JPS62120322A - アイメリア アセルブリナ免疫原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 コクシジウム症は、原虫類門の１部、１種以上の種を有
するコクシジウムの感染によって引き起こされる疾患で
ある。コクシジウムは広い範囲の宿主に感染する細胞内
寄生体であり、羊、山羊、牛、豚、家禽産業に痛烈な経
済損失となる。実際にアイメリア種の感染に起因するコ
クシジウム症は経済的に破壊的な損害を家禽産業に起こ
している。飼われている鳥の中で鶏がコクシジウム症の
経済損失に最も影響されやすいが、七面鳥、がちょう、
かも、はろほろちょうでも損害が生じる。また、コクシ
ジウム症は、飼われているきじやうずらにも深刻な損失
を生じる。コクシジウム症は、急性で、破壊的な大量死
が特徴であるかあるいは疾病が慢性で体重増加がないこ
とが特徴である。

家禽は、生長期の寄生体、胞子形成オーシスト（ｏｏｃ
ｙｓｔ）の増殖期の摂取を伴い、コクシジウムに感染さ
れる。感染期のスポロゾイト（ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）
は腸管で放出され、急速に上皮細胞を侵した後、有性分
化の段階に入る前に急速な細胞内無本生増殖の発生を数
回行ない、糞便で流されるオーシストの産生に誘導する
。アイメリア種（ｓｐｐ、）のいずれの低レベル感染も
再感染に対して防御免疫が生じる。これはコクシジウム
症が生ワクチンの使用によって制御することができるこ
とを示唆している。有効なワクチンの開発は、アイメリ
アの複雑なライフサイクルおよび後感染免疫が一般に種
特異性であるという事実によって遅れている（ロングお
よびローズ、ＷｏｒｌｄｓＰｏｕｌｔｒｙ　Ｓｃｉ、　
Ｊ、　　第３８巻、８５〜９６頁、１９８２年）。感染
は、免疫が誘発される前の無性期の発育まで進行するこ
とが示されている。従って、少なくともある種の免疫化
抗原は、恐らく無性期に含有されると思われる（ローズ
およびヘスケス、バラシトロジー第７３巻、２５〜３７
頁、１９７６年）。　しかしながら、スポロゾイト期は
、はとんど免疫化値がないようである（ローズ、Ｍ、Ｅ
、　１９Ｅ１２年、バイオロジー　オブ　ザ　コクシジ
ア、Ｐ、Ｌ、ロング、編集、ユニバーシティパーク　プ
レス、バルチモア、３２９頁、１９８２年）。

生育不能のアイメリア成分でニワトリを免疫にするこれ
までの試みは不成功に終わっている。非経口的に投与し
た可溶性のアイメリア抗原は、感染スポロゾイトでの次
の攻撃を弱めなかった（ロングアンド　ローズ　１Ｅｘ
ｐ。

Ｐａｒｓｉｔｏ１ｏｇｙ第１６巻、１〜７頁、１９６５
年）、逆に、可溶化Ｅ、テネラスポロゾイト抗原は、Ｅ
、テネラの攻撃に対してニワトリを防御するために使用
しており（ジエンケル等、ヨーロッパ特許出願第０１３
５７１２号）。

一方、可溶化メロゾイト（ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ）抗原は
潜在性ワクチンとみなされている（ジエンケル等、ヨー
ロッパ特許出願第０１３５０７３号）。

Ｅ、アセルブリナ（Ｅ　、　ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）の
胞子形成オーシストを粉砕し５次に上澄み液を凍結融解
および超音波処理によって抽出液を調製する。スポロゾ
イト抽出液はＤＥ−５２陰イオン交換精製スポロゾイト
の凍結融解および超音波処理によってＷｊｌ！Ａする。

スポロゾイトは、特異抗体反応を引き起こすポリペプチ
ド類を含有する。これらのポリペプチド類の２０種、す
なわち分子量２０．２１．５．２２．５゜２３、　２４
．　２６．　２６．５．２７．２９．３１３４．３７゜
４１．５．４５．５９．６５．６８．７４．８４．１１
５　Ｋｄポリペプチドは免疫優性である。これらのポリ
ペプチド類と反応する抗体を含有する血清は免疫のない
攻撃されるニワトリのスポロゾイト感染性を中和する。

これらのポリペプチド類の１種以上はＥ、アセルブリナ
、Ｅ、テネラ（Ｅ　、　ｔｅｎｅｌｌａ）またはＥ、マ
キシマ（Ｅ。

＋ｎａｘｉｍａ）のビルレント感染によって引き起こさ
れる病的状態および死亡に対して予防的に免疫にするた
めに免疫原として使用することができる。

従って、本発明の目的は、コクシジウム症に対して防御
免疫を誘導する免疫原を含有するＥ、アセルブリナの抽
出液を提供するものである。別の目的は、完全なオーシ
ストまたはスポロゾイトの表面または内部に、正常に位
置するタイプの免疫原性ポリペプチド類を提供するもの
である。別の目的は、これらの免疫原性抽出液を得る手
段を提供するものである。別の目的は、これらの免疫原
の予防投与のための組成物を提供するものである。さら
に、別の目的は、主に経済損失を招くアイメリアに対し
て防御するコクシジウム症ワクチンを提供するものであ
る０本発明のこれらのおよび他の目的は、次の説明から
明白となる。

本発明は、寄生体抽出液および典型的には完全なスポロ
ゾイトの表面におよび胞子形成オーシストに見い出され
る１種以上の免疫原性ポリペプチドに基づくコクシジウ
ム症ワクチンに関する。本発明は、さらに、免疫原性ポ
リペプチド類自体さらに抽出液または免疫原性ポリペプ
チド類を得る方法およびコクシジウム症に有効なワクチ
ン調製におけるその用途に関する。

免疫原性ポリペプチド類を含有する寄生体抽出液は、（
１）胞子形成オーシストおよび／または　（２）スポロ
ゾイトから得られる。

オーシストは感染の約６８゛後にニワトリの糞材料の物
理的破壊によって単離される。糞ホモジェネートをチー
ズクロスで濾過し、残層を洗浄および遠心分離で除去す
る。約２０％食塩溶液に浮遊させることによって部分的
に純粋なオーシストのフラクシ目ンを集め、例えば約４
℃で次亜塩素酸塩溶液、好適には次亜塩素酸ナトリウム
を水中約５〜６％の１度で約１０分間処理することによ
って細菌をなくす。無菌の緩衝食塩水で数回洗浄するこ
とによって次亜塩素酸塩を除去する。オーシストをエド
ガーのＴｒａｎｓ、＾ｍ、　Ｍｊｃｒ、　Ｓｏｅ、第６
２巻、２３７〜２４２頁（１９５４年）の技術に従って
胞子形成させておく。

胞子形成オーシストを生理的に許容できる媒質に懸濁さ
せ、パットン、サイエンス、第１５０巻、　７６７〜７
６９頁（１９６５年）の方法によって破壊する。かかる
生理的に許容できる媒質は、生理食塩水、リン酸塩緩衝
食塩水、リン酸塩緩衝食塩グルコース、緩衝食塩水など
を包含するが、それらに限定されるものではない。破壊
オーシストからのスポロシスト（ｓｐｏｒｏｃｙｓｔ　
）を約１１０００Ｘの遠心分離で約１０分間分離する。

上澄み液は、後粉砕上澄み［ｐｏｓｔ−ｇｒｉｎｄ　５
ｕｐｅｒｎａｔａｎｔ（ＰＧＳ）］免疫原混成物と呼ば
れる。そして。

スポロシストを含有するペレットにした物質をさらにス
ポロゾイトとして処理する。ペレットにした物質を緩衝
液巾約０．１２５％トリプシンおよび約１．０％タウロ
デオキシコール酸を含有する脱ｎ　（ｅｘｃｙｓｔｉｎ
ｇ）溶液で約２５〜４１℃において約５％Ｃ０２〜９５
％空気の雰囲気中で約１／２時間処理する。脱嵌溶液を
緩衝溶液で洗浄し、遠心分離によって除去する。最終ペ
レットを上述の如く生理的に許容できる媒質に再想濁さ
せ、スポロゾイトをシュマッツ（Ｓｃｈ＋ｍａｔｚ）等
　　Ｊ、　Ｐｒｏ−ｔｏｚｏｏｌ、第３１巻、１８１〜
１８３頁（１９８４年）の方法を使用するＤＥ−５２陰
イオン交換カラムを用いて分離する。分離スポロゾイト
を約１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリドを含
有する緩衝液に３回凍結融解した後超音波で破壊する。

スポロゾイトから得たポリペプチド類を還元条件下約５
〜２０％ポリアクリルアミドのゲルを用いる線状勾配ド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動によって分析する。クマシーブルー（ＣＯＯ
−ｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ）染色および分子量標識との
比較は、約３００〜１３キロダルトン（ｋｄ）の大きさ
の範囲の３１個のポリペプチドを表わす。これらのポリ
ペプチド類をウェスタンプロット分析を利用して、ウサ
ギの抗Ｅ、アセルブリナ抗体と混ぜると、２０個のポリ
ペプチドだけが強い抗体結合を示すにれらの約１１５、
８４．７４．６８．６５．５９．４５．　４１．５．　
３７゜３４、３１．２９．２７．２６．５．　２６．２
４．２３．２２．５゜２１．５．２０　ｋｄを有する免
疫優性ポリペプチドは、単独または組合わせにおいてＥ
、アセルブリナだけでなく、他のアイメリア種によって
誘発されるコクシジウム症を防御するニワトリの免疫反
応を誘発することができる。

ＰＧＳ免疫原混成物または上記で列挙したポリペプチド
免疫原を単独あるいは併用のいずれかで、または生理的
に許容できる寄生体抽出液として接種することによって
ニワトリを免疫にする。新たに畔イ乙したまたは大人の
鳥類の経口または筋肉内経路による免疫処置は、悪性の
寄生体に触れた後、重要な疾病とならないように感染に
対して免疫が生じる。

防御免疫は、ニラトリ１羽当たりポリペプチド免疫原ま
たは免疫原混成物約１〜２００μｇ、好適には約５〜７
５μｇを１回の服用量で、または数回に分けた服用量で
１週毎に約１〜４回で投与することによって得られる。

筋肉内経路または経口経路のいずれかによって免疫にす
る。匍化後２日目のヒナに対する好適な用量は、卿化後
２日、９日および１６日［Ｊに約１０μｇを投与するか
あるいは卿化後２日目に１回の服用量約５０μｇを投与
する。記載したとおり、Ｅ、アセルブリナのニワトリの
免疫は、Ｅ、アセルブリナに対して著しい防御を生じる
ばかりでなく、意外にもＥ、テネラまたはＥ、マキシマ
での攻撃に対しても著しい免疫防御がある。

次の実施例は、本発明を具体的に説明するものであるが
、それらに限定されるものではない。

実施例　１ オーシスト　−アイメリアアセルブリナオーシストをＥ
、アセルブリナの保存培養で５〜６日前に感染した大人
のニワトリから得た。

感染した鳥類の糞便および腸管内容物を集め蒸留水で稀
釈し、ウェーリング　ブレンダー（Ｗａｒｉｎｇ　ｂｌ
ｅｎｄｅｒ）で破壊した。破壊した材料をチーズクロス
で濾過した。粒子状部分を蒸留水で洗浄し、低速遠心分
離１１０００Ｘで集めた。部分的に純粋なオーシストの
フラクションを２０％食塩溶液に浮遊させて分離し、４
℃で１０分間　５．２５％次亜＠素酸ナトリウムで処理
した。無菌リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７，６で
数回洗浄して次亜塩素酸ナトリウムを除去して、細菌の
ない精製したオーシストを得た。

胞子形成オーシスト　−　」−記のように調製したオー
シストを２９°Ｃで４８時間振盪水浴中で胞子形成させ
た。胞子形成オーシストを使用するまで４℃でＰＢＳ（
ｐＨ７，６）中に貯蔵した。

後粉砕上澄み液　−精製した胞子形成オーシストの　２
ｍＱ懸濁液（５Ｘ　１０７／ｍ　ＱＰ　Ｂ　Ｓ　、　ｐ
　Ｈ７、６）をゆるい取付けの乳棒を備えた組織ホモジ
エナイザー中７０Ｏｒｐｍで６分間４℃で粉砕し、上澄
み物質を遠心分離（ＬＯＯＯｘｇ、１０分間）によって
集めた。この乳白色の脂質に富んだ混成物は、後粉砕−
ヒ澄み（ＰＧＳ）混成免疫原と呼ばれる。

さらに、ペレット化材料を実施例２に記載されるように
スポロゾイトとして処理した。

Ｐ　Ｇ　Ｓをニワトリに注射する前にドライアイス温度
に急速冷却した後、室温に急速加温することによって３
回凍結融解し、次にＰＧＳを１ｍＭフェニルメチルスル
ホニルフルオリドを含有するリン酸塩緩衝食塩水中で超
音波処理して蛋白質の分解を阻害した。

去嵐帆−λ スポロ−ゾイト免疫原−ｑｚｉ スポロゾイト　−　傷ついていないオーシスト、スポロ
シストおよびオーシスト外皮から構成される実施例１で
得たペレット化材料をハンクスの平衡塩溶液（ｐＨ７゜
４）中、０．１２５％（Ｗ／■）トリプシン（Ｌ：２５
０）と１．０％（Ｗ／Ｖ）タウロデオキシコール酸を含
有する脱嵌溶液に再懸濁させ、５％ＣＯ２中４１℃でイ
ンキュベートした。　１／２時間後、脱嚢溶液を遠心分
離によって除去し、寄生体物質を　リン酸塩緩衝食塩グ
ルコース（ＰＢＳＧ　：　９．４４　ｇ／Ｌ無水Ｎａ２
ＨＰＯ４０−５５ｇ　／　Ｌ　ＮａＨ２Ｐ　Ｏ４２Ｈｚ
　Ｏ２−９８ｇ　／Ｌ　ＮａＣＱ　、　　１０　ｇ　／
Ｌグルコース、ｐＨ８，０）で２回洗浄した。寄生体混
合物をＰＢＳＧで平衡にしたＤＥ−５２陰イオン交換カ
ラムに適用した。スポロゾイトをボイドボリュームの溶
離によって他の寄生体物質から精製した。

ドライアイスで冷却し、室温に加温することによって３
回凍結融解したスポロゾイトからスポロゾイト免疫原を
得、プロテアーゼ阻害剤として１ｍＭフェニルメチルス
ルホニルフルオリドを有するＰＢＳ中で破壊されるまで
超音波処理した。蛋白質濃度をローリ−等の（１９５１
年）　Ｊ　、　ｌ３ｉｏ１．　Ｃｈｅｎ＋、第１９３巻
、２６５〜２７５頁の方法によって定量し免疫原を液体
Ｎ２中で貯蔵した。

実施例　３ 実施例２に記載したように得たスポロゾイト免疫原を硫
酸ドデシルナ１−リウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によるサイズによって各ペプ
チドに分離した。

スポロゾイト免疫原２００μｇを０．１％ＳＤＳと２−
メルカプ１〜エタノールの存在下、３％ポリアクリルア
ミド重層ゲルでかされられる５〜２０％ポリアクリルア
ミド線状勾配で分離した［ラエムリネイチュア第２２７
巻、６８０〜６８５頁（１，９７０年）］。　トラッキ
ング染料、ブロモフェノールブルーが底部１ｃｍ以内に
なるまでポリペプチドを５０ｍａで１０〜１２℃　３〜
４時間電気泳動にかけた。各ポリペプチドバンドはクマ
シーブルー染色で見えるようになり、各ポリペプチドの
分子量は公知分子量の蛋白質標準の泳動に関して定量し
た。分子量標準は２００，０００〜１４，４００ダルト
ンの範囲であった。　この方法は、次の相対分子量３０
０．２１５．１４５゜１１５、　１００．　９４．　８
４．７４．６８．５９．５１．５０゜４８、４５．４４
．　４１．５．　４０．　３６．３４．３１．２９゜２
７、２６．２５．２４．２２．２１．５．１９．１７．
　１５．５゜１３　ｋｄを有する３１個のポリペプチド
を表わした。

天！Ｎ　　４− 抗スポロシイ１〜抗体の産生 Ｅ．アセルブリナスポロゾイト免疫原を実施例２で詳述
したように調製した。抗血清をＮＺＷウサギに完全フロ
インドアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ
’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ）に乳化したスポロゾイト免疫
原の１００μｇ蛋白質等価物の全量で多数部位に皮下Ｃ
３Ｃ）免疫することによって＊ａした。ウサギは、−次
免疫の３６．４８．８４日後に不完全フロイント（ＩＦ
Ａ）のスポロゾイト免疫原の１００μｇ’ｔＪ白質等価
物をＳＣに追加され、最後の注射から１０口後に採血さ
れ、そして血清を調製した。

実施例　５ ＤＥ−５２−精製Ｅ．アセルブリナスポロゾイトを実施
例２で詳述したように調製した。

ウサギの抗Ｅ．アセルブリナスポロゾイト免疫血清を実
施例４で詳述したように調製した。

この抗血清のＥ、アセルブリナスポロゾイトを凝集する
能力を９６ウエル（９６−シｅ１１）検定プレートを用
いて定量した。１ｍ１２当たり　４　Ｘ　１０’スポロ
ゾイトを含有するスポロゾイト懸濁液０．０５　ｍ　Ｑ
を稀釈血清０．０５ｍＱと各ウェルに添加した。正常な
ウサギの免疫前血清およびウサギの抗Ｅ、アセルブリナ
スポロゾイト免疫血清を１／１００〜１／１２８００の
二重稀釈で検定した。

混合液を４１℃で１時間インキュベートし、凝集および
／または溶解（血清中補体の存在のため）を顕微鏡的に
試験した。正常なウサギの血清は、スポロゾイトについ
て検出し得る効果はなく、凝集も溶解もｗｉ察されなか
った。ウサギの免疫血清は、１／２００の稀釈で寄生体
を溶解し、ｌ／３２００の稀釈でスポロゾイトを凝集し
た。

また、生体内のＥ．アセルブリナスポロゾイト感染力を
中和する能力についてウサギ血清を試験した。Ｅ、アセ
ルブリナスポロゾイトを正常なウサギ血清あるいはウサ
ギ抗Ｅ。

アセルブリナスポロゾイト免疫血清のいずれかと１／１
００の稀釈で４１℃１時間インキュベートした。次に、
３０，０００あるいはｉ　ｏ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ個の処理
スポロゾイトを　５羽のニワトリのグループの腸管の上
の方に注射した。接種の５日後、腸管を除去し、そして
病変を試験し、その病変をジョンソンおよびレイド、Ｅ
ｘｐ、　　Ｐａｒａｓｉｔ、第２８巻、３０〜３６頁（
１９７０年）に従って評価した１次の結果が得られた。

正常ウサギ　　　　２．０　　　　２．８これらの結果
は、ウサギ抗アイメリア抗体が無傷スポロゾイトの表面
に結合し、転移したスポロゾイトの感染力を中和するこ
とを示す。このデータは、さらにスポロゾイト免疫原が
抗体を誘発し、コクシジウム症の発生を阻害することを
示している。

夫度魅一旦 ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳
動によって実施例３で詳述したようにスポロゾイト免疫
原５０μｇを成分ポリペプチドに分離した。分離した後
、エリックソン等、Ｊ、　Ｉｍｍ、　Ｍｅｔｈｓ、第５
１巻、２４１〜２４９頁（１９８２年）とタウビン等、
Ｐ。

Ｎ、Ａ、Ｓ’、第７６巻、４３５０頁（１９７９年）の
操作にしたがってニトロセルロースに移した。この転移
のために１１℃で２１時間適用される３、５Ｖ／ｃｍ電
圧勾配でバイオラド　トランスプロット（Ｂｉｏｒａｄ
　ｔｒａｎｓｂｌｏｔ）装置を使用した。

転移スポロゾイト免疫原の免疫優性ポリペプチドを実施
例４で詳述したように、！ｌ！ｌ製したウサギ抗血’ｈ
ｌを用いて位置を確認した。この血清を０．２５％ゼラ
チン−ＴＥＮ　（０，０５Ｍトリス、０．１４Ｍ　Ｎａ
ＣＱ、０．００５ＭＥ　Ｄ　ＴＡ　、　　０　、０５％
トリトンｘｌＯＯ）で１：ｌＯＯに稀釈した。洗浄した
後、セイヨウワサビのペルオキシダーゼに接合したヤギ
の抗ウサギＩｇＧを転移ポリペプチドを含有するニトロ
セルロース紙に添加した。ペルオキシダーゼ基質４クロ
ロ−１−ナフトールをニトロセルロース紙に適用し、ポ
リペプチド−抗体複合体の位置で目に見える反応生成物
を生成した。スポロゾイト抽出液の２０個のポリペプチ
ドが、この抗スポロゾイト血清と反応した。これらは、
１１５．８４．７４．６８．６５゜５９、４５．４１．
５．　３７．３４．３１．２９．２７．２６．５゜２６
、２４．２３．２２．５．２１．５および２０　ｋｄの
相対分子量を有する分子である。

岬化後３週のニワトリの 雌のブロイラー用ヒナ［フバードファームス（ｌｌｕｂ
ｂａｒｄ　Ｆａｒｍｓ）　］を実施例１で詳述したよう
に、ＰＧＳ混成免疫原の異種服用量で筋肉内で免疫にし
た。服用量は、上記ローリ−等の方法で定量したように
、蛋白質含有量に基づき、生後３週間で開始して１週ご
とに４回投与した。実験および対照ニワトリを最後の免
疫の１週間後３　Ｘ　１０’毒性Ｅ、アセルブリナ胞子
形成オーシストの経口接種で攻撃した。攻撃の６日後に
ニワトリを殺し、腸管の病変の程度を上記ジョンソンお
よびレイドの方法によって定量した。４が最も重い１〜
４の一定スケールで病変を評価した。糞のオーシスト数
を標準技術により塩浮遊によって誘導される物質の血球
計数によって定量した。

次の結果を得た。

１　　　１０　　　５　　　１．２　　６．０ＸｌＯＳ
２　　　２５　　　５　　　１．０　　８．０Ｘ１０’
３　　　５０　　　５　　　１．６　　２．７ｘ１０’
４　　　１００　　５　　　１．４　　　３．２Ｘ１０
＠５　　　２００　　５　　　３．２　　　１．０Ｘ１
０７６　　　　０　　　５　　　３．５　　　１３ｘ１
０７これらの結果は、ＰＧＳ混成免疫原、無生育性また
は無傷寄生体を含有するＥ、アセルブリナ胞子形成オー
シストからの抽出液を生後３週間のブロイラー用ヒナを
免疫にするために使用することができることを示す。筋
肉内接種は、通常のビルレント感染後、免疫、１類の重
い病変の展開がないことによって示されるように、疾病
に対して高レベルの防御を提供する。免疫は、また、ワ
クチン注射をした鳥類のオーシスト数の減少によって明
白である。

ス［８ 雌のブロイラー用ヒナ（フバードファームス）を実施例
１で詳述したように、ＰＧＳ混成免疫原の異種服用量で
免疫化した。用量は上記ローリ−等の方法によって定量
されるとおり蛋白質含有量に基づき、卿化後２，９゜１
６日に筋肉内に投与した。実験および対照ニワトリを最
後の免疫の１週間後に５ＸＩＯ’Ｅ、アセルブリナ胞子
形成オーシストの経口接種で攻撃した。攻撃の６日後に
ヒナを殺し腸管の病変の程度を上記ジョンソンおよびレ
イドの方法によって定量した。病変は実施例７で詳述し
たとおり評価した。次の結果を得た。

１　　　　　　　　１　　　　　　８　　　　　　　　
２．６２　　　　　　　１０　　　　　８　　　　　　
　　１３３　　　　　　　５０　　　　　８　　　　　
　　　１．８４　　　　　　　　０　　　　　５　　　
　　　　　３．４これらの結果は、無生育性または無傷
寄生体を含有するＰＧＳ、Ｅアセルブリナ胞子形成オー
シストからの抽出液を生後極めて早くに投与したときに
ニワトリを免疫にするために使用することができること
を示す。ＰＧＳ混成免疫原は、通常のビルレント感染後
、免疫、１類に展開する重い病変がないことによって示
されるように、疾病に対して高レベルの防御を提供する
。

卿化後２１／ｚｉ　のニワトリのヒナの経口　疫雌のブ
ロイラーのヒナ（フバードファームス）を実施例１で詳
述したように、ＰＧＳ混成免疫原の異種服用量で免疫に
した。用量は上記ローリ−等の方法によって定量される
通りの蛋白質含有量に基づき、週間隔で４回経口投与で
投与した。実験および対照ニワトリを最後の免疫の８日
後に３　Ｘ　１０’Ｅ、アセルブリナ感染胞子形成オー
シストの経口接種で攻撃した。攻撃の６日後にニワトリ
を殺し腸管の病変の程度を上記ジョンソンおよびレイド
の方法によって定量した。病変を実施例７で詳述したよ
うに評価した。次の結果を得た。

１　　　　１０　　　５　　　　　１．４２　　　　２
５　　　５　　　　　１．４３　　　　５０　　　５　
　　　　０．８４　　　１００　　　５　　　　　２．
０５　　　２００　　　５　　　　　２．４６　　　　
　０　　　５　　　　　３．０これらの結果は、ニワト
リが無生育性または無傷寄生体を含有するＰＧＳ、Ｅア
セルブリナ胞子形成オーシストの抽出液で経口経路の接
種によって免疫することができることを示す。その結果
生じる免疫は、通常のビルレント感染に伴う重い病変が
ないことによって示されるように、疾病に対して高レベ
ルの防御を提供する。

実施例　１０ 雌のブロイラーのヒナ（フバードファームス）を実施例
３で詳述したとおりスポロゾイト免疫原の異種服用量で
免疫にした。用量を上記ローリ−等の方法によって定量
されるとおりの蛋白質含有量に基づき、卿化後２，９゜
１６０目に筋肉内投与した。実験および対照ニワトリを
最後の免疫の６日後に５ＸＩＯ’感染Ｅ、アセルブリナ
胞子形成オーシストの経口接種で攻撃した。攻撃の６日
後、ニワトリを殺し、腸管の病変の程度を上記ジョンソ
ンおよびレイドの方法により定量した。病変を実施例７
で詳述したように評価した。次の結果を得た。

１　　　　０．０１　　８　　　　　３．３２　　　　
０．１　　　８　　　　　３．０３　　　　１．０　　
　８　　　　　２．０４　　　１０．０　　　８　　　
　　１．９５　　　　０　　　　８　　　　　３．３こ
れらの結果は、Ｅ、アセルブリナから抽出したスポロゾ
イト免疫原がＥ、アセルブリナ胞子形成オーシストでヒ
ナを感染に対して免疫にするために使用することができ
ることを示す。ニワトリは感染服用量での攻撃に伴う一
般の重い病変がないことによって示されるように、高レ
ベルの防御を示した。

ス１」［里 雌のブロイラーのヒナ（フバードファームス）を実施例
１で詳述したとおり、ＰＧＳ混成免疫原の異種服用量で
免疫にした。用量は上記ローリ−等の方法によって定量
されるように蛋白質含有量に基づき、菊化後２，９゜１
６日９に筋肉内経路で投与した。実験および対照のニワ
トリを最後の免疫の１週間後に５Ｘ１０’Ｅ、アセルブ
リナ、５Ｘ１０’Ｅ、テネラ、または２Ｘ１０′″Ｅ、
マキシマ胞子形成オーシス１−のいずれかの経口接種で
攻撃した。

６目抜ニワトリを殺し盲腸または腸の病変の程度を上記
ジョンソンおよびレイドの方法により定ｆ＆　ｔ、た。

病変を実施例７で詳述したとおり評価した。次の結果を
得た。

Ｅ、アセルブリナ　１．９　３．０　１．７　２．２　
３．４Ｅ、テネラ　　　　１．６　２．８　１．９　２
．６　３．５Ｅ、マキシマ　　　３．２　１．９　１．
８　３．３　３．７１　各グループ７羽のニワトリであ
る。

これらの結果は、まずアイメリアの１種の免疫原に対す
る免疫もまた他のアイメリア種での感染を防御すること
を決定的に示すことである。実際に、非免疫種に対する
防御レベルはニワトリをワクチン注射をするために使用
した種のレベルと同等であった。

在Ａ皮 雌のブロイラーのヒナ（フバードファームス）を実施例
２で詳述したとおり、スポロゾイト免疫原の異種服用量
で免疫にした。用量を上記ローリ−等の方法で定量した
とおりの蛋白質含有量に基づき、岬化後２，９．１６日
目に筋肉内経路で投与した。実験および対照ニワトリを
最後の免疫の１週間後、５　×１０’　Ｅ、アセルブリ
ナ、５Ｘ１０３　Ｅ、テネラあるいは２Ｘ］、Ｏ’Ｅ、
マキシマ胞子形成オーシストの経口接種で攻撃した９６
日目抜ットリを殺し盲腸または腸管の病変の程度を上記
ジョンソンおよびレイドの方法によって定量した。病変
を実施例７で詳述したとおり評価した。次の結果を得た
。

Ｅ、アセルブリナ　３．３　３．０　２．０　１．９　
３．３Ｅ、テネラ　　　　３．０　３．１　２．６　２
．０　３．２Ｅ、マキシマ　　　３．４　３．３　２．
８　２．１　３．３Ｊ　各グループ７羽のニワトリであ
る。

これらの結果は、無生育性のまたは無傷寄生体を含有す
るスポロゾイト免疫原、精ＷＥ。

アセルブリナスポロゾイトからの抽出液がＥ。

アセルブリナ、Ｅ、テネラおよびＥ、マキシマの感染オ
ーシストに対してニワトリを免疫にするために使用する
ことができることを示す。非免疫種に対する免疫レベル
は、ニワトリにワクチン接種するために使用した種のレ
ベルと同等であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アイメリア　アセルブリナの胞子形成オーシストを
   粉砕し、スポロシストと不溶性オーシストの破片を除去
   することを特徴とする鳥類種をアイメリア　アセルブリ
   ナ、Ｅ．テネラまたはＥ．マキシマによって引き起こさ
   れるコクシジウム症に対して免疫にするのに有効な免疫
   原混成物を得る方法。 ２、スポロシストとオーシストの破片が遠心分離によっ
   て除去される特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、Ｅ．アセルブリナのスポロシストのない摩砕胞子形
   成オーシストを包含している免疫原混成物。 ４、特許請求の範囲第１項記載の免疫原性混成物の抗コ
   クシジウム有効服用量を投与することを特徴とするニワ
   トリのＥ．アセルブリナ、Ｅ．テネラまたはＥ．マキシ
   マによって引き起こされるコクシジウム症に対する免疫
   方法。 ５、分子量３００、２１５、１４５、１１５、１００、
   ９４、８４、７４、６８、５９、５１、５０、４８、４
   ５、４４、４１．５、４０、３６、３４、３１、２９、
   ２７、２６、２５、２４、２２、２１．５、１９、１７
   、１５．５および１３Ｋｄを有するＥ．アセルブリナス
   ポロゾイトのペプチドを包含しているスポロゾイト免疫
   原。 ６、多クローン特異抗体を結合する分子量１１５、８４
   、７４、６８、６５、５９、４５、４１．５、３７、３
   ４、３１、２９、２７、２６．５、２６、２４、２３、
   ２２．５、２１．５および２０Ｋｄを有するＥ．アセル
   ブリナスポロゾイトのペプチドを包含しているスポロゾ
   イト免疫原。 ７、特許請求の範囲第５項記載のペプチドおよび生理学
   的に許容できる媒質を包含している組成物。 ８、特許請求の範囲第６項記載のペプチドおよび生理学
   的に許容できる媒質を包含している組成物。 ９、特許請求の範囲第５項記載のペプチドの抗コクシジ
   ウム有効服用量を投与することを特徴とするニワトリの
   Ｅ．アセルブリナ、Ｅ．テネラまたはＥ．マキシマによ
   って引き起こされるコクシジウム症に対する免疫方法。 １０、ペプチドが約１〜２００μｇの量で存在する特許
   請求の範囲第９項記載の方法。 １１、ペプチドが約５〜７５μｇの量で存在する特許請
   求の範囲第９項記載の方法。 １２、特許請求の範囲第６項記載のペプチド類の抗コク
   シジウム有効服用量を投与することを特徴とするニワト
   リのＥ．アセルブリナ、Ｅ．テネラまたはＥ．マキシマ
   によって引き起こされるコクシジウム症に対する免疫方
   法。 １３、ペプチドが約１〜２００μｇの量で存在する特許
   請求の範囲第１２項記載の方法。 １４、ペプチドが約５〜７５μｇの量で存在する特許請
   求の範囲第１２項記載の方法。 １５、鳥類種をＥ．アセルブリナ、Ｅ．テネラまたはＥ
   ．マキシマによって引き起こされるコクシジウム症に対
   して免疫にすることができる抽出液を生成するために、
   スポロゾイトを粉砕し、粒子物質を遠心分離によって除
   去することによって得られる免疫原性混成物。