JPS62115290A - 根圏内で有用な作用を呈する微生物への形質転換のためのベクタ−、転換された菌株および農業的利用 - Google Patents
根圏内で有用な作用を呈する微生物への形質転換のためのベクタ−、転換された菌株および農業的利用Info
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- JPS62115290A JPS62115290A JP61124753A JP12475386A JPS62115290A JP S62115290 A JPS62115290 A JP S62115290A JP 61124753 A JP61124753 A JP 61124753A JP 12475386 A JP12475386 A JP 12475386A JP S62115290 A JPS62115290 A JP S62115290A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
植物根を包囲する根圏またけ土壌は有益な影響を及ぼす
ものから有害なもの捷で植物との関係を生じる微生物に
富んでいる。
ものから有害なもの捷で植物との関係を生じる微生物に
富んでいる。
遺伝子工学による植物と根圏微生物間の生態的関係の調
節は特定の農業的改良をもたらすことができる。
節は特定の農業的改良をもたらすことができる。
微生物集団の組成は、土壌のタイプ、植物の種類、植物
の生理的状態などによって変化し、一部植物の地下部分
と根圏に棲息する生物間の代謝交換によって支配される
と考える。
の生理的状態などによって変化し、一部植物の地下部分
と根圏に棲息する生物間の代謝交換によって支配される
と考える。
これらの交換の中には特異的代謝伝達因子が包含されて
いる。
いる。
との代謝特異性説では根類がエネルギーに富んだ化合物
を排出し、それが多数の根圏微生物による異化作用に抵
抗すると考えられるが、しかし、またそれはその異化作
用に必要な情報を有する微生物の選択には特有のエネル
ギー源を生じることが発見されている。植物はかかる化
学伝達因子の排出を調節すると考えられ、このようにし
て根圏に住む微生物の数およびタイプを規制し、言わば
選択のための圧力をもたらす。事実、植物によって放出
される十分量のかかる物質は異化作用に必要な遺伝情報
を有する微生物に選択的な栄養源を提供する。
を排出し、それが多数の根圏微生物による異化作用に抵
抗すると考えられるが、しかし、またそれはその異化作
用に必要な情報を有する微生物の選択には特有のエネル
ギー源を生じることが発見されている。植物はかかる化
学伝達因子の排出を調節すると考えられ、このようにし
て根圏に住む微生物の数およびタイプを規制し、言わば
選択のための圧力をもたらす。事実、植物によって放出
される十分量のかかる物質は異化作用に必要な遺伝情報
を有する微生物に選択的な栄養源を提供する。
根圏において植物根によって排出され、豊富に産出され
るこれらのエネルギーに富んだ代謝伝達因子を以後１リ
ゾスフェリン“（ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｉｎｅ ）と総
称する。次の説明はさらに詳細にはカリステギアセビウ
ム （ＣａＬｙｓｔｅｇｉａ ｓｅｐｉｕｍ ）の根圏に観
察されている２種の特定のリゾスフェリン即ちカリステ
ギン（ｃａｌｙｓｔｅｇｉｎｅ ） １および２の記載
に関するものであるが、リゾスフェリンの他のタイプが
他の植物の根圏で同等の方法で見い出されているととは
明白に理解される。
るこれらのエネルギーに富んだ代謝伝達因子を以後１リ
ゾスフェリン“（ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｉｎｅ ）と総
称する。次の説明はさらに詳細にはカリステギアセビウ
ム （ＣａＬｙｓｔｅｇｉａ ｓｅｐｉｕｍ ）の根圏に観
察されている２種の特定のリゾスフェリン即ちカリステ
ギン（ｃａｌｙｓｔｅｇｉｎｅ ） １および２の記載
に関するものであるが、リゾスフェリンの他のタイプが
他の植物の根圏で同等の方法で見い出されているととは
明白に理解される。
これらのエネルギーに富んだ伝達因子の異化作用能が一
般に遺伝子工学の分野で使用される技術によって特定の
予め同定された微生物に伝達することができるプラスミ
ドによって保持されていることを理解する場合この証明
の重要性が認められる。
般に遺伝子工学の分野で使用される技術によって特定の
予め同定された微生物に伝達することができるプラスミ
ドによって保持されていることを理解する場合この証明
の重要性が認められる。
従って、本発明は根圏微生物を、特に有用な根圏作用を
有する微生物に形質転換するためのベクターに関するも
のであシ、該形質転換微生物は、特定のリゾスフェリン
の異化作用能が付与されるものである。
有する微生物に形質転換するためのベクターに関するも
のであシ、該形質転換微生物は、特定のリゾスフェリン
の異化作用能が付与されるものである。
リゾスフェリンの異化作用をコードする遺伝子および当
該形質転換ベクターに挿入される遺伝子は勿論該リゾス
フェリンを異化する菌株から採取される。
該形質転換ベクターに挿入される遺伝子は勿論該リゾス
フェリンを異化する菌株から採取される。
一般に異化作用をコードする遺伝子は該菌株のプラスミ
ドから生じると考えられる。
ドから生じると考えられる。
従って特に次の実施例で詳細に記載されるカリステギン
について、どれらのカリステギンの異化作用能がリゾビ
ウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ）ノ菌株、特にリゾビウム
メリロチ（Ｒｈｉｚｎｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ ）
４１菌株のプラスミドによるという事実を示すととが
可能であった。該プラスミドは、以後ｐＲｍｅ ４１
ａと呼ぶことにする。
について、どれらのカリステギンの異化作用能がリゾビ
ウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ）ノ菌株、特にリゾビウム
メリロチ（Ｒｈｉｚｎｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ ）
４１菌株のプラスミドによるという事実を示すととが
可能であった。該プラスミドは、以後ｐＲｍｅ ４１
ａと呼ぶことにする。
他のリゾスフェリン並びに異化作用をもたらすプラスミ
ドまたは遺伝子フラグメントを使用するととができるこ
とは明白に理解される。
ドまたは遺伝子フラグメントを使用するととができるこ
とは明白に理解される。
本発明によるベクターはリゾスフェリンの異化作用をコ
ードする遺伝子のほかに形質転換するだめの微生物を形
質転換させ且つ該微生物の該遺伝子の発現を確立する因
子を含有する。
ードする遺伝子のほかに形質転換するだめの微生物を形
質転換させ且つ該微生物の該遺伝子の発現を確立する因
子を含有する。
具体的には遺伝マーカーの全部または一部、例えば必要
な場合トランスポゾンＴｎ５のようなトランスポゾンの
全部または一部をベクターに導入することが適当である
。有利な根圏作用を有する異なったタイプの微生物を形
質転換のために使用することもできるため広い宿主スペ
クトルを有するベクターを使用することも必要である。
な場合トランスポゾンＴｎ５のようなトランスポゾンの
全部または一部をベクターに導入することが適当である
。有利な根圏作用を有する異なったタイプの微生物を形
質転換のために使用することもできるため広い宿主スペ
クトルを有するベクターを使用することも必要である。
これらのベクトルのほかに、本発明はまたこれらのベク
ターによって形質転換された菌株にも関するものであり
、そのだめの形質転換技術についてはその菌株にベクタ
ーを挿入しそのベクターを活性に保つことができるもの
である限り技術の種類を問わない。
ターによって形質転換された菌株にも関するものであり
、そのだめの形質転換技術についてはその菌株にベクタ
ーを挿入しそのベクターを活性に保つことができるもの
である限り技術の種類を問わない。
具体例として形質転換される微生物は、アゾスビリリウ
ム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ） アグロバクテリ
ウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）およびリゾビウ
ム属から選択される。
ム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ） アグロバクテリ
ウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）およびリゾビウ
ム属から選択される。
特にリゾリウムメリロチまたはアグロバクテリウムツメ
ファシェンス（Ａｇｒｏｂａｅｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｕｓ ）菌株の形質転換に関するものである。
ファシェンス（Ａｇｒｏｂａｅｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｕｓ ）菌株の形質転換に関するものである。
このように形質転換される根圏微生物の菌株は、さらに
詳しくは農業分野で使用される有利な根圏作用を有する
素材として使用することができる。特にとｎらの形質転
換菌株は特定の場合、いくらかの植物の根圏へ人工導入
を試み且つ原注菌株と競合できない菌株に見い出される
競合の問題点を取り除くことができる。
詳しくは農業分野で使用される有利な根圏作用を有する
素材として使用することができる。特にとｎらの形質転
換菌株は特定の場合、いくらかの植物の根圏へ人工導入
を試み且つ原注菌株と競合できない菌株に見い出される
競合の問題点を取り除くことができる。
結果として植物根の付近に存在するリゾスフェリンを同
化することができる形質転換微生物の菌株はさらに簡単
に抵抗することができ、且つさらに競合的であることが
できるはずである。
化することができる形質転換微生物の菌株はさらに簡単
に抵抗することができ、且つさらに競合的であることが
できるはずである。
また本発明はリゾスフェリンを異化する遺伝子の用途か
らなる微生物の形質転換方法並びに該方法の手段として
の該遺伝子に関するものである。
らなる微生物の形質転換方法並びに該方法の手段として
の該遺伝子に関するものである。
本発明の他の特徴および利点は以下に示す図面と共に次
の実施例を読む際に明白となる。
の実施例を読む際に明白となる。
＊第１図Ｃ左）正常な鉢植えのＣ％セビウム植物の根、
根茎及び葉から抽出されだカリステギン１及び２ 一ライン１−正常な鉢植え植物の根５■Ｃ生重量） 一ライン２＝根茎５ｍ１（生重量） −ライン３＝葉５〜Ｃ生重量） ＊第１図（右）試験管内で生育した形質転換機から抽出
したまたは２１日間培養した培地で集積したカリステギ
ン１および２ −ライン４＝形質転換根ｓ＃ｖを示す抽出液−ライン５
＝２１日間培養に使用した培地−ライン６−使用した培
地の濃縮液６２μｌ−ライン７＝培地の濃縮液１２５μ
ｌ −ライン８一対照の移動度（腫瘍Ａ６６クローン５ｒｎ
ｇを示す抽出液）（１） （開始＝試料適用点、ｍａｎ”マンノビン、ａｇ−アグ
ロビン、ｃａｌ＝カリステギン１および２） カリステギン抽出液を試験管内で生育した正常な植物の
根に検出することができ、しかし、培養で形質転換した
根より少量である。
根茎及び葉から抽出されだカリステギン１及び２ 一ライン１−正常な鉢植え植物の根５■Ｃ生重量） 一ライン２＝根茎５ｍ１（生重量） −ライン３＝葉５〜Ｃ生重量） ＊第１図（右）試験管内で生育した形質転換機から抽出
したまたは２１日間培養した培地で集積したカリステギ
ン１および２ −ライン４＝形質転換根ｓ＃ｖを示す抽出液−ライン５
＝２１日間培養に使用した培地−ライン６−使用した培
地の濃縮液６２μｌ−ライン７＝培地の濃縮液１２５μ
ｌ −ライン８一対照の移動度（腫瘍Ａ６６クローン５ｒｎ
ｇを示す抽出液）（１） （開始＝試料適用点、ｍａｎ”マンノビン、ａｇ−アグ
ロビン、ｃａｌ＝カリステギン１および２） カリステギン抽出液を試験管内で生育した正常な植物の
根に検出することができ、しかし、培養で形質転換した
根より少量である。
＊第２図、カリステギンに関連する根圏細菌の異化特異
性。実施例によって結果をここで示す。
性。実施例によって結果をここで示す。
ライン１−腫瘍Ａ６６クローンの標準抽出液ライン２−
細菌が存在しないコントロールライン３＝Ａ、リゾゲネ
ス（ｒｈｉｚｎｈｅｎａｓ ） Ａ４ライン４−Ａ、リ
ゾゲネス８１９６ ライン５＝Ａ、ツメファシェンスＣ５８ライン６−Ａ、
ツメファシェンスＢｏ ５４２ライン７＝Ａ、ツメファ
シェンスＣ５８Ｃｌライン８＝Ａ、ツメファシェンスＢ
６−８０６ライン９−Ａ、ツメファシェンスＴ３７ライ
ン１０＝Ｒ，メリロチし５３０ ライン１１＝Ｒ，メリロチ４１ （開始＝試料適用点、ｍａｎ−マンノビン、ａｇ−アグ
ロビン、Ｃａ１−カリステギン１および２） 全ての検出可能なカリステギンの培地を透明にするＲ、
メリロチ菌株４１（ライン１１）を除いてはとこで示さ
れていてもいなくても試験した菌株の全てはカリステギ
ン異化作用に関して陰性であった。保温後との培養の溶
解したＲ、メリロチ４１の抽出液はカリステギンを含有
せず、同化ばかりでなく分解も起こっていることを示す
。予期された通りＡ。
細菌が存在しないコントロールライン３＝Ａ、リゾゲネ
ス（ｒｈｉｚｎｈｅｎａｓ ） Ａ４ライン４−Ａ、リ
ゾゲネス８１９６ ライン５＝Ａ、ツメファシェンスＣ５８ライン６−Ａ、
ツメファシェンスＢｏ ５４２ライン７＝Ａ、ツメファ
シェンスＣ５８Ｃｌライン８＝Ａ、ツメファシェンスＢ
６−８０６ライン９−Ａ、ツメファシェンスＴ３７ライ
ン１０＝Ｒ，メリロチし５３０ ライン１１＝Ｒ，メリロチ４１ （開始＝試料適用点、ｍａｎ−マンノビン、ａｇ−アグ
ロビン、Ｃａ１−カリステギン１および２） 全ての検出可能なカリステギンの培地を透明にするＲ、
メリロチ菌株４１（ライン１１）を除いてはとこで示さ
れていてもいなくても試験した菌株の全てはカリステギ
ン異化作用に関して陰性であった。保温後との培養の溶
解したＲ、メリロチ４１の抽出液はカリステギンを含有
せず、同化ばかりでなく分解も起こっていることを示す
。予期された通りＡ。
リゾゲネス菌株Ａ４および８１９６およびＡ。
ツメファシェンス菌株Ｂｏ ５４２およヒＢ６−８０６
はマンノビン異化作用に関して陽性である。予期しない
ことにＲ，メリロチの菌株ｖ７およびＬ５３０はマンノ
ビンを異化した。
はマンノビン異化作用に関して陽性である。予期しない
ことにＲ，メリロチの菌株ｖ７およびＬ５３０はマンノ
ビンを異化した。
＊第３図（上部）表現型ＣａＣ＋がｐＲｍｅ ４１ａの
存在に関係があることを示すために使用される菌株のプ
ラスミドプロフィル ライン１ ＝ ｐＲｍｅ ４１ａ 並びにメガプラスミ
ドを保持するＲ、ノリロチ４１野生 型 ライン２ ＝ ＧＭＩ １３ ； ｐＲｍｅ ４１ａ
がない菌株４１の誘導体 ライン３ ＝ ＧＭＩ １７ ； ｐＲｍｅ ４１０
を可動化するために使用されるＲＰ４誘導体 である９０ＭＩ４１４２を含有する菌 株４１ （ｐＲｍｅ４１ａ ： ： Ｔｎ５ ）ライン
４＝Ｃ’５８α；プラスミドＴｉがないが、潜在プラス
ミドであるｐＡｔ Ｃ５８をなお含有するＡ、ツメファ シェンス ライン５ ＝ ＧＭＩ ９０１９ ； ９０ＭＩ４１４
２およびｐＲｍｅ ４ ： ： Ｔｎ５が導入されてい
るＣ５８のでその結果ｐＡＴＣ’５８の喪失したもの ＊第３図（下部） ＣａＣ機能がｐＲｍｅ４１ａ に
コードされることを示す正常な植物の根茎から抽出され
たカリステギンを使用する異化作用試験。上記の門（植
物の）と同一菌株は第２図に対応する方法を参照する。
存在に関係があることを示すために使用される菌株のプ
ラスミドプロフィル ライン１ ＝ ｐＲｍｅ ４１ａ 並びにメガプラスミ
ドを保持するＲ、ノリロチ４１野生 型 ライン２ ＝ ＧＭＩ １３ ； ｐＲｍｅ ４１ａ
がない菌株４１の誘導体 ライン３ ＝ ＧＭＩ １７ ； ｐＲｍｅ ４１０
を可動化するために使用されるＲＰ４誘導体 である９０ＭＩ４１４２を含有する菌 株４１ （ｐＲｍｅ４１ａ ： ： Ｔｎ５ ）ライン
４＝Ｃ’５８α；プラスミドＴｉがないが、潜在プラス
ミドであるｐＡｔ Ｃ５８をなお含有するＡ、ツメファ シェンス ライン５ ＝ ＧＭＩ ９０１９ ； ９０ＭＩ４１４
２およびｐＲｍｅ ４ ： ： Ｔｎ５が導入されてい
るＣ５８のでその結果ｐＡＴＣ’５８の喪失したもの ＊第３図（下部） ＣａＣ機能がｐＲｍｅ４１ａ に
コードされることを示す正常な植物の根茎から抽出され
たカリステギンを使用する異化作用試験。上記の門（植
物の）と同一菌株は第２図に対応する方法を参照する。
転換された根からのカリステギンを使用する異化作用試
験は同様の結果を示す（例えばｐＲｍｅ４１ａを含有す
る菌株だけがＣａｃ＋ である）。
験は同様の結果を示す（例えばｐＲｍｅ４１ａを含有す
る菌株だけがＣａｃ＋ である）。
（開始＝試料適用点Ｃａｔ−カリステギン１および２）
＊第４図カリステギン依存増殖
野生型のＲ，メリロチおよびｐＲｍｅ４１ａのない同−
菌（菌株ＧＭ１１３）は単に炭素および窒素源としてカ
リステギン１および２を有する８Ｍ培地で増殖した。増
殖は０Ｄ６５０で監視し、カリステギンの分解は培養３
日後高圧Ｆ紙電気泳動および上澄み液の銀染色によって
試験する（第２図に対応する方法を参照）。
菌（菌株ＧＭ１１３）は単に炭素および窒素源としてカ
リステギン１および２を有する８Ｍ培地で増殖した。増
殖は０Ｄ６５０で監視し、カリステギンの分解は培養３
日後高圧Ｆ紙電気泳動および上澄み液の銀染色によって
試験する（第２図に対応する方法を参照）。
増殖のヒストグラムをエレクトロフオレトグＣｌ２）
ラムに載せる。
オープンバー＝ ｐＲｍｅ４１ａのないＲ，メリロチ（
ＧＭ１１３菌株） クローズドバー＝ ｐＲｍｅ４１ａを含有する野生型菌
株４１ カリステギン１および２を第２図に記載される通り一部
精製し、次にトリスアクリルＧ５Ｏ５でゲル濾過および
高圧Ｆ紙電気泳動を用いてさらに精製する。
ＧＭ１１３菌株） クローズドバー＝ ｐＲｍｅ４１ａを含有する野生型菌
株４１ カリステギン１および２を第２図に記載される通り一部
精製し、次にトリスアクリルＧ５Ｏ５でゲル濾過および
高圧Ｆ紙電気泳動を用いてさらに精製する。
（出発＝試料適用、Ｃａｌ ＝カリステギン１および２
） ＊第５図ヒント■制限部位地図 ２−表現型Ｃａｃ−を有するＴｎ５挿入部＊第６図ｐＲ
ｍｅ４１ フラグメントの効能によるカリステギンの
異化作用性を付与する特性を有するＲＰ４から誘導され
た広範囲宿主スペクトルを有するプラスミドの地図 方法 １）抽出、高圧電気泳動および銀染色（第１図）植物組
織を０．Ｉ Ｎ −）Ｔα中で均質にする（組織１μｔ
／μｇ）。
） ＊第５図ヒント■制限部位地図 ２−表現型Ｃａｃ−を有するＴｎ５挿入部＊第６図ｐＲ
ｍｅ４１ フラグメントの効能によるカリステギンの
異化作用性を付与する特性を有するＲＰ４から誘導され
た広範囲宿主スペクトルを有するプラスミドの地図 方法 １）抽出、高圧電気泳動および銀染色（第１図）植物組
織を０．Ｉ Ｎ −）Ｔα中で均質にする（組織１μｔ
／μｇ）。
最低１０ｍｇを必要とする。
ホモジネートを沸騰水浴中で３分間加熱し、工ペンドル
フ微量遠心機中で５分間遠心分離によって清澄化する。
フ微量遠心機中で５分間遠心分離によって清澄化する。
」二澄み液の５μｌ試料を３ＭＭホワットマシ紙にスポ
ットし、ギ酸：酢酸：水（３０：６（１：９１０）ｒ）
ｌＩ＝１．９からなる緩衝液中で＠３，０００ボルトに
１５分間かける。
ットし、ギ酸：酢酸：水（３０：６（１：９１０）ｒ）
ｌＩ＝１．９からなる緩衝液中で＠３，０００ボルトに
１５分間かける。
このエレクトロフオレトグラムを乾燥後まずＡｇＮ０．
溶液（４ｒを水２０−に溶解し。
溶液（４ｒを水２０−に溶解し。
アセトンで１０００−に希釈したもの）に浸漬するとと
によって硝酸銀で染色し、次に乾燥して、水１００ｍＡ
’中ＮａＯＨ５ｔを溶解し、９５ ％ ＥｔＯＨで１０
０ｒｎ！、に希釈することによって調製した第二溶液中
で顕色する。
によって硝酸銀で染色し、次に乾燥して、水１００ｍＡ
’中ＮａＯＨ５ｔを溶解し、９５ ％ ＥｔＯＨで１０
０ｒｎ！、に希釈することによって調製した第二溶液中
で顕色する。
二度目の乾燥の後エレクトロフオレトグラムを写真のペ
ーパ一定着液に定着し洗浄する。
ーパ一定着液に定着し洗浄する。
アグロピンおよびマンノビンスタンダードをＡ、ツメフ
ァシェンス菌株Ａ ６６ （１）によって転換されるタ
バコ腫瘍系を用いる同様の方法で抽出する。
ァシェンス菌株Ａ ６６ （１）によって転換されるタ
バコ腫瘍系を用いる同様の方法で抽出する。
溶出液をダウエックス５０で処理し、溶出液の電気泳動
分析はアミノ酸分別で同時精製しだカリステギン１およ
び２を示す。この留分を蒸発乾固し、水に溶解し、沢過
によって滅菌し、対数期の増殖中のＡ、ツメファシェン
スの培養に添加する。４０時間後アリコートをとってカ
リステギンの存在を高圧Ｆ紙電気泳動さらに硝酸銀でお
よびニンヒドリンで染色することによって試験する。菌
株Ｔ３７はカリステギン１および２さらにマンノピンを
除いてニンヒドリンで検出できる陽性の化合物が々い。
分析はアミノ酸分別で同時精製しだカリステギン１およ
び２を示す。この留分を蒸発乾固し、水に溶解し、沢過
によって滅菌し、対数期の増殖中のＡ、ツメファシェン
スの培養に添加する。４０時間後アリコートをとってカ
リステギンの存在を高圧Ｆ紙電気泳動さらに硝酸銀でお
よびニンヒドリンで染色することによって試験する。菌
株Ｔ３７はカリステギン１および２さらにマンノピンを
除いてニンヒドリンで検出できる陽性の化合物が々い。
乙の生物学的精製後中性糖はほとんどまたは全く残存し
ない。遠心分離および濾過によって細菌を除去した後、
根および根茎を再びダウエックス５０で処理して塩を培
地から除去し、それらの純度を電気泳動および染色によ
って確認する。
ない。遠心分離および濾過によって細菌を除去した後、
根および根茎を再びダウエックス５０で処理して塩を培
地から除去し、それらの純度を電気泳動および染色によ
って確認する。
３）異化作用試験（第２図）
反応混合物２００μｌはカリステギン１および２約２０
μｍ、マンノビン約２０μ２、鉱酸塩の８Ｍ培地および
開始濃度０．５０Ｄ ６５０の細菌を含有する転換根（
ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｒｏｏｔ ）の濃縮抽出液を包
含する。２８°で４０時間後、細菌を遠心分離で除去し
、上澄み液を蒸発乾固する。それを水２０μｔ に再溶
解し、この溶液の５μｔアリコートをカリステギン分解
の試験として高圧沖紙電気泳動にかけて次に銀染色する
。（第１図に対応する方法参照）。３４菌株の細菌を試
験する。
μｍ、マンノビン約２０μ２、鉱酸塩の８Ｍ培地および
開始濃度０．５０Ｄ ６５０の細菌を含有する転換根（
ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｒｏｏｔ ）の濃縮抽出液を包
含する。２８°で４０時間後、細菌を遠心分離で除去し
、上澄み液を蒸発乾固する。それを水２０μｔ に再溶
解し、この溶液の５μｔアリコートをカリステギン分解
の試験として高圧沖紙電気泳動にかけて次に銀染色する
。（第１図に対応する方法参照）。３４菌株の細菌を試
験する。
アグロバクテリウムリゾゲネス
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅａ
） Ａ ４ ８１９６菌株、アグロバクテリウムツメ
ファシェンス（Ａｌ（ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｕｓ ） Ｃ５８。
） Ａ ４ ８１９６菌株、アグロバクテリウムツメ
ファシェンス（Ａｌ（ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｕｓ ） Ｃ５８。
Ｃ５８Ｃ１，Ｔａ２．Ｂ６−８０６．Ｂｏ−５４２菌株
（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ ）リゾビウ
ムメリロチ１４５．Ｓ２６．１３２２．１０２Ｆ５１゜
Ｖ７．ＣＣ１６９，２０１１，４１、リゾビウムレグミ
ノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒ
ｕｍ ） ２４８ 、 Ｐ Ｘ ３１ 、 ＲＢＬＩ菌
株、リゾビウムトリフオリイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｔｒ
ｉｆｏｌｉｉ ）ＲＣＲＤ４０２．ＲＣＲＯ４０３，３
２菌株、リゾビウムファセオリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｐ
ｈａｓｅｏｌｉ ） ８００２菌株、アゾスピリリウム
リポフエルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆ
ｅｒｕｍ ）（２種の命名されない可動性および非可動
性菌株） Ｂｒ １７菌株、アゾスピリリウムブラシレ
ンス（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓ
ｅ ） ＣＤ Ｉ 。
（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ ）リゾビウ
ムメリロチ１４５．Ｓ２６．１３２２．１０２Ｆ５１゜
Ｖ７．ＣＣ１６９，２０１１，４１、リゾビウムレグミ
ノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒ
ｕｍ ） ２４８ 、 Ｐ Ｘ ３１ 、 ＲＢＬＩ菌
株、リゾビウムトリフオリイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｔｒ
ｉｆｏｌｉｉ ）ＲＣＲＤ４０２．ＲＣＲＯ４０３，３
２菌株、リゾビウムファセオリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｐ
ｈａｓｅｏｌｉ ） ８００２菌株、アゾスピリリウム
リポフエルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆ
ｅｒｕｍ ）（２種の命名されない可動性および非可動
性菌株） Ｂｒ １７菌株、アゾスピリリウムブラシレ
ンス（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓ
ｅ ） ＣＤ Ｉ 。
Ｒ，０７、Ｓｐ７ 、に６７ 、ＫＲ７７菌株、クレブ
シェラオキシト力（Ｋｌｅｂｇｉｅｌｌａｅｘｙｔｏｃ
ａ ） 、シュードモナスパウシモビリス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ −） 、ベ
イジエリンクキア（Ｂｅ１ｊｅｒｉｎｃｋｉａ ） ｉ
ｐ （菌株Ｖ］、エンテロバクタ−クロアカニ（Ｅｎｔ
ｅｒｏｂａｓｔｅｒｃｌｏａｃａｅ ） （菌株Ｃ） ４）細菌遺伝（第３図） ｐＲｍｅ４１ａ、＋をトランスポゾンＴｎ５で標識し、
カナマイシンＣ１４）に耐性ｒＫｍｒ）を付与する。得
られたプラスミドｐＲｍｅ４１ ａ ： ： Ｔｎ５（
ｐＧＭＩ ５９と呼ぶ）をＲＰ４（１５）中試験管内で
クローン化したｐＲｍｅ４１ａフラグメントからなる原
プラスミド（ｐｒｉｍｅ ｐｌａｓｍｉｄ ）ＲＰ４
＋ｐＧＭＩ ４１４２ ヲ用いてＡ、ツメファシェンス
（Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ） Ｃ５８Ｃ１中で可
動化する。この原ＲＰ４を’ｐＧＭＩ ５９を含有する
Ｒ。
シェラオキシト力（Ｋｌｅｂｇｉｅｌｌａｅｘｙｔｏｃ
ａ ） 、シュードモナスパウシモビリス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ −） 、ベ
イジエリンクキア（Ｂｅ１ｊｅｒｉｎｃｋｉａ ） ｉ
ｐ （菌株Ｖ］、エンテロバクタ−クロアカニ（Ｅｎｔ
ｅｒｏｂａｓｔｅｒｃｌｏａｃａｅ ） （菌株Ｃ） ４）細菌遺伝（第３図） ｐＲｍｅ４１ａ、＋をトランスポゾンＴｎ５で標識し、
カナマイシンＣ１４）に耐性ｒＫｍｒ）を付与する。得
られたプラスミドｐＲｍｅ４１ ａ ： ： Ｔｎ５（
ｐＧＭＩ ５９と呼ぶ）をＲＰ４（１５）中試験管内で
クローン化したｐＲｍｅ４１ａフラグメントからなる原
プラスミド（ｐｒｉｍｅ ｐｌａｓｍｉｄ ）ＲＰ４
＋ｐＧＭＩ ４１４２ ヲ用いてＡ、ツメファシェンス
（Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ） Ｃ５８Ｃ１中で可
動化する。この原ＲＰ４を’ｐＧＭＩ ５９を含有する
Ｒ。
メリロチ４１に導入する。得られた菌株を供与体として
、Ａ、ツメファシェンスＣ５８Ｃ１のＲｉｆｒＳ＋７１
ｒ誘導体を受容菌として使用する。
、Ａ、ツメファシェンスＣ５８Ｃ１のＲｉｆｒＳ＋７１
ｒ誘導体を受容菌として使用する。
接合体をＫｍ （３０μｒ／ｍｅ）の存在下で選択し、
供与体をＲｉｆ （１００ｔｄ／ｍｌ ）およびＳｍ
（１００μｌ７ｍｅ）の存在下算定によって選択する。
供与体をＲｉｆ （１００ｔｄ／ｍｌ ）およびＳｍ
（１００μｌ７ｍｅ）の存在下算定によって選択する。
実施例１
最初に１００種の植物（２３科を示す）を根および葉に
見い出される二次エネルギー代謝産物として選択し、植
物の粗抽出液を用いてペーパー電気泳動にかけ・次に硝
酸銀染色を行ない糖含有化合物（２）を可視化させた。
見い出される二次エネルギー代謝産物として選択し、植
物の粗抽出液を用いてペーパー電気泳動にかけ・次に硝
酸銀染色を行ない糖含有化合物（２）を可視化させた。
陽性に荷電した２物質をカリステギアセビウム（Ｃａｌ
ｙｌｌｔｅｇｉａ ｓｅｐｉｕｍ ） （モーニンググ
ロリー） （Ｍｏｒｎｉｎｇ Ｇｌｏｒｙ ）の根およ
び根茎で観察した。これらの物質は葉および茎ではまれ
にしかしかも低濃度でし７５）見い出されないＣ第１同
左）。
ｙｌｌｔｅｇｉａ ｓｅｐｉｕｍ ） （モーニンググ
ロリー） （Ｍｏｒｎｉｎｇ Ｇｌｏｒｙ ）の根およ
び根茎で観察した。これらの物質は葉および茎ではまれ
にしかしかも低濃度でし７５）見い出されないＣ第１同
左）。
これらの物質の分泌を無菌条件下で生育した植物の根を
用いて観察した。
用いて観察した。
どれらの２物質を１カリステギン１および２“と呼ぶ。
カリステギン２は実験式 □Ｃ７Ｈ１，Ｎｏ、を
有する。
有する。
同様の特性を有する他の化合物はコンポルブラスアーベ
ンシス（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｕｓ ａｒｖｅｎｓｉｓ
）（３）、アトロパベラドンナ（Ａｔｒｏｐｅ ｂｅｌ
ｌａｄｏｎｎａ ）およびベタブルガリス（Ｂｅｔａ
ｖｕｌｇａｒｉｓ ）の葉および根に見い出された。
ンシス（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｕｓ ａｒｖｅｎｓｉｓ
）（３）、アトロパベラドンナ（Ａｔｒｏｐｅ ｂｅｌ
ｌａｄｏｎｎａ ）およびベタブルガリス（Ｂｅｔａ
ｖｕｌｇａｒｉｓ ）の葉および根に見い出された。
カリステギンの検出方法はアグロビンおよびマンノビン
（アグロバクテリウムツメファシェンスによって誘発さ
れた植物腫瘍で最初に発見された物質）に使用した方法
と同様であり（１）、アグロビンおよびマンノビンを記
載するために最初に使用したタバコの腫瘍系の抽出液を
カリステギン含有量の決定の外的標準として使用した。
（アグロバクテリウムツメファシェンスによって誘発さ
れた植物腫瘍で最初に発見された物質）に使用した方法
と同様であり（１）、アグロビンおよびマンノビンを記
載するために最初に使用したタバコの腫瘍系の抽出液を
カリステギン含有量の決定の外的標準として使用した。
アグロピンとカリステギンの生重量での比較はこれらの
二つの物質が同様の濃度で存在するととを示す。腫瘍系
のアグロピンは乾燥重量約７係を示すと見られた（４）
。
二つの物質が同様の濃度で存在するととを示す。腫瘍系
のアグロピンは乾燥重量約７係を示すと見られた（４）
。
カリステギンの合成は植物による主同化感作を示すこと
が終結である。
が終結である。
Ｃ，セビウムの根の器官培養は連続した均一な多量のカ
リステギン源を得るために及び分泌される場合の定量の
ために用意される。
リステギン源を得るために及び分泌される場合の定量の
ために用意される。
平凡な結果が示される試験管内だけで発芽した種子から
切除した根を培養する試みとして、Ｃ，セピウムの茎に
外来根の生成を誘発させるために菌株のプラスミドＤＮ
Ａの一部を植物ゲノムへ挿入することからなるアグロバ
クテリウムリゾゲネス８１９６菌株による遺伝形質転換
を使用する。
切除した根を培養する試みとして、Ｃ，セピウムの茎に
外来根の生成を誘発させるために菌株のプラスミドＤＮ
Ａの一部を植物ゲノムへ挿入することからなるアグロバ
クテリウムリゾゲネス８１９６菌株による遺伝形質転換
を使用する。
これらの根は培養での急速な増殖の可能性を根に付与す
るＲｉプラスミドＣ根を誘発する）の一部（Ｔ −ＤＮ
Ａ ）を含有する（５．６゜７）。
るＲｉプラスミドＣ根を誘発する）の一部（Ｔ −ＤＮ
Ａ ）を含有する（５．６゜７）。
従ってＣ，セビウム根の連続培養は減退した根尖優性（
頻繁な分枝）を示し、先端での伸長速度１〜２釧７日が
生じる。
頻繁な分枝）を示し、先端での伸長速度１〜２釧７日が
生じる。
液体培地に約ＩＫ９量が生成した。
試験管内で生育する正営々植物の場合のようにペトリ皿
中培養培地にカリステギン１および２の多量の分泌が観
察された（第１同右）。
中培養培地にカリステギン１および２の多量の分泌が観
察された（第１同右）。
培養３週間後には培地のカリステギンを検出するために
は５μｌで十分であり、生重量に基づ〈培地中の濃度は
さらに低いが、同じ培養の根の範囲内とほぼ同じ量であ
る。従って根によって産生じたカリステギン１および２
の大部分が培地に分泌される。
は５μｌで十分であり、生重量に基づ〈培地中の濃度は
さらに低いが、同じ培養の根の範囲内とほぼ同じ量であ
る。従って根によって産生じたカリステギン１および２
の大部分が培地に分泌される。
Ｃ・セピウムの形質転換板はマンノビン。
Ｒｉ −Ｔ −ＤＮＡを含有する根の特徴物質を産生ず
る（５．８）。
る（５．８）。
マンノビン異化作用はＡ、ツメファシェンスおよびＡ、
リソゲネスの特定の菌株に特異的である。
リソゲネスの特定の菌株に特異的である。
マンノビンをカリステギン１および２と同時精製し、カ
リステギンを異化することができる土壌細菌の探索に用
いられる異化作用試験で内部標準としく使用した。
リステギンを異化することができる土壌細菌の探索に用
いられる異化作用試験で内部標準としく使用した。
異化作用試験の前に形質転換板の抽出液（カリステギン
と多少のマンノビンを含有する）またけ正常な植物から
切除した根茎の抽出液（カリステギンだけを含有する）
を部分的に精製した。それらは中性糖の不純物をほとん
どまたは全く含有しない。
と多少のマンノビンを含有する）またけ正常な植物から
切除した根茎の抽出液（カリステギンだけを含有する）
を部分的に精製した。それらは中性糖の不純物をほとん
どまたは全く含有しない。
実施例２
アゾスピリルム、アグロバクテリウムおよびリゾビウム
属の菌株をこれらの細菌が遺伝的および生態学的観点か
ら詳細に記載されていることがらカリステギンを分解す
ることができる土壌細菌の探索に選択した（９．１０％
１１ ）。
属の菌株をこれらの細菌が遺伝的および生態学的観点か
ら詳細に記載されていることがらカリステギンを分解す
ることができる土壌細菌の探索に選択した（９．１０％
１１ ）。
合計３４菌株を試験した。
マンノビン異化作用はオクトビン型Ｔｉ プラスミド
を有するＡ、ツメファシェンスおよびＡ、リゾゲネス菌
株に陽性であり、異化作用試験の信頼性を確認するツバ
リン型のＴｉプラスミドを有する菌株に陰性であった。
を有するＡ、ツメファシェンスおよびＡ、リゾゲネス菌
株に陽性であり、異化作用試験の信頼性を確認するツバ
リン型のＴｉプラスミドを有する菌株に陰性であった。
カリステギン１および２の異化作用は研究された菌株の
１種、リゾビウムメリロチ４１のみに陽性であった。
１種、リゾビウムメリロチ４１のみに陽性であった。
この異化作用表現型をＣａｃ” （＝カリステギン異化
作用）と表わす。
作用）と表わす。
Ｒ，ノリロチ４１菌株では３種のプラスミド、 ｐＲｍ
ｅ４１ａと命名された２ １５ ｋｂの潜在プラスミド
および７００ ｋｂ以上の２種のメガプラスミドが検出
された。これらのうちのｐｓｖｍはマメ科の結節および
窒素固定に包含される遺伝子を有する（１２．１３．１
４）トランスポゾンＴｎ ５を用いるマーカー交換によ
って潜在プラスミドＲｙｌｅ４１ａをマーカＣ２４） −としだ後ｐＲｍｅ４１ＢのないＲ，メリロチ４１の誘
導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｏ ） を分離した。この
菌株はＣａｃ−であり、ｐＲｍｅ４１ａがＣａｃ遺伝子
を有するととを示す。
ｅ４１ａと命名された２ １５ ｋｂの潜在プラスミド
および７００ ｋｂ以上の２種のメガプラスミドが検出
された。これらのうちのｐｓｖｍはマメ科の結節および
窒素固定に包含される遺伝子を有する（１２．１３．１
４）トランスポゾンＴｎ ５を用いるマーカー交換によ
って潜在プラスミドＲｙｌｅ４１ａをマーカＣ２４） −としだ後ｐＲｍｅ４１ＢのないＲ，メリロチ４１の誘
導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｏ ） を分離した。この
菌株はＣａｃ−であり、ｐＲｍｅ４１ａがＣａｃ遺伝子
を有するととを示す。
トランスポゾンＴｎ５を用いる潜在プラスミドｐＲｍｅ
４１ａのマーキング後、低頻度（１０−’ ）で他のＲ
，メリロチ菌株で得られるｐＲｍｅ４１ａ ：Ｔｉ５の
自己伝達（５ｅｌｆ−ｔｒａｎｓｆｅｒ ）が観察され
るがアグロバクテリウムには見られない。
４１ａのマーキング後、低頻度（１０−’ ）で他のＲ
，メリロチ菌株で得られるｐＲｍｅ４１ａ ：Ｔｉ５の
自己伝達（５ｅｌｆ−ｔｒａｎｓｆｅｒ ）が観察され
るがアグロバクテリウムには見られない。
実施される異なった宿主の研究を完全にするために宿主
に対する広範囲スペクトルを有する他の可動化プラスミ
ドを使用する。これを行なうためにＲＰ４プラスミド即
ち ｐＧＭＩ４１４２プラスミドから誘導されたプラスミド
を使用する。
に対する広範囲スペクトルを有する他の可動化プラスミ
ドを使用する。これを行なうためにＲＰ４プラスミド即
ち ｐＧＭＩ４１４２プラスミドから誘導されたプラスミド
を使用する。
使用される宿主菌株はＡ、ツメファシェンスＣ５８Ｃ１
（Ｔｉプラスミドのない）である。
（Ｔｉプラスミドのない）である。
このＣ５８Ｃ１菌株はＣａＣ−であるが、Ｃ５８Ｃ１（
ｐＲｍｅ４１ａ： ： Ｔｉ５ ） （９０ＭＩ４１４
２）の被接合体（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ ）は
、カリステギン異化作用（ｃａｃ ）をもたらす遺伝子
がとのプラスミドに局在することを示すカリステギン１
および２を異化する（第３図）。
ｐＲｍｅ４１ａ： ： Ｔｉ５ ） （９０ＭＩ４１４
２）の被接合体（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ ）は
、カリステギン異化作用（ｃａｃ ）をもたらす遺伝子
がとのプラスミドに局在することを示すカリステギン１
および２を異化する（第３図）。
実施例３
次の試験の目的は実施例２で構成されたベクターの活性
を測定することである。
を測定することである。
コントロール（９０ＭＩ４１４２） Ｃ５８Ｃ１菌株が
ＣａＣ−である場合、被接合（ｐＲｍｅ４１ａ：：Ｔｎ
５ ）（９０ＭＩ４１４２）Ｃ５８Ｃ１菌株はカリス
テギン異化作用（ｃａｃ ）をもたらす遺伝子がこのプ
ラスミドに局在することを示すカリステギン１および２
を異化した。
ＣａＣ−である場合、被接合（ｐＲｍｅ４１ａ：：Ｔｎ
５ ）（９０ＭＩ４１４２）Ｃ５８Ｃ１菌株はカリス
テギン異化作用（ｃａｃ ）をもたらす遺伝子がこのプ
ラスミドに局在することを示すカリステギン１および２
を異化した。
プラスミドｐＲｍｅ４１ａはＣ’５８Ｃ”ｌの４１０ｋ
ｂ潜在プラスミドであるｐＡｔ Ｃ５８と不和合であり
従ってＣ５８Ｃ１菌株（ｐＲｍｅ４１ａ：：Ｔｉ５）の
被接合体はｐＡｔＣ５８プラスミドがない（１５）。
ｂ潜在プラスミドであるｐＡｔ Ｃ５８と不和合であり
従ってＣ５８Ｃ１菌株（ｐＲｍｅ４１ａ：：Ｔｉ５）の
被接合体はｐＡｔＣ５８プラスミドがない（１５）。
ｐＡｔ Ｃ５８がない場合Ｃ’５８Ｃ１がＣａｃ−であ
るため、Ｃ５８Ｃ１菌株（ｐＲｍｅ４１ａ ： ： Ｔ
ｉ５ ）をＣａｃ＋ にするｐＡｔ Ｃ’ ５８は除去
しない。
るため、Ｃ５８Ｃ１菌株（ｐＲｍｅ４１ａ ： ： Ｔ
ｉ５ ）をＣａｃ＋ にするｐＡｔ Ｃ’ ５８は除去
しない。
さらにその上、ｐＲｍｅ４１ａのない菌株４１はｃａｃ
−であり、ｐＲｍｅ４１ａがＣａｃ遺伝子を有するとと
を確認し、これらの遺伝子の機能複写が他に存在しない
ことを示す。
−であり、ｐＲｍｅ４１ａがＣａｃ遺伝子を有するとと
を確認し、これらの遺伝子の機能複写が他に存在しない
ことを示す。
実施例４
Ｃ１１ｃｍおよびＣａｃ＋細菌を炭素および窒素源のみ
としてカリステギン１および２を含有する栄養源の不十
分な培地での増殖能を試験し、上記で記載した通りｄｈ
出し、次にゲル濾過および分取用ペーパー電気泳動によ
って精製した。
としてカリステギン１および２を含有する栄養源の不十
分な培地での増殖能を試験し、上記で記載した通りｄｈ
出し、次にゲル濾過および分取用ペーパー電気泳動によ
って精製した。
３日間培養した後、ＣＢｃ＋細菌の増殖刺激はＣａｃ−
コントロール細菌より３倍以上で・あった。
コントロール細菌より３倍以上で・あった。
一般にＣａｃ＋細菌の増殖は培地中のカリステギン濃度
に比例してＣａｃ−コントロール細菌より刺激された。
に比例してＣａｃ−コントロール細菌より刺激された。
この増殖の差異は、ＣａＣ＋細菌による培地からカリス
テギンを除去することによって生じた（第４図）。
テギンを除去することによって生じた（第４図）。
出願人は科学的説明によって限定することを望まないが
、コントロールに観察される低増殖はカリステギン抽出
液中の不純物またはカリステギンの緩慢な自己分解によ
ると考えられる。
、コントロールに観察される低増殖はカリステギン抽出
液中の不純物またはカリステギンの緩慢な自己分解によ
ると考えられる。
実験条件下でカリステギンは自然機能化学伝達因子の特
性を有することが示される。それらは地下器官で多量に
合成され根周囲に放出され、異化作用の遺伝子を有する
細菌に独占的炭素および窒素源を供給する。根浸出液の
他の成分は同様の特徴を有し、根圏の生態関係における
伝達に関係している。
性を有することが示される。それらは地下器官で多量に
合成され根周囲に放出され、異化作用の遺伝子を有する
細菌に独占的炭素および窒素源を供給する。根浸出液の
他の成分は同様の特徴を有し、根圏の生態関係における
伝達に関係している。
かかる物質に一般名すシスフェリンを与えることが提案
される。リゾスフェリン（例えばＣａ８）の合成および
その異化作用（例えばＣａｃ ）は遺伝的に改良された
土壌細菌の生存を促進し寸だ新規な植物微生物群を産生
するために使用することができる。かかる根圏生態の調
節は植物の培養に著しい改良をもたらすととができる。
される。リゾスフェリン（例えばＣａ８）の合成および
その異化作用（例えばＣａｃ ）は遺伝的に改良された
土壌細菌の生存を促進し寸だ新規な植物微生物群を産生
するために使用することができる。かかる根圏生態の調
節は植物の培養に著しい改良をもたらすととができる。
参考文献
（１） ファーミン、Ｊ、 Ｌ、フェンウィック、Ｇ
、Ｒ，、ネイチュア、第２７６巻％８４２〜Ｃ２８） ８４４頁（１９７８年） （２）トレベリアン、Ｗ、Ｅ、ブロクター、Ｄ。
、Ｒ，、ネイチュア、第２７６巻％８４２〜Ｃ２８） ８４４頁（１９７８年） （２）トレベリアン、Ｗ、Ｅ、ブロクター、Ｄ。
Ｐ、ハリソン％Ｊ、 Ｓ、ネイチュア第１６６巻。
４４４〜４４５頁（１９５０年）
（３） テプファ、Ｄ、ジエネテイツク エンジニア
リング インユーカリオテス（ブレウィン、Ｐ、クライ
ンホフス、へ編集］１５３〜１６４頁（プレナムプレス
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、ゲン、ゲン（Ｍｏｔ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎ ）第１７
６巻％５７〜６５頁（１９７９年） （５）テプファ％Ｄ、Ａ、テンペ、Ｊ、 Ｃ，Ｒ，アカ
ド、セフ（Ａｃａｄ、 ｓｃ、 ３パリ第２９２巻、１
５３〜１５６頁ｒ１９８１年） （６） テプファＤ、 Ａ、 （２エメ コロキュー
サー レス リチャーチス フルイチレスーボーテアツ
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ｒｄｅａｕｘ ）（ＩＮＲＡ−ＣＴＩＦＬ編集）（１９
８２年）（７）テプファ、Ｄ、Ａ、セル第４７巻％９５
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ｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 ）第１９０巻、２０
４〜２１４頁（１９８３年） （９） ベリンガー、Ｊ、 Ｅ、ブレウィン、Ｎ、
Ｊ。
リング インユーカリオテス（ブレウィン、Ｐ、クライ
ンホフス、へ編集］１５３〜１６４頁（プレナムプレス
１９８２年）（４） スコツト、１． Ｍ、等、モル
、ゲン、ゲン（Ｍｏｔ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎ ）第１７
６巻％５７〜６５頁（１９７９年） （５）テプファ％Ｄ、Ａ、テンペ、Ｊ、 Ｃ，Ｒ，アカ
ド、セフ（Ａｃａｄ、 ｓｃ、 ３パリ第２９２巻、１
５３〜１５６頁ｒ１９８１年） （６） テプファＤ、 Ａ、 （２エメ コロキュー
サー レス リチャーチス フルイチレスーボーテアツ
クス（２ｅｍｅ ｃｏｌｌｏｑｕｅ ｓｕｒ １ｅｌＩ
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ｒｄｅａｕｘ ）（ＩＮＲＡ−ＣＴＩＦＬ編集）（１９
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９〜９６７頁（１９８４年） （８）ペチット、Ａ等、５．１モル、ゲン、ゲネト（Ｍ
ｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 ）第１９０巻、２０
４〜２１４頁（１９８３年） （９） ベリンガー、Ｊ、 Ｅ、ブレウィン、Ｎ、
Ｊ。
ジョンストン、Ａ、 Ｗ、 Ｂ、 、ヘレデイテイ（Ｈ
ｅｒｅｄｉｔｙ ）第４５巻、１６１〜１８６頁（１９
８０年） （１０）コンドロシ、Ａ、ジョンストン、Ａ、Ｗ、Ｂ。
ｅｒｅｄｉｔｙ ）第４５巻、１６１〜１８６頁（１９
８０年） （１０）コンドロシ、Ａ、ジョンストン、Ａ、Ｗ、Ｂ。
バイオロジーオブザリゾビアセエ（ギレス、Ｋ、 Ｌ、
アサーリー、Ａ、 Ｇ、編集）１９１〜２２４頁（アカ
デミツクプレス、ニューヨーク、１９８１年） Ｃ１１）エメリッヒ、Ｃ，バイオテクノロジー第１１巻
、９６７〜９７８頁（１９８４年）（１２）バンファル
ビ、２等５モル、ゲン、ゲネト、第１８４巻、３３４〜
３３９頁（１９８１年） （１３）ローゼンバーグ、Ｆ０モル、ゲン、ゲネト、第
１８４巻、３２６〜３３３頁（１９８１年） （１４）フゲット、Ｔｏ等、モレキュラ ジエネテイツ
クオブザバクテリアプラントインターアクション（プー
ラ−１八編集）３５〜４５頁（スプリンガー ベルラグ
ベルリン １９８３年） （１５）ローゼンバーグ、Ｃ，フゲット％Ｔ３モル。
アサーリー、Ａ、 Ｇ、編集）１９１〜２２４頁（アカ
デミツクプレス、ニューヨーク、１９８１年） Ｃ１１）エメリッヒ、Ｃ，バイオテクノロジー第１１巻
、９６７〜９７８頁（１９８４年）（１２）バンファル
ビ、２等５モル、ゲン、ゲネト、第１８４巻、３３４〜
３３９頁（１９８１年） （１３）ローゼンバーグ、Ｆ０モル、ゲン、ゲネト、第
１８４巻、３２６〜３３３頁（１９８１年） （１４）フゲット、Ｔｏ等、モレキュラ ジエネテイツ
クオブザバクテリアプラントインターアクション（プー
ラ−１八編集）３５〜４５頁（スプリンガー ベルラグ
ベルリン １９８３年） （１５）ローゼンバーグ、Ｃ，フゲット％Ｔ３モル。
ゲン、ゲネト、第１９６巻、５３３〜５３６頁（１９８
４年）
４年）
第１図は正常な鉢植えのＣ，セピウム植物の根、根茎及
び葉から抽出されたカリステギン１及び２（図中片）、
及び試験管内で生育した形質転換板から抽出したまたは
２１日間培養した培地で集積したカリステギン１及び２
（図中衣）の電気泳動図である。 第２図はカリステギンに関連する根圏細菌の異化特異性
を示す電気泳動図である。 第３図は表現型Ｃａｃ＋がｐＲｍｅ４１ａの存在に関係
があることを示すために使用される菌株のプラスミドプ
ロフィル（図中上部）及びＣａＣ機能がｐＲｍｅ４１ａ
にコードされることを示す正常な植物の根茎から抽出さ
れたカリステギンを使用する異化作用試験Ｃ図中下部）
を示す。 第４図はカリステギン依存増殖を示す。 第５図はヒント■制限部位地図を示す。 第６図はｐＲｍｅ４１フラグメントの効能によるカリス
テギンの異化作用性を付与する特性を有するＲＰ４から
誘導された広範囲宿主スペクトルを有するプラスミド地
図を示す。 手ｆｒ、売 ネ山正書（方式） ＋１／］ 和６１ 年／２ 月２２ Ｆｌ特許庁長官
黒 １）明 雄 殿 １、事件の表示 昭和６１年特許願第１２４７５３号
２、発明の名称 根圏内で有用な作用を呈する微生物の形質転換のための
ベクター、転換された菌株および農業的利用３、補正を
する者 事件との関係 特許出願人 住 所 フランス国、７５００７ パリ。 リュ、ド グルネール、１４９ （イー エン エール アー） ４、代理人の住所会氏名 〒１００東京都千代ｍＫ丸の内３−２−３ 、富士ビル
２０８ル（室電話（２１３）１５６１ （代表） 昭和６１年７月２［Ｉ（発送日：昭和６１年７月２９日
）８、補正の対象 （１）「 願 書Ｊ（３Ｈ図
面」（２）「明細書」 （１） 別紙のとおり、「発明の名称」を正確に記載
した訂正願書１通を提出いたします。 （２） 別紙のとおり、印書せる全文明細書１通を提
出いたします。 （３） 別紙のとおり２図面（第１図〜第４図）１通
を提出いたします。 ５丁−系売補ｊト書（方式） 昭和６１年１２月２２日 特許庁長官 黒 １）明 雄 殿 １、事件の表示 昭和６１年特許願第１２４７５３号
２、発明の名称 根圏内で有用な作用を呈する微生物の形質転換のための
ベクター、転換された菌株および農業的利用３、補正を
する者 事件との関係 特許出願人 ４、代理人の住所・氏名 ５、補正命令の日付 昭和６１年１１月５日（発送日：昭和６１年１１月２５
日）６、補正の対象 明細書の「図面の簡単な説明
」の欄７、補正の内容 別紙 の と お リ（１
）明細書第３１頁第１６行目の 「図である。」を 「を示す写真である。」と訂正する。 （２）同上第１８頁第１８行目の ｒ図である。」を 「を示す写真である。」と訂正する。 （３）同上第３２頁第５行目の 「示す。」を 「示す写真である。」と訂正する。 （４）同上第３２頁第６行目の 「示す。」を 「示す写真である。」と訂正する。
び葉から抽出されたカリステギン１及び２（図中片）、
及び試験管内で生育した形質転換板から抽出したまたは
２１日間培養した培地で集積したカリステギン１及び２
（図中衣）の電気泳動図である。 第２図はカリステギンに関連する根圏細菌の異化特異性
を示す電気泳動図である。 第３図は表現型Ｃａｃ＋がｐＲｍｅ４１ａの存在に関係
があることを示すために使用される菌株のプラスミドプ
ロフィル（図中上部）及びＣａＣ機能がｐＲｍｅ４１ａ
にコードされることを示す正常な植物の根茎から抽出さ
れたカリステギンを使用する異化作用試験Ｃ図中下部）
を示す。 第４図はカリステギン依存増殖を示す。 第５図はヒント■制限部位地図を示す。 第６図はｐＲｍｅ４１フラグメントの効能によるカリス
テギンの異化作用性を付与する特性を有するＲＰ４から
誘導された広範囲宿主スペクトルを有するプラスミド地
図を示す。 手ｆｒ、売 ネ山正書（方式） ＋１／］ 和６１ 年／２ 月２２ Ｆｌ特許庁長官
黒 １）明 雄 殿 １、事件の表示 昭和６１年特許願第１２４７５３号
２、発明の名称 根圏内で有用な作用を呈する微生物の形質転換のための
ベクター、転換された菌株および農業的利用３、補正を
する者 事件との関係 特許出願人 住 所 フランス国、７５００７ パリ。 リュ、ド グルネール、１４９ （イー エン エール アー） ４、代理人の住所会氏名 〒１００東京都千代ｍＫ丸の内３−２−３ 、富士ビル
２０８ル（室電話（２１３）１５６１ （代表） 昭和６１年７月２［Ｉ（発送日：昭和６１年７月２９日
）８、補正の対象 （１）「 願 書Ｊ（３Ｈ図
面」（２）「明細書」 （１） 別紙のとおり、「発明の名称」を正確に記載
した訂正願書１通を提出いたします。 （２） 別紙のとおり、印書せる全文明細書１通を提
出いたします。 （３） 別紙のとおり２図面（第１図〜第４図）１通
を提出いたします。 ５丁−系売補ｊト書（方式） 昭和６１年１２月２２日 特許庁長官 黒 １）明 雄 殿 １、事件の表示 昭和６１年特許願第１２４７５３号
２、発明の名称 根圏内で有用な作用を呈する微生物の形質転換のための
ベクター、転換された菌株および農業的利用３、補正を
する者 事件との関係 特許出願人 ４、代理人の住所・氏名 ５、補正命令の日付 昭和６１年１１月５日（発送日：昭和６１年１１月２５
日）６、補正の対象 明細書の「図面の簡単な説明
」の欄７、補正の内容 別紙 の と お リ（１
）明細書第３１頁第１６行目の 「図である。」を 「を示す写真である。」と訂正する。 （２）同上第１８頁第１８行目の ｒ図である。」を 「を示す写真である。」と訂正する。 （３）同上第３２頁第５行目の 「示す。」を 「示す写真である。」と訂正する。 （４）同上第３２頁第６行目の 「示す。」を 「示す写真である。」と訂正する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、微生物にリゾスフェリン異化作用を付与する根圏微
生物の形質転換のためのベクタ ー。 ２、該リゾスフェリンを異化する菌株から採取したリゾ
スフェリンの異化作用をコード する遺伝子を含有する特許請求の範囲第１ 項記載のベクター。 ３、この異化作用をコードする遺伝子が該菌株のプラス
ミドに由来する特許請求の範囲 第２項記載のベクター。 ４、コード遺伝子が該リゾスフェリンを異化するリゾビ
ウム菌株のプラスミドに由来す る特許請求の範囲第３項記載のベクター。 ５、リゾビウム菌株がＲ．メリロチの菌株である特許請
求の範囲第４項記載のベクター。 ６、プラスミドがプラスミドｐＲｍｅ４１ａであり、リ
ゾスフェリンがカリステギン１およ び２から選択される特許請求の範囲第５項 記載のベクター。 ７、リゾスフェリンの異化作用をコードする遺伝子のほ
かに遺伝標識の全部または一部、例えばトランスポゾン
の全部または一部を 含有する特許請求の範囲第６項記載のベク ター。 ８、該トランスポゾンがトランスポゾンＴｎ５である特
許請求の範囲第７項記載のベクタ ー。 ９、遺伝子がベクターＲＰ＿４またはその誘導体に挿入
される特許請求の範囲第１項ないし 第８項のいずれかに記載のベクター。 １０、遺伝子がベクターｐＧＭＩ４１４２に挿入される
特許請求の範囲第９項記載のベクター。 １１、特許請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれか
に記載のベクターによって形質転 換された菌株。 １２、アゾスピリリウム、アグロバクテリウムおよびリ
ゾビウム属から選択された菌株に 関する特許請求の範囲第１１項記載の菌株。 １３、リゾビウムメリロチおよびアグロバクテリウムツ
メファシエンスから選択された菌 株に関する特許請求の範囲第１２項に記載 の菌株。 １４、農業における有利な根圏作用を有する素材として
の特許請求の範囲第１１項ないし 第１３項のいずれかに記載の菌株用途。 １５、リゾスフェリンを異化する遺伝子を使用すること
からなる根圏微生物の形質転換方 法。 １６、特許請求の範囲第１５項に記載の方法の手段とし
てのリゾスフェリンを異化する遺 伝子。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8508237A FR2582671B1 (fr) | 1985-05-31 | 1985-05-31 | Vecteurs de transformation des microorganismes a action rhizospherique favorable, souches transformees et applications agronomiques |
| FR8508237 | 1985-05-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62115290A true JPS62115290A (ja) | 1987-05-26 |
Family
ID=9319747
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61124753A Pending JPS62115290A (ja) | 1985-05-31 | 1986-05-31 | 根圏内で有用な作用を呈する微生物への形質転換のためのベクタ−、転換された菌株および農業的利用 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0203863B1 (ja) |
| JP (1) | JPS62115290A (ja) |
| AT (1) | ATE63135T1 (ja) |
| CA (1) | CA1275384C (ja) |
| DE (1) | DE3678996D1 (ja) |
| ES (1) | ES8705037A1 (ja) |
| FR (1) | FR2582671B1 (ja) |
| GR (1) | GR861408B (ja) |
| PT (1) | PT82685B (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2630439A1 (fr) * | 1988-04-22 | 1989-10-27 | Agronomique Inst Nat Rech | Composes chimiques et isomeres, leur preparation et leur utilisation pour la selection de microorganismes, procede pour cette selection et produit utilise |
| US5610044A (en) * | 1990-10-01 | 1997-03-11 | Lam; Stephen T. | Microorganisms with mannopine catabolizing ability |
-
1985
- 1985-05-31 FR FR8508237A patent/FR2582671B1/fr not_active Expired
-
1986
- 1986-05-22 CA CA000509758A patent/CA1275384C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1986-05-26 EP EP86401104A patent/EP0203863B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1986-05-26 AT AT86401104T patent/ATE63135T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-05-26 DE DE8686401104T patent/DE3678996D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-05-29 GR GR861408A patent/GR861408B/el unknown
- 1986-05-29 ES ES555456A patent/ES8705037A1/es not_active Expired
- 1986-05-30 PT PT82685A patent/PT82685B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-05-31 JP JP61124753A patent/JPS62115290A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE63135T1 (de) | 1991-05-15 |
| CA1275384C (fr) | 1990-10-23 |
| FR2582671A1 (fr) | 1986-12-05 |
| PT82685A (fr) | 1986-06-01 |
| DE3678996D1 (de) | 1991-06-06 |
| GR861408B (en) | 1986-09-26 |
| FR2582671B1 (fr) | 1988-08-19 |
| EP0203863B1 (fr) | 1991-05-02 |
| ES8705037A1 (es) | 1987-05-01 |
| PT82685B (pt) | 1988-04-21 |
| ES555456A0 (es) | 1987-05-01 |
| EP0203863A1 (fr) | 1986-12-03 |
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