JPS62130681A - 新規ハイブリド−マ - Google Patents
新規ハイブリド−マInfo
- Publication number
- JPS62130681A JPS62130681A JP60271927A JP27192785A JPS62130681A JP S62130681 A JPS62130681 A JP S62130681A JP 60271927 A JP60271927 A JP 60271927A JP 27192785 A JP27192785 A JP 27192785A JP S62130681 A JPS62130681 A JP S62130681A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- human
- hybridoma
- mouse
- antibody
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 title claims abstract description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 34
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 12
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 9
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 6
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 claims description 3
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 6
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 abstract description 3
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 abstract description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 abstract description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 abstract 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 5
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 3
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- LPMXVESGRSUGHW-UHFFFAOYSA-N Acolongiflorosid K Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1CC2(O)CCC3C4(O)CCC(C=5COC(=O)C=5)C4(C)CC(O)C3C2(CO)C(O)C1 LPMXVESGRSUGHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010012919 B-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000019260 B-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- LPMXVESGRSUGHW-GHYGWZAOSA-N Ouabain Natural products O([C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O1)[C@H]1C[C@@H](O)[C@@]2(CO)[C@@](O)(C1)CC[C@H]1[C@]3(O)[C@@](C)([C@H](C4=CC(=O)OC4)CC3)C[C@@H](O)[C@H]21 LPMXVESGRSUGHW-GHYGWZAOSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 244000166550 Strophanthus gratus Species 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- LPMXVESGRSUGHW-HBYQJFLCSA-N ouabain Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C[C@@]2(O)CC[C@H]3[C@@]4(O)CC[C@H](C=5COC(=O)C=5)[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@@H]3[C@@]2(CO)[C@H](O)C1 LPMXVESGRSUGHW-HBYQJFLCSA-N 0.000 description 1
- 229960003343 ouabain Drugs 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000003760 tallow Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（発明の利用分野）
本発明は、新規ハイブリドーマに関するものである。
（発明の背景）
既知の如く、ケーラーとミルスタインによって開発され
、近年盛んになっているハイブリドーマを用いたモノク
ローナル抗体の製造法は、マウス骨髄腫細胞とマウス特
異抗体産生リンパ球とを融合させたのちにクローニング
を行なって、単一抗体産生細胞を得る方法としてよく知
られている。
、近年盛んになっているハイブリドーマを用いたモノク
ローナル抗体の製造法は、マウス骨髄腫細胞とマウス特
異抗体産生リンパ球とを融合させたのちにクローニング
を行なって、単一抗体産生細胞を得る方法としてよく知
られている。
このクローンが産生ずる抗体は単一の抗原決定基に対し
て単一特異性を示すいわゆる千ノクローナル抗体（以下
Ｍｏ Ａｂと略す）であることや、それが再現性よく得
られることなどから、研究用として診断薬や生理活性物
質の精製等に広く用いられている。
て単一特異性を示すいわゆる千ノクローナル抗体（以下
Ｍｏ Ａｂと略す）であることや、それが再現性よく得
られることなどから、研究用として診断薬や生理活性物
質の精製等に広く用いられている。
また一部では疾病の予防や治療のためにヒトに投与しよ
うという試みもなされているが、ヒトにとってはマウス
系Ｍｏ Ａｂは異物であるため、その有効性および副作
用の点で適当なものとは考えられていない。
うという試みもなされているが、ヒトにとってはマウス
系Ｍｏ Ａｂは異物であるため、その有効性および副作
用の点で適当なものとは考えられていない。
そこで、ヒトの抗体産生細胞を用いてヒト抗体を産生さ
せる試みが種々なされてきており、例えば次ぎのような
方法が提案されている。
せる試みが種々なされてきており、例えば次ぎのような
方法が提案されている。
ヒト系ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマを得る方法としては
、（１）ヒト−ヒトバイブリドーマを用いる方法（例え
ば、特開昭５８−２１８１２５号、特開昭５９−１７５
８９６号、特開昭［１０−５８０９３号、特開昭６０−
７８９９８号等）（２）エプスタイン バー ウィルス
（Ｅ ｐｓｔｅｉｎ Ｂ ａｒｒ Ｖ １ｒｕｓ）て
トランスフオームさせた細胞を用いる方法、例えば特開
昭５５−３１２号、特開昭８０−５４６８７号、特開昭
６０−１３６５９９号等）、あるいは（３）ヒト−マウ
ス へテロハイブリドーマを用いる方ン去（プロシーデ
ィングオブ ナショナル アカデミ−オブ サイエンス
８０．７３０８〜７３１２． １９８３ ）等が報告
されている。
、（１）ヒト−ヒトバイブリドーマを用いる方法（例え
ば、特開昭５８−２１８１２５号、特開昭５９−１７５
８９６号、特開昭［１０−５８０９３号、特開昭６０−
７８９９８号等）（２）エプスタイン バー ウィルス
（Ｅ ｐｓｔｅｉｎ Ｂ ａｒｒ Ｖ １ｒｕｓ）て
トランスフオームさせた細胞を用いる方法、例えば特開
昭５５−３１２号、特開昭８０−５４６８７号、特開昭
６０−１３６５９９号等）、あるいは（３）ヒト−マウ
ス へテロハイブリドーマを用いる方ン去（プロシーデ
ィングオブ ナショナル アカデミ−オブ サイエンス
８０．７３０８〜７３１２． １９８３ ）等が報告
されている。
しかし、これらの方法には以下のような欠点のあること
が知られている。
が知られている。
すなわち、前記（１）の場合には融合効率が低い。（２
）の場合にはクローニングが困難である。（３）の場合
にはヒト染色体の脱落が起り易く安定なヒト系抗体の産
生が得にくいなどの問題である。
）の場合にはクローニングが困難である。（３）の場合
にはヒト染色体の脱落が起り易く安定なヒト系抗体の産
生が得にくいなどの問題である。
（発明の目的）
本発明は、以上のような現状に鑑みてなされたものであ
り、その目的は、融合効率およびクローニング効率が高
く、かつ融合後は安定的にヒト免疫ガンマグロブリン（
以下Ｉｇという）を産生ずることができるハイブリドー
マを提供するところにある。
り、その目的は、融合効率およびクローニング効率が高
く、かつ融合後は安定的にヒト免疫ガンマグロブリン（
以下Ｉｇという）を産生ずることができるハイブリドー
マを提供するところにある。
また本発明の他の目的は、かかるハイブリドーマを用い
て、これにさらに特異抗体産生ヒトリンパ球を融合させ
たヒト−マウス−ヒト へテロハイブリドーマを提供す
るところにある。
て、これにさらに特異抗体産生ヒトリンパ球を融合させ
たヒト−マウス−ヒト へテロハイブリドーマを提供す
るところにある。
（発明の概要）
而してかかる目的の実現のために提供された本発明の特
徴は、ヒトリンパ球とマウス骨髄腫細胞Ｐ３ｕｌとを細
胞融合させたのち８アザグアニン（８ＡＧ）耐性化して
、ヒトリンパ球との融合効率が高いハイブリドーマ（以
下親株という）を得たところににある。
徴は、ヒトリンパ球とマウス骨髄腫細胞Ｐ３ｕｌとを細
胞融合させたのち８アザグアニン（８ＡＧ）耐性化して
、ヒトリンパ球との融合効率が高いハイブリドーマ（以
下親株という）を得たところににある。
また本発明のもう一つの特徴は、ヒトリンパ球とマウス
骨髄腫細胞Ｐ３ｕ１とを細胞融合させたのち８アザグア
ニン（８ＡＧ）耐性化したハイブリドーマと、これにさ
らに特異抗体産生ヒトリンパ球を融合させたバイブリド
ーマを得たところにある。
骨髄腫細胞Ｐ３ｕ１とを細胞融合させたのち８アザグア
ニン（８ＡＧ）耐性化したハイブリドーマと、これにさ
らに特異抗体産生ヒトリンパ球を融合させたバイブリド
ーマを得たところにある。
前記したハイブリドーマ親株は、マウス骨髄腫細胞Ｐ３
ｕｌと正常ヒト末梢血リンパ球（以下ＰＢＬという）と
を、ポリエチレングリコール４０００ （ＰＥＧ４００
０）を用いて融合させ、ハイポキサンチン−アミノプテ
リン−チミジン（ＨＡＴ）を加えた培地により選択培養
することでＨＡＴ耐性なヒト−マウス ハイブリドーマ
を得、次いで、８アザグアニン（８ＡＧ）耐性化を行な
い得られたハイブリドーマを限界希釈法によってクロー
ン化して、ヒト−マウス ハイブリドーマクローンとし
て得ることができる。
ｕｌと正常ヒト末梢血リンパ球（以下ＰＢＬという）と
を、ポリエチレングリコール４０００ （ＰＥＧ４００
０）を用いて融合させ、ハイポキサンチン−アミノプテ
リン−チミジン（ＨＡＴ）を加えた培地により選択培養
することでＨＡＴ耐性なヒト−マウス ハイブリドーマ
を得、次いで、８アザグアニン（８ＡＧ）耐性化を行な
い得られたハイブリドーマを限界希釈法によってクロー
ン化して、ヒト−マウス ハイブリドーマクローンとし
て得ることができる。
このバイブリドーマクローンは、ヒト−マウス−ヒト
へテロハイブリドーマの親株として用いる時、融合効率
およびクローニング効率が高（、しかも親株自身はＩｇ
を産生ぜず、融合した後は安定的にＩｇを産生すること
ができるという特徴がある。
へテロハイブリドーマの親株として用いる時、融合効率
およびクローニング効率が高（、しかも親株自身はＩｇ
を産生ぜず、融合した後は安定的にＩｇを産生すること
ができるという特徴がある。
またヒト−マウス−ヒト へテロハイブリドーマは、上
記により得たハイブリドーマ親株と、所定の特異抗体産
生ヒトリンパ球（ＰＢＬ）とを、常法にしたがって融合
、クローン化して得ることができる。
記により得たハイブリドーマ親株と、所定の特異抗体産
生ヒトリンパ球（ＰＢＬ）とを、常法にしたがって融合
、クローン化して得ることができる。
特にこのヒト−マウス−ヒト へテロハイブリドーマに
よれば、Ｂ型肝炎ウィルスに対する抗体を好適に得るこ
とができるという特徴がある。
よれば、Ｂ型肝炎ウィルスに対する抗体を好適に得るこ
とができるという特徴がある。
Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）には３種類の抗原系が知ら
れている。すなわち、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓ）、ＨＢ
Ｖ核抗原（ＨＢｃ）、同ｅ抗原（ＨＢｅ）である。この
うちＨＢｓ抗原に対する抗体（抗ＨＢｓ抗体）は、ＨＢ
ｓ抗原陽性血液の輸血あるいは人工透析等によって起こ
る水平感染や、ＨＢｓ抗原陽性の母と児のあいだの垂直
感染等の予防その他に臨床適用（受動免疫）されており
、最近ではＨＢｓワクチンを投与する積極的予防法（能
動免疫）も実用化されているが、緊急な予防効果を期待
する場合、あるいは免疫不全者への適用には、前記抗Ｈ
Ｂｓ抗体の使用が望まれるため、本発明によって得られ
る抗ＨＢｓ抗体の有用性は極めて大きいものとなる。す
なわち、現在用いられている抗ＨＢｓ抗体は抗体価の高
いヒトの血液を原料としているため、その入手は困難さ
を伴なっているが、本発明によれば、ヒト由来の抗ＨＢ
ｓ抗体が大量に得られるからである。
れている。すなわち、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓ）、ＨＢ
Ｖ核抗原（ＨＢｃ）、同ｅ抗原（ＨＢｅ）である。この
うちＨＢｓ抗原に対する抗体（抗ＨＢｓ抗体）は、ＨＢ
ｓ抗原陽性血液の輸血あるいは人工透析等によって起こ
る水平感染や、ＨＢｓ抗原陽性の母と児のあいだの垂直
感染等の予防その他に臨床適用（受動免疫）されており
、最近ではＨＢｓワクチンを投与する積極的予防法（能
動免疫）も実用化されているが、緊急な予防効果を期待
する場合、あるいは免疫不全者への適用には、前記抗Ｈ
Ｂｓ抗体の使用が望まれるため、本発明によって得られ
る抗ＨＢｓ抗体の有用性は極めて大きいものとなる。す
なわち、現在用いられている抗ＨＢｓ抗体は抗体価の高
いヒトの血液を原料としているため、その入手は困難さ
を伴なっているが、本発明によれば、ヒト由来の抗ＨＢ
ｓ抗体が大量に得られるからである。
また同様にしてＨＢｃ抗原に対する抗ＨＢｃ抗体、ＨＢ
ｅ抗原に対する抗ＨＢｅ抗体を産生ずるヒト−マウス−
ヒト ヘテロハイブリドーマを得て、ヒト系の抗ＨＢｃ
抗体、抗ＨＢｅ抗体を得ることができる。
ｅ抗原に対する抗ＨＢｅ抗体を産生ずるヒト−マウス−
ヒト ヘテロハイブリドーマを得て、ヒト系の抗ＨＢｃ
抗体、抗ＨＢｅ抗体を得ることができる。
前記産生抗体は、遠心分離、塩析、更にカラムクロマト
グラフィー等の常法の精製手段を用いて分ｍ精製するこ
とができる。
グラフィー等の常法の精製手段を用いて分ｍ精製するこ
とができる。
（発明の効果）
本発明によれば、ヒト系特異抗体産生細胞との融合効率
、クローニング効率の高いバイブリドーマ親株を得るこ
とができ、またこの親株を用いて、抗ＨＢｓモノクロー
ナル抗体、 抗ＨＢ ｃモノクローナル抗体、抗ＨＢｅ
モノクローナル抗体を産生するヒト−マウス−ヒト ヘ
テロハイブリドーマが得られ、その有用性は犬なるもの
である。
、クローニング効率の高いバイブリドーマ親株を得るこ
とができ、またこの親株を用いて、抗ＨＢｓモノクロー
ナル抗体、 抗ＨＢ ｃモノクローナル抗体、抗ＨＢｅ
モノクローナル抗体を産生するヒト−マウス−ヒト ヘ
テロハイブリドーマが得られ、その有用性は犬なるもの
である。
（発明の実施例）
以下本発明を実施例によって説明する。
実施例１
（１）８アザグアニン耐性ヒト−マウス へテロハイブ
リドーマ親株の製造 正常人末梢血よりフィコールパック（ファルマシア社製
）比重遠心法にてリンパ球層を分別し、ＲＰＭＩ １６
４０合成培地（ギプコ社製）で３回洗浄し末梢血リンパ
球（ＰＢＬ）を得た。
リドーマ親株の製造 正常人末梢血よりフィコールパック（ファルマシア社製
）比重遠心法にてリンパ球層を分別し、ＲＰＭＩ １６
４０合成培地（ギプコ社製）で３回洗浄し末梢血リンパ
球（ＰＢＬ）を得た。
この分１１１ＰＢＬと、予かじめ１０％牛脂児血清（以
下ＦＣ３という）含有ＲＰＭＩ １６４０培地にて培養
した対数増殖期にあるマウス骨髄腫細胞Ｐ３ｕｌを１０
；１の細胞比にて混合し、予かしめ３７℃に保温したＰ
ＥＧ４０００（シグマ社製）１．ＯｍＩＬ中１分間融合
し、この細胞混合液を３０ｍＪＺのＲＰＭＩ １０００
合成培地にて緩徐に１５分間で希釈した。この液は３７
℃の保温をしておくのが好ましい。希釈後４００Ｘｇ５
分間の遠心操作にて細胞を沈澱させ１ｏ％ＦＣ５含有Ｒ
ＰＭＩ １６４０合成培地でＩ Ｘ １０ＢＰＢＬ／
ｍｕに希釈浮遊させた。この細胞浮遊液を９６ウエルマ
イクロタイタプレートに２００μＬずつ分注して２４時
間培養し、そのウェルの半量を１０％ＦＣ５含有ＲＰＭ
Ｉ １８４０合成培地にハイポキサンチン−アミノプテ
リン−チミジンを加えたＨＡＴ培地に交換した。
下ＦＣ３という）含有ＲＰＭＩ １６４０培地にて培養
した対数増殖期にあるマウス骨髄腫細胞Ｐ３ｕｌを１０
；１の細胞比にて混合し、予かしめ３７℃に保温したＰ
ＥＧ４０００（シグマ社製）１．ＯｍＩＬ中１分間融合
し、この細胞混合液を３０ｍＪＺのＲＰＭＩ １０００
合成培地にて緩徐に１５分間で希釈した。この液は３７
℃の保温をしておくのが好ましい。希釈後４００Ｘｇ５
分間の遠心操作にて細胞を沈澱させ１ｏ％ＦＣ５含有Ｒ
ＰＭＩ １６４０合成培地でＩ Ｘ １０ＢＰＢＬ／
ｍｕに希釈浮遊させた。この細胞浮遊液を９６ウエルマ
イクロタイタプレートに２００μＬずつ分注して２４時
間培養し、そのウェルの半量を１０％ＦＣ５含有ＲＰＭ
Ｉ １８４０合成培地にハイポキサンチン−アミノプテ
リン−チミジンを加えたＨＡＴ培地に交換した。
以後３〜４日毎に同様に新鮮培地交換を行なった。１０
〜１４日後、各ウェルに細胞の増夕直が認められるよう
になり、およそ２０％のウェルで細胞の増殖が認められ
た。その中で最も増殖性のよい株を選択しＨＭｒＶＯ４
と命名した。
〜１４日後、各ウェルに細胞の増夕直が認められるよう
になり、およそ２０％のウェルで細胞の増殖が認められ
た。その中で最も増殖性のよい株を選択しＨＭｒＶＯ４
と命名した。
その後、この）（、ＭＩＶＯ４をＨＡＴ培地に２週間継
代培養し、次いで１０％ＦＣ３含有ＲＰＭＩ １６４０
合成培地で２週間継代培養した。
代培養し、次いで１０％ＦＣ３含有ＲＰＭＩ １６４０
合成培地で２週間継代培養した。
このようにして馴化したＨＭＩＶＯ４を、細胞密度ｉ
Ｘ Ｉ Ｑ６／ ＮＩＬとなるように１０％ＦＣ３含有
ＲＰＭＩ １６４０合成培地に浮遊し、突然変異誘発剤
エチルメタンスルホネートを最終濃度Ｏ〜５００μｇ／
ｍｆ１．加え、２４時間培養した後、４００ｘｇ５分間
の遠心操作にて細胞を集め、２μＭの８アザグアニンを
加えた１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ １８４０合成培地に
て培養を開始した。
Ｘ Ｉ Ｑ６／ ＮＩＬとなるように１０％ＦＣ３含有
ＲＰＭＩ １６４０合成培地に浮遊し、突然変異誘発剤
エチルメタンスルホネートを最終濃度Ｏ〜５００μｇ／
ｍｆ１．加え、２４時間培養した後、４００ｘｇ５分間
の遠心操作にて細胞を集め、２μＭの８アザグアニンを
加えた１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ １８４０合成培地に
て培養を開始した。
一以後、４μｇ、８μｇ、１６μｇ、３２μｇ。
５０μｇ、１００μｇの８アザグアニンを加えた１０％
ＦＣ３含有ＲＰＭＩ １６４０合成培地の６種類の新鮮
培地を用いて順次交換を行なフた。各濃度での培養は７
〜１０日間行なった。
ＦＣ３含有ＲＰＭＩ １６４０合成培地の６種類の新鮮
培地を用いて順次交換を行なフた。各濃度での培養は７
〜１０日間行なった。
約２〜３か刃稜、最終濃度１００μＭ８アザグアニン含
有培地中で増殖する細胞が認められるようになり、Ｂ
Ａ Ｌ Ｂ／Ｃマウス胸腺細胞をフィーダ細胞に用いた
限界希釈法によりこの増殖細胞をクローン化し、８アザ
グアニン耐性化ヒト−マウス へテロハイブリドーマの
５クローン ＹＩＯ５，Ｙｌｒ０７゜ＹｍＯ１、ＹＩＶ
Ｏ２，ＹＶＯ１を樹立した。
有培地中で増殖する細胞が認められるようになり、Ｂ
Ａ Ｌ Ｂ／Ｃマウス胸腺細胞をフィーダ細胞に用いた
限界希釈法によりこの増殖細胞をクローン化し、８アザ
グアニン耐性化ヒト−マウス へテロハイブリドーマの
５クローン ＹＩＯ５，Ｙｌｒ０７゜ＹｍＯ１、ＹＩＶ
Ｏ２，ＹＶＯ１を樹立した。
これらの樹立細胞は８アザグアニン含有培地およびウワ
バイン（１０ｍＭ）含有沼地で増殖可能であるが、ＨＡ
Ｔ培地では４〜６日培養にて全て死滅したことにより、
ＨＡＴ感受性細胞であることが確認された。
バイン（１０ｍＭ）含有沼地で増殖可能であるが、ＨＡ
Ｔ培地では４〜６日培養にて全て死滅したことにより、
ＨＡＴ感受性細胞であることが確認された。
さらに、酵素免疫測定法（以下ＥＬＩＳＡという）によ
る測定から、ヒト免疫グロブリンおよびマウス免疫グロ
ブリン非分泌型であることも明らかとなった。染色体分
析の結果、これらの細胞は、ヒト染色体およびマウス染
色体の両者を保有するハイブリドーマであることが明ら
かとなった。
る測定から、ヒト免疫グロブリンおよびマウス免疫グロ
ブリン非分泌型であることも明らかとなった。染色体分
析の結果、これらの細胞は、ヒト染色体およびマウス染
色体の両者を保有するハイブリドーマであることが明ら
かとなった。
（２）融合効率の検討と抗ＨＢｓ抗体産生クローンの製
造 正常ヒト抗ＨＢｓ抗体陽性者末梢血よりフィコールパッ
ク法にてＰＢＬを分離し、先にクローン化した８アザグ
アニン耐性５株と各々２Ｘ１０７の細胞数で前述のごと
＜ＰＥＧ４０００を用い細胞融合並びにＨＡＴ選択培養
を実施した。対照として、マウス骨髄腫細胞Ｐ３ｕｌを
用いた。
造 正常ヒト抗ＨＢｓ抗体陽性者末梢血よりフィコールパッ
ク法にてＰＢＬを分離し、先にクローン化した８アザグ
アニン耐性５株と各々２Ｘ１０７の細胞数で前述のごと
＜ＰＥＧ４０００を用い細胞融合並びにＨＡＴ選択培養
を実施した。対照として、マウス骨髄腫細胞Ｐ３ｕｌを
用いた。
これらの試験結果をＴａｂｌｅ １に示した。
試験１より、ＨＡＴ培養後の細胞増殖ウェルは、５クロ
ーンの合計２９４／ ４７５ウェル平均６１．９％（４
３，２〜１００％）であり、マウス骨髄腫細胞Ｐ３ｕｌ
では、１４／９５ウエル １４．７％のハイブリドーマ
が形成された。最もバイブリドーマ形成率の高い親株は
、Ｙ ＩＩ Ｏ７株で９５／９５ウエル（１００％）で
あり、その融合効率は２２．８／Ｉ Ｘ １０６ Ｐ
Ｂ Ｌ以上であった。
ーンの合計２９４／ ４７５ウェル平均６１．９％（４
３，２〜１００％）であり、マウス骨髄腫細胞Ｐ３ｕｌ
では、１４／９５ウエル １４．７％のハイブリドーマ
が形成された。最もバイブリドーマ形成率の高い親株は
、Ｙ ＩＩ Ｏ７株で９５／９５ウエル（１００％）で
あり、その融合効率は２２．８／Ｉ Ｘ １０６ Ｐ
Ｂ Ｌ以上であった。
また試験２の中より、長期に抗ＨＢｓ抗体産生を続ける
ウェルの細胞を限界希釈法によりクローニングを行ない
長期抗体産生クローン６株を樹立した。なお、抗ＨＢｓ
抗体の検出はＨＢｓ抗原感作羊赤血球による凝集反応（
ＰＨＡ法）およびＨＢｓ抗原をコートした９６ウエルプ
レートを用いたＥＬＩＳＡ法によった。またこれら５株
の細胞はＨＢｓ抗原感作羊赤血球とロゼツトを形成し、
細胞表面に抗原レセプターとしての表面免疫グロブリン
の存在が示された。
ウェルの細胞を限界希釈法によりクローニングを行ない
長期抗体産生クローン６株を樹立した。なお、抗ＨＢｓ
抗体の検出はＨＢｓ抗原感作羊赤血球による凝集反応（
ＰＨＡ法）およびＨＢｓ抗原をコートした９６ウエルプ
レートを用いたＥＬＩＳＡ法によった。またこれら５株
の細胞はＨＢｓ抗原感作羊赤血球とロゼツトを形成し、
細胞表面に抗原レセプターとしての表面免疫グロブリン
の存在が示された。
（３）抗ＨＢｓ抗体の産生とその性質
上記（２）で樹立した抗ＨＢｓ抗体産生クローンを、１
０％ＦＣ３含有ＲＰＭＩ １６４０合成培地に細胞密度
ｌＸｌ０６／ｍｕで浮遊させ、培養を一日行なったとこ
ろ、その産生抗体量は１〜２μｇ ／ ｍＡ ／ ｄａ
ｙであった。
０％ＦＣ３含有ＲＰＭＩ １６４０合成培地に細胞密度
ｌＸｌ０６／ｍｕで浮遊させ、培養を一日行なったとこ
ろ、その産生抗体量は１〜２μｇ ／ ｍＡ ／ ｄａ
ｙであった。
この産生抗体は抗ヒトＩｇＧサブクラス抗体（マイルス
社製）を用いたＥＬＩＳＡ法および二次元免疫拡散法に
より全て抗ヒトＩｇＧ 、１タイプであり、さらにこれ
らの抗体はＩｇＧマウスモノクローナル抗体結合セファ
ロースＣＬ４Ｂ、およびＨＢｓ結合セファロースＣＬ４
Ｂのどちらにも吸収されたことによりヒトＩｇＧ １タ
イプの抗ＨＢｓ抗体であることが確認された。
社製）を用いたＥＬＩＳＡ法および二次元免疫拡散法に
より全て抗ヒトＩｇＧ 、１タイプであり、さらにこれ
らの抗体はＩｇＧマウスモノクローナル抗体結合セファ
ロースＣＬ４Ｂ、およびＨＢｓ結合セファロースＣＬ４
Ｂのどちらにも吸収されたことによりヒトＩｇＧ １タ
イプの抗ＨＢｓ抗体であることが確認された。
実施例２
抗ＨＢｃ抗体産生クローンの製造
抗ＨＢｃ抗体陽性者ＰＢＬをフィコールパック法にて分
離し、実施例１の８アザグアニン耐性株Ｙ ＩＩ ０７
とＰＥＧ４０００にて融合した。
離し、実施例１の８アザグアニン耐性株Ｙ ＩＩ ０７
とＰＥＧ４０００にて融合した。
その結果をＴａｂｌｅ２に示す。
抗ＨＢｃ抗体の検出は、ＨＢｃ抗原感作羊赤血球を用い
たＰＨＡ法によった。抗体陽性細胞を限界希釈法により
クローニングし、抗ＨＢｃ抗体を長期にわたり産生ずる
５株のクローンを樹立した。これらのクローンはその培
養土清中にＰＨＡ法にて２５〜２Ｂの抗体を産生してい
ることが明らかとなった。
たＰＨＡ法によった。抗体陽性細胞を限界希釈法により
クローニングし、抗ＨＢｃ抗体を長期にわたり産生ずる
５株のクローンを樹立した。これらのクローンはその培
養土清中にＰＨＡ法にて２５〜２Ｂの抗体を産生してい
ることが明らかとなった。
実施例３
抗ＨＢｅ抗体産生クローンの製造
実施例２と同様にして抗ＨＢｅ抗体産土株を樹立し、そ
の結果をＴａｂ１６３に示した。
の結果をＴａｂ１６３に示した。
抗ＨＢｅ抗体の検出は、ＨＢｅ抗原感作羊赤血球を用い
たＲＰＨＡ試薬を用いての抗原の凝集阻害能でみる、い
わゆるＲＰＨＩ法と、抗ヒト免疫グロブリンをコートし
た９６ウエルプレートを用い、次いで試験試料、更にＨ
Ｂｅ抗原そしてパーオキシダーゼ標識抗、Ｉ
ＨＢｅ抗体と一連の反応をさせるＣ ａｐｔｕ
ｒｅアッセイ法によった。
たＲＰＨＡ試薬を用いての抗原の凝集阻害能でみる、い
わゆるＲＰＨＩ法と、抗ヒト免疫グロブリンをコートし
た９６ウエルプレートを用い、次いで試験試料、更にＨ
Ｂｅ抗原そしてパーオキシダーゼ標識抗、Ｉ
ＨＢｅ抗体と一連の反応をさせるＣ ａｐｔｕ
ｒｅアッセイ法によった。
Ｔａｂｌｅ １ （試験 １）
Ｔａｂｌｅ １ （試験 ２）
Ｔａｂｌｅ ２
Ｔａｂｌｅ ３
手続補正書
事件との関係 出 願 人
一任一刊←＋÷刑−
氏 名（名称） 日本ツ早、嶺」失へン発末辷４、代
理人 住 所 東京都千代田区丸の内２丁目６番２号丸の内
へ重洲ビル３３０５、 補正命令の日付 角瑣も 補正書 本願明細書中下記事項を補正いたします。
理人 住 所 東京都千代田区丸の内２丁目６番２号丸の内
へ重洲ビル３３０５、 補正命令の日付 角瑣も 補正書 本願明細書中下記事項を補正いたします。
記
１、第４頁下から４行目に
「ヒト免疫ガンマグロブリン」とあるを「ヒト免疫グロ
ブリン」と訂正する。
ブリン」と訂正する。
２、第４頁下から３行目に
［ハイブリドーマを提供］とあるを
［ハイブリドーマ親株を提供］と訂正する。
３、第６頁下から４〜３行目に
ｒ （ＰＢＬ）Ｊ とあるを削除する。
４、第１１頁６〜７行目に
［ｇｇ」 （ｅ箇所）とあるをそれぞれｒｊＬＭＪと訂
正する。
正する。
５、第１３頁下から４行目に
「これら５株の」とあるを
「これら６株の」と訂正する。
６、第１４頁９行目に
「全て抗ヒトＩｇＧＩＪとあるを
「全てヒトＩｇＧＩＪ と訂正する。
７、第１４頁１０〜１１行目に
「抗体はＩｇＧマウスモノクローナル抗体」とあるを
「抗体は抗ヒ） ＩｇＧマウスモノクローナル抗体」と
訂正する。
訂正する。
８、第１５頁１４〜１５行目に
ｒＨＢｅ抗原感作羊赤血球」とあるを
「抗ＨＢｅ抗体感作羊赤血球」と訂正する。
Claims (5)
- （１）ヒトリンパ球とマウス骨髄腫細胞Ｐ３ｕ１とを細
胞融合させたのち８アザグアニン（８ＡＧ）耐性化して
得たヒトリンパ球との融合効率が高いハイブリドーマ - （２）ヒトリンパ球とマウス骨髄腫細胞Ｐ３ｕ１とを細
胞融合させたのち８アザグアニン（８ＡＧ）耐性化して
得たハイブリドーマと、特異抗体産生ヒトリンパ球とを
融合させて得ることを特徴とするハイブリドーマ - （３）特異抗体産生ヒトリンパ球が、Ｂ型肝炎ウィルス
表面抗原（ＨＢｓ）に対する抗体産生細胞であることを
特徴とする特許請求の範囲第（２）項に記載したハイブ
リドーマ - （４）特異抗体産生ヒトリンパ球が、Ｂ型肝炎ウィルス
核抗原（ＨＢｃ）に対する抗体産生細胞であることを特
徴とする特許請求の範囲第（２）項に記載したハイブリ
ドーマ - （５）特異抗体産生ヒトリンパ球が、Ｂ型肝炎ウィルス
核抗原（ＨＢｅ）に対する抗体産生細胞であることを特
徴とする特許請求の範囲第（２）項に記載したハイブリ
ドーマ
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60271927A JPS62130681A (ja) | 1985-12-03 | 1985-12-03 | 新規ハイブリド−マ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60271927A JPS62130681A (ja) | 1985-12-03 | 1985-12-03 | 新規ハイブリド−マ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62130681A true JPS62130681A (ja) | 1987-06-12 |
Family
ID=17506798
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60271927A Pending JPS62130681A (ja) | 1985-12-03 | 1985-12-03 | 新規ハイブリド−マ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62130681A (ja) |
-
1985
- 1985-12-03 JP JP60271927A patent/JPS62130681A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5204095A (en) | Monoclonal antibodies against hepatitis B virus | |
| US4468346A (en) | Monoclonal antibodies to porcine immunoglobulins | |
| US4271145A (en) | Process for producing antibodies to hepatitis virus and cell lines therefor | |
| EP0014519B1 (en) | Cell lines, process for preparing them and process for producing antibodies | |
| EP0038642B1 (en) | A monoclonal antibody against hepatitis b and its production, a hybridoma producing the monoclonal antibody and compositions containing it, the propagation of the hybridoma and the monoclonal antibody for use as an antiviral agent against hepatitus b and in isolating hepatitus b surface antigen from a sample | |
| US4491632A (en) | Process for producing antibodies to hepatitis virus and cell lines therefor | |
| JP2640463B2 (ja) | ヒト―ヒトハイブリドーマの製造法 | |
| US4634666A (en) | Human-murine hybridoma fusion partner | |
| JPH03236794A (ja) | ヒトモノクローン抗体の製造法 | |
| CA2066433A1 (en) | Chicken-specific immunoglobulin g-producing hybridoma | |
| EP0179483A2 (en) | Method for preparing monoclonal antibodies to HBsAg | |
| Shih et al. | Production of monoclonal antibodies against hepatitis B surface antigen (HBsAg) by somatic cell hybrids | |
| Tucker et al. | Specific bovine monoclonal antibody produced by a re-fused mouse/calf hybridoma | |
| US8173425B2 (en) | Fusion partner cells | |
| EP0131878A2 (en) | Process for producing human monoclonal antibodies | |
| NAGATA et al. | Preferential generation of monoclonal IgG-producing hybridomas by use of vesicular stomatitis virus-mediated cell fusion | |
| Caulfield et al. | Characterization of the spontaneous autoimmune (anti-erythrocyte) response in NZB mice using a pathogenic monoclonal autoantibody and its anti-idiotype | |
| CA1240628A (en) | Fusion partner and its product | |
| JPS62130681A (ja) | 新規ハイブリド−マ | |
| Faller et al. | HAB-1, a new heteromyeloma for continuous production of human monoclonal antibodies | |
| JPH0695949B2 (ja) | ヒトＩｇＧ１型モノクローン抗体 | |
| EP0093774A1 (en) | Monoclonal antibodies against leishmania | |
| Kudo et al. | Highly efficient procedure for production of human monoclonal antibodies: establishment of hybrids between Epstein-Barr virus-transformed B lymphocytes and heteromyeloma cells by use of GIT culture medium | |
| JP3084030B2 (ja) | 新規ハイブリドーマ | |
| US5849539A (en) | Thymidine kinase-lacking ouabain-resistant chicken hybridoma |