）中で０．ＩＶ／ｃｄにて６０分間ニトロセ
ルロースに移行せしめた。移行の後、濾紙を２５０ ｍ
Ｊの５％無脂ドライミルク、１％オバルブミン、１Ｍ
グリシン中で３０分間洗浄した。この濾紙を５分間ずつ
３回２５０ｍＮの洗浄緩衝液（０，０１Ｍ Ｔｒｉｓ−
Ｈ（ｂ（ｐＨ７，４） 、０．１５Ｍ Ｎａ（Ｊ、０．
００１Ｍ ＥＤＴＡ 、 ０．１％ＳＤＳ、０．２％ト
リトンＸ−１００，１％無脂ドライミルク、０．１％オ
バルブミン）中で洗浄した。濾紙をモノクローナル抗体
クローン２５．５と共にインキュベートすることにより
、ＦｅＬＶエンベロープ蛋白質を検出した。腹水を洗浄
緩衝液中に１ ： ２００で稀釈し、そして濾紙を２５
℃にて３時間、又は４℃にて一夜インキユベートした。
。分離の後、蛋白質を０．０５Ｍ酢酸す） ＩＪウム（
ｐＨ７，０）中で０．ＩＶ／ｃｄにて６０分間ニトロセ
ルロースに移行せしめた。移行の後、濾紙を２５０ ｍ
Ｊの５％無脂ドライミルク、１％オバルブミン、１Ｍ
グリシン中で３０分間洗浄した。この濾紙を５分間ずつ
３回２５０ｍＮの洗浄緩衝液（０，０１Ｍ Ｔｒｉｓ−
Ｈ（ｂ（ｐＨ７，４） 、０．１５Ｍ Ｎａ（Ｊ、０．
００１Ｍ ＥＤＴＡ 、 ０．１％ＳＤＳ、０．２％ト
リトンＸ−１００，１％無脂ドライミルク、０．１％オ
バルブミン）中で洗浄した。濾紙をモノクローナル抗体
クローン２５．５と共にインキュベートすることにより
、ＦｅＬＶエンベロープ蛋白質を検出した。腹水を洗浄
緩衝液中に１ ： ２００で稀釈し、そして濾紙を２５
℃にて３時間、又は４℃にて一夜インキユベートした。
２５０ｍＪの洗浄緩衝液中で５分間ずつ３回洗浄するこ
とにより未反応抗体を除去した。
とにより未反応抗体を除去した。
ホースラディツシュパーオキシダーゼと接合したラビッ
ト抗−マウスＩｇＧを製造者（アキュレート・ケミカル
ス社）の指示に従って稀釈し、そして濾紙を２５°Ｃに
て１時間インキュベートした２５０ｍ１ずつの洗浄緩衝
液中で５分間ずつ３回洗浄することにより未反応抗体を
除去した。濾紙を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−１１（Ｊ！
（ｐＨ７，５）中０．５ｍｇ／ｍｌジアミノベンジジン
及び０．０３％のＨ２０□から成る酵素基質と共にイン
キュベートすることにより免疫反応性蛋白質を可視化し
た。
ト抗−マウスＩｇＧを製造者（アキュレート・ケミカル
ス社）の指示に従って稀釈し、そして濾紙を２５°Ｃに
て１時間インキュベートした２５０ｍ１ずつの洗浄緩衝
液中で５分間ずつ３回洗浄することにより未反応抗体を
除去した。濾紙を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−１１（Ｊ！
（ｐＨ７，５）中０．５ｍｇ／ｍｌジアミノベンジジン
及び０．０３％のＨ２０□から成る酵素基質と共にイン
キュベートすることにより免疫反応性蛋白質を可視化し
た。
第５図に示すように、組換ワクチニアウィルスに感染さ
れた細胞により生産される蛋白質は真正なＦｅＬＶによ
り感染された細胞により生産されたそれと同時泳動する
。ｖＦｅＬＶｅｎｖにより感染されたヒーラ細胞により
発現される蛍白質のイムノプロット分析は、８３ＫＤの
見かけ分子量をもって泳動する免疫反応性材料の単一バ
ンドを示した（第５図）。この蛋白質はこれらの細胞か
ら調製された膜中に濃縮されており、この観察はｅｎｖ
遺伝子生成物が膜に会合するという予想と一致する。真
正なＧＡ−ＦｅＬＶウィルスにより増殖的に感染された
イヌ細胞の膜調製物中に同じ分子サイズの蛋白質が観察
された（第５図）。
れた細胞により生産される蛋白質は真正なＦｅＬＶによ
り感染された細胞により生産されたそれと同時泳動する
。ｖＦｅＬＶｅｎｖにより感染されたヒーラ細胞により
発現される蛍白質のイムノプロット分析は、８３ＫＤの
見かけ分子量をもって泳動する免疫反応性材料の単一バ
ンドを示した（第５図）。この蛋白質はこれらの細胞か
ら調製された膜中に濃縮されており、この観察はｅｎｖ
遺伝子生成物が膜に会合するという予想と一致する。真
正なＧＡ−ＦｅＬＶウィルスにより増殖的に感染された
イヌ細胞の膜調製物中に同じ分子サイズの蛋白質が観察
された（第５図）。
８３ＫＤ蛋白質の見かけ分子サイズは、ＦｅＬＶｅｎｖ
遺伝子生成物の２つの可能性ある形、すなわち“ｇｐ８
５”前駆体蛋白質、又はプロセシングされた成熟“ｇｐ
７０”蛋白質を区別しない。ＧＡ−ＦｅＬＶの成熱“ｇ
ｐ７０”の分子量マーカーを得るため、’ｇｐ７０”を
含有するＦｅＬＶピリオンをＧＡ−ＦｅＬＶ感染ＣＦ／
２イヌ細胞の培養上清から部分精製した。
遺伝子生成物の２つの可能性ある形、すなわち“ｇｐ８
５”前駆体蛋白質、又はプロセシングされた成熟“ｇｐ
７０”蛋白質を区別しない。ＧＡ−ＦｅＬＶの成熱“ｇ
ｐ７０”の分子量マーカーを得るため、’ｇｐ７０”を
含有するＦｅＬＶピリオンをＧＡ−ＦｅＬＶ感染ＣＦ／
２イヌ細胞の培養上清から部分精製した。
ピリオン蛋白質のイムノプロット分析（第５図、ＧＡ−
ＰｅＬＶウィルスと標示された最終レーン）は、ｖＦｅ
ＬＶｅｎｖ又は真正なＧＡ−ＦｅＬＶのいずれかにより
感染された細胞の脱調製物中にすでに観察されたものと
同時泳動するバンドを示した。従って、これらの細胞中
に貯積するｅｎｖ遺伝子生成物はプロセシングされた成
熟型の蛋白質ｇｐ７０である。この帰属は、炭水化物成
分（５１ＫＤ ；データは示さず）を除去するための無
水弗化水素処理（Ｍｏｒｔ等、Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、、８２ ： ２８９−３０１ （ｂ９７７））後
の蛋白質生成物の分子サイズ分析により確認された。
ＰｅＬＶウィルスと標示された最終レーン）は、ｖＦｅ
ＬＶｅｎｖ又は真正なＧＡ−ＦｅＬＶのいずれかにより
感染された細胞の脱調製物中にすでに観察されたものと
同時泳動するバンドを示した。従って、これらの細胞中
に貯積するｅｎｖ遺伝子生成物はプロセシングされた成
熟型の蛋白質ｇｐ７０である。この帰属は、炭水化物成
分（５１ＫＤ ；データは示さず）を除去するための無
水弗化水素処理（Ｍｏｒｔ等、Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、、８２ ： ２８９−３０１ （ｂ９７７））後
の蛋白質生成物の分子サイズ分析により確認された。
Ｇ＾−ＦｅＬＶ”ｇｌ）７０ ”グリコプロティンの８
３ＫＤの見かけ分子サイズは、他のテトロウィルス“ｇ
ｐ７０”蛋白質に比べてこの蛋白質中に存在する潜在的
なグリコジル化部位の数が多いことを反映しているであ
ろう。
３ＫＤの見かけ分子サイズは、他のテトロウィルス“ｇ
ｐ７０”蛋白質に比べてこの蛋白質中に存在する潜在的
なグリコジル化部位の数が多いことを反映しているであ
ろう。
定常状態蛋白質レベルのこれらの分析において、高分子
サイズ“ｇｐ８５”前駆体蛋白質の蓄積は観察されなか
った。成Ｗ！ｇｐ１０を生じさせるための蛋白質分解的
プロセシングがｖＰｅＬＶｅｎｖで感染された細胞中で
効率的に起こることは、ｇｐａ５前駆体の開裂は他のＦ
ｅＬＶにコードされる蛋白質を必要とせず、そしてＦｅ
ＬＶウィルスの集成及びパッディングの過程と独立であ
ることを示している。
サイズ“ｇｐ８５”前駆体蛋白質の蓄積は観察されなか
った。成Ｗ！ｇｐ１０を生じさせるための蛋白質分解的
プロセシングがｖＰｅＬＶｅｎｖで感染された細胞中で
効率的に起こることは、ｇｐａ５前駆体の開裂は他のＦ
ｅＬＶにコードされる蛋白質を必要とせず、そしてＦｅ
ＬＶウィルスの集成及びパッディングの過程と独立であ
ることを示している。
組換ワクチニアウィルスによるＦｅＬＶエンベロープ遺
伝子の発現の性質をさらに評価するため、発現された蛋
白質の細胞的所在をＭａｎｇｅｒ等、装置（ｂ９８４）
進： ３２７−３３７により記載されている方法に類似
する生細胞免疫蛍光アッセイを用いて決定した。
伝子の発現の性質をさらに評価するため、発現された蛋
白質の細胞的所在をＭａｎｇｅｒ等、装置（ｂ９８４）
進： ３２７−３３７により記載されている方法に類似
する生細胞免疫蛍光アッセイを用いて決定した。
６０〜７５％コンフルエンシープ１４３Ｂ細胞の単層を
収容する組織培養チャンバースライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ
）に、ワクチニアウィルスのＷＲ株又は組換ワクチンｖ
ＦｅＬＶｅｎｖを１０〜２０ ｐｆｕ／細胞のＭｏｌで
感染せしめた。感染後３時間、６時間及び２４時間にお
いて、細胞（下記のように固定したもの又は未固定のも
の）を抗体と共にインキュベートして下記のようにして
ＰｅＬＶエンベロープ遺伝子生成物の発現を検出した。
収容する組織培養チャンバースライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ
）に、ワクチニアウィルスのＷＲ株又は組換ワクチンｖ
ＦｅＬＶｅｎｖを１０〜２０ ｐｆｕ／細胞のＭｏｌで
感染せしめた。感染後３時間、６時間及び２４時間にお
いて、細胞（下記のように固定したもの又は未固定のも
の）を抗体と共にインキュベートして下記のようにして
ＰｅＬＶエンベロープ遺伝子生成物の発現を検出した。
約胞を４℃のＰＢＳにより３回注意深く洗浄した。細胞
を固定しないで細胞の表面上の抗原のみが抗体に接近で
きるようにするか、又は−２０℃のアセトン中で１５分
間固定して細胞の内部抗原も抗原に接近できるようにし
た。細胞（固定されているか、又は固定されていない）
を２５℃にて６０分間、４％のＢＳＡを含むＰＢＳ中に
１ ： ２００稀釈されたモノクローナル抗体クローン
２５．５ （上記）腹水液と共にインキュベートした。
を固定しないで細胞の表面上の抗原のみが抗体に接近で
きるようにするか、又は−２０℃のアセトン中で１５分
間固定して細胞の内部抗原も抗原に接近できるようにし
た。細胞（固定されているか、又は固定されていない）
を２５℃にて６０分間、４％のＢＳＡを含むＰＢＳ中に
１ ： ２００稀釈されたモノクローナル抗体クローン
２５．５ （上記）腹水液と共にインキュベートした。
細胞をＰＢＳにより３回注意深く洗浄し、そして４％Ｂ
ＳＡを含有するＰＢＳ中に１：５０で稀釈された、フル
オレッセインイソチオシアナートと接合したラビット抗
−マウスＩｇＧと２５℃にて６０分間反応せしめた。細
胞を再度ＰＢＳにより３回注意深く洗浄し、そしてＰＢ
Ｓ中５中筒０％グリセリンにカバースリップを置いた。
ＳＡを含有するＰＢＳ中に１：５０で稀釈された、フル
オレッセインイソチオシアナートと接合したラビット抗
−マウスＩｇＧと２５℃にて６０分間反応せしめた。細
胞を再度ＰＢＳにより３回注意深く洗浄し、そしてＰＢ
Ｓ中５中筒０％グリセリンにカバースリップを置いた。
細胞を紫外線エピフルオレッセンスにより観察し、そし
て写真撮影した。
て写真撮影した。
これらの免疫蛍光分析の結果を第６図に示す。
パネルＢにおいては、細胞は固定されておらず、そして
表面のみが利用可能である。パネルＡにおいては、細胞
が固定されており、細胞の内部が抗体に暴露される。感
染後３時間という早期にＦｅＬＶエンベロープ遺伝子生
成物が細胞中に明瞭に発現された。表面蛍光は６時間後
に観察された。さらに、感染の２４時間後、固定されて
いない細胞（パネルＢ）は特徴的な強い細胞表面染色を
示し、エンベロープ遺伝子生製物が組換ワクチニアｖＦ
ｅＬＶｅｎｖで感染された細胞の表面に位置することが
示された。すなわち、この免疫蛍光アッセイの結果は、
ｅｎｖｇｐ７０蛋白質が組換ワクチニアウィルスにより
感染された細胞の表面に輸送され、そしてそこに蓄積す
ることを示した。
表面のみが利用可能である。パネルＡにおいては、細胞
が固定されており、細胞の内部が抗体に暴露される。感
染後３時間という早期にＦｅＬＶエンベロープ遺伝子生
成物が細胞中に明瞭に発現された。表面蛍光は６時間後
に観察された。さらに、感染の２４時間後、固定されて
いない細胞（パネルＢ）は特徴的な強い細胞表面染色を
示し、エンベロープ遺伝子生製物が組換ワクチニアｖＦ
ｅＬＶｅｎｖで感染された細胞の表面に位置することが
示された。すなわち、この免疫蛍光アッセイの結果は、
ｅｎｖｇｐ７０蛋白質が組換ワクチニアウィルスにより
感染された細胞の表面に輸送され、そしてそこに蓄積す
ることを示した。
（２）免聚沈澱犬放
これらの知見を定量化するため、及びｖＦｅＬＶｅｎｖ
で感染された細胞内でのｅｎｖ遺伝子生成物の輸送をＦ
ｅＬＶにより感染された細胞内でのそれと比較するため
、免疫沈澱実験を行ってｇｐ７０抗原の細胞内発現及び
表面発現を区別した。細胞単層をワクチニアウィルスに
より感染せしめ、そして１９時間代謝的にラベルした。
で感染された細胞内でのｅｎｖ遺伝子生成物の輸送をＦ
ｅＬＶにより感染された細胞内でのそれと比較するため
、免疫沈澱実験を行ってｇｐ７０抗原の細胞内発現及び
表面発現を区別した。細胞単層をワクチニアウィルスに
より感染せしめ、そして１９時間代謝的にラベルした。
次に、そのままの単層を抗−ＦｅＬＶｇｐ７０モノクロ
一ナル抗体（Ｃ１１Ｄ８；Ｇｒａｎｔ等、Ｊ、 Ｔｍｍ
ｕｎｏｌ、 、匪： ３０４２−３０４８（ｂ９８３）
）と共にインキュベートし、そして十分に洗浄した後
洗剤溶解（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−１ｙｓｉｓ）及びスタ
フィロコッカスＡプロティンによる免疫沈澱を行った。
一ナル抗体（Ｃ１１Ｄ８；Ｇｒａｎｔ等、Ｊ、 Ｔｍｍ
ｕｎｏｌ、 、匪： ３０４２−３０４８（ｂ９８３）
）と共にインキュベートし、そして十分に洗浄した後
洗剤溶解（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−１ｙｓｉｓ）及びスタ
フィロコッカスＡプロティンによる免疫沈澱を行った。
この方法において、表面ｇｐ７０抗原のみが沈澱する。
全細胞ｇｐ７０抗原を、抗体とのインキュベートの前に
細胞溶解を行った並行培養物から免疫沈澱せしめた。第
７図は組換ワクチニアウィルスジＦｅＬＶｅｎｖにより
感染された細胞から得られた結果（いずれの場合もレー
ン３）と真正なＧＡ−ＦｅＬＶにより永続的に感染され
た細胞から得られた結果（いずれの場合もレーン４）と
を比較する。
細胞溶解を行った並行培養物から免疫沈澱せしめた。第
７図は組換ワクチニアウィルスジＦｅＬＶｅｎｖにより
感染された細胞から得られた結果（いずれの場合もレー
ン３）と真正なＧＡ−ＦｅＬＶにより永続的に感染され
た細胞から得られた結果（いずれの場合もレーン４）と
を比較する。
第８図に関する図面の簡単な説明の欄において後記する
ように、１×１０７細胞は抗体とのインキュベーション
の前に細胞溶解されず（麦瓦免疫几結果）、他方２．５
Ｘ１０ｂ細胞は抗体とのインキュベーションの前に細胞
溶解された（全貞忽溌■璽免及丈澱結果）。処理された
細胞数との比較において免疫沈澱の結果を判断すれば、
ｖＦｅＬＶｅｎｖで感染された細胞中のｇｐ７０蛋白質
は細胞内及び細胞表面膜におよそ等しく分配され、他方
ＦｅＬＶにより永続的に感染されている細胞においては
１０％未満のｇｐ７０蛋白質が細胞膜上に蓄積する。
ように、１×１０７細胞は抗体とのインキュベーション
の前に細胞溶解されず（麦瓦免疫几結果）、他方２．５
Ｘ１０ｂ細胞は抗体とのインキュベーションの前に細胞
溶解された（全貞忽溌■璽免及丈澱結果）。処理された
細胞数との比較において免疫沈澱の結果を判断すれば、
ｖＦｅＬＶｅｎｖで感染された細胞中のｇｐ７０蛋白質
は細胞内及び細胞表面膜におよそ等しく分配され、他方
ＦｅＬＶにより永続的に感染されている細胞においては
１０％未満のｇｐ７０蛋白質が細胞膜上に蓄積する。
これらの結果は、組換ワクチニアウィルスにより感染さ
れた細胞はその表面上に、ＦｅＬＶにより感染された細
胞より実質上多くのｇｐ７ｏを蓄積することを示してい
る。
れた細胞はその表面上に、ＦｅＬＶにより感染された細
胞より実質上多くのｇｐ７ｏを蓄積することを示してい
る。
要約すれば、組換ワクチニアウィルスｖＦｅＬＶｅｎν
により感染された細胞内で、又はＦｅＬＶにより感染さ
れた細胞内で発現される場合、ＦｅＬＶｅｎｖ蛋白質の
合成、プロセシング、及び輸送において質的な差異は見
出されない。成熟ｇｐ７０をもたらす！工Ｖｇｐ８５前
駆体の蛋白質分解的プロセシングはそれが蓄積する細胞
表面への移行の間に急速に生ずる。
により感染された細胞内で、又はＦｅＬＶにより感染さ
れた細胞内で発現される場合、ＦｅＬＶｅｎｖ蛋白質の
合成、プロセシング、及び輸送において質的な差異は見
出されない。成熟ｇｐ７０をもたらす！工Ｖｇｐ８５前
駆体の蛋白質分解的プロセシングはそれが蓄積する細胞
表面への移行の間に急速に生ずる。
Ｃ，ｖＦｅＬＶｅｎｖによ コードされたＦｅＬＶｅｎ
ｖ ｉ伝このセクションにおいて記載する実験において
は、ワクチニアウィルスの複製及びＦｅＬＶｅｎｖ遺伝
子の発現をネコ由来の細胞中で試験した。獣医学１７２
（ｂ９８３））から、及び本発明者等により行われた
公表された安全性試験から、ワクチニアウィルスはネコ
において複製することができることが知られる。これら
の観点を定量化するため、ネコ、ネズミ及びヒト由来の
細胞（それぞれ、ＣＲＦＫ又はＦｃ９ ： Ｌ９２９
；及びヒーラ又は１４３Ｂ）に組換ワクチニアウィルス
を感染せしめ、そしてウィルスの生産及びＦｅＬＶｅｎ
ｖ蛋白質の蓄積を測定した。対応する細胞単層に感染倍
率１で感染せしめ、そして感染後４８時間目に細胞を収
得した。細胞に会合したウィルスをヒーラ細胞を用いる
プラークアッセイにより定量し、そしてｇｐ７ｏの蓄積
を感染細胞の膜沈澱から免疫的に決定した。これらの実
験は、ネコ由来の細胞中で実質的なワクチニアウィルス
の複製が生ずることを確認した。しかしながら、ネコ細
胞において得られるウィルス収量は、ヒト細胞において
得られるそれより実質的に少なかった（それぞれ、１０
７細胞当り１０” ＝１０’ｐｆｕ ：ＩＱ１６〜１０
”ｐｆｕ）。ネコ細胞中でのウィルスの複製をさらに、
感染されたネコ細胞単層において観察される徐々にでは
あるが広範な細胞変性効果により証明した。ウィルス増
殖の’１４１２のパターンがネズミ由来の細胞において
観察された。
ｖ ｉ伝このセクションにおいて記載する実験において
は、ワクチニアウィルスの複製及びＦｅＬＶｅｎｖ遺伝
子の発現をネコ由来の細胞中で試験した。獣医学１７２
（ｂ９８３））から、及び本発明者等により行われた
公表された安全性試験から、ワクチニアウィルスはネコ
において複製することができることが知られる。これら
の観点を定量化するため、ネコ、ネズミ及びヒト由来の
細胞（それぞれ、ＣＲＦＫ又はＦｃ９ ： Ｌ９２９
；及びヒーラ又は１４３Ｂ）に組換ワクチニアウィルス
を感染せしめ、そしてウィルスの生産及びＦｅＬＶｅｎ
ｖ蛋白質の蓄積を測定した。対応する細胞単層に感染倍
率１で感染せしめ、そして感染後４８時間目に細胞を収
得した。細胞に会合したウィルスをヒーラ細胞を用いる
プラークアッセイにより定量し、そしてｇｐ７ｏの蓄積
を感染細胞の膜沈澱から免疫的に決定した。これらの実
験は、ネコ由来の細胞中で実質的なワクチニアウィルス
の複製が生ずることを確認した。しかしながら、ネコ細
胞において得られるウィルス収量は、ヒト細胞において
得られるそれより実質的に少なかった（それぞれ、１０
７細胞当り１０” ＝１０’ｐｆｕ ：ＩＱ１６〜１０
”ｐｆｕ）。ネコ細胞中でのウィルスの複製をさらに、
感染されたネコ細胞単層において観察される徐々にでは
あるが広範な細胞変性効果により証明した。ウィルス増
殖の’１４１２のパターンがネズミ由来の細胞において
観察された。
マウス上９２９細胞中で得られるウィルスの収量は一般
に、ネコ細胞中で得られるそれに匹敵した。
に、ネコ細胞中で得られるそれに匹敵した。
試験したすべてのセルラインにおいて、ウィルス生産は
、野性型ＷＲウィルスにより感染された細胞又は組換ｖ
ＦｅＬＶｅｎｖウィルスにより感染された細胞中で頻偵
していた（データは示してない）。
、野性型ＷＲウィルスにより感染された細胞又は組換ｖ
ＦｅＬＶｅｎｖウィルスにより感染された細胞中で頻偵
していた（データは示してない）。
すなわち、ＦｅＬＶ ｅ ｎ ｖ遺伝子生成物の発現は
ウィルス生産のレベルに影響を与えないようであった。
ウィルス生産のレベルに影響を与えないようであった。
確かに、およそのところ、ｖＦｅＬＶｅｎｖにより感染
された細胞中でのＦｅＬＶｇｐ ７０蛋白質の発現はウ
ィルス生産の観察されるレベルと相関するようであった
。すなわち、すべてのセルラインは感染中にＦｅＬＶｇ
ｐ ７０蛋白質を生産した。ウィルス生産の相対レベル
と調和して、ネコ細胞及びネズミ細胞におけるｇｐ７０
蛋白質の蓄積はヒト細胞におけるそれと比べて実質的に
低かった（第８図）。
された細胞中でのＦｅＬＶｇｐ ７０蛋白質の発現はウ
ィルス生産の観察されるレベルと相関するようであった
。すなわち、すべてのセルラインは感染中にＦｅＬＶｇ
ｐ ７０蛋白質を生産した。ウィルス生産の相対レベル
と調和して、ネコ細胞及びネズミ細胞におけるｇｐ７０
蛋白質の蓄積はヒト細胞におけるそれと比べて実質的に
低かった（第８図）。
しかしながら、ネコ細胞とネズミ細胞との比較において
、ウィルスの収量とＦｅＬＶｇｐ ７０の蓄積との間の
直接的関係は表面的には弱められる。感染されたネコ細
胞及びネズミ細胞においてウィルス生産は匹敵したが、
ネズミ細胞はＰｅＬＶｇｐ ７０蛋白質の一層高いレベ
ルを蓄積することが一貫して見られた。
、ウィルスの収量とＦｅＬＶｇｐ ７０の蓄積との間の
直接的関係は表面的には弱められる。感染されたネコ細
胞及びネズミ細胞においてウィルス生産は匹敵したが、
ネズミ細胞はＰｅＬＶｇｐ ７０蛋白質の一層高いレベ
ルを蓄積することが一貫して見られた。
例１の方法により調製されるｐＶＧＡＯｐｔｓＨＩ域が
水泡性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）Ｇ）ランスメンプラン
領域により置き換えられている好ましい挿入ベクターの
造成をこの例において記載する。
水泡性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）Ｇ）ランスメンプラン
領域により置き換えられている好ましい挿入ベクターの
造成をこの例において記載する。
Ａ、 ＶΣ仕引」里
ｐＧＦｌ （Ｒｏｓｅ等、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 ３９
：５１９−５２８（ｂ９８１））のりＳｖＧ蛋白質ｃＤ
ＮＡを工ｕＩ （ヌクレオチド１２９１）及びＮＩａ
Ｉ［［（ヌクレオチド１５９１）により完全消化する。
：５１９−５２８（ｂ９８１））のりＳｖＧ蛋白質ｃＤ
ＮＡを工ｕＩ （ヌクレオチド１２９１）及びＮＩａ
Ｉ［［（ヌクレオチド１５９１）により完全消化する。
次に、トランスメンプラン領域及び停止コドンを含有す
る３００ｂｐ断片を単離する。
る３００ｂｐ断片を単離する。
次に、前記３００ｂｐ断片を一致するＡｃｃ１部位及び
５刃１部位においてｐＵｃ１８中に分子クローン化する
。次に、得られるプラスミドｐＵｃ８−ＶＳＶＧを足並
Ｒ１及び１釦ｄＩＩ［により消化して、末端に過当なポ
リリンカー由来制限部位を有するＶＳＶ Ｇ断片を遊離
せしめる（第１０図中に示すセクションＡ）。
５刃１部位においてｐＵｃ１８中に分子クローン化する
。次に、得られるプラスミドｐＵｃ８−ＶＳＶＧを足並
Ｒ１及び１釦ｄＩＩ［により消化して、末端に過当なポ
リリンカー由来制限部位を有するＶＳＶ Ｇ断片を遊離
せしめる（第１０図中に示すセクションＡ）。
プラスミドｐｔＧＡΔＨｇ１ＡＩ はＦｅＬＶｇｐ７０
のＣ−末端の先端を除くすべてをコードし、ｔｒｐＬＥ
’融合蛋白質をコードする。ｐｔＧＡΔＨｇ１ＡＩの
誘導を第９図に要約する。
のＣ−末端の先端を除くすべてをコードし、ｔｒｐＬＥ
’融合蛋白質をコードする。ｐｔＧＡΔＨｇ１ＡＩの
誘導を第９図に要約する。
プラスミドｐ ｔＧＡ及びｐ旦ＬＥ’の造成、起源及び
誘導はＰＣＴ／１１５８４１０１９６３ （ｂ９８５年
１２月１８日公開）に詳細に記載されている。この公開
された特許出願の該当部分を引用によりこの明細書に組
み入れる。プラスミドｐｔｃＡは、第９図に示すように
、ｔｒｐＬＥ ’に融合した全ＦｅＬＶｇｐ ８５前駆
体蛍白質の配列を含有する。
誘導はＰＣＴ／１１５８４１０１９６３ （ｂ９８５年
１２月１８日公開）に詳細に記載されている。この公開
された特許出願の該当部分を引用によりこの明細書に組
み入れる。プラスミドｐｔｃＡは、第９図に示すように
、ｔｒｐＬＥ ’に融合した全ＦｅＬＶｇｐ ８５前駆
体蛍白質の配列を含有する。
プラスミドｐｔＧ＾を且１Ａ Ｉにより消化しく且れＡ
Ｉ：１〜５ユニット／μｇ、３０〜６０分間、３７℃）
、そして１紅ＡＩ３’突出末端を、ＤＮＡポリメラーゼ
ｒのＫｌｅｎｏ−断片の３ ’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性を用いて分解して平滑末端化した。次に、この材
料をｌｌ■で消化し、そしてポリアクリルアミドゲル電
気泳動により１．５ ｋ ｂ几■−平滑１紅Ａｌ断片を
単離した。プラスミドｐｔｒｐＬＨ’をＥｃｏＲＩで消
化し、末端をＫｌｅｎｏｈ断片により修復した。次に、
この材料を几■で消化し、そして２．６ ｋ ｂベクタ
ー断片をゲル電気泳動により単離した。１．６ｋｂ旦麩
■−平滑且れＡｌ断片及び２．６ ｋ ｂ １ＬＬＩＩ
−修復旦並Ｒ１ベクター断片を混合し、そして２段階法
で連結した（分子間接着末端十分子内平滑末端）。この
材料を用いてＥ、コリをアンピシリン耐性に形質転換し
た。生じたコロニーからのプラスミドをＥｃ。
Ｉ：１〜５ユニット／μｇ、３０〜６０分間、３７℃）
、そして１紅ＡＩ３’突出末端を、ＤＮＡポリメラーゼ
ｒのＫｌｅｎｏ−断片の３ ’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性を用いて分解して平滑末端化した。次に、この材
料をｌｌ■で消化し、そしてポリアクリルアミドゲル電
気泳動により１．５ ｋ ｂ几■−平滑１紅Ａｌ断片を
単離した。プラスミドｐｔｒｐＬＨ’をＥｃｏＲＩで消
化し、末端をＫｌｅｎｏｈ断片により修復した。次に、
この材料を几■で消化し、そして２．６ ｋ ｂベクタ
ー断片をゲル電気泳動により単離した。１．６ｋｂ旦麩
■−平滑且れＡｌ断片及び２．６ ｋ ｂ １ＬＬＩＩ
−修復旦並Ｒ１ベクター断片を混合し、そして２段階法
で連結した（分子間接着末端十分子内平滑末端）。この
材料を用いてＥ、コリをアンピシリン耐性に形質転換し
た。生じたコロニーからのプラスミドをＥｃ。
ＲＩ部位及び且れ■部位の再形成についてスクリーニン
グした。目的とするプラスミドを第９図に９ｔＧＡΔＨ
ｇ１ＡＩ として示す。
グした。目的とするプラスミドを第９図に９ｔＧＡΔＨ
ｇ１ＡＩ として示す。
４ （Ｂ）（ｂ）において要約した方法により調製され
たプラスミドｐｔＧＡΔ）ＩｇｉＡＩをＥｃｏＲＩ
（ＬｅＬＶｇｐ７０のＣ−末端の近傍の前記丘Ａ■部位
）により、そしてＭｓｔｆｆ （ＦｅＬＶｇｐ７０内）
により消化する。次に、ＦｅＬＶｇｐ ７０遺伝子のＣ
−末端の約半分を含む、この消化により開裂された５６
０ｂｐ断片を単離する（第１０図中セクションＢ）。
たプラスミドｐｔＧＡΔ）ＩｇｉＡＩをＥｃｏＲＩ
（ＬｅＬＶｇｐ７０のＣ−末端の近傍の前記丘Ａ■部位
）により、そしてＭｓｔｆｆ （ＦｅＬＶｇｐ７０内）
により消化する。次に、ＦｅＬＶｇｐ ７０遺伝子のＣ
−末端の約半分を含む、この消化により開裂された５６
０ｂｐ断片を単離する（第１０図中セクションＢ）。
プラスミドｐＶＧＡ （例１）をＭｓｔＴＩ （Ｆｅ
ＬＶｇｐ７０内）で部分消化し、そしてＨｉｎｄ ｍ
（もとのプラスミドｐＫＨＲ−１中及びそれに由来する
ｐＶＧＡ中ＦｅＬＶプロウィルスを挟むヒトゲノム配列
内）により部分消化した。ｐＶＧＡのこのような部分消
化は、２個のＭｓｔ Ｕ及び２個のＨｉｎｄ Ｕ部位の
内のそれぞれ平均１個が開裂されるように設計された条
件のもとで行われる。次に、大断片（第１Ｏ図において
ｐＶＧＡ−ＶＳＶＧのセクションＣとして示される）を
単離する。この断片は、時計方向に、Ｈｉｎｄｌ１１部
位及びｐＧｓ２０からのワクチニアウィルスＴＫ遺伝子
の３′側半分；そして次にＥ、コリ複製開始点及びアン
ピシリン耐性マーカーを含む完全ｐＧｓ２０プラスミド
；そしてさらにｐＧｓ２０ＴＫ遺伝子の５′側半分、ｐ
Ｇｓ２０の７．５ Ｋ Ｄプロモーター、及び最後にＰ
ｅＬＶｇｐ ７０の中央のＭｓｔ１１部位を含有する。
ＬＶｇｐ７０内）で部分消化し、そしてＨｉｎｄ ｍ
（もとのプラスミドｐＫＨＲ−１中及びそれに由来する
ｐＶＧＡ中ＦｅＬＶプロウィルスを挟むヒトゲノム配列
内）により部分消化した。ｐＶＧＡのこのような部分消
化は、２個のＭｓｔ Ｕ及び２個のＨｉｎｄ Ｕ部位の
内のそれぞれ平均１個が開裂されるように設計された条
件のもとで行われる。次に、大断片（第１Ｏ図において
ｐＶＧＡ−ＶＳＶＧのセクションＣとして示される）を
単離する。この断片は、時計方向に、Ｈｉｎｄｌ１１部
位及びｐＧｓ２０からのワクチニアウィルスＴＫ遺伝子
の３′側半分；そして次にＥ、コリ複製開始点及びアン
ピシリン耐性マーカーを含む完全ｐＧｓ２０プラスミド
；そしてさらにｐＧｓ２０ＴＫ遺伝子の５′側半分、ｐ
Ｇｓ２０の７．５ Ｋ Ｄプロモーター、及び最後にＰ
ｅＬＶｇｐ ７０の中央のＭｓｔ１１部位を含有する。
Ｄ−パ旦りづ５匹
前記４ （Ａ） 、４ （Ｂ）及び４（Ｃ）に記載した
調製から単離されそしてそれぞれセクションＡ、セクシ
ョンＢ及びセクションＣと称する３つの断片を混合し、
そして連結することにより、ＦｅＬＶｇｐ７０のＣ−末
端において融合したＶＳＶ Ｇ蛋白質トランスメンプラ
ン領域をコードする配列を含有する目的プラスミドを得
る。
調製から単離されそしてそれぞれセクションＡ、セクシ
ョンＢ及びセクションＣと称する３つの断片を混合し、
そして連結することにより、ＦｅＬＶｇｐ７０のＣ−末
端において融合したＶＳＶ Ｇ蛋白質トランスメンプラ
ン領域をコードする配列を含有する目的プラスミドを得
る。
ｐＶＧＡ−ｖｓｖｃと命名されるこのプラスミドを第１
０図に示す。次に、例１ （Ｂ）に記載した方法と同
様にして組換ワクチニアウィルスを調製することができ
る。この組換ワクチニアウィルスの感染によって発現さ
れる融合蛋白質はほとんど完全なＦｅＬＶｇｐ ７０
ｅｎｖ蛋白質及びＶＳＶ Ｇ蛋白質トランスメンプラン
領域を含有し、膜内での付着が保証される。
０図に示す。次に、例１ （Ｂ）に記載した方法と同
様にして組換ワクチニアウィルスを調製することができ
る。この組換ワクチニアウィルスの感染によって発現さ
れる融合蛋白質はほとんど完全なＦｅＬＶｇｐ ７０
ｅｎｖ蛋白質及びＶＳＶ Ｇ蛋白質トランスメンプラン
領域を含有し、膜内での付着が保証される。
他の近傍の部位及びそのような部位に向けられた同様の
方策を用いて、カセットがｇｐ７０ｅＪ［域及びＦｅＬ
Ｖｐ１５Ｅ？＋Ｉ域以外のトランスメンプラン領域を含
んでなる、概念的に同等な融合体を製造することができ
る。
方策を用いて、カセットがｇｐ７０ｅＪ［域及びＦｅＬ
Ｖｐ１５Ｅ？＋Ｉ域以外のトランスメンプラン領域を含
んでなる、概念的に同等な融合体を製造することができ
る。
劃」ユ ＦＨＶ
この例は、ネコ白血病に対する生組換ウィルスワクチン
の製造におけるワクチニアウィルスに代るものとしての
ネコ・ヘルペスウイルス（Ｆ ＨＶ）の使用を記載する
。ＦＨＶはヘルペスウィルス科の天然ウィルスである。
の製造におけるワクチニアウィルスに代るものとしての
ネコ・ヘルペスウイルス（Ｆ ＨＶ）の使用を記載する
。ＦＨＶはヘルペスウィルス科の天然ウィルスである。
このものはネコに感染し、かなりの病的状態及び死亡を
もたらす呼吸器失意であるネコ・ライノトラカイチス（
ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ）病をもたらす。家庭
のネコは日常的に、幾つかの市販の死菌ウィルスワクチ
ン又は弱毒生ウイルスワクチンによりネコ・ライノトラ
カイチス・ウィルスに対して予防免疫される。最近の弱
毒性生ＦＨＶワクチンの使用はＦｅＬＶエンベロープ遺
伝子を含む生組換ＦＨＶウィルスワクチンの使用を許容
し、このワクチンはライノトラカイチスに対して保護す
るのに加えて、ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子の発現の結
果としてＦｅＬＶに対して保護する。弱毒化されたＦＨ
Ｖワクチン株が好ましい。
もたらす呼吸器失意であるネコ・ライノトラカイチス（
ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ）病をもたらす。家庭
のネコは日常的に、幾つかの市販の死菌ウィルスワクチ
ン又は弱毒生ウイルスワクチンによりネコ・ライノトラ
カイチス・ウィルスに対して予防免疫される。最近の弱
毒性生ＦＨＶワクチンの使用はＦｅＬＶエンベロープ遺
伝子を含む生組換ＦＨＶウィルスワクチンの使用を許容
し、このワクチンはライノトラカイチスに対して保護す
るのに加えて、ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子の発現の結
果としてＦｅＬＶに対して保護する。弱毒化されたＦＨ
Ｖワクチン株が好ましい。
ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子を含有する、ＦＨＶを基礎
にしだ組換体ウィルスの造成方法は次の段階を含む。
にしだ組換体ウィルスの造成方法は次の段階を含む。
・Ｆ）ＩＶ ＴＫＫ伝子及びフランキング配列の分子ク
ローニング； ・完全なＦｅＬＶエンベロープ遺伝子又はＦｅＬＶｇｐ
７０遺伝子及び代替可能な由来からのトランスメンプラ
ン領域蛋白質をコードする配列及び転写を駆動するため
の適当な上流プロモーター（例えば、このようなプロモ
ーターにはＨ５Ｖ Ｉ ＴＫプロモーター、Ｈ５Ｖｆｆ
−４プロモーター、ＦＨＶ ＴＫＫＨ２１−一ター、又
はＦＨＶキャプシドもしくは主要エンベロープ糖蛋白質
プロモーターが包含されよう）を含有する組換ＤＮＡカ
セットの、ＴＫ遺遺伝円内の挿入； ・上記のように造成されたプラスミドとＦＨＶゲノムＤ
ＮＡとによるネコ細胞の同時形質転換による、ＦＨＶ
ＴＫ配列のインビトロ相同性組換及びＦＨＶのゲノムへ
のプロモーターＦｅＬＶエンベロープ遺伝子カセットの
導入の許容； ・野性型ウィルス及び組換体ウィルスを含むトランスフ
ェクションからの子孫ウィルスの単離；並びに、 ・ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子生成物を発現するＴＫ−
マイナスウィルスの単離。
ローニング； ・完全なＦｅＬＶエンベロープ遺伝子又はＦｅＬＶｇｐ
７０遺伝子及び代替可能な由来からのトランスメンプラ
ン領域蛋白質をコードする配列及び転写を駆動するため
の適当な上流プロモーター（例えば、このようなプロモ
ーターにはＨ５Ｖ Ｉ ＴＫプロモーター、Ｈ５Ｖｆｆ
−４プロモーター、ＦＨＶ ＴＫＫＨ２１−一ター、又
はＦＨＶキャプシドもしくは主要エンベロープ糖蛋白質
プロモーターが包含されよう）を含有する組換ＤＮＡカ
セットの、ＴＫ遺遺伝円内の挿入； ・上記のように造成されたプラスミドとＦＨＶゲノムＤ
ＮＡとによるネコ細胞の同時形質転換による、ＦＨＶ
ＴＫ配列のインビトロ相同性組換及びＦＨＶのゲノムへ
のプロモーターＦｅＬＶエンベロープ遺伝子カセットの
導入の許容； ・野性型ウィルス及び組換体ウィルスを含むトランスフ
ェクションからの子孫ウィルスの単離；並びに、 ・ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子生成物を発現するＴＫ−
マイナスウィルスの単離。
これらの段階を以下に詳細に記載する。
Ａ、Ｊ 云 の クローニング
ＴＫ遺伝子を包含するＦＨＶゲノムのすべての制限断片
を含む組換ＤＮＡライブラリーを次のようにして造成す
る。ＦＨＶゲノムｃＤＮＡをＰｉｇｎａｔｔｉ等（Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ（ｂ９７９）９３ ： ２６０−２６４
）により記載されているようにして単離し、そして幾つ
かのまれに切断する制限エンドヌクレアーゼ（例えば旦
ｃｏＲＩ、且ザＨＩ、旦旦ｄｌ［Ｉ等）のいずれかによ
り完全消化し、そして生ずる断片をＭａｎｉａｔｉｓ等
、前掲、により記載されているようにしてプラスミド又
はファージスベクターに分子クローニングする。これら
の消化からの平均制限断片が５ｋｂであると仮定すれば
、約１００ｋｂの完全ＦＨＶゲノムを含むためには約２
０個の異るクローンが必要とされる。ＴＫ遺伝子を含有
する特定の分子クローンを同定するために幾つかの方法
が使用される。
を含む組換ＤＮＡライブラリーを次のようにして造成す
る。ＦＨＶゲノムｃＤＮＡをＰｉｇｎａｔｔｉ等（Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ（ｂ９７９）９３ ： ２６０−２６４
）により記載されているようにして単離し、そして幾つ
かのまれに切断する制限エンドヌクレアーゼ（例えば旦
ｃｏＲＩ、且ザＨＩ、旦旦ｄｌ［Ｉ等）のいずれかによ
り完全消化し、そして生ずる断片をＭａｎｉａｔｉｓ等
、前掲、により記載されているようにしてプラスミド又
はファージスベクターに分子クローニングする。これら
の消化からの平均制限断片が５ｋｂであると仮定すれば
、約１００ｋｂの完全ＦＨＶゲノムを含むためには約２
０個の異るクローンが必要とされる。ＴＫ遺伝子を含有
する特定の分子クローンを同定するために幾つかの方法
が使用される。
１つの方法は、宿主細胞中のＴＫ欠損を補完する分子ク
ローン化ＦＨＶ ＴＫ遺伝子の能力に基く。この方法は
ＴＫ−マイナスネコセルラインの単離を必要とする。Ｔ
Ｋ−マイナスネコセルラインは、ネコＣＲＦＫ細胞（Ｃ
ｒａｎｄａｌｌ等、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ （２９７４）
９ ：１７６−１８５ ）から、ＣＲＦＫ細胞をＢＵ
ｄＲの存在下で選択することにより、又は化学変異剤〔
例えば、Ｃａｂｏｃｈｅ 、 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ｂ９
７４）？７：３０９−３２２：ｖａｎ ＤａａｌｅｎＷ
ｅｔｔｅｒｓ及びＣｏｆｆ１ｎｏ 、、Ｍｏｌ、 Ｃｅ
１ｌ Ｂｉｏｌ （ｂ９Ｂ２）２ ： １２２９−１
２３７ ）により処理した後に選択的条件下で増殖せし
めることにより、単離することができる。最高濃度のＢ
ＵｄＲにおいて増殖することができる細胞クローンを単
離する。細胞溶解物をＴＫ活性についてアッセイする（
Ｌｅｅ及びＣｈｅｎｇ ％Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｍ、（ｂ９７６）２５１ ：２６００−２６０４）こと
によりＴＫ酵素活性の欠損が確認される。ＫＴ−マイナ
スネコセルラインが得られれば、前記のごときトランス
フェクション実験を行って、ＫＴ−マイナス表現型を補
完することができる分子クローン化配列をＨＡＴ選択選
択培地量定する。
ローン化ＦＨＶ ＴＫ遺伝子の能力に基く。この方法は
ＴＫ−マイナスネコセルラインの単離を必要とする。Ｔ
Ｋ−マイナスネコセルラインは、ネコＣＲＦＫ細胞（Ｃ
ｒａｎｄａｌｌ等、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ （２９７４）
９ ：１７６−１８５ ）から、ＣＲＦＫ細胞をＢＵ
ｄＲの存在下で選択することにより、又は化学変異剤〔
例えば、Ｃａｂｏｃｈｅ 、 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ｂ９
７４）？７：３０９−３２２：ｖａｎ ＤａａｌｅｎＷ
ｅｔｔｅｒｓ及びＣｏｆｆ１ｎｏ 、、Ｍｏｌ、 Ｃｅ
１ｌ Ｂｉｏｌ （ｂ９Ｂ２）２ ： １２２９−１
２３７ ）により処理した後に選択的条件下で増殖せし
めることにより、単離することができる。最高濃度のＢ
ＵｄＲにおいて増殖することができる細胞クローンを単
離する。細胞溶解物をＴＫ活性についてアッセイする（
Ｌｅｅ及びＣｈｅｎｇ ％Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｍ、（ｂ９７６）２５１ ：２６００−２６０４）こと
によりＴＫ酵素活性の欠損が確認される。ＫＴ−マイナ
スネコセルラインが得られれば、前記のごときトランス
フェクション実験を行って、ＫＴ−マイナス表現型を補
完することができる分子クローン化配列をＨＡＴ選択選
択培地量定する。
ＴＫ−マイナスのネコセルラインを必要としない他の方
法は、ＰｒＶ ＴＫ遺伝子を単離するためにＫａｐｌａ
ｎ及びＨｅｎ−Ｐｏｒａｔ 、 ｎｕ旦■（ｂ９６１）
１３ニア８−９２により開発された方法に従う、チミジ
ン類似体５−フルオロウラシル（ＦＵ）により処理され
次にチミジンにより処理された細胞は、新生（ｄｅ ｎ
ｏｖｏ）（ＴＫ）経路又は再生（ｓａｌｖａｇｅ） （
Ｔ Ｋ ）経路によリチミジンを利用することが不可逆
的に不可能となる。これらの細胞は分裂することはでき
ないが、機能的ＴＫ遺伝子を含有するヘルペスウィルス
の複製を支持することができる。
法は、ＰｒＶ ＴＫ遺伝子を単離するためにＫａｐｌａ
ｎ及びＨｅｎ−Ｐｏｒａｔ 、 ｎｕ旦■（ｂ９６１）
１３ニア８−９２により開発された方法に従う、チミジ
ン類似体５−フルオロウラシル（ＦＵ）により処理され
次にチミジンにより処理された細胞は、新生（ｄｅ ｎ
ｏｖｏ）（ＴＫ）経路又は再生（ｓａｌｖａｇｅ） （
Ｔ Ｋ ）経路によリチミジンを利用することが不可逆
的に不可能となる。これらの細胞は分裂することはでき
ないが、機能的ＴＫ遺伝子を含有するヘルペスウィルス
の複製を支持することができる。
約２０個の別個の分子クローン化ＦＨＶ断片をａｒｏＴ
−耐性（ＴＫ−マイナス’）ＦＨＶウィルスからのＦＨ
Ｖ ＤＮＡと共にネコ細胞に同時トランスフェクトし、
そして子孫ウィルスを単離する０分子クローン化断片が
ＴＫ遺伝子を含有しておれば、幾つかの子孫ウィルスは
トランスフェクトされた野性型ＴＫ遺伝子断片との組換
のために機能的ＴＫ遺伝子を含有するであろう。次に子
孫ウィルスを用いて、ＦＶ及びチミジンで処理されてい
るネコ細胞に感染せしめる。ＴＫ−プラスウィルスを含
有するウィルス集団のみがこれらの細胞で増殖すること
ができる。この感染からのウィルス収量が決定されよう
。この感染において有意な子孫ウィルスが生産されれば
、分子クローン化断片は野性型ＦＨＶ ＴＫ遺伝子を含
有しているはずである。
−耐性（ＴＫ−マイナス’）ＦＨＶウィルスからのＦＨ
Ｖ ＤＮＡと共にネコ細胞に同時トランスフェクトし、
そして子孫ウィルスを単離する０分子クローン化断片が
ＴＫ遺伝子を含有しておれば、幾つかの子孫ウィルスは
トランスフェクトされた野性型ＴＫ遺伝子断片との組換
のために機能的ＴＫ遺伝子を含有するであろう。次に子
孫ウィルスを用いて、ＦＶ及びチミジンで処理されてい
るネコ細胞に感染せしめる。ＴＫ−プラスウィルスを含
有するウィルス集団のみがこれらの細胞で増殖すること
ができる。この感染からのウィルス収量が決定されよう
。この感染において有意な子孫ウィルスが生産されれば
、分子クローン化断片は野性型ＦＨＶ ＴＫ遺伝子を含
有しているはずである。
この分子クローン化配列のＤＮＡ配列分子を用いて、他
のヘルペスウィルスの既知の類似のＴＫ蛋白質との比較
により、Ｆｌ（Ｖ ＴＫ遺伝子の正確な位置における存
在を明らかにする。遺伝子内の便利な制限部位を用いて
、ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子を含有する発現カセット
のその後の分子クローニングを行う。
のヘルペスウィルスの既知の類似のＴＫ蛋白質との比較
により、Ｆｌ（Ｖ ＴＫ遺伝子の正確な位置における存
在を明らかにする。遺伝子内の便利な制限部位を用いて
、ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子を含有する発現カセット
のその後の分子クローニングを行う。
Ｂ、ＦｅＬＶエンベロープ゛ −カセ・ト完全ＦｅＬＶ
エンベロープ遺伝子（例１に記、載されているような）
、又はＦｅＬＶｇｐ７０遺伝子及び代替可能なトランス
メンプラン領域（ＰｅＬＶｐ１５Ｅ以外）を含有するカ
セットが、エンベロープ遺伝子を含有するヱｓｔ Ｉ
−ＥｃｏＲＩ制限断片又は他の造成のための適当な制限
断片の５′末端からすぐ上流への強力なプロモーター配
列の並置により発現される。プロモーターは、ＨＳＶ
ＴＫプロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲＴＲ上−ター、ＦＨ
Ｖ ＴＫプロモーター、ＨＳＶα−４遺伝子プロモータ
ー、又はヘルペスウィルスに感染された細胞中で活性な
他の種々の強力なプロモーターのいずれかであることが
できる。
エンベロープ遺伝子（例１に記、載されているような）
、又はＦｅＬＶｇｐ７０遺伝子及び代替可能なトランス
メンプラン領域（ＰｅＬＶｐ１５Ｅ以外）を含有するカ
セットが、エンベロープ遺伝子を含有するヱｓｔ Ｉ
−ＥｃｏＲＩ制限断片又は他の造成のための適当な制限
断片の５′末端からすぐ上流への強力なプロモーター配
列の並置により発現される。プロモーターは、ＨＳＶ
ＴＫプロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲＴＲ上−ター、ＦＨ
Ｖ ＴＫプロモーター、ＨＳＶα−４遺伝子プロモータ
ー、又はヘルペスウィルスに感染された細胞中で活性な
他の種々の強力なプロモーターのいずれかであることが
できる。
組換ＦＨＶ中のＦｅＬＶｅｎｖ遺伝子の発現を駆動する
ために有用な追加の強力なプロモーターは、ＦＨＶ感染
細胞を試験して感染中に豊富に発現されるＦＨＶ遺伝子
を決定することにより同定することができる。ＦＨＶ構
造遺伝子、例えばキャプシド蛋白質又は主要エンベロー
プ糖蛋白質をコードする遺伝子、の幾つかの発現を駆動
する強力なプロモーターがこのような試験により見出さ
れよう。
ために有用な追加の強力なプロモーターは、ＦＨＶ感染
細胞を試験して感染中に豊富に発現されるＦＨＶ遺伝子
を決定することにより同定することができる。ＦＨＶ構
造遺伝子、例えばキャプシド蛋白質又は主要エンベロー
プ糖蛋白質をコードする遺伝子、の幾つかの発現を駆動
する強力なプロモーターがこのような試験により見出さ
れよう。
次に、このような強力なプロモーターを単離することが
でき、そしてＦｅＬＶエンベロープ遺伝子の発現を駆動
するために使用され得る。インビトロでのプラスミドの
造成は日常的であり、そしてＭａｎｉａｔｉｓ等、前掲
、により記載された方法を用いて実施することができる
。
でき、そしてＦｅＬＶエンベロープ遺伝子の発現を駆動
するために使用され得る。インビトロでのプラスミドの
造成は日常的であり、そしてＭａｎｉａｔｉｓ等、前掲
、により記載された方法を用いて実施することができる
。
これらのカセットを、ウィルスＴＫ遺伝子を中断するよ
うに便利な制限部位においてＦＦＩＶ ＴＫ遺伝子に挿
入する。このプラスミドを使用してこの発現カセットを
ＴＫ遺伝子においてＦＨＶゲノム中に挿入する。
うに便利な制限部位においてＦＦＩＶ ＴＫ遺伝子に挿
入する。このプラスミドを使用してこの発現カセットを
ＴＫ遺伝子においてＦＨＶゲノム中に挿入する。
ＦＨＶ ＴＫ遺伝子内、にＦｅＬＶエンベロープ遺伝子
発現カセット（ｐ１５Ｅ領域を含むか又は他のトランス
メンプラン領域を含む）を含有する組換挿入ベクターを
使用して、ＦＨＶゲノムＤＮＡと共に例１におけるよう
にしてネコ細胞に同時トランスフェクトする。トランス
フェクトされた細胞内でのプラスミド配列及びゲノムＴ
Ｋ遺伝子配列間の相同性組換現象が、ゲノムＴＫ遺伝子
内にＦｅＬＶエンベロープ遺伝子カセットを含有する組
換ウィルスを生じさせる。このトランスフェクションか
らの子孫ウィルスを収得し、そしてＢＵｄＲ選択の存在
下でＴＫ−マイナスネコ細胞中で増殖せしめるか、又は
ＴＫ−特異的薬剤ａｒａ Ｔの存在下で野性型ＴＫ−プ
ラスのネコ細胞中で増殖せしめる。これらの薬剤のいず
れかの存在下でＴＫ−マイナス子孫ウィルスのみが効率
的に複製することができる。２ラウンドの選択の後、ウ
ィルスをクローン化し、そして例１に記載したようにし
てＦｅＬＶエンベロープ遺伝子の存在及び発現について
アッセイする。
発現カセット（ｐ１５Ｅ領域を含むか又は他のトランス
メンプラン領域を含む）を含有する組換挿入ベクターを
使用して、ＦＨＶゲノムＤＮＡと共に例１におけるよう
にしてネコ細胞に同時トランスフェクトする。トランス
フェクトされた細胞内でのプラスミド配列及びゲノムＴ
Ｋ遺伝子配列間の相同性組換現象が、ゲノムＴＫ遺伝子
内にＦｅＬＶエンベロープ遺伝子カセットを含有する組
換ウィルスを生じさせる。このトランスフェクションか
らの子孫ウィルスを収得し、そしてＢＵｄＲ選択の存在
下でＴＫ−マイナスネコ細胞中で増殖せしめるか、又は
ＴＫ−特異的薬剤ａｒａ Ｔの存在下で野性型ＴＫ−プ
ラスのネコ細胞中で増殖せしめる。これらの薬剤のいず
れかの存在下でＴＫ−マイナス子孫ウィルスのみが効率
的に複製することができる。２ラウンドの選択の後、ウ
ィルスをクローン化し、そして例１に記載したようにし
てＦｅＬＶエンベロープ遺伝子の存在及び発現について
アッセイする。
以上、具体的な例示によりこの発明を説明したが、この
発明の範囲内において、多くの変法を行うことができよ
う。
発明の範囲内において、多くの変法を行うことができよ
う。
第１図は、ワクチニアウィルスＴＫ遺伝子に挟まれたＦ
ｅＬＶエンベロープ遺伝子とワクチニアプロモーターと
を含有する挿入ベクターｐＶＧＡの誘導の流れ図である
。 第２図は、ＧＡ−ＦｅＬＶ Ｂプロウィルスゲノムのダ
イヤグラム、及び例１において使用したエンベロープ遺
伝子断片の拡大図である。非−拡大図上に示された制限
酵素開裂部位は例１において使用した関連部位のみであ
る。拡大図には後記の例４に従って調製されるこの発明
の発現プラスミドの製造のために使用することができる
制限部位が示されている。 第３図はＰｅＬＶエンベロープ遺伝子を含有するプラス
ミドｐＧＡｐｖの誘導の流れ図である。 第４図は組換ワクチニアウィルスｖＦｅＬＶｅｎｖの形
成の流れ図である。 第５図は、組換ワクチニアウィルスｖＦｅＬＶｅｎｖに
よりコードされたＦｅＬＶエンベロープ遺伝子産物及び
真正なＧＡ−ＦｅＬＶ Ｂによりコードされたそれの免
疫的分析（ウェスタン プロット）の結果を示す。 レーンは、（ｂ） ｖＦｅＬＶｅｎｖにより惑染された
ヒーラ細胞からの細胞膜蛋白質（ｂ５０μｇ）、（２）
ＷＲワクチェアウイルスにより惑染されたヒーラ細胞か
らの細胞膜蛋白質（２５０μｇ）、（３）真正な分子ク
ローン化ＧＡ−ＦｅＬＶ−βウィルスを発現するイヌＧ
Ｆ／２細胞からの細胞膜蛋白質（２５０μｇ）、及び（
４）ＣＦ／２細胞の培養上清からの部分精製されたＧＡ
−ＦｅＬＶウィルス、を示す。 第６図は、ｖＰｅＬＶｅｎｖにより感染された細胞の免
疫蛍光分析の結果を示す（パネルＡ及びＢ）。ヒーラ細
胞単層に組換ワクチニアウィルスｖＦｅＬＶｅｎｖを低
倍率感染で感染せしめ、そして感染後２４時間に間接免
疫蛍光により試験した。ＦｅＬＶｅｎｖ蛋白質をＦｅＬ
Ｖｇｐ ７０特異的モノクロ一ナル抗体を用いて検出し
た。パネルＡは、冷アセトン中で固定されそして透過性
にした細胞中の全体細胞免疫蛍光を示す。パネルＢは生
細胞免疫蛍光を示し、この場合には感染された細胞の表
面に発現されたＦｅＬＶｅｎｖ蛋白質のみが検出される
。顕微鏡写真のための露出時間はそれぞれ０．５分間及
び２分間であった。 第７図は、組換ワクチニアウィルスｖＦｅＬＶｅｎｖに
より感染された細胞を用いる免疫沈澱の結果、及び真正
なＧＡ−ＦｅＬＶにより永続的に感染された細胞から得
られたそれとの比較を示す。（表面免疫沈澱はｌＸｌ０
’細胞からであり、他方全細胞溶解物免疫沈澱は２．５
Ｘ１０’からであった。）レーンは、（ｂ）非感染ヒー
ラ細胞、（２）ＷＲウィルスにより感染されたヒーラ細
胞、（３） ｖＦｅＬＶｅｎｖウィルスにより感染され
たヒーラ細胞、及び（４） ＧＡ−ＦｅＬＶにより感染
されたヒトＲＤ細胞である。 第８図は、ヒト細胞、ネズミ細胞及びネコ細胞中でのｖ
ＦｅＬＶｅｎｖ−によりコードされたｅｎｖ蛋白質の発
現を示すイムノプロット分析を示す。ヒト−ヒーラ細胞
、ネズミＬ９２９細胞、及びネコＣＲＦＫ細胞の匹敵す
る細胞単層に組換ｖＦｅＬＶｅｎｖウィルス、又はＷＲ
ワクチニアウィルスを感染せしめた。脱調製物（ｂ００
／ｊｇ蛋白りを分析してＰｅＬＶｅｎｖ蛋白質を測定し
た。 第９図はプラスミドｐｔＧＡΔＨｇ１ＡＩの作製方法の
フローチャートである。 第１０図は、ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子のｐ１５Ｂア
ンカー領域に代るものとして水庖性口内炎ウィルス（Ｖ
Ｓ Ｖ）プロティンＧトランスメンプラン領域を用い
る好ましい挿入ベクターｐＶＧＡ−ＶＳＶＧを示Ｌ
以下余白ＦｅＬＶｅ
ｎｖ遺伝子を含有する 組換ワクチニアウィルスの生成 １４３（ｔｋ−）細胞の ＢｕｄＲ選択 凋 − 図面の浄書（内容に変更なし） 第６８図 ＶＦ＠ＬＶ ａｎ＠！ ： 衣面兵芒し
μｊｃｒ）ｉ」１山（ｂ７Ｊ’、、−二支史なし）図面
のびδ（内容に変更なし） 、８゜ ′ ネズミ ネコ ３二９，７ ′二讐 °”′ ハブ胞 ｐ！ＧＡ−ΔＨｇｉ Ａｌ （４，２ｋｂ）ＦＩＧ、
９
ｅＬＶエンベロープ遺伝子とワクチニアプロモーターと
を含有する挿入ベクターｐＶＧＡの誘導の流れ図である
。 第２図は、ＧＡ−ＦｅＬＶ Ｂプロウィルスゲノムのダ
イヤグラム、及び例１において使用したエンベロープ遺
伝子断片の拡大図である。非−拡大図上に示された制限
酵素開裂部位は例１において使用した関連部位のみであ
る。拡大図には後記の例４に従って調製されるこの発明
の発現プラスミドの製造のために使用することができる
制限部位が示されている。 第３図はＰｅＬＶエンベロープ遺伝子を含有するプラス
ミドｐＧＡｐｖの誘導の流れ図である。 第４図は組換ワクチニアウィルスｖＦｅＬＶｅｎｖの形
成の流れ図である。 第５図は、組換ワクチニアウィルスｖＦｅＬＶｅｎｖに
よりコードされたＦｅＬＶエンベロープ遺伝子産物及び
真正なＧＡ−ＦｅＬＶ Ｂによりコードされたそれの免
疫的分析（ウェスタン プロット）の結果を示す。 レーンは、（ｂ） ｖＦｅＬＶｅｎｖにより惑染された
ヒーラ細胞からの細胞膜蛋白質（ｂ５０μｇ）、（２）
ＷＲワクチェアウイルスにより惑染されたヒーラ細胞か
らの細胞膜蛋白質（２５０μｇ）、（３）真正な分子ク
ローン化ＧＡ−ＦｅＬＶ−βウィルスを発現するイヌＧ
Ｆ／２細胞からの細胞膜蛋白質（２５０μｇ）、及び（
４）ＣＦ／２細胞の培養上清からの部分精製されたＧＡ
−ＦｅＬＶウィルス、を示す。 第６図は、ｖＰｅＬＶｅｎｖにより感染された細胞の免
疫蛍光分析の結果を示す（パネルＡ及びＢ）。ヒーラ細
胞単層に組換ワクチニアウィルスｖＦｅＬＶｅｎｖを低
倍率感染で感染せしめ、そして感染後２４時間に間接免
疫蛍光により試験した。ＦｅＬＶｅｎｖ蛋白質をＦｅＬ
Ｖｇｐ ７０特異的モノクロ一ナル抗体を用いて検出し
た。パネルＡは、冷アセトン中で固定されそして透過性
にした細胞中の全体細胞免疫蛍光を示す。パネルＢは生
細胞免疫蛍光を示し、この場合には感染された細胞の表
面に発現されたＦｅＬＶｅｎｖ蛋白質のみが検出される
。顕微鏡写真のための露出時間はそれぞれ０．５分間及
び２分間であった。 第７図は、組換ワクチニアウィルスｖＦｅＬＶｅｎｖに
より感染された細胞を用いる免疫沈澱の結果、及び真正
なＧＡ−ＦｅＬＶにより永続的に感染された細胞から得
られたそれとの比較を示す。（表面免疫沈澱はｌＸｌ０
’細胞からであり、他方全細胞溶解物免疫沈澱は２．５
Ｘ１０’からであった。）レーンは、（ｂ）非感染ヒー
ラ細胞、（２）ＷＲウィルスにより感染されたヒーラ細
胞、（３） ｖＦｅＬＶｅｎｖウィルスにより感染され
たヒーラ細胞、及び（４） ＧＡ−ＦｅＬＶにより感染
されたヒトＲＤ細胞である。 第８図は、ヒト細胞、ネズミ細胞及びネコ細胞中でのｖ
ＦｅＬＶｅｎｖ−によりコードされたｅｎｖ蛋白質の発
現を示すイムノプロット分析を示す。ヒト−ヒーラ細胞
、ネズミＬ９２９細胞、及びネコＣＲＦＫ細胞の匹敵す
る細胞単層に組換ｖＦｅＬＶｅｎｖウィルス、又はＷＲ
ワクチニアウィルスを感染せしめた。脱調製物（ｂ００
／ｊｇ蛋白りを分析してＰｅＬＶｅｎｖ蛋白質を測定し
た。 第９図はプラスミドｐｔＧＡΔＨｇ１ＡＩの作製方法の
フローチャートである。 第１０図は、ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子のｐ１５Ｂア
ンカー領域に代るものとして水庖性口内炎ウィルス（Ｖ
Ｓ Ｖ）プロティンＧトランスメンプラン領域を用い
る好ましい挿入ベクターｐＶＧＡ−ＶＳＶＧを示Ｌ
以下余白ＦｅＬＶｅ
ｎｖ遺伝子を含有する 組換ワクチニアウィルスの生成 １４３（ｔｋ−）細胞の ＢｕｄＲ選択 凋 − 図面の浄書（内容に変更なし） 第６８図 ＶＦ＠ＬＶ ａｎ＠！ ： 衣面兵芒し
μｊｃｒ）ｉ」１山（ｂ７Ｊ’、、−二支史なし）図面
のびδ（内容に変更なし） 、８゜ ′ ネズミ ネコ ３二９，７ ′二讐 °”′ ハブ胞 ｐ！ＧＡ−ΔＨｇｉ Ａｌ （４，２ｋｂ）ＦＩＧ、
９
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、免疫原性ネコ白血病ウイルスエンベロープ蛋白質の
発現をコードする組換形ウイルスを製造するために哺乳
動物細胞のトランスフェクションにおいて使用する挿入
ベクターであって、 （ａ）レプリケーター； （ｂ）前記ウイルスのゲノムの非必須領域の少なくとも
部分；及び （ｃ）前記ウイルスに感染された細胞内で活性なプロモ
ーター、翻訳開始コドン、及び前記蛋白質をコードしそ
して該プロモーターの制御のもとにあるＤＮＡ配列を含
んで成る、前記非必須領域内に挿入されたキメラ遺伝子
； を含んで成るベクター。 ２、前記非必須領域が前記組換形の選択を可能にするマ
ーカー機能を含む特許請求の範囲第１項に記載の挿入ベ
クター。 ３、前記非必須領域が前記ウイルスのチミジンキナーゼ
遺伝子を含んで成る特許請求の範囲第１項に記載の挿入
ベクター。 ４、前記ウイルスがネコに感染することができるウイル
スである特許請求の範囲第１項に記載の挿入ベクター。 ５、前記ウイルスがネコに馴化されたウイルスである特
許請求の範囲第４項に記載の挿入ベクタ６、前記ウイル
スがワクチニアウイルスである特許請求の範囲第４項に
記載の挿入ベクター。 ７、（ｉ）前記ウイルスがワクチニアウイルスであり、
そして前記プロモーターがワクチニアウイルスプロモー
ターであり；あるいは （ｉｉ）前記ウイルスがネコ・ヘルペスウイルスであり
、そして前記プロモーターがヘルペスシンプレックスＩ
チミジンキナーゼプロモーター、ネコ・ヘルペスウイル
スチミジンキナーゼプロモーター、ヘルペスシンプレッ
クスα−４プロモーター又はネコ・ヘルペスウイルスキ
ャプシドもしくは主要エンベロープ糖蛋白質プロモータ
ーである特許請求の範囲第１項に記載の挿入ベクター。 ８、ネコ白血病ウイルスワクチンとして有用な感染性組
換ウイルスであって、該ウイルスは該ウイルスに感染さ
れるべき細胞内で活性なプロモーター、翻訳開始コドン
、及び免疫原性ネコ白血病ウイルスエンベロープ蛋白質
をコードしそして前記プロモーターの制御のもとにある
ＤＮＡ配列を含んで成るキメラ遺伝子を有し、そして該
キメラ遺伝子は前記ウイルスのゲノムの非必須領域中に
挿入されていることを特徴とするウイルス。 ９、前記組換ウイルスがネコに馴化されている特許請求
の範囲第８項に記載のウイルス。 １０、前記ウイルスがワクチニアウイルスである特許請
求の範囲第９項に記載のウイルス。 １１、宿主中でのワクチン感染及び複製に際して免疫反
応を生じさせるのに十分な量の感染性組換ウイルス並び
に非経腸ビヒクルを含んで成るネコ白血病ウイルスワク
チンであって、該感染性組換ウイルスが、該ウイルスに
感染されるべき細胞内で活性なプロモーター、翻訳開始
コドン、及び免疫原性ネコ白血病ウイルスエンベロープ
蛋白質をコードしそして前記プロモーターの制御のもと
にあるＤＮＡ配列を含んで成るキメラ遺伝子を有し、そ
して該キメラ遺伝子は前記ウイルスのゲノムの非必須領
域中に挿入されていることを特徴とする、ワクチン。 １２、感染性組換ウイルスにより感染された細胞又は細
胞画分の不活性化調製物の免疫原的有効量及び非経腸ビ
ヒクルを含んで成るネコ白血病ウイルスワクチンであっ
て、該感染性組換ウイルスが、該ウイルスに感染される
べき細胞内で活性なプロモーター、翻訳開始コドン、及
び免疫原性ネコ白血病ウイルスエンベロープ蛋白質をコ
ードしそして前記プロモーターの制御のもとにあるＤＮ
Ａ配列を含んで成るキメラ遺伝子を有し、そして該キメ
ラ遺伝子は前記ウイルスのゲノムの非必須領域中に挿入
されていることを特徴とする、ワクチン。 １３、前記感染性組換ウイルスがネコに馴化されている
特許請求の範囲第１２項に記載のワクチン。 １４、ネコにおけるネコ白血病ウイルス感染の予防方法
であって、免疫原的有効量のワクチンをネコに予防免疫
注射することを含んで成り、該ワクチンが感染性組換ウ
イルス及び非経腸ビヒクルを含んで成り、該感染性組換
ウイルスが、該ウイルスに感染されるべき細胞内で活性
なプロモーター、翻訳開始コドン、及び免疫原性ネコ白
血病ウイルスエンベロープ蛋白質をコードしそして前記
プロモーターの制御のもとにあるＤＮＡ配列を含んで成
るキメラ遺伝子を有し、そして該キメラ遺伝子は前記ウ
イルスのゲノムの非必須領域中に挿入されていることを
特徴とする、方法。 １５、ネコにおけるネコ白血病ウイルス感染の予防方法
であって、免疫原的有効量のワクチンをネコに予防免疫
注射することを含んで成り、該ウイルスが感染性組換ウ
イルスにより感染された細胞又は細胞画分の不活性化調
製物及び非経腸ビヒクルを含んで成り、該感染性組換ウ
イルスが、該ウイルスに感染されるべき細胞内で活性な
プロモーター、翻訳開始コドン、及び免疫原性ネコ白血
病ウイルスエンベロープ蛋白質をコードしそして前記プ
ロモーターの制御のもとにあるＤＮＡ配列を含んで成る
キメラ遺伝子を有し、そして該キメラ遺伝子は前記ウイ
ルスのゲノムの非必須領域中に挿入されていることを特
徴とする、方法。 １６、コードされている前記免疫原性ネコ白血病ウイル
スエンベロープ蛋白質がＦｅＬＶｇｐ８５を含んで成る
特許請求の範囲第１項に記載の挿入ベクター。 １７、コードされている前記免疫原性ネコ白血病ウイル
スエンベロープ蛋白質がＦｅＬＶｇｐ７０、及び該Ｆｅ
ＬＶｇｐ１５Ｅと異る由来のトランスメンブラン領域蛋
白質を含んで成る特許請求の範囲第１項に記載の挿入ベ
クター。 １８、前記トランスメンブラン領域蛋白質が水疱性口内
炎ウイルスＧ蛋白質である特許請求の範囲第１７項に記
載の挿入ベクター。 １９、前記免疫原性ネコ白血病ウイルスエンベロープ蛋
白質がＦｅＬＶサブグループＡに由来する特許請求の範
囲第１項の挿入ベクター。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US77404085A | 1985-09-09 | 1985-09-09 | |
| US774040 | 1985-09-09 | ||
| US88761486A | 1986-07-18 | 1986-07-18 | |
| US887614 | 1986-07-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62151186A true JPS62151186A (ja) | 1987-07-06 |
Family
ID=27118834
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0216564A3 (ja) |
| JP (1) | JPS62151186A (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06510910A (ja) * | 1991-11-08 | 1994-12-08 | ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー | ネコ白血病ウイルスワクチン |
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-
1986
- 1986-09-08 AU AU62416/86A patent/AU607399B2/en not_active Expired
- 1986-09-09 JP JP61210817A patent/JPS62151186A/ja active Pending
- 1986-09-09 EP EP86306950A patent/EP0216564A3/en not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JOURNAL OF VIROLOGY=1983 * |
| MED.MICROBIOL.IMMUNOL=1893 * |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0216564A2 (en) | 1987-04-01 |
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