JPS6196998A - Production of human apolipoprotein a-1-like protein - Google Patents

Production of human apolipoprotein a-1-like protein

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Publication number
JPS6196998A
JPS6196998A JP59216988A JP21698884A JPS6196998A JP S6196998 A JPS6196998 A JP S6196998A JP 59216988 A JP59216988 A JP 59216988A JP 21698884 A JP21698884 A JP 21698884A JP S6196998 A JPS6196998 A JP S6196998A
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JP
Japan
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protein
dna fragment
promoter
apoliboprotein
host
Prior art date
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Pending
Application number
JP59216988A
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Japanese (ja)
Inventor
Yutaka Teranishi
豊 寺西
Hideho Tanaka
秀穂 田中
Yasuko Ikeda
池田 康子
Masako Kimura
昌子 木村
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Mitsubishi Kasei Corp
Original Assignee
Mitsubishi Kasei Corp
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Filing date
Publication date
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775Apolipopeptides

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  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Abstract

PURPOSE:A specific DNA fragment is introduced into the cloning site in the downstream of the promotor gene in the expression vector and the resultant vector is introduced into the host to enable high-efficiency production of a protein like human apolipoprotein. CONSTITUTION:A DNA fragment containing DNA coding for apolipoprotein or a substance having a similar physiological activity to human apolipoprotein is prepared. The resultant DNA fragment is introduced into the expression vector at the cloning site in the downstream of the promotor gene. Then, the vector including the DNA fragment is introduced into the host, the host is cultured to collect the protein produced. Some of the promotors are controllable by 1acI. The resultant protein is used as an antigen to produce an antiserum according to usual manner and the antiserum is used to detect apolipoprotein A-1.

Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 蛋白の微生物学的産生方法に関する。[Detailed description of the invention] (Industrial application field) Concerning a method for microbiological production of proteins.

(従来の技術) ″血漿中に存在する主要な脂質と、しては、コレステロ
ール、リン脂質、トリグリセリド及び遊離脂肪酸が挙げ
られるが、このうちの前三者は蛋白と結合して存在する
。水に不溶の脂質が可溶化されたこの脂質−蛋白複合体
はリボ蛋白と呼ばれ、脂質・と蛋白の割合によシ、種々
の重さのものを形成する。このリボ蛋白は、球形粒子状
の構造をなし、中核部分に極性のないトリグリセリド、
コレステロールエステルが存在シ、極性のおるリン脂質
、遊離コレステロールが蛋白とともに表層を形成すると
考えられている。
(Prior Art) ``Major lipids present in plasma include cholesterol, phospholipids, triglycerides, and free fatty acids, of which the first three exist in combination with proteins.Water This lipid-protein complex, in which insoluble lipids are solubilized, is called riboprotein, and forms compounds of various weights depending on the ratio of lipid and protein. The structure is triglyceride with no polarity in the core,
It is believed that the presence of cholesterol esters, polar phospholipids, and free cholesterol together with proteins form the surface layer.

このリボ蛋白中に含まれる蛋白は、アポリボプロティン
と呼ばれ、現在10種類以上が知られている。アポリボ
ロチインは、リボ蛋白を構成するのに必要であるばかシ
でなく、リボ蛋白の代謝においても重要な役割を果たす
。このアポリボプロティンのひとつとして、アポリボプ
ロティンA−1が知られている。そしてこのアポリボプ
ロティンA−(は、レシヂーンのβ位の脂肪酸を遊離コ
レステロールに運んでこれをコレステロールエステルに
変える酵素であるI、C!AT(レシチン・コレステロ
ール・アシル・トランスフェラーゼ)を活性化する働き
がちることが知られている。
The protein contained in this riboprotein is called apoliboprotein, and more than 10 types are currently known. Apoliborotiine is not only necessary for the construction of riboproteins, but also plays an important role in riboprotein metabolism. Apoliboprotein A-1 is known as one of these apoliboproteins. This apoliboprotein A- has the function of activating I,C!AT (lecithin cholesterol acyl transferase), an enzyme that transports fatty acids at the β-position of lecithin to free cholesterol and converts it into cholesterol ester. It is known that it tends to fall.

このアポリボプロティンA−Iに異常がある場合、種々
のリボ蛋白代謝異常をきたし、たとえば、高脂血症にな
シ、さらに動脈硬化に至る場合が多い。
When there is an abnormality in this apoliboprotein A-I, various abnormalities in riboprotein metabolism occur, such as hyperlipidemia and arteriosclerosis in many cases.

このような場合、患者に正常なA−1を投与することに
よシ、正常なアポリボプロティンA−■の機能を回復さ
せることができる。
In such cases, the normal function of apoliboprotein A-■ can be restored by administering normal A-1 to the patient.

口 本発明者らは、このアボリボリボプβティンA−■を組
換えDNA技術によシ得るために、完全長cDNA断片
を得、今般、これを用いてアポリボプロティンA−1を
産生ずる本発明方法に到達した。
In order to obtain this apoliboprotein β-■ by recombinant DNA technology, the present inventors obtained a full-length cDNA fragment and have now used it to produce apoliboprotein A-1. reached the method.

すなわち、本発明の要旨は、ヒトアポリボプロティンA
−7又はそれと同様の生理活性を有するヒトアポリボプ
ロティンA−1様物質をコードするDNAを含有するD
NA断片を発現用ベクターのプロモータの下流に存在す
るクローニング部位に導入し、ついで上記DNA断片を
導入したベクターを宿主微生物に導入して同宿主を培養
し、産生ずる蛋白を取得することを特徴とするヒトアポ
リボプロティンA−■様蛋白工 の産榎方法にある。
That is, the gist of the present invention is that human apoliboprotein A
-7 or a D containing DNA encoding a human apoliboprotein A-1-like substance having similar physiological activity.
The method is characterized by introducing an NA fragment into a cloning site located downstream of the promoter of an expression vector, then introducing the vector into which the DNA fragment has been introduced into a host microorganism, culturing the host, and obtaining the protein to be produced. The present invention provides a method for producing human apoliboprotein A--like protein.

(発明の構成) 以下、本発明の詳細な説明する。(Structure of the invention) The present invention will be explained in detail below.

まず、本発明において用いるDNA断片は、次のような
方・法によって調製される。すなわち、ヒト肝臓切片、
小腸上皮細胞、血液中のマクロファージ又は腎臓切片等
をグアジニルチオシアネートとともにホモジナイズし、
Ca1l 平衡密度勾配超遠心によって全RNAを分離
する(  Chirgwin  ら、BiOCh8mi
8tr7.  /I、  12り弘−!コタタ。
First, the DNA fragment used in the present invention is prepared by the following method. i.e. human liver sections,
Homogenize small intestinal epithelial cells, macrophages in blood, kidney sections, etc. with guadinyl thiocyanate,
Separate total RNA by Ca1l equilibrium density gradient ultracentrifugation (Chirgwin et al., BiOCh8mi
8tr7. /I, 12 Rihiro-! Kotata.

/り7り)。/ri7ri).

ついで、常法によシこれをオリゴ(aT)セルロースカ
ラムクロマトグラフィーで精製し、ポ(Mo1ecul
ar ana Ce1lular B10l0g7.2
. /lr/−/70. /912 )によって、CD
NA ライブラリーを得る。すなわち、pBR322と
5vtAOの/Nイブリッドプラスミドを用いて、ベク
タープライマーとオリゴ(aG)テールリンカ−を得る
This was then purified by oligo(aT) cellulose column chromatography in a conventional manner, and
ar ana Ce1lular B10l0g7.2
.. /lr/-/70. /912) by CD
Get the NA library. That is, a vector primer and an oligo(aG) tail linker are obtained using pBR322 and 5vtAO/N hybrid plasmid.

このベクタープライマーと上記mRNA共存下に逆転写
酵素を作用させてcDNAを合成し、その後制限酵素H
1M[[で消化し、ついで上記リンカ−を用いて環化さ
せる。その後、mRNA部分をDNAで置換して、cD
NA断片含有プラスミドを得る。
Reverse transcriptase is allowed to act in the coexistence of this vector primer and the above mRNA to synthesize cDNA, and then restriction enzyme H
Digested with 1M [[ and then cyclized using the linker described above. Then, the mRNA part is replaced with DNA to create cD
Obtain a plasmid containing an NA fragment.

ついで、常法によシ、これを大腸菌 (’Escherichia coli )  等をア
ンピシリン耐性に形質転換する。その後、プローブとし
て、アポリボプロティンA−1のアミノ酸配列101−
112位 T r p−G1.n−G l u−G 1u−M e
 tに対応する合成オリゴヌクレオチドを用いて、これ
と相補性のある配列を含むクローンを選択する。こうし
て得られるクローン中よシ、適切な制限酵素で切断して
、最も長いcDNAが挿入されているプラスミドを有す
るクローンを選択する。
This is then used to transform Escherichia coli or the like into ampicillin-resistant cells by a conventional method. Thereafter, the amino acid sequence 101-1 of apoliboprotein A-1 was used as a probe.
112th position T r p-G1. n-G l u-G 1u-M e
A synthetic oligonucleotide corresponding to t is used to select a clone containing a sequence complementary to this. The clones thus obtained are digested with appropriate restriction enzymes to select the clone containing the plasmid containing the longest cDNA.

そのクローンより得られるCIINA断片は、Maxa
mとG11bertの方法(Methods in E
nzy −mology、 &j、弘タターjtO,/
りto )によって塩基配列が決定される。
The CIINA fragment obtained from the clone was obtained from Maxa
Methods in E
nzy-mology, &j, KotaterjtO,/
The base sequence is determined by

本発明方法において発現用ベクターのクローニング部位
に導入されるDNA断片は、アポリボプロティン、A 
−1又はアポリボプロティンA−■と同様の生理活性を
有するアポリボプロティンA−(様物質をコードするD
NAを含有するDNA断片である。その−例を第2図に
示すが、本発明に係るDMA断片は必ずしもこれと同一
の塩基配列を有することを要求されず、該DNA断片に
含まれるDNAによってコードされる物質が、アポリボ
プロティンA−1と同様の生理活性を有するアポリボプ
ロティンA−1様物質であれば、該塩基配列の一部が置
換もしくは削除され、又は塩基が付加された塩基配列で
あってもよい。
In the method of the present invention, the DNA fragment introduced into the cloning site of the expression vector is apoliboprotein, A
-1 or apoliboprotein A-1, which has the same physiological activity as apoliboprotein A-■
It is a DNA fragment containing NA. An example thereof is shown in FIG. 2, but the DMA fragment according to the present invention is not necessarily required to have the same base sequence as this, and the substance encoded by the DNA contained in the DNA fragment is apoliboprotein. As long as it is an apoliboprotein A-1-like substance that has the same physiological activity as A-1, it may be a base sequence in which part of the base sequence is substituted or deleted, or a base is added.

本発明方法において、上記DNA断片は、発現ベクター
の下流に存在するクローニング部位に導入することによ
って、これを鋳型とする翻訳によシアボリボプロテイン
A−■又はアポリボプロティンA−i様物質、あるいは
これを含む融合蛋白を得ることができる。
In the method of the present invention, the above-mentioned DNA fragment is introduced into a cloning site located downstream of an expression vector, and by translation using this as a template, a siaboriboprotein A-■ or an apoliboprotein A-i-like substance, Alternatively, a fusion protein containing this can be obtained.

クローニング部位としては、目的とする異種遺伝子の直
接発現を可能とする制限酵素認識部位が挙げられる。具
体的には、翻訳開始コドンの直前にあるBarnH工部
位が工部口く、プロモータ下流ic BamH工部位工
部布しないときには。
Cloning sites include restriction enzyme recognition sites that enable direct expression of a target heterologous gene. Specifically, when the BarnH site immediately before the translation initiation codon is closed, and the BamH site located downstream of the promoter is not transmitted.

が好ましく、このようなプロモータとしては、” tr
p 7’ o モー1 及ヒtrp 7’ロモータ、!: 
1ac 7’ロモータとの融合型プロモータであるta
cプロモータ(Proceedlng of Nati
onal Acaderny 8cienceto r
t (tyii)  及ヒ特1.q 昭j7−7944
790号参照)が好ましい。宿主としては、通常大腸菌
、たとえばHB10/、7M104  等を用いること
ができ、形質転換株の培養、蛋白の取得は、常法による
ことができる。
is preferable, and such a promoter is preferably “tr
p 7' o mo1 and hit trp 7' lomota,! :
ta, a fusion type promoter with the 1ac 7' promoter.
c promoter
onal Academy 8cienceto r
t (tyii) and special features 1. q Shoj7-7944
No. 790) is preferred. As a host, Escherichia coli, such as HB10/, 7M104, etc. can be used, and the transformed strain can be cultured and the protein obtained by conventional methods.

(発明の効果) 本発明方法によれば、ヒトアポリボプロティンA−1様
蛋白を効率よく発現させることができ、得られる蛋白(
アポリボプロティンム−■)を抗原とし、常法によシ抗
血清を得、これを用いてアポリボプロティンA−Tの存
在を検出できる。
(Effects of the Invention) According to the method of the present invention, human apoliboprotein A-1-like protein can be efficiently expressed, and the resulting protein (
Apoliboprotein A-T) is used as an antigen, and an antiserum obtained by a conventional method can be used to detect the presence of apoliboprotein AT.

さらに、得られるアポリボプロティンA−1を、抗高脂
血症剤、抗動脈硬化剤として用いることもできる。
Furthermore, the obtained apoliboprotein A-1 can also be used as an antihyperlipidemic agent and an antiarteriosclerotic agent.

(実施例) 以下、実施例によシ、本発明を更に具体的説明するが、
本発明は、その要旨を超えない限シ、以下の実施例によ
り限定されない。
(Example) Hereinafter, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples.
The present invention is not limited by the following examples unless it exceeds the gist thereof.

実施例1 A 原料DNA断片の調製 (1)  ヒト肝臓切片を液体窒素で破砕した後グアニ
ジニウムチオシアネート水溶液を添加しホモジナイズし
た。得られたホモジネートを、Chirgwinらの方
法(Biochemistry、 /♂。
Example 1 A Preparation of raw material DNA fragment (1) A human liver section was crushed with liquid nitrogen, and then a guanidinium thiocyanate aqueous solution was added and homogenized. The obtained homogenate was subjected to the method of Chirgwin et al. (Biochemistry, /♂).

j2外−jコタタ、127り)にしたがって、塩化セシ
ウム平衡密度勾配超遠心によって全RNAを分離した。
Total RNA was isolated by cesium chloride equilibrium density gradient ultracentrifugation according to J2 Ex-J Kotata, 127.

ついで、常法によりこれをオリゴ(aT)セルロースカ
ラムクロマトグラフィで精製し、ボ!J (A)含有R
NAを単離し、mRNA原料とした。
Next, this was purified by oligo(aT) cellulose column chromatography using a conventional method, and Bo! J (A) Containing R
NA was isolated and used as an mRNA source.

(2)一方、岡山とBergの方法(Mo1ecula
ranti (elular Biology 2. 
/l/ −/70. /#J)によシ、pBRJ22と
日V弘Oのハ、イプリ′ツドプラスミドを用いて、ベク
タープライマーとオリゴ(dG)テールリンカ−を得た
(2) On the other hand, Okayama and Berg's method (Mo1ecula
ranti (elular Biology 2.
/l/-/70. /#J) A vector primer and an oligo(dG) tail linker were obtained using pBRJ22 and the original plasmid of Nippon V.H.

すなわち、pBRj、22と5veO(−vツブユニッ
ト0.7 / −OJ乙)のハイブリッドグラスミド弘
QOμg を、ウシ血清アルブミンを含む緩衝液中で制
限酵素Kpn lで37℃、μ時間消化させた。
That is, pBRj, 22 and 5veO (-v tube unit 0.7/-OJ Otsu) hybrid Grasmid Hiro QOμg was digested with the restriction enzyme Kpnl at 37°C for μ hours in a buffer containing bovine serum albumin. .

ついで、常法によジェタノール沈澱によってDNAを回
収し、これをdTTPを含む緩衝液に溶解し、ターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランス7エラーゼを添加し
て、37℃で30分間反応させて、制限酵素Kpn l
の消化部位に約40個のdTデテール付加させた後、エ
タノール沈澱によJDNAを回収した。ついで、このD
NAをウシ血清アルブミンを含む緩衝液中で、制限酵素
klによシ消化した(3,7℃、J′待時間。大きい方
のDNA断片を、アガロースゲル電気泳動によシ精製し
、ガラスパウダー法(Vogelsteinら、Pro
c、 Natl、 Acad、 8ci、 U、8.A
、、 7A、 61!−tit’、 #7り)によって
回収した。その後、このDNAt?O℃でオリゴ(aA
)セルロースカラムに付し、水で溶出させた後、エタノ
ールで回収し、オリゴ(dT)テールを有スるベクター
プライマーを得た。
Next, the DNA was recovered by jetanol precipitation using a conventional method, dissolved in a buffer containing dTTP, terminal deoxynucleotidyl trans7-elase was added, and the reaction was carried out at 37°C for 30 minutes to dissolve the restriction enzyme Kpnl.
After about 40 dT details were added to the digestion site, JDNA was recovered by ethanol precipitation. Next, this D
The NA was digested with the restriction enzyme kl in a buffer containing bovine serum albumin (3.7°C, J' waiting time. The larger DNA fragment was purified by agarose gel electrophoresis and separated into glass powder. method (Vogelstein et al., Pro
c, Natl, Acad, 8ci, U, 8. A
,, 7A, 61! -tit', #7). After that, this DNAt? Oligo (aA
) The primer was applied to a cellulose column, eluted with water, and then recovered with ethanol to obtain a vector primer with an oligo(dT) tail.

他方、pBRJ2Jと、71 ’V 参〇 (マツプユ
ニット0./ 9−0.32 )とのハイブリッドプラ
スミド700μgをクシ血清アルブミンを含む緩衝液中
で、制限酵素自ユ■によシ消化した。、(77℃、1時
間半)。ついで、DNAを回収し、dGTPを含む緩衝
液に溶解し、ターミナルデオキシヌクレオチジルトラン
ス7エラーゼを添加して、37℃で20分間反応させ、
約10〜/!のdGデテール付加させた。回収したDN
A1. ウシ血清アルブミンを含む緩衝液中で制限酵素
H1nd Ill にょシ消化させ(37℃、1時間)
、ついでアガロースゲル(t、r%)電気泳動に付し、
小さいオリゴ(dG)テールリンカ−DNAを抽出回収
した。
On the other hand, 700 μg of a hybrid plasmid of pBRJ2J and 71'V San〇 (map unit 0./9-0.32) was digested with the restriction enzyme YU in a buffer containing comb serum albumin. , (77°C, 1.5 hours). Then, the DNA was collected, dissolved in a buffer containing dGTP, terminal deoxynucleotidyl trans7-erase was added, and reacted at 37°C for 20 minutes.
Approximately 10~/! dG detail was added. Recovered DN
A1. Digested with restriction enzyme H1nd Ill in a buffer containing bovine serum albumin (37°C, 1 hour).
, then subjected to agarose gel (t, r%) electrophoresis,
Small oligo(dG) tail linker-DNA was extracted and recovered.

0r11u:Lar  Biology  2.  I
ll  −/70.  /り12  )  により、c
DNAライブラリーを得た。
0r11u:Lar Biology 2. I
ll-/70. /ri12), c
A DNA library was obtained.

すなわち、Tris−HCjl(pH♂、3)、MgC
l2、KOl、 ジチオスレイトール、dATP、dT
T Pld G T P及び(sap)  a OT 
Pヲ含fF水溶液に上記(1)で得られ九mRNAJ(
7℃gと上記(2)で得られたベクタープライマー/θ
μg を添加して、逆転写酵素の存在下に37℃、20
分間、反応させ、プラスミド−cDNA:mRNAを合
成し、これをエタノール沈澱しベレット状で回収した。
That is, Tris-HCjl (pH♂, 3), MgC
l2, KOl, dithiothreitol, dATP, dT
T Pld G T P and (sap) a OT
The nine mRNAJ (
7℃g and the vector primer obtained in (2) above/θ
μg was added and incubated at 37°C for 20 minutes in the presence of reverse transcriptase.
The mixture was reacted for 1 minute to synthesize plasmid-cDNA:mRNA, which was precipitated with ethanol and collected in the form of a pellet.

このベレットを0oC12、ジテオスレイトール、ポリ
(A)、(32p)  dcTp及びターミナルデオキ
シヌークレオテジルトランスフエラーゼを含有する緩衝
液に溶解し、37℃、10分間反応させ、末端あた9L
OMPのio〜/!の残基を付加させた。ついで、回収
したオリゴ(aa)テールプラスミド−cDNA:mR
NAを含有するベレットをウシ血清アルブミンを含む緩
衝液に溶解し、制限酵素H1nd l[で37℃、7時
間消化し、エタノール沈澱によ、9.utnd■消化オ
リゴ(ac)テールcDNA:mRNAプラスミドを回
収した。これを前記(2)で得られたオリゴ(aC)テ
ールリンカ−DNAを含む緩衝液に溶解し、4j℃、J
分間インキユベートシ、さらに弘コ”Q、30分間保持
し、0℃に冷却した。ついで、β−NADにコチンアデ
ニンジヌクレテド)存在下、大腸菌(L coli )
 D N Aリガーゼを加えて、−夜インキユペートし
た。その後、dATP。
This pellet was dissolved in a buffer containing 0oC12, diteothreitol, poly(A), (32p) dcTp, and terminal deoxynucleotedyl transferase, and reacted at 37°C for 10 minutes, resulting in a total of 9 L per end.
OMP's io~/! residue was added. Then, the recovered oligo(aa) tail plasmid-cDNA:mR
9. The pellet containing NA was dissolved in a buffer containing bovine serum albumin, digested with the restriction enzyme H1ndl for 7 hours at 37°C, and precipitated with ethanol.9. The utnd■ digested oligo(ac) tail cDNA:mRNA plasmid was recovered. This was dissolved in a buffer containing the oligo(aC) tail linker-DNA obtained in (2) above, and incubated at 4j℃, J
Incubate for 30 minutes, hold for 30 minutes, and cool to 0°C. Then, in the presence of β-NAD and cotin adenine dinucleotide), Escherichia coli (L coli)
DNA ligase was added and incubated overnight. Then dATP.

dTTP、dGTP% dC!TP、β−MAD。dTTP, dGTP% dC! TP, β-MAD.

E、 coli D N Aリガーゼ、  B、 co
li D N Aポリメラーゼ及びE、coli RN
ase Hを添加して、この混合物をlコ℃at時間、
次いで室温で7時間インキュベートした後、冷却し、反
応を停止させ目的とするc DNA断片含有プラスミド
を得た。
E, coli DNA ligase, B, co
li DNA polymerase and E. coli RN
Ase H was added and the mixture was heated for 1 hour at °C.
After incubation at room temperature for 7 hours, the reaction was stopped and the desired cDNA fragment-containing plasmid was obtained.

(4)ついで、このプラスミドを用いて常法によシ、大
腸菌(Fi、 0O11) HB / 0 /を形質転
換させた。
(4) This plasmid was then used to transform Escherichia coli (Fi, 0O11) HB/0/ by a conventional method.

その後、プタープとして、アポリボプロティンA−1の
アミノ酸配列10♂−//、Z位T r p−G 1n
−G 1u−G 1u−M e tに相1補性のあるl
≠量体の合成オリゴヌクレオチド j’−0AT−CTC@CTC−CTCk−CC−J’
を用いて、Hanahanらの方法(Gene、 10
゜tj −J7. /910 )によってスクリーニン
グを行ない、これと相補性のある配列を含むクローンを
選択した。約コoo 、 oooの形質転換体中、約r
個のクローンが選択され、これらを数種の制限酵素によ
り処理し、そのうちの2つのクローンが共通の制限酵素
認識部位をもつことが判明した。そのうちで最も大きな
りローンphAニーAn!択L、このクローンの塩基配
列をMaxamとGilMrtの方法によシ決定した。
Then, as a ptarp, the amino acid sequence 10♂-// of apoliboprotein A-1, Z position T r p-G 1n
-G 1u-G 1u-M e t has complementarity l
≠mer synthetic oligonucleotide j'-0AT-CTC@CTC-CTCk-CC-J'
using the method of Hanahan et al. (Gene, 10
゜tj −J7. /910), and clones containing sequences complementary to this were selected. In transformants of about kooo, ooo, about r
Two clones were selected and treated with several restriction enzymes, and two of them were found to have a common restriction enzyme recognition site. The biggest loan among them is phA knee An! Optionally, the nucleotide sequence of this clone was determined by the method of Maxam and GilMrt.

第1図は上記クローンの塩基配列決定のために作成した
制限酵素切断地図を示す(ATG:翻訳開始コドン、T
GA:翻訳停止コドン)。また、第2図に上記DNA断
片の塩基配列及びそれよシ想定されるアミノ酸配列を示
す。
Figure 1 shows a restriction enzyme cleavage map prepared for determining the base sequence of the above clone (ATG: translation initiation codon, T
GA: translation stop codon). Furthermore, FIG. 2 shows the base sequence and the assumed amino acid sequence of the above DNA fragment.

B ヒトアポリボプロティンA−(様蛋白の産生 a)発現プラスミドの構築 1)プラスミドphA工l1i−/の構築(第3図)上
記Aで得られたプラスミドphAニーtを制限酵素Ba
n [で部分消化しく37℃2時間)、さらに制限酵素
Hpa l[で消化しく37℃、コ時間)、74L2b
p  の断片を得る。
B. Production of human apoliboprotein A-(like protein a) Construction of expression plasmid 1) Construction of plasmid phA engineering (Figure 3) Plasmid phA neat obtained in above A was digested with restriction enzyme Ba.
n [partially digested with 37°C for 2 hours), further digested with restriction enzyme Hpal [37°C for 2 hours], 74L2b
Obtain a fragment of p.

一方、プラスミドpBRJコ2を制限酵素二Δ11坦H
工で消化しく37℃、 2時間)大きい断片を得る(約tiooθbp)。つい
でこれらの二つの断片と合GTAI:t・・GGGGT
C をT≠DNAポリメラーゼの存在下で連結させ(11℃
、l≠待時間、プラスミドphA工l1l−/を得る(
第3図)。
On the other hand, transform plasmid pBRJco2 into restriction enzyme Δ11H
(2 hours at 37°C) to obtain a large fragment (approximately tiooθbp). Then these two fragments are combined GTAI:t...GGGGT
C ligated in the presence of T≠DNA polymerase (11°C
, l≠waiting time, obtain plasmid phA engineering l1l-/ (
Figure 3).

次に、このグラスミドを制限酵素Ec oR工、Bam
H工で消化し約1000bpの断片を得る。
Next, this grasmid was treated with restriction enzyme EcoR, Bam
Digest with H-engine to obtain a fragment of about 1000 bp.

一方、プラスミドpDRj弘0 (P、 −LB4io
chemicaLsよシ入手可能)を制限酵素Eco 
R工、Bam H工で消化しく37℃、一時間)、ニブ
ロモータ領域を含む約 !00bpの断片を得る。
On the other hand, plasmid pDRjhiro0 (P, -LB4io
(available from chemicalLs) and the restriction enzyme Eco
R engineering, Bam H engineering at 37℃ for 1 hour), including the nibro motor area! Obtain a 00bp fragment.

つぎに、プラスミドpBRJコλをEc。Next, plasmid pBRJ λ was transformed into Ec.

R1消化(37℃、2時間)、BAP処理(37℃、1
時間)シ、これと前記λつの断片をTFDNA!jガー
ゼで連結してC11℃、tr待時間、プラスミド phA工°に一/を得る。
R1 digestion (37°C, 2 hours), BAP treatment (37°C, 1 hour)
Time) Shi, this and the λ fragments are TFDNA! Ligate with J gauze to obtain a temperature of 11°C, tr waiting time, and plasmid phA processing time.

11)蛋白の産生 上記プラスミドphA工E−/を用い −て犬陽菌HB10/を形質転換し、得られた形質転換
株をMP−OA培地で培養し、蛋白を産生させた。電気
泳動によυヒトアポリボプロティンA−1様蛋白の産生
が確認された。
11) Production of protein The above-mentioned plasmid phA-E-/ was used to transform Inuyo bacterium HB10/, and the resulting transformant was cultured in MP-OA medium to produce protein. Production of human apoliboprotein A-1-like protein was confirmed by electrophoresis.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第1図は本発明に係るDNA断片が挿入されているプラ
スミドを有するクローンの制限酵素切断地図を示し、第
2図(a、b)は、本発明に係るDNA断片の塩基配列
及びそれよシ想定されるアミノ酸配列を示す。 第3図は本発明におけるプラスミドphA工に一/の構
築工程の概略図である。 図面の+1”【、1′白πに1更な1−)第 2 図(
λ) G’GAGTCCCCCACGGCCCTTCAGG 
ATG AAA GCT GCG GTG CTG A
CCCTG GCCGTG CTCTTCMat Ly
s Ala Ala Val Leu Thr Leu
 Ala Val Leu PheGACGAA CC
CCCCCAG AGCCCCTGG GAT CGA
 GTG AAG GACCTG GCCACT GT
G TACAsp  Glu  Pro  Pro  
Gln  Ser  Pro  Trp  Asp  
Arg  Val  Lys  Asp  Lsu  
Ala  Thr  Vat  Tyr丁CCCAG 
 TTT  GAA GGCTCCGCCTTCGGA
 AAIII CAG  CTA AACCTA  A
AG  CTCCTT  GAC6et Gln Ph
e Glu Gly Sir Ala Leu Gly
 Lys Glr+ Leu Asn Leu Lys
 Leu Leu aspCGCGAA CAG CT
CGGCCCT GTG ACCCAG GAG TT
CTGG GAT AACCTG GAA AAG G
AGArg  Glu  Gln  Leu  Gly
  Pro  Vat  丁hr  Gln  Glu
  Phe  Trp  Asp  Asn  Leu
  Glu  Lys  GluGAG GAG GT
G AAG GCCAAG GTG CAG CCCT
ACCTG GACGACTTCCAG AAG AA
G TGGGlu Glu Vol Lys Ala 
Lys Val Gln Pro Tyr Lau A
sp Asp Phs Gln Lys Lys Tr
p・   ・  ・  ・ AGACTGCGAGGA
ACTG  ACG  GGG  AGCCAG  G
CT  CGG  CAT  TTCTGG  CAG
  CAALeu Thr Gly Ssr Gln 
Ala Arg His PheTrp Gln Gl
n   −IGTG GAT GTG CTCAAA 
GACAGCGGCAGA GACTAT GTGVa
l  Asp Vat  Leu Lys Asp S
er Gly Arg Asp Tyr  Vat  
  30AACTGG  GACAGCGTG ACC
TCCACCnCAGCAAG  CτGASn Tr
p Asp S@r Val Thr Ser Thr
 Phe Sir Lys Leu   60ACA 
GAG GGCCTG AGG CAG GAG AT
G AGCAAG GAT CTGThr Glu G
ly Lau Arg Gln Glu Mat Ss
r Lys Asp Leu   90CAG GAG
 GAG ATG GAG CTCTACCGCCAG
 AAG GTG GAGGln Glu Glu M
at Glu Leu Tyr Arg Gln Ly
s Val Glu   120第3図(z) −1?1 手続ネm正書く方式) 昭和60年2月/と日
FIG. 1 shows a restriction enzyme cleavage map of a clone having a plasmid into which the DNA fragment according to the present invention has been inserted, and FIG. 2 (a, b) shows the base sequence of the DNA fragment according to the present invention and its sequence. The assumed amino acid sequence is shown. FIG. 3 is a schematic diagram of the construction steps for the plasmid phA construct according to the present invention. Figure 2 (
λ) G'GAGTCCCCCACGGCCCTTCAGG
ATG AAA GCT GCG GTG CTG A
CCCTG GCCGTG CTCTTCMat Ly
s Ala Ala Val Leu Thr Leu
Ala Val Leu PheGACGAA CC
CCCCAG AGCCCCTG GAT CGA
GTG AAG GACCTG GCCACT GT
G TACAsp Glu Pro Pro
Gln Ser Pro Trp Asp
Arg Val Lys Asp Lsu
Ala Thr Vat Tyr CCCAG
TTT GAA GGCTCCGCCTTCGGA
AAIII CAG CTA AACCTA A
AG CTCCTT GAC6et Gln Ph
e Glu Gly Sir Ala Leu Gly
Lys Glr+ Leu Asn Leu Lys
Leu Leu aspCGCGAA CAG CT
CGGCCCT GTG ACCCAG GAG TT
CTGG GAT AACCTG GAA AAG G
AGArg Glu Gln Leu Gly
Pro Vat Dinghr Gln Glu
Phe Trp Asp Asn Leu
Glu Lys GluGAG GAG GT
G AAG GCCAAG GTG CAG CCCT
ACCTG GACGACTTCCAG AAG AA
G TGGGlu Glu Vol Lys Ala
Lys Val Gln Pro Tyr Lau A
sp Asp Phs Gln Lys Lys Tr
p・ ・ ・ ・ AGACTGCGAGGA
ACTG ACG GGG AGCCAG G
CT CGG CAT TTCTGG CAG
CAALeu Thr Gly Ssr Gln
Ala Arg His PheTrp Gln Gl
n-IGTG GAT GTG CTCAAA
GACAGCGGCAGA GACTAT GTGVa
l Asp Vat Leu Lys Asp S
er Gly Arg Asp Tyr Vat
30AACTGG GACAGCGTG ACC
TCCACCnCAGCAAG CτGASn Tr
p Asp S@r Val Thr Ser Thr
Phe Sir Lys Leu 60ACA
GAG GGCCTG AGG CAG GAG AT
G AGCAAG GAT CTGThr Glu G
ly Lau Arg Gln Glu Mat Ss
r Lys Asp Leu 90CAG GAG
GAG ATG GAG CTCTACCGCCAG
AAG GTG GAGGln Glu Glu M
at Glu Leu Tyr Arg Gln Ly
s Val Glu 120 Figure 3 (z) -1?1 Procedural name (proper writing) February 1985/and date

Claims (6)

【特許請求の範囲】[Claims] (1)ヒトアポリポプロテインA− I 又はそれと同様
の生理活性を有するヒトアポリポプロテインA− I 様
物質をコードするDNAを含有するDNA断片を、発現
用ベクターのプロモータの下流に存在するクローニング
部位に導入し、ついで上記DNA断片を導入したベクタ
ーを宿主微生物に導入して同宿主を培養し、産生する蛋
白を取得することを特徴とするヒトアポリポプロテイン
A− I 様蛋白の産生方法。
(1) Introducing a DNA fragment containing DNA encoding human apolipoprotein A-I or a human apolipoprotein A-I-like substance with similar physiological activity into the cloning site located downstream of the promoter of the expression vector. A method for producing a human apolipoprotein A-I-like protein, which comprises the steps of: introducing the vector into which the DNA fragment has been introduced into a host microorganism; culturing the host; and obtaining the protein produced.
(2)プロモータがlac I により調節可能なもので
あることを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の方法
(2) The method according to claim 1, characterized in that the promoter is regulated by lac I .
(3)プロモータが¥tac¥プロモータであることを
特徴とする特許請求の範囲第2項記載の方法。
(3) The method according to claim 2, wherein the promoter is a \tac\ promoter.
(4)プロモータがβ−ラクタマーゼ遺伝子のプロモー
タであることを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の
方法。
(4) The method according to claim 1, wherein the promoter is a β-lactamase gene promoter.
(5)クローニング部位が翻訳開始部位の直前に存在す
る、¥Bam¥H I 部位であることを特徴とする特許
請求の範囲第1項記載の方法。
(5) The method according to claim 1, wherein the cloning site is a \Bam\H I site that is present immediately before a translation initiation site.
(6)宿主微生物が大腸菌であることを特徴とする特許
請求の範囲第1項記載の方法。
(6) The method according to claim 1, wherein the host microorganism is Escherichia coli.
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