JP2515975B2 - Polypeptide with antitumor effect - Google Patents

Polypeptide with antitumor effect

Info

Publication number
JP2515975B2
JP2515975B2 JP61040733A JP4073386A JP2515975B2 JP 2515975 B2 JP2515975 B2 JP 2515975B2 JP 61040733 A JP61040733 A JP 61040733A JP 4073386 A JP4073386 A JP 4073386A JP 2515975 B2 JP2515975 B2 JP 2515975B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
leu
val
ala
pro
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP61040733A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JPS6291198A (en
Inventor
泰治 古谷
純一 山岸
山田  正明
三津恵 野竹
Original Assignee
大日本製薬株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to EP85102093A priority Critical patent/EP0155549B1/en
Priority to JP8729785 priority
Priority to JP13628085 priority
Priority to JP85102093.3 priority
Priority to JP60-136280 priority
Priority to JP60-87297 priority
Application filed by 大日本製薬株式会社 filed Critical 大日本製薬株式会社
Publication of JPS6291198A publication Critical patent/JPS6291198A/en
Application granted granted Critical
Publication of JP2515975B2 publication Critical patent/JP2515975B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Application status is Expired - Lifetime legal-status Critical

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52Cytokines; Lymphokines; Interferons

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗腫瘍作用を有する新規ポリペプチド,その製法及び該ポリペプチドをコードするDAN等に関する。 Description of the Invention The present invention relates to novel polypeptides having an anti-tumor effect, relates DAN etc. encoding the preparation and the polypeptide.

マクロファージが産生する生理活性物質として、癌細胞を壊死させる因子が見い出され、このような細胞傷害活性を有する物質をTumor necrosis factor(TNF)と名付けた[Carswell,EAら、Proc.Nat.Acad.Sci.,LSA. 7 As physiologically active substance macrophages produced, found factors that necrotic cancer cells, a substance having such cytotoxic activity was named Tumor necrosis factor (TNF) [Carswell, EA, et al., Proc.Nat.Acad. Sci., LSA. 7
2 ,3666(1975)]。 2, 3666 (1975)]. その後、各種動物由来のTNFに関する研究が行なわれてきたが、特にヒトTNFについては大量生産が困難であるため、物質としての実体の究明には至らなかった。 Thereafter, Studies on TNF derived from various animals have been performed, especially since it is difficult to mass production for human TNF, did not lead to investigation entity as material.

本発明者等は遺伝子組み換え技術を応用したヒトTNF Human TNF present inventors have that applies recombinant technology
の大量生産を目的として研究を重ね、ヒトTNFをコードするcDNAのクローン化に成功すると共に、ヒトTNFの大量生産及び単離に成功し、これらの発明につき特許出願している(特開昭60−185799,特開昭60−232097,特願昭 Extensive research for the purpose of mass production of, with successful cloning of cDNA encoding human TNF, succeeded in mass production and isolation of human TNF, have filed a patent application per these inventions (JP 60 -185799, JP-A-60-232097, Japanese Patent Application No. Sho
59−172307等)。 59-172307, etc.).

その後、相次いでヒトTNFをコードする遺伝子のクローニング及び大腸菌における生産に関する研究成果が報告されている[Pennica,D.et al.,Nature, 312 ,724(198 Then, one after another is research on the production of cloning and Escherichia coli of the gene encoding human TNF have been reported [Pennica, D.et al., Nature , 312, 724 (198
4);Shirai,T.,et al.,Nature 313 ,803(1985);Wang,A. 4);. Shirai, T., et al, Nature 313, 803 (1985); Wang, A.
M.,et al.,Science, 228 ,149(1985)]。 M., et al., Science, 228, 149 (1985)].

本発明者等の一連の研究過程において、ヒトTNFは遺伝子上にその前駆体としてコードされていることが明らかになり、その前駆体のC末端側の155残基のアミノ酸配列からなるポリペプチドが成熟(mature)ヒトTNFであることをウサギTNFとのアミノ酸配列における相同性に基づき明らかにした。 In a series of research process of the present inventors, the human TNF becomes obvious that it is coded as a precursor thereof on gene, a polypeptide comprising the amino acid sequence of 155 residues of the C-terminal side of the precursor that the mature (mature) human TNF revealed on the basis of the homology in the amino acid sequence of the rabbit TNF.

更に研究を重ね、成熟ヒトTNFのC末端側150残基以下のアミノ酸配列よりなるポリペプチドが優れた抗腫瘍活性を有することを見い出すに至った。 Further extensive research, has led to find that it has a C-terminal 150 residues or less of the comprising amino acids sequence a polypeptide excellent antitumor activity of mature human TNF. 又、その前駆体部分の一部を含む成熟ヒトTNFポリペプチドのアミノ酸配列についてポップとウッズの方法[Proc.Nat.Acad.Sci. Also, pop and Woods methods for the amino acid sequence of mature human TNF polypeptide comprising a portion of its precursor portion [Proc.Nat.Acad.Sci.
USA, 78 ,3824(1981)]に従って、その親水性及び疎水性アミノ酸配列領域分布を解析した結果、第1図に示す通り、数ケ所の親水性領域が認められる。 Accordance USA, 78, 3824 (1981) ], the result of the analysis of the hydrophilic and hydrophobic amino acid sequence region distribution, as shown in FIG. 1, the hydrophilic region of several Kesho is observed. これら親水性領域は水溶液中では分子の外面に位置していると考えられ、これらの領域又は特定の領域が腫瘍(癌)細胞に対する抗腫瘍作用の発現に深く関連しているものと予想される。 These hydrophilic regions is thought to be located on the outer surface of the molecule in aqueous solutions, these areas or specific regions are expected to have closely related to the expression of antitumor effect against a tumor (cancer) cells . 成熟ヒトTNFのC末端側150残基のアミノ酸配列からなるポリペプチドが強い抗腫瘍活性を示すことから、 A polypeptide consisting of the amino acid sequence of the C-terminal side 150 residues of mature human TNF from that exhibit strong anti-tumor activity,
第1図において「 」で示した親水性領域のアミノ酸配列が抗腫瘍活性の発現に必ずしも必須ではないことが示唆されると共に、抗腫瘍活性の発現には後記146残基のアミノ酸配列〔I〕が大きく関与しているものと考えられるに至った。 With the amino acid sequence of the hydrophilic regions indicated by "A" is not necessarily essential for expression of antitumor activity is suggested in Figure 1, amino acid sequence of below 146 residues for expression of antitumor activity [I ] led to it is considered that greatly involved.

更に、成熟ヒトTNFのC末端のLeuのみを酵素処理(カルボキシペプチダーゼAによる処理)して遊離除去させた場合には、抗腫瘍活性が顕著に低下若しくは殆んど消失することから、C末端のLeuは抗腫瘍活性発現に必須であると考えられる。 Further, in the case where only the Leu at the C-terminus of mature human TNF by enzyme treatment (treatment with carboxypeptidase A) to free removal, since the anti-tumor activity is throat disappears N significantly reduced or 殆, the C-terminal Leu is believed to be essential for the anti-tumor activity expression.

本発明は、上記の様な新たな知見に基づき完成されたものである。 The present invention has been completed based on the new findings as described above.

本発明は、150以下のアミノ酸残基からなるポリペプチドであって、そのC末端側のアミノ酸配列が下記のアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその誘導体に関する。 The present invention is a polypeptide comprising the amino acid residues 150, relates to a polypeptide or a derivative thereof wherein the amino acid sequence of the C-terminal side consisting of the following amino acid sequence.

Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Try Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 〔I〕 本発明に係るポリペプチドとしては、上記式〔I〕で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの他、そのN末端に、Pro−Ser−Asp−Lys−,Ser−Asp−Lys−,Asp Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Try Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu [I] this the polypeptides according to the invention, other polypeptides comprising the amino acid sequence represented by the formula [I], at its N-terminus, Pro-Ser-Asp-Lys-, Ser-Asp-Lys-, Asp
−Lys−又は−Lys−が結合してなるポリペプチド或いは該ポリペプチドのN末端にMet−が結合したポリペプチドが具体的に挙げられる。 -Lys- or -Lys- combine to become a polypeptide or polypeptide to the N-terminus of the polypeptide Met- bound can be mentioned specifically.

本発明のポリペプチドの誘導体とは、該ポリペプチドの鎖上の側鎖官能基、N末端にアミノ基又はC末端のカルボキシル基を利用して形成される誘導体を意味し、例えばカルボキシル基と脂肪族アルコールとのエステル類,第一或いは第二アミンとの酸アミド類,アミノ基のN−アシル誘導体又はヒドロキシル基のO−アシル誘導体,側鎖酸アミド基の脱アミド体,更には該ポリペプチドのカルボキシル基又はアミノ基等とで形成される塩、 The derivatives of the polypeptides of the present invention means a derivative that is formed by utilizing the side chain functional group, an amino group or C-terminal carboxyl group of the N-terminus of the chain of the polypeptide, for example, a carboxyl group and fat esters of family alcohol, acid amides of the first or second amine, O- acyl derivatives of N- acyl derivatives or hydroxyl group of the amino group, deamidation of Gawakusarisan amide groups, even the polypeptide salts formed with the carboxyl group or amino group or the like,
例えば水酸化ナトリウム,水酸化カリウム,アルギニン,カフェイン,プロカイン,塩酸,グルコン酸等との塩が挙げられる。 Such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, arginine, caffeine, procaine, hydrochloric acid, salts of gluconic acid.

本発明のポリペプチドは、会合体として存在し得る場合もあり、このような会合体も本発明のポリペプチドに包含される。 Polypeptides of the present invention, there may be present as aggregates, such aggregates are also included in the polypeptides of the present invention.

本発明はまた、上記本発明のポリペプチドをコードするDNAにも関する。 The present invention also relates to DNA encoding the polypeptide of the present invention.

本発明に係るDNAの具体例としては、次の塩基配列 (5′)−CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG CTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG−(3′) 〔II〕 を有するDANの他、その5′末端に、 CCGAGTGACAAG−,AGTGACAAG−,GACAAG−又はAAG− が結合した塩基配列を有するDNA及びそれらの5′末端に更に開始コドンATG及び/又は3′末端に終止コドンが結合した塩基配列を有するDNA及び縮重(degenerat Specific examples of the DNA of the present invention, the following nucleotide sequence (5 ') - CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG CTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG- (3 ') other DAN with [II], the 5' end, CCGAGTGACAAG-, AGTGACAAG-, GACAAG- or AAG- bound DNA and degenerate having the nucleotide sequence stop codon bound to the DNA and 'further initiation codon ATG and / or 3' end terminus 5 thereof having the nucleotide sequence (Degenerat iv iv
e)コドンを含む該DNA誘導体が挙げられる。 The DNA derivatives including e) codon and the like.

上記発明以外の本発明は、以下の記述から明らかであろう。 The present invention other than the above-described invention will be apparent from the following description.

本発明に係るDNA及びポリペプチド並びにその誘導体は以下の様にして作製或いは製造することができる。 DNA and polypeptides and derivatives thereof according to the present invention can be produced or manufactured in the following manner.

ヒトTNFの前駆体或いは成熟ヒトTNFをコードするDNA DNA encoding the precursor or mature human TNF human TNF
は、例えば後記参考例に示した方法で作製することができる。 It can be manufactured by the method for example as shown in the following Reference Examples.

(1) このDNAを適当な制限酵素で切断し、これと必要に応じ、常法により合成したDNAアダプターとを結合することにより本発明のポリペプチドをコードするDNA (1) DNA that the DNA was cut with appropriate restriction enzymes, optionally with which encodes a polypeptide of the present invention by combining the DNA adapters were synthesized by a conventional method
断片を含むDNA,例えば、第1表に示したアミノ酸番号84 DNA containing the fragment, e.g., amino acid numbers shown in Table 1 84
〜233番,アミノ酸番号85〜233番,アミノ酸番号86〜23 ~233 number, amino acid number 85-233 number, amino acid number 86-23
3番,アミノ酸番号87〜233番,アミノ酸番号88〜233番に対応する塩基配列を含むDNAを作製することができる。 Third, amino acid numbers 87 to 233 number, it is possible to prepare a DNA containing a base sequence corresponding to amino acid numbers 88 to 233 number. また、本発明のポリペプチドをコードするDNA断片は、全合成することも可能である。 Furthermore, DNA fragments coding for the polypeptide of the present invention, it is possible to total synthesis. 更に詳しくは、本発明のポリペプチドそれ自体をコードする塩基配列を有するDNAの5′末端に開始コドンATGを、かつ3′末端には終止コドンを有するDNA断片を作製し、これを適当なプロモーター及びSD配列に続いて結合させ、ついでベクターに組み込む。 More specifically, polypeptide 5 of DNA having a nucleotide sequence encoding its own present invention 'the initiation codon ATG at the end, and 3' end to produce a DNA fragment having a stop codon, which a suitable promoter and following the SD sequence is bound, and then incorporated into a vector. このようにして本発明のポリペプチド生産用の形質発現ベクターを得ることができる。 In this way, the transformed expression vector for producing a polypeptide of the present invention can be obtained. プロモーターとしては、例えばlactrptacphoSphoA ,PL,S The promoter, e.g. lac, trp, tac, phoS, phoA, PL, S
V40初期プロモーター等が挙げられる。 V40 early promoter, and the like. SD配列から開始コドン間の配列としては公知のものを利用するか或いは好ましくは下記塩基配列からなる配列が利用される。 The sequence between the initiation codon from the SD sequence or preferably utilizes a known comprising the following nucleotide sequence sequence is utilized.

AAGGAGGTTATCGATTATG又は AAGGAGGTTTAATATTATG ベクターとしては、形質転換させる宿主中で増殖するものはすべて用いられ、例えば、プラスミド(pBR322 The AAGGAGGTTATCGATTATG or AAGGAGGTTTAATATTATG vector, used all those which grow in the host to be transformed, for example, a plasmid (pBR322
等),ファージ(λファージ誘導体等),ウイルス(SV Etc.), phage (λ phage derivatives and the like), virus (SV
40等),ランナウェイ プラスミドが挙げられる。 40, etc.), runaway plasmid, and the like.

(2) この本発明のポリペプチド生産用の形質発現ベクターを適当な宿主に、例えば大腸菌にコーエンらの方法[Proc.Nat.Acad.Sci.USA 69 ,2110(1972)]により、導入することにより形質転換体を得ることができる、 (3) ついでこの形質転換体をそれに応じた適当な培養条件下で培養することにより、目的とするポリペプチド或いはそのN末端にMetが結合したポリペプチドを産生させることができる。 (2) into a suitable host transformed expression vector for producing a polypeptide of the present invention, for example, by the method of Cohen et al. In E. coli [Proc.Nat.Acad.Sci.USA 69, 2110 (1972) ], introducing makes it possible to obtain a transformant, and (3) followed by culturing the transformant under appropriate culture conditions accordingly, the polypeptide or polypeptide Met is bound to the N-terminus for the purpose it can be produced. この培養物を例えば、リゾチーム消化と凍結融解や超音波破砕,フレンチプレス等により破壊したのち、遠心分離又は濾過することにより本発明のポリペプチド含有抽出液を得ることができる。 The cultures example, lysozyme digestion and freezing and thawing or sonication, then disrupted by French press or the like to obtain a polypeptide containing extract of the present invention by centrifugation or filtration.

(4) この抽出液を蛋白質の一般的な精製法(限外濾過,透析,イオン交換クロマトグラフィー,ゲル濾過, (4) General purification of the extract protein (ultrafiltration, dialysis, ion exchange chromatography, gel filtration,
電気泳動,アフィニティクロマトグラフィー等)に従い精精することにより、目的とする本発明のポリペプチドを得ることができる。 Electrophoresis, by at most in accordance with affinity chromatography and the like), it is possible to obtain a polypeptide of the present invention of interest.

(5) 本発明のポリペプチドの誘導体は、上記のようにして得られたポリペプチドを用いて、これに脂肪族アルコールを作用させ該ポリペプチドのエステル体を、カルボン酸の反応性誘導体を作用させ該ポリペプチドのN (5) derivatives of the polypeptides of the present invention, by using a polypeptide obtained as described above, the ester form of the polypeptide by the action of an aliphatic alcohol to the action of the reactive derivative of the carboxylic acid N of is the polypeptide
−アシル又はO−アシル体を、第1アミン又は第2アミンを作用させ該ポリペプチドのアミド体を、酸アミドを水解して脱アミド体を、それぞれ形成せしめることができる。 - acyl or O- acylated compound, the amides of the polypeptide by the action of a primary amine or secondary amine, deamidation body hydrolyzes the acid amide, it can be allowed to form, respectively. これらの反応は常法に従い行なわれる。 These reactions are carried out according to a conventional method. 更には、 Furthermore,
本発明のポリペプチドに有機酸,無機酸又は塩基を常法に従い作用させることにより本発明のポリペプチド塩を形成せしめることができる。 Organic acids to a polypeptide of the present invention, an inorganic acid or base may be allowed to form a polypeptide salt of the invention by acting in accordance with a conventional method.

尚、本明細書では記載の簡略化のために以下の略号を用いることにする。 Incidentally, in this specification will be the following abbreviations are used in order to simplify the description.

A アデニン C シトシン G グアニン T チミン Ala アラニン Arg アルギニン Asn アスパラギン Asp アスパラギン酸 Cys システイン Gln グルタミン Glu グルタミン酸 Gly グルシン His ヒスチジン Ile イソロイシン Leu ロイシン Lys リジン Met メチオニン Phe フェニルアラニン Pro プロリン Ser セリン Thr スレオニン Trp トリプトファン Tyr チロシン Val バリン DNA デオキシリボ核酸 cDNA 相補DNA sscDNA 単鎖cDNA dscDNA 二重鎖cDNA RNA リボ核酸 mRNA 伝令RNA poly(A)mRNA ポリアデニル酸含有伝令RNA dATP デオキシアデノシン三リン酸 dCTP デオキシシチジン三リン酸 dGTP デオキシグアノシン三リン酸 dTTP デオキシチミジン三リン酸 オリゴ(dT) オリゴデオキシチミジル酸 ポリ(A) ポリアデニル酸 dC デオキシシチジル酸 dG デオキシグアニル酸 EDTA エチレンジアミン四酢酸 A Adenine C Cytosine G Guanine T Thymine Ala Alanine Arg Arginine Asn Asparagine Asp Aspartic acid Cys Cysteine ​​Gln Glutamine Glu Glutamic acid Gly Gurushin His Histidine Ile Isoleucine Leu Leucine Lys Lysine Met Methionine Phe Phenylalanine Pro Proline Ser Serine Thr Threonine Trp Tryptophan Tyr Tyrosine Val Valine DNA deoxyribonucleic acid cDNA complementary DNA sscDNA single-stranded cDNA dscDNA duplex cDNA RNA ribonucleic acid mRNA messenger RNA poly (A) mRNA polyadenylation containing messenger RNA dATP deoxyadenosine triphosphate dCTP deoxycytidine triphosphate dGTP deoxyguanosine triphosphate dTTP deoxy thymidine triphosphate oligo (dT) oligo deoxythymidylate poly (A) polyadenylate dC deoxycytidylate dG deoxyguanylic acid EDTA ethylenediaminetetraacetic acid kbp キロ塩基対 bp 塩基対 SDS ドデシル硫酸ナトリウム MW 分子量 S配列 シャイン−ダルガーノ配列 TPA ホルボール−12−ミリステート−13−アセテート 以下に実施例及び参考例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。 kbp kilo base pairs bp base pairs SDS sodium dodecyl sulfate MW molecular weight S sequence Shine - Dalgarno sequence TPA phorbol-12-myristate-13-acetate to Examples and Reference Examples below illustrate the present invention more specifically.

実施例1 ポリペプチド[TNF(150)]の製造 (1) 参考例1の(8)項で得た組み換え体プラスミドpHTNF13から、制限酵素Pst Iによりクローン化DNAを切り出し、更に非翻訳領域の一部を制限酵素EcoR Iで分解除去し、約1.1kbpの断片を得た。 Example 1 polypeptide [TNF (0.99)] from production (1) Reference Example 1 (8) recombinant plasmid pHTNF13 obtained in section excised cloned DNA by restriction enzyme Pst I, one further untranslated region part decomposed was removed by restriction enzyme EcoR I, to obtain a fragment of about 1.1 kbp. これをプラスミドpB This plasmid pB
R322のPst I− EcoR I断片(約3.6kbp)に組み込むことにより再クローニングし、この組み換え体プラスミドを Recloned by incorporating R322 of Pst I- EcoR I fragment (about 3.6 kbp), the recombinant plasmid
pHTP113と名づけた。 It was named pHTP113.

このプラスミドpHTP113に制限酵素Ava IとSal Iを作用させ3種のDNA断片(それぞれ約0.8kbp,1.3kbp及び2. This plasmid pHTP113 restriction enzymes Ava I and Sal I to act three DNA fragments (each about 0.8 kbp, 1.3 kbp and 2.
6kbp)に切断した。 It was cut into 6kbp). これらのDNA断片のうち、ヒトTNFをコードする領域の大部分とプラスミドpBR322のテトラサイクリン耐性遺伝子の一部を含む約1.3kbpのDNA断片を分離精製した。 Of these DNA fragments were separated and purified the DNA fragment of about 1.3kbp containing part of the tetracycline resistance gene of most plasmid pBR322 region encoding human TNF. この断片に、常法により合成した次式 This fragment, synthesized following formula by a conventional method で示されるオリゴヌクレオチド アダプターをT 4 DNAリガーゼを用いて結合させた。 The oligonucleotide adapters shown in were combined using T 4 DNA ligase. ここに得られたDNA断片を、以下DNA断片(イ)という。 The DNA fragment obtained herein, hereinafter referred to as DNA fragment (A).

一方、 trpプロモーターベクターpDR720[Gene 20 ,231 On the other hand, trp promoter vector pDR720 [Gene 20, 231
(1982);P−Lバイオケミカルズ社より購入]に制限酵素EcoR IとHpa Iを作用させ、 trpプロモーター領域の一部を含むDNA断片(35bp)を切り出した。 (1982); P-L purchased from Bio Chemicals Inc.] is reacted with restriction enzyme EcoR I and Hpa I, to cut out a DNA fragment (35 bp) including a part of trp promoter region. このDNA断片の塩基配列は次式に示す通りである。 Nucleotide sequence of the DNA fragment are shown in the following equation.

これに、常法により合成した次式 To this, the following equation was synthesized by a conventional method で示されるオリゴヌクレオチド アダプターをT 4 DNAリカーゼを用いて結合させた。 The oligonucleotide adapters shown in were combined using T 4 DNA helicase. これに得られたDNA断片を、以下trpプロモーター断片という。 The resulting DNA fragment to this, hereinafter referred to as trp promoter fragment.

別途に、プラスミドpBR322に制限酵素EcoR IとSal I Separately, restriction enzyme into a plasmid pBR322 EcoR I and Sal I
を作用させ、大きなDNA断片(約3.7kbp)を切り出した。 Allowed to act were cut larger DNA fragment (about 3.7 kbp). これに、先に調製したDNA断片(イ)とtrpプロモーター断片をT 4 DNAリガーゼを用いて結合させることにより、第1表のアミノ酸番号84〜233番に相当する150残基のアミノ酸よりなるポリペプチド[TNF(150)]生産用の形質発現プラミドを構築した。 Thereto, by coupling the previously prepared DNA fragment and (b) the trp promoter fragments using T 4 DNA ligase, comprising amino acids of 150 residues corresponding to amino acid numbers 84 to 233 No. Table 1 poly peptide [TNF (150)] was constructed phenotypic expression Puramido for production. この形質発現プラスミドをpHTR55と名づけた(第2図参照)。 The phenotypic expression plasmid was named PHTR55 (see Figure 2).

(2) このプラスミド(pHTR55)を参考例1の(6) (2) This plasmid (PHTR55) of Reference Example 1 (6)
項に記載した方法に準じてE.coli HB101に導入し、形質転換体を得た。 It was introduced into E. coli HB101 according to the method described in the section, to obtain a transformant. 形質転換体の選択はテトラサイクリン(12.5μg/ml)耐性で行った。 Selection of the transformants was performed on tetracycline (12.5 [mu] g / ml) resistance.

この形質転換体をテトラサイクリン(12.5μg/ml)を含むLBブロス(組成:1当り、トリプトン10g,酵母エキス5g,NaCl10g;pH7.5)に一夜培養し、この培養液を10倍量の改良M9培地(組成:0.7%Na 2 HPO 4・12H 2 O,0.3%KH 2 P The transformant tetracycline (12.5 [mu] g / ml) LB broth containing (composition: 1 per tryptone 10 g, yeast extract 5g, NaCl10g; pH7.5) overnight culture, improving the culture solution in 10 volumes M9 medium (composition: 0.7% Na 2 HPO 4 · 12H 2 O, 0.3% KH 2 P
O 4 ,0.05%NaCl,0.1%NH 4 Cl,2mg/ビタミンB 1 ,0.45%カザミノ酸,1mM MgSO 4 ,0.1mM CaCl 2 ,0.5%ブドウ糖)に接種し、37℃で1時間培養し、次いでインドールアクリル酸を最終濃度20μg/mlになるように加え、更に24時間培養を継続したのち、遠心分離により菌体を集めた。 O 4, 0.05% NaCl, 0.1 % NH 4 Cl, 2mg / vitamin B 1, 0.45% casamino acids, 1mM MgSO 4, 0.1mM CaCl 2 , was inoculated into 0.5% glucose), incubated for 1 h at 37 ° C., then It added so as indole acrylic acid to a final concentration of 20 [mu] g / ml, then was further continued for 24 hours culture, collect the cells by centrifugation. 菌体を培地容量を1/10容量の0.1%リゾチームと30mM NaClを含む50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)に懸濁させ0℃ 0 ℃ suspended in HCl buffer (pH 8.0) - 50 mM Tris containing 0.1% lysozyme and 30 mM NaCl 1/10 volume of medium capacity cell
で30分間静置した。 In and allowed to stand for 30 minutes. 更にドライアイス/エタノール浴での凍結と37℃での融解を繰り返した後、遠心分離により菌体残渣を除いた上清抽出液を得た。 After further repeated thawing of frozen and 37 ° C. in a dry ice / ethanol bath, to obtain a supernatant extract excluding the cell debris by centrifugation. この抽出液について、下記方法に従い抗腫瘍活性を測定した結果、3×10 This extract, a result of measuring the anti-tumor activity according to the following method, 3 × 10
3単位/ml値を示した。 3 shows a unit / ml value.

(抗腫瘍活性の評価法) 検体を順次培地で希釈した試料0.1mlとL−M細胞(A (Antitumor activity evaluation method) sample was diluted sequentially media sample 0.1ml and L-M cells (A
TCC,CCL1.2)の1×10 5個/mlの懸濁液0.1mlを96穴の組織培養用マイクロプレート(フロー・ラボラトリー社製)に加える。 TCC, is added to 1 × 10 5 cells / ml suspension 0.1ml microplates for tissue culture 96-well of CCL1.2) (manufactured by Flow Laboratories, Inc.). 培地は1v/v%のウシ胎児血清を含むイーグルのミニマム・エッセンシャル培地[ポール著“セル アンド ティッシュカルチュア";“Cell and Tissue Medium 1v / v% of minimum essential medium Eagle, including fetal bovine serum [Paul Author "cell and tissue Culture"; "Cell and Tissue
Culture",E&S Livingstone Ltd.(1970)参照]を用いる。このマイクロプレートを5%の炭酸ガスを含む空気中、37℃で48時間培養する。培養終了後、グルタルアルデヒド20μを加え、生き残った細胞を固定する。固定後、マイクロプレートを洗浄、乾燥して、0.05%メチレンブルー溶液を0.1ml加え、固定された細胞を染色する。余分なメチレンブルーを洗い流し、乾燥後、固定された細胞に付着したメチレンブルーを0.36N塩酸で抽出し、その665nmにおける吸光度をタイターテック・マルチキャン(フロー・ラボラトリー社製)で測定する。この吸光度は、生き残った細胞数に比例する。L−M細胞の50%を殺すために必要な生理活性量を1単位/mlと定義し、試料を加えない対照の吸光度の50%の値に相当する試料の希釈率を、グラフあるいは計算によって求 Culture ", E & S Livingstone Ltd. (1970) Reference is used. The air containing microplates 5% carbon dioxide. After the cultivation for 48 hours at 37 ° C., glutaraldehyde 20μ addition, surviving cells fixing the. after fixation, washing the microplate, and dried, 0.05% methylene blue solution 0.1ml added to stain the fixed cells. wash away excess methylene blue, dried and adhered to the fixed cells methylene blue was extracted with 0.36N hydrochloric acid, measuring the absorbance at the 665nm in Titertek multi scan (manufactured by flow Laboratories, Inc.). the absorbance kill 50% of .L-M cells in proportion to the number of surviving cells It is defined as 1 unit / ml bioactive amount required for the dilution of the sample corresponding to 50% of the value of the absorbance of the control without addition of the sample, determined graphically or computed ,
その希釈率の逆数を試料の生理活性量(単位/mlで表記する)とする。 The reciprocal of the dilution physiologically active amount of a sample and (denoted in units / ml).

実施例2 ポリペプチド[TNF(150)]の製造 (1) 参考例1の(8)項で得た組み換え体プラスミドpHTNF13に制限酵素Ava IとHind IIIを作用させ、得られたDNA断片を5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、約600bpのDNA断片を単離した。 Example 2 polypeptide [TNF (0.99)] (1) Preparation of reacted with restriction enzyme Ava I and Hind III in recombinant plasmid pHTNF13 obtained in (8) section in Reference Example 1, the obtained DNA fragment 5 % were separated by polyacrylamide gel electrophoresis to isolate a DNA fragment of about 600 bp. このDNA断片に、常法により合成した次式 This DNA fragment by a conventional method synthesized following formula で示されるオリゴヌクレオチド アダプターをT 4 DNAリガーゼを用いて結合させた。 The oligonucleotide adapters shown in were combined using T 4 DNA ligase. 得られたDNA断片を、以下D The resulting DNA fragment, hereinafter D
NA断片(ロ)という。 That the NA fragment (b).

一方、プラスミドpCT−1[Proc.Nat.Acad.Sci.USA 8 On the other hand, the plasmid pCT-1 [Proc.Nat.Acad.Sci.USA 8
1 ,5959(1984)]に制限酵素Hpa IとAat IIを作用させt 1, 5959 (1984)] by the action of restriction enzyme Hpa I and Aat II in t
rpプロモーター領域の一部を含む約380bpのDNA断片[このDNA断片の3′末端から上流のtrpプロモーター領域の塩基配列は、ベネットらの報告(J.Mol.Biol., 121 113,1 nucleotide sequence upstream of the trp promoter region from the 3 'end of the DNA fragment [this DNA fragment of about 380bp containing the part of rp promoter region, Bennett et al reported (J. Mol. Biol., 121 113,
978年)に示されている]を切り出し、これを上記のDNA Cut out and which] is shown in 978 years), which in the DNA
断片(ロ)にT 4 DNAリガーゼを用いて結合させた。 They were combined using T 4 DNA ligase fragment (b). 得られたDNA断片を、以下DNA断片(ハ)という。 The resulting DNA fragment, hereinafter referred to as DNA fragment (C).

別途に、プラスミドpBR322に制限酵素Ava IとPvu II Separately, restriction enzyme into a plasmid pBR322 Ava I and Pvu II
を作用させ、大きなDNA断片(約3.7kbp)を0.7%アガロースゲル電気泳動により分離した。 By the action of a large DNA fragment (about 3.7 kbp) was separated by 0.7% agarose gel electrophoresis. このDNA断片の両端をDNAポリメラーゼI(クレノー フラグメント)及びd The ends of DNA polymerase I (Klenow fragment) of DNA fragments and d
GTP,dATP,dCTP,dTTPを用い平滑末端とし、その両端をT 4 GTP, and dATP, dCTP, blunted with dTTP, both ends thereof T 4
DNAリガーゼを用いて結合させた。 It was coupled with DNA ligase. このプラスミドベクターをpBRS6という。 This plasmid vector that pBRS6. 更に、このベクター(pBRS6)に制限酵素Aat IIとHind IIIを作用させ、大きなDNA断片(約3.6kbp)を単離精製した。 Further, by the action of restriction enzymes Aat II and Hind III to this vector (PBRS6), a large DNA fragment (about 3.6 kbp) was isolated and purified. このDNA断片に先に調製したDNA断片(ハ)をT 4 DNAリガーゼを用いて結合させることにより、第1表のアミノ酸番号84〜233番に相当する150残基のアミノ酸よりなるポリペプチド生産用の形質発現プラスミドを構築した。 By the DNA fragment previously prepared in the DNA fragment (c) is coupled with a T 4 DNA ligase, for producing a polypeptide consisting of amino acids 150 residues corresponding to amino acid numbers 84 to 233 No. in Table 1 It was constructed for gene expression plasmid. この形質発現プラスミドをpHTP361と名づけた(第3図参照)。 The phenotypic expression plasmid was named PHTP361 (see FIG. 3).

(2) この形質発現プラスミドpHTP361を用い、実施例1の(2)項に示した方法に従い、形質転換体を作製し、培養したのち菌体抽出液を得た。 (2) using the phenotypic expression plasmid PHTP361, according to the method shown in (2) of Example 1, to prepare a transformant, to obtain a cell extract after incubation.

この抽出液中の抗腫瘍活性は前記評価法に従い測定した結果、4×10 6単位/mlであった。 The antitumor activity of the extract is the result of measurement in accordance with the evaluation method and found to be 4 × 10 6 units / ml.

(3) (2)項で得た菌体抽出液に2%SDS,10%2− (3) (2) 2% cell extract obtained in terms SDS, 10% 2-
メルカプトエタノール及び10%グリセロールを含む0.12 0.12 containing mercaptoethanol and 10% glycerol
5M Tris−HCl緩衝液(pH6.8)を加え、室温にて30分間静置ののち、12.5%ポリアクリルアミドゲル(2×170 5M Tris-HCl buffer (pH 6.8) was added, after the stand 30 minutes at room temperature, 12.5% ​​polyacrylamide gel (2 × 170
×170cm)に負荷し、175Vで3時間泳動させた。 Loaded onto × 170cm), it was 3 hours run at 175V. 泳動終了後、ポリアクリルアミドゲルを蒸留水にて洗ったのちゲルの一部を切り取りクマシー ブリリアント ブルーで染色した。 After completion of the electrophoresis, a part of the gel after washing the polyacrylamide gel with distilled water and stained with cut Coomassie Brilliant Blue. 約16×10 3ダルトンの位置に濃いポリペプチドのバンドを確認したのち、その位置に対応するゲルを2mm巾で切り出し、細切したのち1%重炭酸アンモニウム水溶液に浸し、4℃にて24時間撹拌してゲル中のポリペプチドを抽出した。 After confirming the band of dark polypeptide at the position of about 16 × 10 3 daltons, the gel corresponding to the position cut by 2mm wide, immersed in 1% aqueous ammonium bicarbonate solution After minced, 24 hours at 4 ° C. stirred to extract the polypeptide in the gel. この操作を繰り返し行ない、得られた抽出液を集め、凍結乾燥により濃縮した。 Performs repeating this operation, collect the resulting extract was concentrated by lyophilization. この最終調製品を以下の分析実験に供した。 The final preparation was subjected to the following analysis experiments.

(i) 分子量 本品の分子量をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析にて測定した。 (I) the molecular weight of the molecular weight of this product was measured by SDS- polyacrylamide gel electrophoresis analysis.

電気泳動分析の諸条件は上記方法に準じた。 The terms and conditions of the electrophoresis analysis according to the method described above. 分子量既知の標準蛋白質としてホスフォリラーゼb(MW94,00 Phosphorylase a known molecular weight standard proteins b (MW94,00
0),ウシ血清アルブミン(MW67,000),オボアルブミン(MW43,000),炭酸脱水酵素(MW30,000),大豆トリプシン インヒビター(MW20,100)及びα−ラクトアルブミン(MW14,400)を用いた。 0), bovine serum albumin (MW67,000), ovalbumin (MW43,000), carbonic anhydrase (MW30,000) was used soybean trypsin inhibitor (MW20,100) and α- lactalbumin (MW14,400) .

その結果、分子量は16,000±2,000ダルトンと求められた。 As a result, the molecular weight was determined to be 16,000 ± 2,000 Dalton.

形質発現プラスミドpHTP361に組み込まれたポリペプチドをコードするDNAから翻訳されるアミノ酸配列(第1表のアミノ酸番号84〜233番に相当するアミノ酸配列)に基づいて算出される分子量は16,579ダルトン(ただし、開始コドンATGに由来するメチオニンを除いた) The molecular weight calculated based on the amino acid sequence translated from the DNA encoding the incorporated polypeptide phenotypic expression plasmid PHTP361 (amino acid sequence corresponding to amino acid numbers 84 to 233 No. in Table 1) is 16,579 Daltons (although, minus methionine derived from the initiation codon ATG)
であり、上記測定値とほぼ一致している。 , And the substantially matches the above measurements.

(ii) N末端部分アミノ酸配列 本品のN末端アミノ酸配列をエドマン分解法[Arch.B (Ii) N-terminal partial amino acid sequence Edman degradation method The N-terminal amino acid sequence of the product [Arch.B
iochem.Biophys., 22 ,475(1949)]により決定した。 Iochem.Biophys., was determined by 22, 475 (1949)].

その結果、N末端部のアミノ酸配列は、NH 2 −Pro−Se As a result, the amino acid sequence of the N-terminal portion, NH 2 -Pro-Se
r−Asp…であった。 r-Asp ... it was.

(iii) C末端部分アミノ酸配列 本品のC末端部分のアミノ酸配列はカルボキシペプチダーゼ−A及び−Yを用いる酵素法により決定した。 (Iii) the amino acid sequence of the C-terminal portion of the C-terminal partial amino acid sequence of this product was determined by an enzymatic method using carboxypeptidase -A and -Y.

その結果、C末端部分のアミノ酸配列は…Ile−Ala− As a result, the amino acid sequence of the C-terminal portion ... Ile-Ala-
Leu−COOHであった。 Was Leu-COOH.

以上のことより本品は、第1表におけるアミノ酸番号 The product from the above, the amino acid numbers in Table 1
84〜233番に相当するポリペプチドであることが確認された。 Be a polypeptide corresponding to No. 84-233 was confirmed.

実施例3 ポリペプチド[TNF(149)]の製造 (1) 第1表に示したアミノ酸配列第85〜233番に相当する149残基のアミノ酸よりなるポリペプチド[TNF Example 3 polypeptide [TNF (149)] (1) Preparation of polypeptide consisting of amino acids corresponding to 149 residues in the amino acid sequence No. No. 85-233 shown in Table 1 [TNF
(149)]生産用の形質発現プラスミド(pHTR56)を、 (149) gene expression plasmid for producing (PHTR56),
参考例3に示した組み換え体プラスミド(pHTR91)を用いて構築した(第4図参照)。 It was constructed using the recombinant plasmid (PHTR91) described in Reference Example 3 (see FIG. 4).

組み換え体プラスミドpHTR91に制限酵素Cla IとBal I Limiting the recombinant plasmid pHTR91 enzymes Cla I and Bal I
を作用させ、4つのDNA断片に切断し、それらのうち2 It reacted with, was cut into four DNA fragments, among them 2
種の小さな断片(それぞれ113bpと0.6kbp)を5%ポリアクリルアミド電気泳動にて分離精製した。 Seed small fragments (respectively 113bp and 0.6 kbp) was separated and purified by a 5% polyacrylamide electrophoresis. このうち小さな断片(113bp)を、更に制限酵素Dde Iにて2つのDN Of this small fragment (113 bp), 2 single DN further with restriction enzymes Dde I
A断片(47bpと66bp)に切断し、47bpのDNA断片を単離した。 Was cut into A fragment (47 bp and 66 bp), isolated a DNA fragment of 47 bp. このDNA断片を、以下47bp断片という。 This DNA fragment, hereinafter referred to as 47bp fragment.

この断片に、常法によりそれぞれ合成した次式 This fragment, the following formula was synthesized respectively by a conventional method 及び次式 And the following equation で示される2種類のオリゴヌクレオチド アダプターを Two types of oligonucleotide adapter shown in
T 4 DNAリガーゼを用いて順次結合させた。 It was sequentially coupled using T 4 DNA ligase. このDNA断片を、以下DNA断片(ニ)という。 This DNA fragment, hereinafter referred to as DNA fragment (d).

更に、このDNA断片(ニ)に実施例1に示した方法により得たtrpプロモーター断片をT 4 DNAリガーゼを用いて結合させた。 Furthermore, the trp promoter fragment was obtained by the method described in Example 1 to the DNA fragment (d) were coupled with T 4 DNA ligase. このDNA断片を、以下DNA断片(ホ)という。 This DNA fragment, hereinafter referred to as DNA fragment (e).

このDNA断片(ホ)に、先にプラスミドpHTR91より制限酵素Cla IとBal Iにより切り出した0.6kbpのDNA断片、すなわち、ヒトTNFポリペプチドのC末端部分をコードする領域を含むDNA断片を、T 4 DNAリガーゼを用いて結合させた。 This DNA fragment (E), DNA fragments of 0.6kbp was cut with restriction enzymes Cla I and Bal I from plasmid pHTR91 above, i.e., a DNA fragment containing the region encoding the C-terminal portion of the human TNF polypeptide, T 4 was coupled with DNA ligase. このDNA断片を、以下DNA断片(ヘ)という。 This DNA fragment, hereinafter referred to as DNA fragment (f).

別途に、プラスミドpBR322に制限酵素EcoR IとCla I Separately, restriction enzyme into a plasmid pBR322 EcoR I and Cla I
を作用させ、切断された2種のDNA断片のうち大きな断片(約4.3kbp)を単離し、この断片に上記のDNA断片(ヘ)をT 4 DNAリガーゼを用 By the action of a large fragment of the cut two DNA fragments (about 4.3 kbp) was isolated, use of T 4 DNA ligase the DNA fragment (F) in this fragment て結合させることにより、ポリペプチド[TNF(149)] By binding Te, polypeptide [TNF (149)]
生産用の形質発現プラスミドを構築した。 It was constructed phenotypic expression plasmid for production. この形質発現プラスミドをpHTR56と名づけた。 The phenotypic expression plasmid was named PHTR56.

(2) この形質発現プラスミドpHTR56を用い、実施例1の(2)項に示した方法に従い、形質転換体を作製し、培養したのち菌体抽出液を得た。 (2) using the phenotypic expression plasmid PHTR56, according to the method shown in (2) of Example 1, to prepare a transformant, to obtain a cell extract after incubation. この抽出液中の抗腫瘍活性は前記評価法に従い測定した結果、1×10 3単位/mlであった。 The antitumor activity of the extract is the result of measurement in accordance with the evaluation method and found to be 1 × 10 3 units / ml.

実施例4 ポリペプチド[TNF(149)]の製造 (1) 実施例3の(1)項で得た47bp断片に常法により合成した次式 Example 4 polypeptide [TNF (149)] (1) Preparation of synthesized following formula by a conventional method to 47bp fragment obtained by (1) the Example section 3 で示されるオリゴヌクレオチド アダプター,実施例3 In oligonucleotide adapter indicated, Example 3
の(1)項で合成したオリゴヌクレオチド アダプター〔E〕、更に常法により合成した次式 (1) an oligonucleotide adapter was synthesized in the section (E), further the following equation synthesized by a conventional method で示されるオリゴヌクレオチド アダプターをT 4 DNAリガーゼを用いてそれぞれ順次結合させた。 The oligonucleotide adapters shown in respectively are sequentially combined using T 4 DNA ligase. このDNA断片を、以下DNA断片(ト)という。 This DNA fragment, hereinafter referred to as DNA fragment (g).

一方、プラスミドpCT−1に制限酵素Hpa IとAat IIを作用させtrpプロモーター領域の一部を含む約380bpのDN On the other hand, about 380bp containing a part of trp promoter region by the action of restriction enzyme Hpa I and Aat II plasmid pCT-1 DN
A断片を切り出し、これを上記のDNA断片(ト)にT 4 DNA Excised fragment A, T 4 DNA it to the DNA fragment (g)
リガーゼを用いて結合させた。 It was coupled using a ligase. このDNA断片を、以下DNA This DNA fragment, following DNA
断片(チ)という。 That fragment (h).

更に、参考例3で得た組み換え体プラスミドpHTR91に制限酵素Bal IとHin d IIIを作用させ、ヒトTNFのC末端部分をコードする領域を含むDNA断片(487bp)を切り出し分離精製し、この断片を上記のDNA断片(チ)にT 4 DNA Further, Reference example 3 by the action of restriction enzyme Bal I and Hin d III in recombinant plasmid pHTR91 obtained was separated and purified excised DNA fragment (487 bp) containing the region encoding the C-terminal portion of human TNF, the fragment T 4 DNA to said DNA fragment (h)
リガーゼを用いて結合させた。 It was coupled using a ligase. このDNA断片を、以下DNA This DNA fragment, following DNA
断片(リ)という。 That fragment (Li).

別途に、プラスミドベクターpBRS6(実施例2の(1)項参照)に制限酵素Aat IIとHin d IIIを作用させ、大きなDNA断片(約3.6kbp)を単離精製した。 Separately, plasmid vectors PBRS6 (Example 2 (1) see Section) is reacted with restriction enzymes Aat II and Hin d III, a large DNA fragment (about 3.6 kbp) was isolated and purified. このD The D
NA断片に先に調製したDNA断片(リ)をT 4 DNAリガーゼを用いて結合させることにより、第1表のアミノ酸番号85 Previously prepared DNA fragment NA fragment (Li) by coupling with T 4 DNA ligase, in Table 1 amino acid No. 85
〜233番に相当する149残基のアミノ酸よりなるポリペプチド[TNF(149)]生産用の形質発現プラスミドを構築した。 Comprising amino acids of the corresponding 149 residues No. ~233 polypeptide [TNF (149)] was constructed phenotypic expression plasmid for production. この形質発現プラスミドをpHTP367と名づけた(第5図参照)。 The phenotypic expression plasmid was named PHTP367 (see Figure 5).

(2) この形質発現プラスミドpHTP367を用い、実施例1の(2)項に示した方法に従い、形質転換体を作製し、培養したのちポリペプチド含有抽出液を得た。 (2) using the phenotypic expression plasmid PHTP367, according to the method shown in (2) of Example 1, to prepare a transformant, to obtain a polypeptide containing extracts after incubation.

この抽出液中の抗腫瘍活性は前記評価法に従い測定した結果、3×10 6単位/mlであった。 The antitumor activity of the extract is the result of measurement in accordance with the evaluation method and found to be 3 × 10 6 units / ml.

(3) (2)項で得た抽出液から、ポリペプチドを分離精製した。 (3) (2) from the resulting extract in the section was separated and purified polypeptide.

抽出液100mlに10%ポリエチレンイミンの2mlを添加し、混和放置後、遠心分離にて上清液を得た。 Extract 100ml was added 2ml of 10% polyethyleneimine, after mixing allowed to stand to obtain a supernatant by centrifugation. この上清液100mlに飽和硫酸アンモニウム水溶液の200mlを添加し、混和放置後、遠心分離に沈殿を集めた。 The supernatant was added to 200ml of saturated aqueous ammonium sulfate solution to 100 ml, after mixing allowed to stand, the precipitate was collected to centrifugation. この沈殿を This precipitate
10mlの20mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)に溶解し、同緩衝液に対して透析した。 It was dissolved in 20 mM Tris-HCl buffer 10 ml (pH 8.0), and dialyzed against the same buffer.

その透析内液を、あらかじめ同緩衝液にて平衡化した The dialyzed solution was equilibrated in advance the same buffer
DEAE−セファロースCL−6B(ファルマシア社)のカラムに負荷した。 And loaded onto a column of DEAE- Sepharose CL-6B (Pharmacia). 20mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)にて同カラムを十分洗浄したのち、NaClの0〜0.3Mの濃度勾配で溶出した。 After washing thoroughly the same column at 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), and eluted with a gradient of 0~0.3M of NaCl.

抗腫瘍活性を有する溶出画分を集め、限外濾過にて濃縮し、更にセファクリルS−200カラムによるゲル濾過に付した。 Collected elution fraction having antitumor activity, concentrated by ultrafiltration and subjected to gel filtration by further Sephacryl S-200 column.

溶媒には5mMリン酸塩緩衝化生理食塩液(pH7.4)を用いた。 The solvent was used 5mM phosphate buffered saline (pH 7.4). 溶出位置として約35,000〜45,000ダルトンに相当する画分に、抗腫瘍活性を有するポリペプチドを回収し、精製ポリペプチド[TNF(149)]を得た。 The fraction corresponding to about 35,000~45,000 daltons as an elution position, a polypeptide with antitumor activity was recovered as a purified polypeptide [TNF (149)].

ここで得られた精製ポリペプチドについて、実施例2 For the purified polypeptide obtained in this Example 2
の(3)項に示した方法に従って分子量,N末端及びC末端のアミノ酸配列を分析した結果、分子量は16,500±30 (3) molecular weight according to the process shown in section, analysis of the amino acid sequence of the N-terminal and C-terminal, the molecular weight 16,500 ± 30
0ダルトンと求められ、N末端部分のアミノ酸配列は、S 0 Daltons and obtained, the amino acid sequence of the N-terminal portion, S
er−Asp−Lys−Pro…であった。 er-Asp-Lys-Pro ... was. 翻訳開始コドンATGに由来するMetは除かれていた。 Met derived from the translation initiation codon ATG had been removed. また、C末端アミノ酸としてLeuが同定された。 Further, Leu was identified as C-terminal amino acids.

以下の結果より、本品は第1表に示したアミノ酸配列第85〜233番に相当するポリペプチドであることが確認された。 The following results, this product was confirmed to be a polypeptide corresponding to the amino acid sequence No. No. 85-233 shown in Table 1.

実施例5 ポリペプチド[TNF(149)]の製造 (1) 第1表に示したアミノ酸配列第86〜第233番目に相当するポリペプチド[TNA(148)]生産用の形質発現プラスミド(pHTP369)を、参考例3に示した組み換え体プラスミド(pHTR91)を用いて構築した(第6図参照)。 Example 5 polypeptides [TNF (149)] (1) Preparation of polypeptide [TNA (148)] gene expression plasmid for the production corresponding to the amino acid sequence first 86 to # 233 th shown in Table 1 (PHTP369) It was constructed using recombinant plasmid (PHTR91) described in reference example 3 (see FIG. 6).

実施例3の(1)項で得た47bp断片に、常法により合成した次式 The 47bp fragment obtained by (1) the Example section 3, synthesized following formula by a conventional method で示されるオリゴブヌクレオチド アダプター及び実施例3の(1)項で合成したオリゴヌクレオチドアダプター〔E〕をT 4 DNAリガーゼを用いて順次結合させた。 In the Oligo Bed nucleotide adapter and Example 3 are shown the (1) an oligonucleotide adapter was synthesized in Section (E) were sequentially coupled with the T 4 DNA ligase.

このDNA断片を、以下DNA断片(ヌ)という。 This DNA fragment, hereinafter referred to as DNA fragment (j).

更に、このDNA断片(ヌ)に実施例4の(1)項で合成したオリゴヌクレオチド アダプター〔G〕をT 4 DNA In addition, the DNA fragment (j) to Example 4 (1) oligonucleotide adapters were synthesized in Section (G) T 4 DNA
リガーゼを用いて結合させた。 It was coupled using a ligase. このDNA断片を、以下DNA This DNA fragment, following DNA
断片(ル)という。 That fragment (Le).

一方、プラスミドpCT−1に制限酵素Hpa IとAat IIを作用させtrpプロモーター領域の一部を含む約380bpのDN On the other hand, about 380bp containing a part of trp promoter region by the action of restriction enzyme Hpa I and Aat II plasmid pCT-1 DN
A断片を切り出し、これを上記のDNA断片(ル)にT 4 DNA Excised fragment A, T 4 DNA which the above DNA fragment (Le)
リガーゼを用いて結合させた。 It was coupled using a ligase. このDNA断片を、以下DNA This DNA fragment, following DNA
断片(オ)という。 That fragment (e).

更に、参考例3で得た組み換え体プラスミドpHTR91に制限酵素Bal IとHin d IIIを作用させ、ヒトTNFのC末端部分をコードする領域を含むDNA断片(487bp)を切り出し分離精製し、この断片を上記のDNA断片(オ)にT 4 DNA Further, Reference example 3 by the action of restriction enzyme Bal I and Hin d III in recombinant plasmid pHTR91 obtained was separated and purified excised DNA fragment (487 bp) containing the region encoding the C-terminal portion of human TNF, the fragment T 4 DNA to said DNA fragment (O)
リガーゼを用いて結合させた。 It was coupled using a ligase. このDNA断片を、以下DNA This DNA fragment, following DNA
断片(ワ)という。 That fragment (Wa).

別途に、プラスミド ベクターpBRS6に制限酵素Aat I Separately, limited to a plasmid vector pBRS6 enzyme Aat I
IとHin d IIIを作用させ、大きなDNA断片(約3.6kbp)を単離精製した。 By the action of I and Hin d III, a large DNA fragment (about 3.6 kbp) was isolated and purified. このDNA断片に先に調製したDNA断片(ワ)をT 4 DNAリガーゼを用いて結合させることにより、ポリペプチド[TNF(148)]生産用の形質発現プラスミドを構築した。 By previously prepared DNA fragment on the DNA fragment (Wa) and combined using T 4 DNA ligase, polypeptide [TNF (148)] was constructed phenotypic expression plasmid for production. この形質発現プラスミドをpHTP369 The phenotypic expression plasmid pHTP369
と名づけた。 And it was named.

(2) この形質発現プラスミドpHTR369を用い実施例1の(2)項に示した方法に従い、形質転換体を作製し、培養したのちポリペプチド含有抽出液を得た。 (2) according to the method shown in (2) of Example 1 using the phenotypic expression plasmid PHTR369, to prepare a transformant, to obtain a polypeptide containing extracts after incubation. この抽出液中の抗腫瘍活性は前記評価法に従い測定した結果、5×10 5単位/mlであった。 The antitumor activity of the extract is the result of measurement in accordance with the evaluation method, was 5 × 10 5 units / ml.

(3) (2)項で得た抽出液から、ポリペプチド[TN (3) (2) from the resulting extract in the section, the polypeptide [TN
F(148)]を分離精製した。 F (148)] was isolated and purified.

抽出液100mlに10%ポリエチレンイミンの2mlを添加し、混和放置後、遠心分離にて上清液を得た。 Extract 100ml was added 2ml of 10% polyethyleneimine, after mixing allowed to stand to obtain a supernatant by centrifugation. この上清液100mlに硫酸アンモニウムを55%飽和になるように添加し、混和放置後、遠心分離にて沈殿を集めた。 This supernatant 100ml ammonium sulfate was added to a 55% saturation, after mixing allowed to stand, the precipitate was collected by centrifugation. この沈殿を10mlの20mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)に溶解し、 The precipitate was dissolved in 20 mM Tris-HCl buffer 10 ml (pH 8.0),
同緩衝液に対して透析した。 It was dialyzed against the same buffer.

その透析内液を、あらかじめ同緩衝液にて平衡化した The dialyzed solution was equilibrated in advance the same buffer
DEAE−セファロースCL−6B(ファルマシア社)のカラムに負荷した。 And loaded onto a column of DEAE- Sepharose CL-6B (Pharmacia). 20mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)にて同カラムを十分洗浄したのち、NaClの0〜0.2Mの濃度勾配で溶出した。 After washing thoroughly the same column at 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), and eluted with a gradient of 0~0.2M of NaCl.

抗腫瘍活性を有する溶出画分を集め、限外濾過にて濃縮し、更にセファクリルS−200カラムによるゲル濾過に付し、抗腫瘍活性を有するポリペプチドを回収した。 Collected elution fraction having antitumor activity, concentrated by ultrafiltration, further subjected to gel filtration on Sephacryl S-200 column was recovered polypeptide with antitumor activity.
溶媒には5mMリン酸塩緩衝化生理食塩液(pH7.4)を用いた。 The solvent was used 5mM phosphate buffered saline (pH 7.4).

この画分を再び上記と同方法でDEAE−セファロースCL This fraction again in the same way DEAE- Sepharose CL
−6Bを用いるカラム クロマトグラフィーを繰返し、更に限外濾過にて濃縮したのち、トヨパールHW−55カラムによるゲル濾過に付し、精製ポリペプチドTNF(148)を得た。 Repeated column chromatography using-6B, After further concentrated by ultrafiltration, subjected to gel filtration on Toyopearl HW-55 column to obtain purified polypeptide TNF (148).

この精製ポリペプチドについて、実施例2の(3)項に示した方法に従って、分子量,N末端及びC末端部分のアミノ酸配列を分析した結果、分子量は16,500±2,000 This purified polypeptide, according to the process shown in item (3) of Example 2, molecular weight, Analysis of the amino acid sequence of the N-terminal and C-terminal moiety, the molecular weight 16,500 ± 2,000
ダルトンと求められた。 Dalton and was asked. N末端部分のアミノ酸配列は、 The amino acid sequence of the N-terminal portion,
Met−Asp−Lys−Pro−Val−…であった。 Met-Asp-Lys-Pro-Val- ... it was. また、C末端アミノ酸としてLeuが同定された。 Further, Leu was identified as C-terminal amino acids.

以上の結果より本品は、第1表におけるアミノ酸番号第86〜233番に相当するポリペプチドのN末端にMetが付加されたものであることが確認された。 The product from the above results, Met at the N-terminus of a polypeptide corresponding to amino acid number No. No. 86-233 in Table 1 is one that was added was observed.

実施例6 ポリペプチド[TNF(147)]の製造 (1) 第1表に示したアミノ酸配列第87〜233番目に相当するポリペプチド[TNF(147)]生産用の形質発現プラスミドを、実施例5の(1)項に示した方法に従い、但し合成オリゴヌクレオチド アダプター〔H〕の代りに、次式〔I〕 EXAMPLE 6 polypeptide [TNF (147)] (1) Preparation of polypeptide [TNF (147)] gene expression plasmid for the production corresponding to amino acid sequence No. 87-233 th shown in Table 1, Example according to the method shown in 5 (1) of this section, except instead of the synthetic oligonucleotide adapters (H), the following formula [I] で示される合成アダプターを用いて構築した。 It was constructed in using synthetic adapters shown.

(2) この形質発現プラスミドを用い、実施例1の(2)項に示した方法に従い、形質転換体を作製し、培養したのちポリペプチド[TNF(147)]含有抽出液を得た。 (2) using the phenotypic expression plasmid according to the method shown in (2) of Example 1, to prepare a transformant, the polypeptide after incubation [TNF (147)] was obtained containing extract. この抽出液中の抗腫瘍活性は前記評価法により測定した結果、6×10 5単位/mlであった。 The antitumor activity of the extract is the result of measurement by the evaluation method was 6 × 10 5 units / ml.

(3) (2)項で得られた抽出液から、実施例5の(3)項に示した方法に従って、ポリペプチド[TNF(1 (3) (2) from the extract obtained in section, according to the process shown in item (3) of Example 5, the polypeptide [TNF (1
47)]を分離精製した。 47)] was isolated and purified.

この精製ポリペプチドについて、実施例2の(3)項に示した方法に従って分子量,N末端及びC末端部分アミノ酸配列を分析した結果、分子量は16,300±2,000ダルトンと求められた。 This purified polypeptide, the molecular weight according to the process shown in item (3) of Example 2, the results of analysis of the N-terminal and C-terminal partial amino acid sequence, the molecular weight was found to be 16,300 ± 2,000 daltons. N末端部分のアミノ酸配列は、Met The amino acid sequence of the N-terminal portion, Met
−Lys−Pro−Val−Ala…であった。 -Lys-Pro-Val-Ala ... it was. またC末端アミノ酸としてLeuが同定された。 The Leu was identified as C-terminal amino acids. 以上の結果より、本品は第1 From the above results, this product first
表におけるアイノ酸第87〜233番に相当するポリペプチドのN末端にMetが付加されたものであることが確認された。 It the N-terminus of the polypeptide corresponding to Aino acid number first 87-233 in Table in which Met is added was confirmed.

実施例7 ポリペプチド[TNF(146)]の製造 (1) 第1表に示したアミノ酸配列第88〜233番目に相当するポリペプチド[TNF(146)]生産用の形質発現プラスミドを、実施例5の(1)項に示した方法に従い、但し合成オリゴヌクレオチド アダプター〔H〕の代りに、次式 EXAMPLE 7 polypeptide [TNF (146)] (1) Preparation of polypeptide [TNF (146)] gene expression plasmid for the production corresponding to amino acid sequence No. 88-233 th shown in Table 1, Example according to the method shown in 5 (1) of this section, except instead of the synthetic oligonucleotide adapters (H), the following equation で示されるアダプターを用いて構築した。 It was constructed in using the adapter as shown.

(2) この形質発現プラスミドを用い、実施例1の(2)項に示した方法に従い、形質転換体を作製し、培養したのちポリペプチド[TNF(146)]含有抽出液を得た。 (2) using the phenotypic expression plasmid according to the method shown in (2) of Example 1, to prepare a transformant, the polypeptide after incubation [TNF (146)] was obtained containing extract. この抽出液中の抗腫瘍活性は前記評価法により測定した結果、1×10 2単位/mlであった。 The antitumor activity of the extract is the result of measurement by the evaluation method was 1 × 10 2 units / ml.

参考例1 ヒトTNF前駆体をコードするDNAのクローニング (1)ヒト肺胞マクロファージからのmRNA画分の単離 ヒト肺洗浄液からマクロファージを採取し、この肺胞マクロファージを10%牛胎児血清含有のRPMI−164培地に懸濁させてペトリディッシュ(直径8cm)に1枚当たり9×10 6個となるように播き、37℃で前培養した。 Reference Example 1 Human TNF precursor encoding cloning of DNA (1) macrophages were collected from the mRNA fraction isolated human lung lavage of human alveolar macrophages, the alveolar macrophages with 10% fetal bovine serum-containing RPMI -164 suspended in culture medium were seeded such that the 9 × 10 6 cells per one Petri dish (diameter 8 cm), the preincubated at 37 ° C.. 1
時間の前培養の後、エンドトキシン(大腸菌由来のリポポリサッカライド),TPA及びシクロヘキシミドをそれぞれ最終濃度が10μg/ml,10ng/ml及び1μg/mlとなるように添加混和し、更に培養を継続した。 After a time of pre-culture, endotoxin (lipopolysaccharide derived from E. coli), final concentrations of TPA and cycloheximide is added mixed so as to 10μg / ml, 10ng / ml and 1 [mu] g / ml, and culture was further continued. 4〜4.5時間後に培養液を吸引除去しディッシュ上に残ったマクロファージを0.6%ラウロイルサルコシン酸ナトリウムと6mMクエン酸ナトリウムを含む5Mグアニジルチオシアネート液で溶解し、ホモジナイズした。 The remaining macrophage cultures on Aspirate dish after 4-4.5 hours was dissolved in 5M guanylyl Jiruchi thiocyanate solution containing 0.6% sodium lauroyl sarcosinate and 6mM sodium citrate, and homogenized. このホモジネートを0.1ME The homogenate 0.1ME
DTAが含有5.7M CsCl 2水溶液上に重層し、超遠心分離機(RPS27−2ローター,日立製作所製)を用い26,500rpm DTA is overlaid on the content 5.7 M CsCl 2 an aqueous solution, 26,500Rpm using ultracentrifuge (RPS27-2 rotor, manufactured by Hitachi, Ltd.)
で20時間遠心し、全RNA画分をペレットとして得た。 In 20 hours centrifuged to obtain a total RNA fraction as pellets. これを0.35M NaCl,20mM Tris及び20mM EDTAを含む7M尿素液の少量に溶解し、エタノール沈殿として回収した。 This was dissolved in a small amount of 0.35 M NaCl, 7M urea solution containing 20 mM Tris and 20 mM EDTA, and collected as ethanol precipitation.

この全RNA画分を1mM EDTAを含む10mM Tris−HCl緩衝液(pH7.4)(以下TE液という)1mlに溶解し、65℃で5 The total RNA fraction was dissolved in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) (hereinafter referred to as TE solution) 1 ml containing 1 mM EDTA, 5 at 65 ° C.
分間加熱した。 It was heated minutes. これにNaCl溶液を0.5Mとなるように加えた後、あらかじめ0.5M NaClを含むTE液で平衡化したオリゴ(dT)セルロースカラムに付し、吸着したpoly After adding to the NaCl solution becomes 0.5M thereto, subjected to oligo (dT) cellulose column equilibrated with TE solution containing pre-0.5M NaCl, the adsorbed poly
(A)mRNAをTE液で溶出することにより、poly(A)mR (A) by eluting the mRNA in TE solution, poly (A) mR
NAを得た。 To give the NA.

(2)cDNAの合成 (1)項で得られたpoly(A)mRNAを鋳型としてグブラーとホフマンの方法[Gene 25 ,263(1983)]に従って According (2) Gubler and Hoffman method was poly (A) mRNA obtained in Synthesis (1) term of cDNA as a template [Gene 25, 263 (1983) ]
cDNAを合成した。 It was synthesized cDNA. すなわち、6μgのpoly(A)mDNA That, 6 [mu] g of poly (A) mDNA
を、10mM MgCl 2 ,10mMジチオスレイトール,4mMピロホスフェート ナトリウム,1.25mM dGTP,1.25mM dATP,1.25m The, 10mM MgCl 2, 10mM dithiothreitol, 4 mM pyrophosphate sodium, 1.25mM dGTP, 1.25mM dATP, 1.25m
M dTTP,0.5mM dCTP,0.167μMα− 32 P−dCTP(比活性30 M dTTP, 0.5mM dCTP, 0.167μMα- 32 P-dCTP ( specific activity 30
00Ci/mmole),4μgオリゴ(dT) 12〜18および120単位トリ骨髄性白血病ウイルス由来逆転写酵素を含む50mM T 00Ci / mmole), 4μg oligo (dT) 12 to 18 and 50 mM T containing 120 units avian myelogenous leukemia virus-derived reverse transcriptase
ris−HCl緩衝液(pH8.3)の40μに溶解させ、43℃で3 ris-HCl buffer 40μ was dissolved in a (pH 8.3), 3 at 43 ° C.
0分間反応させた後、EDTAを加えて反応を停止させ、フェノール−クロロホルム混液(1:1)で抽出し、その水層に酢酸アンモニウムを最終濃度2.5Mになるように加え、エタノールにより反応生成物(sscDNA−RNA複合体)を沈殿させた。 After reacting for 10 minutes, the reaction was terminated by adding EDTA, phenol - chloroform mixture: extracted with (1 1) was added so that the ammonium acetate to a final concentration of 2.5M aqueous layer, the reaction product by ethanol things and (sscDNA-RNA complex) was precipitated. このsscDNA−RNA複合体を、5mM MgC This sscDNA-RNA complex, 5mM MgC
l 2 ,10mM(NH 42 SO 4 ,100mM KCl,0.15mM β−ニコチンアミド アデニン ジヌクレオチド,50μg/mlウシ血清アルブミン,40μM dGTP,40μM dATP,40μM dTTP,40μM dC l 2, 10mM (NH 4) 2 SO 4, 100mM KCl, 0.15mM β- nicotinamide adenine dinucleotide, 50 [mu] g / ml bovine serum albumin, 40μM dGTP, 40μM dATP, 40μM dTTP, 40μM dC
TP,0.9単位大腸菌リボヌクレアーゼH,23単位大腸菌DNA TP, 0.9 units E. coli RNase H, 23 units E. coli DNA
ポリメラーゼIを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH7)100 20 mM Tris-HCl buffer containing polymerase I (pH 7) 100
μに溶解した。 It was dissolved in μ.

12℃で60分間、続いて22℃で60分間反応させた後、ED 60 minutes at 12 ° C., was reacted subsequently 60 minutes at 22 ° C., ED
TAを加えて反応を停止させ、上記と同様にフェノール− Reaction was quenched by the addition of TA, as in the phenol -
クロロホルム混液で抽出し、エタノールにより沈殿させてdscDNAを得た。 And extracted with chloroform mixture, to give a dscDNA precipitated by ethanol.

(3)dCテール付加cDNAの調製 (2)項で得られたdscDNAを2mM CoCl 2 ,0.2mMジチオスレイトール,0.1mM 32 P−dCTP(比活性3Ci/mmole)及び (3) dC tailed preparation of cDNA (2) 2 mM of dscDNA obtained in section CoCl 2, 0.2 mM dithiothreitol, 0.1mM 32 P-dCTP (specific activity 3Ci / mmole) and
10単位ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含有する100mMカコジル酸ナトリウム(pH7.2) 100mM sodium cacodylate containing 10 units terminal deoxynucleotidyl transferase (pH 7.2)
100μに溶解し、37℃で30分間反応させ、dscDNAの3′末端にdCテールを付加させた。 It was dissolved in 100 microns, and reacted at 37 ° C. 30 min, obtained by adding dC tails to the 3 'end of dscDNA.

反応はEDTA水溶液を添加して停止させ、フェノール− The reaction was stopped by adding EDTA solution, phenol -
クロロホルム混液で抽出し、dCテ−ル付加cDNAをエタノールにより沈殿させ回収した。 And extracted with chloroform mixture, dC tape - to recover precipitated with ethanol Le added cDNA. これを10mM Tris−HCl緩衝液(pH7.4),1mM EDTA及び100mM NaClを含む水溶液に This 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4), an aqueous solution containing 1 mM EDTA and 100 mM NaCl
1ml当たり2μgのdCテール付加cDNAを含むように溶解した。 It was dissolved to include dC tailed cDNA of 1ml per 2 [mu] g.

(4)dGテール付加プラスミドpBR322DNAの調製 プラスミドpBR322DNAの10μgを、20mM Tris−HCl緩衝液(pH7.4),10mM MgCl 2 ,50mM(NH 42 SO 4及び1ml当たり0.1mgのウシ血清アルブミンを含む水溶液100μに溶解し、制限酵素Pst Iエンドヌクレアーゼ15単位を加え、37℃で1時間反応させた。 (4) dG to 10μg Preparation plasmid pBR322 DNA of tailing plasmid pBR322DNA, 20mM Tris-HCl buffer (pH 7.4), bovine serum albumin 10mM MgCl 2, 50mM (NH 4 ) 2 SO 4 and 1ml per 0.1mg dissolved in an aqueous solution 100μ containing added restriction enzyme Pst I endonuclease 15 units, it was reacted at 37 ° C.. 反応液からDNAをフェノール−クロロホルム混液による抽出とエタノール沈殿によって回収した。 The DNA from the reaction mixture was subjected to phenol - was recovered by extraction and ethanol precipitation with chloroform mixture. 得られたDNAを(3)項に示した方法に従って、dGテープ付加プラスミドpBR322を得た。 According to the process shown resulting DNA in item (3), to obtain a dG tape additional plasmid pBR322. 但し、反応液量は200μとし、 32 P−dCTPの代わりに3 H− However, amount of the reaction solution was 200 [mu], 3 instead of 32 P-dCTP H-
dGTPを用い、さらに80単位のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ80単位を用いて37℃で20分間反応させた。 Using dGTP, it was further reacted at 37 ° C. 20 minutes using 80 units of terminal deoxynucleotidyl transferase 80 units. これを(3)項に示したdCテール付加cD dC tailing cD showing this (3) in section
NAの場合と同様の緩衝液に1ml当たり20μgのdGテール付加プラスミドpBR322DNAを含むように溶解した。 It was dissolved to include dG tailed plasmid pBR322DNA of 1ml per 20μg in same buffer as in the case of NA.

(5)組み換え体プラスミドの作製 (3)項で得られたdCテール付加cDNA溶液120μ (5) Preparation of recombinant plasmid (3) dC tail resulting in additional term cDNA solution 120μ
を、(4)項で得られたdGテール付加pBR322DNA溶液120 The, (4) dG tailed pBR322DNA solution 120 obtained in section
μと混合し、65℃で5分間、57℃で120分間インキュベートしてアニーリングを行い、組み換え体プラスミド溶液を調製した。 Mixed with mu, 5 minutes at 65 ° C., incubated perform annealing 57 ° C. for 120 minutes, to prepare a recombinant plasmid solution.

(6)形質転換体の選択 (5)項で得られた組み換え体プラスミド溶液を用い、 E.coli χ1776株を形質転換させた。 (6) using the recombinant plasmid solution obtained in selection (5) section transformant, and the E. coli Kai1776 strain was transformed. 即ち、 E.coli In other words, E.coli
χ1776株を、ジアミノピメリン酸100μg/ml及びチミジン40μg/mlを補ったL−ブロス20ml中、37℃で吸光度(600nm)が0.5となるまで培養し、菌体を4℃で遠心して集め、50mM CaCl 2含有10mM Tris−HCl緩衝液(pH7. The χ1776 strain was cultured to L- broth 20ml supplemented with diaminopimelic acid 100 [mu] g / ml and thymidine 40 [mu] g / ml, the absorbance at 37 ° C. (600 nm) is 0.5, collected by centrifugation the cells at 4 ° C., 50 mM CaCl 2 containing 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.
3)10mlに分散し、4℃で再度遠心して沈殿させた。 3) was dispersed in 10 ml, and precipitated again centrifuged at 4 ° C.. 集めた菌体を同じ緩衝液2mlに分散し、0℃で5分間静置した。 The collected cells were dispersed in the same buffer 2 ml, was allowed to stand for 5 minutes at 0 ° C.. この分散液0.2mlに(5)項で得られた組み換え体プラスミド溶液0.1mlを添加混合し、0℃で15分間静置し、更に42℃で2分間保持した後、前の培養で用いたのと同一組成のL−ブロス0.5mlを加えて1時間振盪培養を行った。 This dispersion 0.2ml (5) The recombinant plasmid solution 0.1ml obtained in section and mixed added, allowed to stand for 15 minutes at 0 ° C., was maintained for 2 minutes a further 42 ° C., were used in the previous cultivation adding L- broth 0.5ml Noto same composition was subjected to 1 hour shaking culture. この培養液の一部を取り、上記成分の他にテトラサイクリン15μg/mlを含むL−ブロス寒天天板に広げ、37℃で約12時間培養し、テトラサイクリン耐性菌を選択してcDNAライブラリーを作製した。 A portion of the culture solution, in addition to spread L- broth agar top plate containing tetracycline 15 [mu] g / ml of the above ingredients, and about 12 hours at 37 ° C., a cDNA library by selecting tetracycline-resistant bacteria did.

(7)クローニング (6)項で得られたcDNAライブラリーについて、ヒト (7) Cloning (6) cDNA library obtained in section, human
TNFをコードするcDNAを含むプラスミドを持つ形質転換体をスクリーニングするため、コロニー・ハイブリダイゼーション試験をハナハン(Hanahan)らの方法[Gene 1 For screening a transformant having a plasmid containing the cDNA encoding TNF, Hanahan the colony hybridization test (Hanahan)'s method [Gene 1
0 ,63(1980)]に従って行った。 0, was conducted in accordance with 63 (1980)]. プローブとして、参考例2の(8)項で得たウサギTNFをコードするクローン化DNAを制限酵素Hae II及びAva Iを用いて切り出し、それぞれ第2表の18〜105番の88bpから成るDNA断片と270 As a probe, cut with restriction cloned DNA encoding a rabbit TNF enzyme Hae II and Ava I obtained in (8) section of Reference Example 2, DNA fragment consisting of 88bp of No. 18 to 105 of Table 2, respectively and 270
〜568番の299bpから成る2種類のDNA断片を単離し、 32 P Two types of DNA fragments consisting ~568 No. 299bp isolated, 32 P
で標識したものを用いた。 In was used as the label. 約2万個のコロニーから、これらの標識プローブと強く結合する6個のコロニーを選び出した。 About 20,000 colonies were picked six colonies strongly bonded to these labeled probes.

(8)クローン化DNAの塩基配列の決定 (7)項で選択された組み換え体プラスミドの中から (8) from the determination of the base sequence of the cloned DNA (7) is selected in the section recombinant plasmid
pHTNF−13を選び、そのクローン化cDNAの塩基配列をマキサム−ギルバート法により決定した。 Select pHTNF-13, the nucleotide sequence of the cloned cDNA Maxam - was determined by Gilbert method. この塩基配列の解析により明らかにされたヒトTNF前駆体をコードする領域の塩基配列及びこの塩基配列から翻訳されるアミノ酸配列は第1表の通りである。 Nucleotide sequence and amino acid sequence translated from the nucleotide sequence of the region encoding the human TNF precursor revealed by analysis of the nucleotide sequences are as in Table 1. 成熟ヒトTNFをコードする領域(〔 〕で囲んだ部分)は、第2表に示した成熟ウサギTNFをコードする塩基配列との相同性に基づいて決定した。 Region encoding the mature human TNF ([portion surrounded by]) was determined on the basis of homology with the nucleotide sequence encoding the mature rabbit TNF shown in Table 2.

参考例2 ウサギTNFをコードするDNAのクローニング (1)ウサギ肺胞マクロファージからのmRNA分画の単離 ウサギ(体重約2.5kg)にプロピオニバクテリウム Reference Example 2 Cloning of DNA coding for rabbit TNF (1) Isolation rabbit mRNA fraction from rabbit alveolar macrophages (weighing about 2.5 kg) in Propionibacterium
アクネス死菌体を1羽当り100mgの投与量で静脈内に注入し、8日後に屠殺した。 The acnes dead cells were injected intravenously at a dose of 1 bird per 100mg, were sacrificed after 8 days. 直ちに開胸気管切開し、気管内に挿入したチューブを介してリン酸緩衝化生理食塩液を用い肺洗浄を繰返し、肺胞マクロファージを採取し、 Immediately thoracotomy tracheotomized, repeated lung wash with phosphate buffered saline through a tube inserted into the trachea, collect alveolar macrophages,
この肺胞マクロファージを10%牛胎児血清含有のRPMI− The alveolar macrophages 10% fetal bovine serum-containing RPMI-
1640倍地に懸濁させてペトリディッシュ(直径8cm)に1枚当り2×10 7個となるように播き、37℃で1時間培養した。 It was suspended in 1640 sown so that 2 × 10 7 cells per one Petri dish (diameter 8 cm), the incubated for 1 hour at 37 ° C.. 更に、参考例1の(1)項に示した方法に従って、エンドトキシン,TPA及びシクロヘキシミドとともに培養し、マクロファージからpoly(A)mRNAを得た。 Furthermore, according to the process shown in (1) section of Reference Example 1, endotoxin, incubated with TPA and cycloheximide, to give a poly (A) mRNA from macrophages. ここで得たpoly(A)mRNAをアガロースゲル電気泳動(ゲル濃度1%,6M尿素存在下,pH4)に付し、分子サイズとして1.6〜2.7kbに相当する画分にウサギTNF mRNAを高濃度に回収した。 Here obtained poly (A) mRNA to agarose gel electrophoresis (gel concentration 1%, the presence of 6M urea, pH 4) subjected to a high concentration of rabbit TNF mRNA in the fractions corresponding to 1.6~2.7kb as molecular size It was collected in.

(2)cDNAの合成 (1)項で得た精製poly(A)mRNA4μgを、10mM Mg (2) Purification poly (A) mRNA4μg obtained in Synthesis (1) term of cDNA, 10 mM Mg
Cl 2 ,70mM KCl,1mMジチオスレイトール,0.5mM dTTP,0.5m Cl 2, 70mM KCl, 1mM dithiothreitol, 0.5 mM dTTP, 0.5 m
M dCTP,0.5mM dATP,0.5mM dGTP(但しdCTPは32 Pで標識,比活性4.4×10 6 cpm/nmole),3μgオリゴ(dT) M dCTP, 0.5mM dATP, 0.5mM dGTP ( although dCTP are labeled with 32 P, specific activity 4.4 × 10 6 cpm / nmole) , 3μg oligo (dT)
12〜18及び80単位トリ骨髄性白血病ウイルス由来逆転写酵素を含む50mM Tris−HCl緩衝液(pH8.3)の100μに溶解させ、43℃で90分間反応させた後、EDTA水溶液で反応を停止させた。 Dissolved in 100μ of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.3) containing 12 to 18 and 80 units Avian myelogenous leukemia virus-derived reverse transcriptase and reacted for 90 minutes at 43 ° C., quenched with aqueous EDTA It was. フェノール−クロロホルム混液(1: Phenol - chloroform mixture (1:
1)によりcDNA−mRNA複合体を抽出し、エタノールにより沈殿させ回収した。 1) by extracting the cDNA-mRNA complex was recovered and precipitated with ethanol. 更に、アルカリ加温処理することによりmRNAを分解除去した後、合成されたsscDNAをエタノールにより沈殿させ回収した。 Furthermore, after decomposing and removing mRNA by treating an alkali warming, and the synthesized sscDNA it was precipitated with ethanol and recovered.

このsscDNAを、0.5mM dATP,0.5mM dTTP,0.5mM dGTP, This sscDNA, 0.5mM dATP, 0.5mM dTTP, 0.5mM dGTP,
0.5mM dCTP,5mM MgCl 2 ,70mM KCl,1.5mM β−メルカプトエタノール,8単位大腸菌DNAポリメラーゼI(ラージフラグメント)を含有する0.1Mへペス緩衝液(pH6.9)の4 0.5mM dCTP, 5mM MgCl 2, 70mM KCl, 4 of 1.5 mM beta-mercaptoethanol, 8 units E.coli DNA polymerase I Hepes buffer to 0.1M containing (large fragment) (pH 6.9)
0μに溶解し、15℃で20時間反応させdscDNAを合成した。 Was dissolved in 0Myu, it was synthesized dscDNA reacted at 15 ° C. 20 hours. 反応液にSDS水溶液を加えて反応を停止させ、dsc D The reaction by adding SDS aqueous solution to the reaction solution to stop, dsc D
NAをフェノール−クロロホルム混液で抽出し、エタノールにより沈殿させ回収した。 NA phenol - extracted with chloroform mixture were collected and precipitated with ethanol.

得られたdscDNAの沈殿を、50mM酢酸ナトリウム(pH4. The obtained precipitate of dscDNA, 50mM sodium acetate (pH 4.
5),1mM ZnSO 4 ,200mM NaCl,0.5%グリセロール及びS1ヌスレアーゼ0.5単位を含有する水溶液100μに溶解し、 5), it was dissolved in 1 mM ZnSO 4, 200 mM NaCl, the aqueous solution containing 0.5% glycerol and S1 Nusureaze 0.5 units 100 microns,
37℃で20分間反応させてヘアピン構造を開裂させた。 It reacted at 37 ° C. 20 minutes to cleave the hairpin structure. 反応はEDTA水溶液を添加して停止させ、フェノール−クロロホルム混液で抽出し、更にエーテルで再抽出した後、 The reaction was stopped by adding EDTA solution, phenol - extracted with chloroform mixture, then re-extracted further with ether,
エタノールにより沈殿させdscDNAを回収した。 Was recovered dscDNA was precipitated with ethanol.

(3)dCテール付加cDNAの調製 (2)項で得られたdscDNAの3′末端に参考例1の(3)項に示した方法に準じて、dCテールを付加させ、 (3) dC Preparation of tailing cDNA (2) of dscDNA obtained in section 3 'end of Reference Example 1 (3) according to the method shown in section, by adding dC tails,
これを10mM Tris−HCl緩衝液(pH7.4),1mM EDTA及び10 This 10 mM Tris-HCl buffer (pH7.4), 1mM EDTA and 10
0mM NaClを含む水溶液に1ml当り0.2μgのdCテール付加 dC tailing of 1ml per 0.2μg in an aqueous solution containing 0 mM NaCl
cDNAを含むように溶解した。 It was dissolved to contain cDNA.

(4)dGテール付加プラスミドpBR322 DNAの調製 dGテール付加プラスミドpBR322は参考例1の(4)項の方法により調製した。 (4) dG tailed plasmid pBR322 DNA Preparation dG tailing plasmid pBR322 was prepared by the method of item (4) of Reference Example 1. これをdCテール付加cDNAの場合と同様の緩衝液に1ml当り2μgのdGテール付加プラスミドpBR322 DNAを含むように溶解した。 This was dissolved to include dG tailed plasmid pBR322 DNA of 1ml per 2μg the same buffer as in the case of dC tailing cDNA.

(5)組み換え体プラスミドの作製 dCテール付加cDNA溶液50μをdGテール付加pBR322 D (5) dG Preparation dC tailed cDNA solution 50μ recombinant plasmid tailing pBR322 D
NA溶液50μと混合し、65℃で10分間、57℃で120分間、45℃で60分間、35℃で60分間及び室温で60分間インキュベートしてアニーリングを行い、組み換え体プラスミド溶液を調製した。 Mixed with NA solution 50.mu., 10 minutes at 65 ° C., 120 min at 57 ° C., incubated perform annealing 45 ° C. for 60 minutes, 60 minutes at 35 ° C. and at room temperature for 60 minutes to prepare a recombinant plasmid solution.

(6)形質転換体の選択 (5)項で得られた組み換え体プラスミド溶液を用い、参考例1の(6)項の方法に従ってE.coli χ1776 (6) using the recombinant plasmid solution obtained in selection (5) section transformant, E. coli according to the method of Reference Example 1 (6) section χ1776
株を形質転換させ、cDNAライブラリーを作製した。 The strain was transformed, to prepare a cDNA library.

(7)ハイブリダイゼーション試験 (6)項で得られたcDNAライブラリーの中から、下記の方法によりウサギTNFをコードするcDNAを含むプラスミドを持つ形質転換体をスクリーニングした。 (7) out of a hybridization test (6) cDNA library obtained in section and screened for transformants having a plasmid containing cDNA encoding rabbit TNF by the following method. (1)項の方法で得たmRNAを鋳型として、(2)項の方法で合成した32 P標識sscDNAを誘導プラス プローブとした。 (1) mRNA as a template obtained in the methods section and an induction plus probe 32 P-labeled sscDNA synthesized in (2) the methods section. 但し、 32 P−dCTPは高放射能比活性のものを用い、高濃度に標識した。 However, 32 P-dCTP is used as a highly radioactive specific activity were labeled to a high concentration. 別に、エンドトキシン,TPA及びシクロヘキシミドによる培養を省略したマクロファージを用いて、 Separately, endotoxin, using macrophages omitted incubation with TPA and cycloheximide,
同じ方法により調製した32 P標識sscDNAを誘導マイナス プローブとした。 32 P-labeled sscDNA prepared by the same method was induced negative probe. 約2万個のコロニーについて、これらのプローブを用いるコロニー・ハイブリダイゼーション試験を行ったところ、誘導プラスのプローブと強く結合し、誘導マイナスのプローブとはハイブリダイズしない塩基配列を含む組み換え体プラスミドを有する50個のコロニーを選別した。 About 20,000 colonies were subjected to colony hybridization test using these probes, binding strongly with induction plus probe, having a recombinant plasmid containing a nucleotide sequence that does not hybridize to the induction minus probe It was selected 50 colonies.

次いで、これらの選択された形質転換体の20個についてハイブリダイゼーション・トランスレーション試験をマニアティス編“モレキュラークローニング”[“Mole Then, Maniatis eds hybridization Translation tested 20 of these selected transformants "Molecular Cloning" [ "Mole
cular Cloning",329(1980),Cold Spring Harbor La cular Cloning ", 329 (1980), Cold Spring Harbor La
b.,]に記載の方法に従って行った。 b.,] it was carried out in accordance with the method described in. それぞれの形質転換体よりプラスミドDNAを抽出し、ニトロセルロースフィルター上に加熱変性させたのち固定し、これに上記(1)項で得たウサギTNF mRNAを含むpoly(A)mRNA画分を加え、50℃で180℃分間反応させ、ハイブリダイゼーションを行った。 Each plasmid DNA was extracted from the transformant, and a fixed mixture was allowed to heat denaturation onto nitrocellulose filters, which in the above (1) a poly (A) mRNA fraction containing rabbit TNF mRNA obtained in section added, reacted 180 ° C. min at 50 ° C., hybridization was performed. 結合したmRNAを溶出回収した後、アフリカツメガエルの卵母細胞を用いる方法により蛋白質に翻訳させ、その蛋白質のL細胞傷害活性をラフの方法[J.Immunol 126 ,235(1981)]に準じて測定することにより、回収されたmRNAがウサギTNF mRNAであるか否かを検定した。 After bound mRNA was eluted collected and translated into protein by a method using a Xenopus oocytes, measured according to the protein of L cytotoxic activity rough methods [J.Immunol 126, 235 (1981) ] by the recovered mRNA was assayed whether the rabbit TNF mRNA. この試験により、ウサギTNF mRNAと強くハイブリダイズするcDNAを含むプラスミドを持つ形質転換体3個を見いだした。 This test was found three transformants with plasmid containing cDNA hybridized strongly with rabbit TNF mRNA. そのうち最も長いcDNA(約750b Of which the longest cDNA (about 750b
p)を有するプラスミドよりcDNAを単離し、制限酵素Dde cDNA was isolated from the plasmid with a p), restriction enzymes Dde
IでDNA断片を切り出し、二次スクリーニング用のプローブとした。 Cut out DNA fragments in I, as a probe for secondary screening. このDNA断片を32 Pで標識し、上記(6)項で得たcDNAライブラリーについて再度コロニー・ハイブリダイゼーション試験を行い、標識プローブと強く結合するcDNAを含むプラスミドを持つ形質転換体を選んだ。 The DNA fragment was labeled with 32 P, the (6) is performed again colony hybridization test for cDNA library obtained in section, chose transformants having a plasmid containing cDNA binds strongly labeled probe.
cDNAライブラリーの約6万個のコロニーのうち98個が陽性コロニーであった。 98 out of about 60,000 colonies of cDNA library were positive colony. これらからcDNAを制限酵素Pst I Limit the cDNA from these enzymes Pst I
で切り出し、そのサイズをポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べ、1kbp以上のサイズを有する17個のクローンを選び出した。 Excised with, examine its size by polyacrylamide gel electrophoresis, it was selected 17 clones having a size of more than 1 kbp. これらのうち最も大きなcDNAを含む形質転換体(組み換え体プラスミド番号:pRTNF802)について、クローン化DNAを単離し、塩基配列を決定した。 Transformants containing the largest cDNA of these (the recombinant plasmid ID: pRTNF802) for the cloned DNA was isolated and sequenced.

(8)クローン化DNAの塩基配列の決定 (7)項で選択された組み換え体プラスミド(pRTNF8 (8) Determination of nucleotide sequence of cloned DNA (7) section at the selected recombinant plasmids (PRTNF8
02)から単離したクローン化cDNAの塩基配列をマキサム−ギルバート法で決定した。 The nucleotide sequence of the cloned cDNA was isolated from 02) Maxam - was determined by the Gilbert method.

その塩基配列及びこの塩基配列から翻訳されたアミノ酸配列は第2表の通りである。 The nucleotide sequence and amino acid sequence translated from this nucleotide sequence are shown in Table 2. ウサギTNF前駆体は第2 Rabbit TNF precursor is the second
表の19〜723番の塩基配列に、成熟ウサギTNFは262〜723 To 19-723 number of nucleotide sequence of the table, mature rabbit TNF is 262-723
番の塩基配列にコードされている。 It is encoded by turn of the nucleotide sequence.

参考例3 成熟ヒトTNF生産用形質発現プラスミドの構築 実施例1の(1)項で得たプラスミドpHT113に制限酵素Ava IとSal Iを作用させ、3種のDNA断片(それぞれ約0.8kbp,1.3kbp及び2.6kbp)に切断した。 Reference Example 3 mature human TNF production for phenotypic expression plasmid construction of Example 1 (1) into plasmid pHT113 obtained in section by the action of restriction enzyme Ava I and Sal I, 3 kinds of DNA fragments (each about 0.8 kbp, 1.3 It was cut into kbp and 2.6kbp). これらの断片のうち、ヒトTNFをコードする領域の大部分とプラスミドpBR322のテトラサイクリン耐性遺伝子の一部を含む約1.3kbpのDNA断片を分離精製した。 Of these fragments were separated and purified the DNA fragment of about 1.3kbp containing part of the tetracycline resistance gene of most plasmid pBR322 region encoding human TNF. この断片に、次式 In this fragment, the following equation で示されるオリゴヌクレオチド アダプターをT 4 DNAリガーゼを用いて結合させた。 The oligonucleotide adapters shown in were combined using T 4 DNA ligase. このDNA断片を、以下HTNF This DNA fragment, following HTNF
−アダプター断片という。 - that the adapter fragment.

別途に、プラスミドpBR322に制限酵素Eco R IとSal I Separately, restriction enzyme into a plasmid pBR322 Eco R I and Sal I
を作用させ、大きなDNA断片(約3.7kbp)を切り出した。 Allowed to act were cut larger DNA fragment (about 3.7 kbp). これに、先に調製したHTNF−アダプター断片と実施例1の(1)項で得たtrpプロモーター断片をT 4 DNAリガーゼを用いて結合させることにより、第1表のアミノ酸番号79〜233番に相当する155残基のアミノ酸よりなる成熟ヒトTNF生産用の形質発現プラミドを構築した。 Thereto, by coupling the trp promoter fragment was obtained by the previously prepared HTNF- the adapter fragment (1) section in Example 1 using T 4 DNA ligase, to amino acid number 79-233 No. in Table 1 It was constructed corresponding 155 transformed expression Puramido for mature human TNF production comprising amino acids residues. この形質発現プラスミドをpHTR91と名づけた。 The phenotypic expression plasmid was named PHTR91.

第7図はpHTR91の構築工程を示す。 Figure 7 shows a process building PHTR91.

参考例4 ポリペプチド[TNF(151)]の製造 第1表に示したアミノ酸配列第83〜233番目に相当するポリペプチド[TNF(151)]生産用の形質発現プラスミドを、参考例3の示した方法に従い、但し合成オリゴヌクレオチド アダプター〔K〕の代りに Reference Example 4 polypeptide [TNF (151)] polypeptide [TNF (151)] gene expression plasmid for the production corresponding to amino acid sequence No. 83-233 th shown in the preparation Table 1 shows the Reference Example 3 in accordance with the method, but instead of the synthetic oligonucleotide adapters [K] で示される合成アダプターを用いて構築した。 It was constructed in using synthetic adapters shown.

この形質発現プラスミドを用い、実施例1の(2)項に示した方法に従い、形質転換体を作製し、培養したのちポリペプチド含有抽出液を得た。 Using this trait expression plasmid according to the method shown in the item (2) in Example 1 to prepare a transformant, to obtain a polypeptide containing extracts after incubation.

この抽出液について、実施例1の(2)項に記載した抗腫瘍活性の評価法により測定した結果、2×10 5単位/ This extract of Example 1 (2) Results of measurement by the evaluation method of the antitumor activity described in claim, 2 × 10 5 units /
mlであった。 It was ml.

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

第1図はヒトTNFのアミノ酸配列の親水性・疎水性領域解析図を示す。 Figure 1 illustrates a hydrophilic-hydrophobic domain analysis diagram of the amino acid sequence of human TNF. 第2図は形質発現プラスミドpHTR55の構築工程図を示す。 Figure 2 shows the construction process diagram of gene expression plasmid PHTR55. 尚、図中の〔A〕,〔B〕は実施例1で示したそれぞれの合成オリゴヌクレオチド アダプターを意味する。 Note that [A] in the figure, [B] denotes the respective synthetic oligonucleotide adapters shown in Example 1. 第3図は形質発現プラスミドpHTP361の構築工程図を示す。 Figure 3 shows a construction process diagram of gene expression plasmid PHTP361. 尚、図中の〔C〕は実施例2で示した合成オリゴヌクレオチド アダプターを意味する。 Incidentally, [C] in the figure means the synthetic oligonucleotide adapters shown in Example 2. 第4図は形質発現プラスミドpHTR56の構築工程図を示す。 Figure 4 shows the construction process chart of gene expression plasmid PHTR56. 尚、図中の〔D〕,〔E〕は実施例3で示したそれぞれの合成オリゴヌクレオチド アダプターを意味する。 Note that [D] in the figure, [E] denotes the respective synthetic oligonucleotide adapters shown in Example 3. 第5図は形質発現プラスミドpHTP367の構築工程図を示す。 Figure 5 shows a construction process diagram of gene expression plasmid PHTP367. 尚、図中の〔E〕は実施例3で、〔F〕,〔G〕は実施例4で示したそれぞれの合成オリゴヌクレオチド In [E] Example 3 in the figure, [F], [G] Each of the synthetic oligonucleotides shown in Example 4
アダプターを意味する。 It refers to the adapter. 第6図は形質発現プラスミドpHTP369の構築工程図を示す。 Figure 6 shows the construction process diagram of gene expression plasmid PHTP369. 尚、図中の〔E〕は実施例3で、〔G〕は実施例4 In [E] Example 3 in the figure, [G] Example 4
で、〔H〕は実施例5で示したそれぞれの合成オリゴヌクレオチド アダプターを意味する。 In, [H] denotes the respective synthetic oligonucleotide adapters shown in Example 5. 第7図は形質発現プラスミドpHTR91の構築工程図を示す。 Figure 7 shows a construction process diagram of gene expression plasmid PHTR91. 尚、図中の〔B〕は実施例1で、〔K〕は参考例3 In (B) of Example 1 in the figure, [K] Reference Example 3
で示したそれぞれの合成オリゴヌクレオチド アダプターを意味する。 It means each of the synthetic oligonucleotide adapter indicated by.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 6識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:19) A61K 37/02 (56)参考文献 特表 昭62−500631(JP,A) Nature,Vol. ────────────────────────────────────────────────── ─── front page continued (51) Int.Cl. 6 in identification symbol Agency Docket No. FI art display portion C12R 1:19) A61K 37/02 (56) reference Kohyo Sho 62-500631 (JP, a) Nature, Vol. 312,(1984) P. 312, (1984) P. 724−729 724-729

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】 (57) [the claims]
  1. 【請求項1】下記のアミノ酸配列: Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Try Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu からなるポリペプチドのN末端にPro−Ser−Asp−Lys− [Claim 1] following amino acid sequence: Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Try Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile at the N-terminus of Ile Ala consisting Leu polypeptide Pro-Ser-Asp-Lys-
    が結合してなる抗腫瘍活性を有するポリペプチド。 There polypeptide having a binding to become anti-tumor activity.
JP61040733A 1984-03-06 1986-02-26 Polypeptide with antitumor effect Expired - Lifetime JP2515975B2 (en)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP85102093A EP0155549B1 (en) 1984-03-06 1985-02-26 Dna encoding human tumor necrosis factor and human tumor necrosis factor polypeptide
JP8729785 1985-04-23
JP60-136280 1985-06-21
JP60-87297 1985-06-21
JP13628085 1985-06-21
JP85102093.3 1985-06-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS6291198A JPS6291198A (en) 1987-04-25
JP2515975B2 true JP2515975B2 (en) 1996-07-10

Family

ID=27227704

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP61040733A Expired - Lifetime JP2515975B2 (en) 1984-03-06 1986-02-26 Polypeptide with antitumor effect

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2515975B2 (en)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GR851626B (en) * 1984-07-05 1985-11-26 Genentech Inc
WO1986002381A1 (en) * 1984-10-15 1986-04-24 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
JP2675294B2 (en) * 1984-10-15 1997-11-12 カイロン コーポレイション Human tumor necrosis factor

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2675294B2 (en) * 1984-10-15 1997-11-12 カイロン コーポレイション Human tumor necrosis factor

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nature,Vol.312,(1984)P.724−729

Also Published As

Publication number Publication date
JPS6291198A (en) 1987-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gubler et al. Molecular cloning establishes proenkephalin as precursor of enkephalin-containing peptides
US5260273A (en) Pulmonary surfactant protein and related polypeptide
FI95915B (en) Process for the preparation of therapeutically useful insulin analogues
KR100321651B1 (en) Peptide
US5077276A (en) Growth factor
EP0211148B2 (en) Mature human leukozyte interferons, process for their bacterial production, intermediates therefor and compositions containing them
JP3705732B2 (en) Novel polypeptide, a method for producing, dna encoding the polypeptide, a vector consisting of the dna, host cells transformed with the vector
JP2755394B2 (en) Tumor necrosis factor suppression sexual protein and its purification
CA2033176C (en) Growth hormone fusion proteins
US5427925A (en) Recombniant method for making leukemia inhibitor factor
EP0691406A1 (en) Process for the preparation of superoxide dismutase by recombinant DNA-technology
CN1130374C (en) Synthetic peptide analogs of lung surfactant protein SP-C
JP2567385B2 (en) Neurite-promoting factor and a method of manufacturing the same
DK172013B1 (en) DNA vector containing this DNA, host transformed with the vector, polypeptide contained in the DNA and its salt, aggregate containing the polypeptide as well as pharmaceutical composition containing the polypeptide or assembly.
CN1031893C (en) A mutant of protein for basic fibroblast growth factor, DNA and use thereof
JP2583770B2 (en) gene
USRE32637E (en) Physiologically active peptide
US5670338A (en) DNA encoding bone morphogenetic proteins, host cells transformed there by, and uses thereof
US5214132A (en) Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
EP0272703B2 (en) Novel polypeptide
EP0256843A1 (en) Expression of g-csf and muteins thereof and their use
EP0335243A2 (en) Mutant human angiogenin (angiogenesis factor with superior angiogenin activity) genes therefor and methods of expression
FI86992C (en) Foerfarande Foer framstaellning human tumoernekrosfaktor Science plasmid anvaend at foerfarandet
CA1341633C (en) Interleukin-2 polypeptides
EP0468337B1 (en) DNA coding for a human vasoconstrictive peptide and use thereof