JPS6185188A - 組換えｄｎａ含有ストレプトマイセスの選択方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、組換えＤＮＡを含有しているストレプトマイ
セス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　）宿主細胞の選択方
法、並びに該方法を実施するのに有用な組換えＤＮＡク
ローニングベクターおよび形質転換体に関するものであ
る。

本発明方法は、ストレプトマイセス内で用いるためにタ
イロシン耐性付与クローニングベクターを利用すること
に関する。ストレプトマイセス（こおける組換えＤ　Ｎ
　Ａ技術の発展と開発は、適当なりローユングベクター
上に、選択可能な遺伝的マーカーを得ることができるか
否かに依存している。

今日では、入手し得る、ストレプトマイセス内で利用可
能な選択マーカーの数が少いために、上記の発展は幾分
遅れていた。本発明は、その様な使用目的に適した選択
可能なマーカーの数を増加させるという意味で、有用で
あり、特に重要である。

本発明方法に用いられるベクターは、小さく、多方面に
利用でき、タイロシンに感受性を宵するあらゆるストレ
プトマイセス細胞を形質転換することができ、しかも選
択可能であるため、極めて有用である。ストレプトマイ
セスは臨床上重要な抗生物質の半数以上の生産に係って
おり、商業上ｔｉな微生物群である。本発明は、この工
業約９こｉｔな群のだめの、新規で有用なりローニング
システムおよびベクターを提供し、もって、既知の抗生
物質のＩｌｌ率を向上させ、さらには、新規な抗生物質
および抗生物質誘導体を生産する為に遺伝子をクローニ
ングすることを可能ならしめるものである。

本発明方法は、形質転換細胞を含むバックグラウンド責
背景）からストレプトマイセス形質転換体を選択する方
法を提供するものである。本発明方法によれば、本発明
ベクター（二選択不可能なりＮＡを挿入し、この修飾さ
れたベクターでストレプトマイセスを形質転換すること
により、さもなくば選択不可能なこのＤＮＡを含有して
いる形質転換体をタイロシン耐性に基いて選択すること
ができる。形質転換は極めて確率の低い現象であるので
、数百方間の細胞の内、どの細胞が形質転換番こ係るＤ
ＮＡを獲得したかを決定するため（こ、その様な機能テ
ストが実用上必要とされる。

本明細書中に開示し、クレームした発明の理解を助ける
ために、以下に用語を定義する。

組換えＤＮＡクローニングベクター：１またはそれ以上
のＤ　Ｎ　Ａセグメントを付加することのできる、もし
くはそれらが既に付加されたＤＮＡ分子からなる自律的
復製または組込み可能な物質であって、プラスミドを含
むがこれに限定されない。

形質転換：　ＤＮＡを宿主受容細胞中に導入し、その遺
伝子型を変化させ、その結果該受容細胞に変化をもたら
すこと。

トランスフエクタント：ファージＤＮＡで形質転換され
た組換え宿王細胞 形質転換体：形質転換された宿主受容細胞。

感受性宿主細胞：ある特定の抗生物質耐性を付与するＤ
ＮＡセグメントなしでは、該抗生物質の存在下において
生育できない宿主細胞。

制限フラグメント：ｉｔたは１以上の制限酵素の作用に
よって生じｆｃ＋頁線伏線状ＤＮＡ分子ァスミド；ファ
ージまたはプラスミドとして作用する組換えＤＮＡベク
ター。

Ａｐ＋’：アンピシリン１耐性表現型。

ｔｓｒＲ：　チオストレプトン耐性表現型。

ｚｙＪ　　：　　タイルシン附性表現型。

Ｔ−：テトラサイタリン耐性表現型、 ｍｅｌ　：チロシナーゼ遺伝子。

本発明は、組換えＤＮＡ含有ストレプトマイセス宿主細
胞を選択する方法であって、 ａ）形質転換、細胞分裂および培養可能なタイロ７ン感
受性の非制限的なストレプトマイセス宿主細胞を、該宿
主細胞内で自己複製または組込み可能であって、タイロ
シン耐性を付与し得るＤＮΔ配列を含有しているＨｉ換
えＤＮＡクローニングベクターにより形質転換し、 ｂ）形質転換された細胞を、タイロシン耐性の選択（こ
適した条件下で培養することからなる方法を提供するも
のである。

本発明はまた、上記の方法の実施に際して用いられるベ
クターおよび形質転換体（こ関するものでもある。

タイロシン耐性発現型◆こよってストレプトマイセス形
質転換体を選択する本発明方法の最も良い例は、ストレ
プトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅ
ｓ　　ｌ１ｖｉｄａｎｓ　）　Ｔ　Ｋ　２３をプラスミ
ドＰＳＶＢ２で形質転換し、得られた形質転換体をタイ
ロシン含有培地上で選択することである。プラスミドＰ
ＳＶＢ２　は、ストレプトマイセス・フラデイエ（ｆｒ
ａｄｉａｅ　）から単離され、プラスミドＰＩＪ７０２
Ｇニクローンされた新規なタイロシンを性付与遺伝子を
含有している。プラスミドＰＳＶＢ２は、ノーザン・リ
ージョナル・リサーチ・ラボラトリイ、アグリカルチュ
ラル・リサーチ・サービス、１８１５ノース・ユニバー
ンティ・ストリート、Ｕ、Ｓ、デパートメント・オブ・
アグリカルチャー、ペオリア、イリノイス６１６０４　
（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　　ＲｅｇｉｏｎａＪＲｅｓｅｒｃ
ｈ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｒａｌ　Ｒｅ５ｅｒｃｈＳｅｒｖｉｅｅ、　　ｌ　３　
ｌ　５　　Ｎｏｒｔｈ　　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　　５
ｔｒｅｅｔ　。

Ｕ、Ｓ、　　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　　ｏｆ　　Ａｇｒ
ｉｃｕｌｔｕｒｅ、　Ｐｅｏｒｉａ。

ＩＬ　　６１６０４．）＋こ、寄記番号ＮＲ＆Ｌ　１５
８８０の下で寄託され、そのパーマネント！ストック・
カルチャー・コレクションの一部となっている菌株、ス
トレプトマイセス・リビダンスＴ　Ｋ　２３　／ＰＳ■
２から得られる。プラスミドＰＳＶＢ２　　の制限サイ
トおよび機能地図を添付の第１図に示す。

第１図に示されている様に、プラスミドＰＳＶＢ２の〜
２．５　ｋｂ　Ｋｐｎｌ制限フラグメントは、本発明に
係るタイロシン耐性付与遺伝子の全体を含有している。

タイロシン耐性付与遺伝子の位置を知ることにより、本
発明方法をこ用いるのに有用なその他のクローニングベ
クターをも組立てることができる。すなわち、〜２．６
ｋｂ　　タイロシン耐性付与１ζ、ｎＩ制限フラグメン
トをプラスミドｐ　Ｉ　Ｊ　７０２のに、ｎＩ部位に挿
入してプラスミドＰＳＶＢ１２およびｐ　Ｓ　Ｖ　Ｂ　
２３を組立てた。これら２個のプラスミド、ＰＳＶＢ１
２とＰＳＶＪ３２３は、挿入フラグメントの方向性に関
してのみ異っている。出発物質のプラスミドＰＩＪ７０
２はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクンヨン、
１２３０１パーク。

−ン・ドライブ、ロックビレ、ＭＤ２０８５２（Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕｈｕｒｅ　　Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ　、　１２３ｏＩＰａｒｋＪａｗｎ　　Ｄ
ｒｉｖｅ　、　Ｒｏｃｋｖ目１ｅ％ＭＤ２０８５２）に
寄託番号ＡＴＣＣ３９１５５の下で寄託され、そのパー
マネント・ストック・カルチャー−コレクションの一部
となっている菌株、ストレプトマイセス・リビダンス／
ＰＩＪ７０２から得ることができる。プラスミドｐｉＪ
７０２、ｐ　Ｓ　Ｖ　Ｂ　１２　オヨ０’ＰＳＶＢ２３
の制限サイトおよび機能地固を、それぞれ添付の第２．
３および４因に示す。

プラスミドｐｌＪ７０２のＰｓｔ１部位に、プラスミＦ
ｐＳＶＢ２（７）　〜３．Ｓ　ｋｂ　ＰｓｔＩ制御９１
ラグメ７トを挿入することにより、プラスミドｐｓＶＢ
１６およびｐｓＶＪ３１８を組立てた、挿入されたフラ
グメントに２つの方向性が可能なため、この場合も２つ
のプラスミドが得られた。これらのプラスミドｐ　Ｓ　
Ｖ　Ｂ　ｌ　６　オヨびＰＳＶＢ１８ｉ１、挿入された
フラグメントがプラスミドｐｓＶＢ２の〜２，５ｋｂＫ
、。■タイロシン耐性付与制限フラグメントを含有して
いるので、本発明方法をことって有用である。

プラスミドｐｓＶＢ１６およびｐ　Ｓ　ＶＢ　１８の制
限サイトおよび機能地図を、それぞれ添付の第５および
６図に示す。

さらに、プラスミドｐｌＪ７０２のＢｇｌ［［部位に、
プラスミｌ’ｐｓＶＢ２の〜２．９　ｋｂ　ＢａｍＨＩ
−Ｂｇｌ■制限フラグメントを挿入することによってプ
ラスミドｐｌＪ７０２内に存在するチロシナーゼ遺伝子
を不活化し、別の例示プラスミドを組立てた。こうして
得られたプラスミドｐｓＶＢ２０およびＰＳＶＢ２２は
、挿入フラグメントの方向性に関しては異っているが、
いずれもタイロシン惑受性のストレプトマイセス宿主細
胞にタイロシン耐性を付与することができる。プラスミ
ドｐｓＶＢ２０およびＰＳＶＢ２２の制限サイトおよび
機能地図を、それぞれ添付の第７および８図番こ示す。

ライゲーションを容易にするため、本発明の例示ベクタ
ーの組立てに用いる制限フラグメントを常法（こよって
修飾することもできる、例えば特定のタイロシンｍａ付
与遺伝子含臀制限フラグメント、あるいは、複製機能ま
たは組込み機能を有するＤ　Ｎ　Ａに分子リンカ−を付
加する。こうして、以後のライゲーションのための特異
部位を簡単に作り上げることができる。さらに、様々な
タイロシン耐性遺伝子含有制限フラグメント、複製起源
または組込み用の配列に対し、ヌクレオチドの付加、削
除または置換を施すことによって修飾し、それらの性質
を変化させ、また、ＤＮＡのライゲーションのだめの様
々な制限部位を供給することができる。当業者はヌクレ
オチドの化学および遺伝子暗号等について理解している
ので、どのヌクレオチドが交換可能であり、また、ある
目的のためにどのＤＮＡ修飾法が好ましいかを知ること
ができる。また、〜２．５　ｋｂ　ＫｐｎＩタイロシン
耐性遺伝子含有制限フラグメントのクローニングベクタ
ー上での位置は、臨界的な（重要な）ベクター制御（コ
ントロール）機能を破壊しない限り、特定の位置に限定
されるものではない。当業者ならば、特定のタイロシン
耐性遺伝子含有制限フラグメントのライゲーションまた
は挿入に、ベクター上のどの位置が好都合であるかを理
解することができ、または容易に決定することができる
。

上記のベクターにはプラスミドｐｌＪ７０２由来のスト
レプトマイセス・レプリコンがｉ’ｚれているが、同種
のベクターの組立てには、様々な既知のストレプトマイ
セス・レプリコンを用いることができる。その他の機能
的なストレプトマイセス・レプリコンの供給源となり得
るストレプトマイセス・プラスミドを表１に例示する。

ただし、この一覧表は例示的なものであって全てを包括
するものではない。当業者には理解されることだが、レ
プリコン機能が破壊されない限り、本発明を例示するプ
ラスミドの組立てにはプラスミドの全体または一部のい
ずれを使用してもよい。各プラスミドを含有している宿
主、並びにその寄託番号を表１に記載した。

＊　アグリカルチュラル・リサーチ・カルチャーコレク
ソヨン（ＮＲＲＬ　）、１８１５ノース・ユニバーシテ
ィ・ストリート、ペオリア、イリノイス６１６０４．ア
メリカ合衆国（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　　Ｒｃｓｃ
ｒｃｈ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（
ＮＲＲＬ）、１８１５　　Ｎｏｒｔｈ　　Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ　　５ｔｒｅｅｔ。

Ｐｅｏｒｉａ、　　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ　　６１６０４．
　　Ｌｌｎｉｔｅｄ　　５ｔａｔｅｓｏｆ　　Ａｍｅｒ
ｉｃａ　） ＊＊　す７ヨナルコレクンヨン・オブ・インダストリア
ル・バクテリア（Ｎ（：ＩＢ）、）リイ・リサーチ・ス
テーゾョン、私書箱３１，１３５アベイロード、アバ−
ゾーンＡＢ９８ＤＧ。

スコツトランド連合王国（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎｏｆ　　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　　Ｂａｃ
ｔｅｒｉａ　（ＮＧ　Ｉ　Ｂ　）　。

Ｔｏｒｒｙ　　Ｒｅ５ｅｒｃｈ　　５ｔａｔｉｏｎ、　
Ｐｏ５ｔ　　０ｆｆｉｃｅＢｏｘ　　３１．１３５　Ａ
ｂｂｅｙ　　Ｒｏａｄ、　　ＡｂｅｒｄｅｅｎＡＢ９８
ＤＧ、　５ｃｏｔｌａｎｄ、　　Ｕｎｉｔｅｄ　　Ｋｉ
ｎｇｄｏｍ　）ファージφＣ３１は良く知られたストレ
プトマイセス・ファージであり、本発明を例示する姐込
み可能なタイロシン耐性付与ベクターの優れた供給源で
ある。ファージφＣ３１の誘導体である７γスミドｐＫ
ｃ３３１はその様な組込み用ベクターの組立てに特に好
ましく、これは、ノーザン・リージョナル・リサーチ・
ラボラトリイに寄託番号ＮＲＲＬＢ−１５８２８の下に
寄託され、そのパーマネント・ストック・カルチャー・
コレクションの一部となっている菌株、大腸菌Ｋ　ｌ　
２ＢＥ４４７／ｐＫｃ３３１から得ることができる。フ
ァスミドｐＫｃ３３１の〜３７ｋｂＰｓｔＩ制限フラグ
メントとプラスミドＰＳＶＢ２の〜３，８ｋｂタイロシ
ン耐性付与Ｐｓｃｌ制限フラグメントとをライゲートす
ることにより、誘導体ファージｐ　５ＶＢ３３１　ｏｔ
ａＪ：びｐＳＶＢ３３１１が得られる。これらのファー
ジはストレプトマイセスにタイロシン耐性を付与する組
込みベクターであり、これらもまた本発明を例示するも
のである。ファージｐｓＶＢ３３１０およびｐｓＶＢ３
３１１の制限サイトおよび機能地図をそれぞれ添付の第
９および１０図に示す。

本発明のベクターはストレプトマイセス・レプリコンと
タイロシン耐性付与制限フラグメントとを含有している
。ストレプトマイセス内よりも大腸菌内において、プラ
スミドの増幅と操作がより早く、しかも容易であるため
、大腸菌内で復製させ得る様なりＮＡ配列を加えること
は好都合である。従って、例えばｐＢＲ３２２、ｐ　Ａ
　ＣＹ　Ｃ１８４、ｐＢＲ３２５およびｐ　ＢＲ３２８
等の大腸菌プラスミドからの、機能的な、レプリコンを
含有している、抗生物質耐性付与制限フラグメントを付
加することは、極めて有用であり、本発明の例示プラス
ミドの一般的な用途を拡張するものである。

本発明方法に係るベクターはタイロンン感受性ストレプ
トマイセスまたは近縁の宿主細胞にタイロシン耐性を付
与する。タイロノン恩受性ストレプトマイセスにとって
通常、１０μｇ　／　ｍｌのタイロシンでも有害である
が、本発明のベクターを用いれば、タイロシンレベル１
０　Ｍｆ／／ｌｔｌ　Ｚでの１Ｉｔｌｌが付与される。

しかしながら、選択を目的とする場合に好ましいタイロ
シン濃度は、ストレプトマイセス・グリセオフスカスで
ＦＪ５０μｇ／ｙｔｔ１％　Ｓ。

ス リビダンで約５００μｇ／１ｔｔｌである。その他のス
トへ レプトマイセス種について、選択を目的とする場合の好
ましいタイロシン濃度は、当該技術分野で周り、（］の
方法（こより、容易に決定することかできる。

本発明の全ての態様が有用であるが、いくつかの胡ｊｆ
Ｊ　、（Ｄ　Ｎ　Ａタローエングベクターおよび形質転
換体か好ましし・。そ、れらの好ましいベクターおよび
形質転換体を表２に示す。

表　２　好ましいベクターおよび形質転換体プラスミド
　　形　質　転　換　体 ＰＳＶＢ２　　　　ストレプトマイセス・リビダンス（
Ｓｔｒｅ　ｃｏｍ　ｃｅｓ　　ｌ１ｖｉｄａｎｓ　）Ｐ
ＳＶＢ２　　　　　ストレプトマイセス・グリセオフス
カス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｇｒｉｓｅｏｆｕ
ｓｃｕｓ）ｐｓＶＢ１２　　　ストレプトマイセス・リ
ビダンスＰＳＶＢ１２　　　ストレプトマイセス・グリ
セオフスカスｐＳＶＢ２３　　　ストレプトマイセス・
リビダンスｐＳＶＢ２３　　　ストレプトマイセス・グ
リセオフスカスｐｓＶＢ１６　　　　ストレプトマイセ
ス・リビダンスｐｓＶＢ１６　　　ストレプトマイセス
・グリセオフスカス１）ＳＶＢ１８　　　ストレプトマ
イセス・リビダンスｐＳＶＢ１８　　ストレプトマイセ
ス・グリセオフスカスＰＳＶＢ２０　　　ストレプトマ
イセス−リビダンスＰＳＶＢ２０　　　ストレプトマイ
セス・グリセオフスカスＰＳＶＢ２２　　　ストレプト
マイセス・リビダンスＰＳＶＢ２２　　　ストレプトマ
イセス・グリセオフスカス本発明に係る岨換えＤＮＡク
ローニングベクターは、その用途をストレプトマイセス
の単一の種または１株に限るものではな（・。逆に、本
ベクターは広範囲の適用が可能で、多くのストレプトマ
イセス類のタイロシン感受性宿王用胞、特にアミノグリ
コンド、マクロライド、β−ラクタム、ポリエーテルお
よびグリコペプチドのような抗生物質を産生ずる経済的
重要性のある非制限菌株に導入することかできる。こう
した非制限菌株は、当業者周方の常法〔ロモフスカヤ（
Ｌｏｍｏｖｓｋａｙａ）等、１９８０、マイクロバイオ
ロジカルレビューズ（ＭｉｃｒｏｂｉｏＪｏｇｉｃａＪ
　　　Ｒｅｖｉｅｗｓ　　）４　４　　：　　２　０　
６　　）’ｔこより、ストレプトマイセス類から容易に
選択、分尊される。非制限菌株の宿生細胞は制限酵素を
欠くため、形質転換の際プラスミドＤＮＡをり断したり
劣化させることがない。本発明（こおいては、本発明に
係るベクターのいかなる制限サイトも切断しない制限酵
素を含んでいる宿主細胞もまた非制限性とみなすことと
する。

アミノグリコンド抗生物質を産生し、本発明に係るベク
ターを特（こ有用（こ使用でき、形質転換できるストレ
プトマイセス類の非制限的な菌株の好ましい宿主細胞に
は、例えば以下の菌株に由来する非制限細胞が含まれる
： Ｓ、カナマイセ子カス（Ｓ　、　Ｋａｎａｍｙｃｅｔｉ
ｃｕｓ　）（カナマイノンｍ）、Ｓ、　　タレストマイ
セチカス（５、ｃｈｒｅｓ　ｔｏｍγｃｅｃｉｃｕｓ　
）　　（アミノシジン）、Ｓ。

グリセオフラバ７、　（Ｓ　、　ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖ
ｕｓ　）　（抗生物質ＭＡ１２６７）、Ｓ、ミクロスポ
レウス（Ｓ。

ｍ１ｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ　）　（抗生物質５Ｆ−７６
７）、Ｓ。

リボシジフイカス（Ｓ、ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ）
（抗生物質５Ｆ７３３）、Ｓ＋フラホヘルンカス（Ｓ、
ｆＩａｖＯＰｅ−ｒｓｉｃｕｓ　）（スペクチノマイン
ン）、Ｓ、スペクタビリス（Ｓ、５ｐｃｃｔａｂｉｌｉ
ｓ　）（７クチノスヘクタシン）、５、ＩＪモサス・ホ
ルマ、パロモマインナス（Ｓ。

ｒｉｍｏｓｕｓ　ｆｏｕｍ）’Ｆｉｎｕｓ　）　ノ＜　
Ｏモア　イツ：／　類、（カテヌリン）、Ｓ、フラグイ
エ。バー、イタリカス（Ｓ、ｆｒａｄｉａｅｖａｒ、　
１ｔａｌｉｃｕｓ　）　（７ミノンジン）、Ｓ、プルエ
ンシス・バー・プルエンシス（Ｓ。

ｂｌｕｅｎｓｉｓ　　ｖａｒ、　ｂｌｕｅｎｓｉｓ）（
プルエンソマイシン）、Ｓ、カテニューレ（Ｓ、　ｃａ
ｔｅｎｕＪａｅ　）　（カテヌリン）。

Ｓ、オリボレテイキュリ・バー・セルロフイラス（Ｓ、
ｏｌｉｖｏｒｅｃｉｃｕｌｉ　ｖａｒ　ｃｅｌｌｕｌｏ
ｐｈｉｌｕｓ　）　（デストマンンＡ）、Ｓ、ラベンデ
ュ−しく　Ｓ　、　Ｊａｖｅｎ−ｄｕｌａｅ　）（ネオ
マイノン）、Ｓ、アルボグリセオラス（Ｓ、　ａｌｂｏ
ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　）（ネオマインン類）、Ｓ６テネ
ブラリウス（Ｓ、ｔｅｎｅｂｒａｒｉｕｓ　）（）ブラ
マイ、アブラマイシン シン）、Ｓ、アルプス・バー・メタマイシヌス（八 （Ｓ、ａｌｂｕｓ　　ｖａｒ、　ｍｅｔａｍｙｃｉｎｕ
ｓ　〕（メ９　フィシン）、Ｓ、バイグロスコピカス・
バー・サガミエンンス（Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕ
ｓ　　ｖａｒ、　ｓａｇａｍｉｅｎｓｉｓ　）　（スペ
クチノマインン）、Ｓ、ビキニエンンス（Ｓ、ｂｉｋｉ
ｎｉ　−ｅｎｓｉｓ　）　（ストレプトマイシン）、Ｓ
、グリセウス（Ｓ、　ｇｒｉｓｃｕｓ　）　（ストレプ
トマイシン）、Ｓ。

エリスロクロモゲネス・バー・ナルトエンシス（Ｓ、ｅ
ｒｙｔｈｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　　ｖａｒ、ｎａ
ｒｕｃｏｅｎｓｉｓ　　）（ストレプトマイシン）、ｓ
、　プールエンシス（Ｓ・ｐｏｏｌｅｎｓｉｓ　）（ス
トレプトマイシン）、Ｓ、ガルブス（５，ｇａｌｂｕｓ
　）　（ストレプトマイシン）、Ｓ。

ラメウス（Ｓ　、　ｒａｍｅｕｓ　）　（ストレプトマ
イシン）、Ｓ、オリバセウス（Ｓ、ｏｌｉｖａｃｅｕｓ
　）（ストレプトマイシン）、Ｓ　、７　ンユｘ　７　
シス（Ｓ　、ｍａｓｈｕｃｎｓｉｓ）（ストレプトマイ
シン）、Ｓ、ハイクロスコピカス・バー・リモネウス（
Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　　ｖａｒ。

ｌｉｍｏｎｅｕｓ　）（バリダマインン類）、Ｓ、リモ
ファンＩ−７ス（Ｓ　、　ｒｉｍｏｆａｃｉｅｎｓ　）
　（デストマイシン）、Ｓ、パイグロスコピカス帝ホル
マ・グレボサス（Ｓ、　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　
　ｆｏｎｎａ　　ｇｌ　ｅｂｏｓｕｓ　）（グレボマイ
シン）、Ｓ、フラデイエ（Ｓ　、ｆｒａｄｉａｅ　）（
１）イブリマインン類、ネオマインン類）、Ｓ、ユーロ
シジカｘ　（Ｓ、ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ　）　（抗生
物質Ａ１６３１６−ｃ）、Ｓ、アクアカナス（Ｓ　、　
ａｑｕａｃａｎｕｓ　）（Ｎ−メチルハイグロマイシン
Ｂ）、Ｓ、クリスタリヌス（Ｓ　、　ｃｒｙｓｔａｌｌ
ｉｎｕｓ）　（ハイグロマイシフＡ）、Ｓ。

ノ、？リドエンシス（Ｓ　、ｎｏｂｏｒｉｔｏｅｎｓｉ
ｓ　）（／％　イグロマイソン）、Ｓ、バイグロスコピ
カス（Ｓ、ｈｙｇｒｏ−ｓｃｏｐｉｃｕｓ　）（ハイグ
ロマイシフ類）、Ｓ、アトロファンｘンｘ　（Ｓ、ａｔ
ｒｏｆａｃｉｅｎｓ　）　（ハイグロマイシン）、Ｓ、
カスガスビナｘ　（Ｓ　、　Ｋａｓｕｇａｓｐｉｎｕｓ
　）（カスガマインン）、Ｓ、カスガエンンス（Ｓ。

Ｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓ　）　（カスガマインン類）、
Ｓ、ネトロプンｘ　（Ｓ、ｎｅｃｒｏｐｓｉｓ）　（抗
生物質ＬＬ−ＡＭ３１）、Ｓ、リビダス（Ｓ　、　Ｉ　
１ｖｉｄｕｓ）　（リビドマイシン類）、Ｓ、ホ７−Ｔ
−７シス（Ｓ、ｈｏｆｕｅｎｓｉｓ）（セルドマイシン
複合体）、およびＳ、カナメ（Ｓ、　ｃａｎｕｓ　）　
（リボシルパロマミン）。

マクロライド抗生物質を産生じ、本発明に係るベクター
を特に何用に使用噂き、形質転換できる好ましいストレ
プトマイセス類の非制限菌株宿主細胞には、例えば以下
のような磯生物の非制限用胞が含まれる：Ｓ、ケレステ
・「ス（Ｓ、ｃａｌｅｓｔｉｓ）（抗生物質Ｍ１８８）
、Ｓ、プラテンシス（Ｓ。

ｐｌａｃｅｎｓｉｓ　）（プラテノマイソン）、Ｓ１ロ
゛ンチエイＩ　／＜　−＊ポルピリｘ　（Ｓ、　ｒｏｃ
ｈｅｉ　　ｖａｒ＋ｖｏｌｕ−ｂｉｌｉｓ　）（抗生物
質Ｔ２６３６）、Ｓ、ベネズエレ、（Ｓ、ｖｅｎｅｚｕ
ｅｌａｅ　）（メチマインン類）、Ｓ、グリセオフ　ス
カ７．　（Ｓ　０ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ）（プント
リン）、Ｓ、ナルボネンシス（Ｓ、　ｎａｒｂｏｎｅｎ
ｓｉｓ）（ジョサマイシン、ナルボネンシス）、Ｓ、フ
ンジシジカス（Ｓ　、　ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ　）
　（抗生物／ＩＮＡ−１８１）、Ｓ、グリーｔ＝オフ７
シ！７ス（Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｆａｃｉｅｎｓ）（抗生物
質ＰＡ１３３Ａ、Ｂ）、Ｓ、ロゼオントレウス（Ｓ、ｒ
ｏｓｅｏｃｉｔｒｅｕｓ　）（フイボサ’ｒｙリン）、
Ｓ、プルネオグリセウス（Ｓ、ｂｒｕｎｅｏｇｒｉｓｃ
ｅｕｓ）（アルボサイタリン）、Ｓ、ロゼオクロモゲネ
ス（Ｓ　、ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　）（ア
ルボサイタリン）、Ｓ、　　ンネロクロモゲネ７．　（
Ｓ　、　ｃｉｎｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）（ンネ
ロマイシンＢ）、Ｓ、アルプス（Ｓ、ａｌｂｕｓ）（ア
ルボマイセチン）、Ｓ、フエレウス（Ｓ。

［ｅｌｌｃｕｓ　）　（アルゴマインン、ピクロマイシ
ン）、Ｓ、ｏ・ンチェイ（Ｓ、ｒｏｃｈｅｉ）（う７ｆ
ｊシジン、ボレリジン）、Ｓ、ビオラセオニゲル（Ｓ、
ｖｉｏｌａ−ｃｅｏｎｉｇｅｒ　）　（ランカンジン）
、Ｓ、グリセウス（（Ｓ　、　ｇｒｉｓｅｕｓ）（ボレ
リジン）、Ｓ、メゼウス（Ｓ。

ｍａｉｚｅｕｓ　）　（インゲラマイシン）、Ｓ、アル
プス・バー・コイルマイセチカス（Ｓ、ａｌｂｕｓ　　
ｖａｒ。

ｃｏｉｌｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）（）レイマイジン）、Ｓ
、ミカロフ７　’ｉ　ｘ　７　ス（Ｓ　、　ｍｙｃａｒ
ｏｆａｃｉｅｎｓ　）（アセチルｏイコマインン、エス
ピノマインン）、Ｓ、グリセオスビラリス（Ｓ、　ｇｒ
ｉｓｅｏｓｐｉｒａｌｉｓ　）　（し０フインン）、Ｓ
、ラヘンジュレ（５，１ａｖｅｎｄｕｌａｅ　）（アル
ボマイセン）、Ｓ、リモ＋ス（Ｓ、ｒｉｍｏｓｕｓ　）
　（＝ニートラマイシン）、Ｓ、デルタｘ　（Ｓ　、ｄ
ｅｌｔａｅ）（デルタマイシン類）％Ｓ、ファンジンジ
カス・バー・エスピノマイセチカス（Ｓ、　［ｕｎｇｉ
ｃｉｄｉｃｕｓ　　ｖａｒ。

ｅｓｐｉｎｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ　）　（エスビノマイ
ンンＭ）、Ｓ。

フルジンジカス（Ｓ、　ｆｕｒｄｉｃｉｄｉｃｕｓ　）
　（ミｆカマイシン）、Ｓ、アンボファンエンス（Ｓ、
ａｍｂｏｆａｃｉ　−ｅｎｓ）（フオロマソジンＤ）、
Ｓ−ニーロンディカス（Ｓ、ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ　
）（メチマイジン）、Ｓ、グリセオラス（Ｓ、ｇｒｉｓ
ｅｏｌｕｓ　）　（グリセオマイシン）、Ｓ、フラボク
ロモゲネス（Ｓ、ｆｌａｖｏｃｈｒｏ即ｇｅｎｅｓ）（
アマロマイノン、ソンコマイシンＱ）、Ｓ、フィムブリ
アタス（５，［ｉｍｂｒｉａｔｕｓ　）　（ア７０　フ
イシン）、Ｓ、フ゛ｒシキュラス（Ｓ　、　ｆａｓｃｉ
ｃｕＪｕｓ）（アマロマインン）、Ｓ、エリスレウス（
５，ｅｒｙｔｈ−ｒｅｕｓ　）（エリスロマイシンｍ）
、Ｓ・アンチビオチカｘ　（Ｓ、ａｎｃｉｂｉｏｔｉｃ
ｕｓ　）　（オＬ／７７　）−マイン７）、Ｓ、オリボ
クロモゲネス（Ｓ　、ｏｌ　ｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎ
ｅｓ）（オレアンドマインン）、Ｓ、スピニクロモゲネ
７、−バー・スラガオエ７　ンｘ　（Ｓ　、　ｓｐｉｎ
ｉｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓｖａｒ、　　ｓｕｒａｇａｏ
ｃｎｓｉｓ　）　（クジマイシン類）、Ｓ。

キタサトエンシス（Ｓ、ｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓ　
）（ロイコマイシン）、Ｓ、ナルボネンシス・バー・ジ
ョサマイセチカス（Ｓ、ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓ　　ｖ
ａｒ、　ｊｏｓａｍｙｃｅ−ｔｉｃｕｓ　）　（ｏイコ
マインンＡ３、ジョサマインン）、Ｓ、アルボグリセオ
ラス（Ｓ、　ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　）（ミコノ
マイシン）、Ｓ、ビキニエンシス（Ｓ。

ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ　）　（チャルコマインン）、
５．サーラタス（Ｓ、ｃｉｒｒａｔｕｓ　）（シラマイ
シン）、Ｓ、ジャカルテ７　シス（Ｓ、ｄｊａｋａｒｃ
ｅｎｓｉｓ　）　（＝ダマインン）、５．ユーリサー−
ｒ　ス（Ｓ　、　ｅｕｒｙｃｈｅｒｍｕｓ）（アンゴラ
マイシン）、Ｓ、　ゴシキエンシス（Ｓ　０ｇｏｓｈｉ
ｋｉｅｎｓ　ｉｓχパンダマイシン）、Ｓ、グリセオフ
ラプス（Ｓ、　ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ　）　（アキ
ュマイシン）、Ｓ、ハルステシイ（Ｓ、ｈａＪｓｔｅｄ
ｉｉ　）　（カマ ルボインン）、Ｓ、テンプｘ　（Ｓ、　ｔｅｎｄａｅ　
）　（力Δ ルポマイシン）、Ｓ、マクロスポレウス（Ｓ。

ｒｒｕｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ　）　　（カルボマイシン
）、Ｓ、サーモトレラ７　ス（Ｓ、　ｔｈｅｒｍｏｔｏ
ｌｅｒａｎｓ　）（カルボマイシン）、オよヒＳ、アル
ビレチキュ’Ｊ　（Ｓ、ａｌｂｉ　−ｒｅｔｉｃｕｌｊ
）　（カルボマイ’ｉ７）、β−ラクタム抗生物質を産
生し、本発明番こ係るベクターを特に有用に使用でき、
形質ＩＥ、換できる好ましいストレプトマイセス類の非
制限菌株宿主細胞には、例えば以下のような微生物の非
制限細胞が含まれる：Ｓ、リップ？　＝　（Ｓ、　Ｉｉ
ｐｍａｎｉｉ　）　（Ａ１６８８４、ＭＭ４５５０、Ｍ
Ｍ１３９０２）、Ｓ。

クラブリゲラス（Ｓ、　ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ　）
（Ａ　ｌ　５８８６　Ｂ。

クラプラン酸）、Ｓ、ラクタムデユランス（Ｓ。

ｌａｃｔａｍｃｉｕｒａｎｓ　）　　（セフ　７？　イ
’ｉ　７　Ｇ　）、Ｓ、グリセウス（Ｓ　、　ｇｒｉｓ
ｅｕｓ　）（セファマイシンＡ、Ｂ）、Ｓ、バイグロス
コピカス（Ｓ　、　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　）（
デアセトキシセファロスポリンＣ）、Ｓ、ワグヤ７工：
／　シス（Ｓ、　ｗａｄａｙａｍａｅｎｓｉｓ）（ＷＳ
−３４４２−Ｄ）、Ｓ、チャートレウシ７．　（Ｓ、　
ｃｈａｒｃｒｅｕｓｉｓ　）（ＳＦ１６２３）、Ｓ、ヘ
テロモルファス（Ｓ。

ｈｅｔｅｒｏｍｏｌｐｈａｓ　）およびＳ、バナー１−
７シ７、　（Ｓ。

ｐａｎａｙｅｎｓｉｓ　）　（Ｃ２０８１Ｘ）　；　Ｓ
、シナモネンシス；　（Ｓ、ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉ
ｓ　）、Ｓ、フィンブリアタス（Ｓ　、　ｆｉｎｂｒｉ
ａｔｕｓ　）、Ｓ　、　ハ／ｌ／　；ｚ、テジ（Ｓ、ｈ
ａｌｓｃｅｄｉｉ）、Ｓ、ロツチェイ（Ｓ　、　ｒｏｃ
ｈｅｉ痢よびＳ、ビリドクロモゲネｘ　（Ｓ　、　ｖｉ
ｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　）（セファマイノア
Ａ、Ｂ　）；Ｓ、カトレヤ；　（Ｓ　、　ｃａｔｃＪｅ
ｙａ　）（＋エナマイソン）；オよびＳ、オリバセウス
（Ｓ。

０１ｉｖａｃｅｕｓ　）、Ｓ、７ラボビレ７　ス（Ｓ　
、　ｆｌａｖｏｖｉｒｅｎｓ）、Ｓ、フラハｙ、　（Ｓ
　、　ｆｌａｖｕｓ　）、Ｓ、フルボビリジｘ　（Ｓ、
　Ｅｕ１ｖｏｖｉｒｉｄｉｓ　）　、　Ｓ　、　７　ル
ゲンテオラス（Ｓ　、ａｒｇｅｎｔｅｏｌｕｓ　）およ
びＳ、シオヤエンシス（Ｓ　、　５ｉｏｙａｅｎｓｉｓ
　）　（ＭＭ４５５０およびＭＭＩ　３９０２）。

ポリエーテル抗生物質を産生じ、本発明（こ係るベクタ
ーを特（こ有用に使用でき、形質転換できる好ましいス
トレプトマイセス類の非制限菌株宿主細胞（こは、例え
ば以下のような微生物の非制限細胞が含まれる：Ｓ、ア
ルプス（Ｓ　、　ａｌｂｕｓ）（Ａ２０４、Ａ２８６９
５ＡおよびＢ、サリノマイシン）、Ｓ、バイグロスコピ
カス（Ｓ　、　ｈｙｇｒｏｓｅｏｐｉｃｕａ　）　（Ａ
　２１８、エメリシト、ＤＥ３９３６、Ａ１２０Ａ、Ａ
２８６９５ＡおよびＢ１エテロマイシン、ジアネマイシ
ン）、Ｓ、グリセウス（Ｓ、ｇｒｉｓｅｕｓ　）　（ク
リツリキシン）、Ｓ、：Ｉ７グロバｙ　ス（Ｓ　、　ｃ
ｏｎｇｌｏｂａｔｕｓ）（イオノマイシン）、Ｓ、ユー
ロシジカス中バー・アステロシジカス（Ｓ、ｅｕｒｏｃ
ｉｄｉｃｕｓ　　ｖａｒ、　ａｓｃｅｒｏ−ｃｉｄｉｃ
ｕｓ　）　（ライド０フイシン）、Ｓ、　　ラｆりエフ
　’／　ス（Ｓ　、　Ｉａｓａｌ　１ｅｎｓｉｓ）（ラ
サロンド）、Ｓ、リボシジフイカ７．　（Ｓ　、　ｒｉ
ｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ　）　（ｏ　／　７　インン）
、Ｓ、カカオ・バー・アソエンシス（Ｓ。

ｃａｃａｏｉ　　ｖａｒ、　　ａｓｏｅｎｓｉｓ　）（
ライソセリ７）、Ｓ。

シナモネンシス（Ｓ、　ｃｉｎａｍｏｎｅｎｓｉｉ　）
　（％ネンシン）、Ｓ＋オーレオファシェンス（Ｓ　、
　ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ　）（ナラジン）、Ｓ、ガ
リナリウス（Ｓ、　ｇａＪＩｉｎａｒｉｕｓ）（ＲＰ３
０５０４）、Ｓ、ロングウツデンシス（Ｓ。

１ｏｎｇｗｏｏｄｅｎｓ　ｉ　ｓ　）（ライソセリン）
、５．７ラヘオラｘ　（Ｓ、［Ｉａｖｅｏｌｕｓ　　）
（ＣＰ３８９３６　）、Ｓ、ムタビリｘ　（Ｓ、ｍｕｔ
ａｂｉｌｌｉｓ）　（Ｓ−１１７４３ａ　）、およびＳ
、ビオラセオニゲ／ｌ／　（Ｓ　、　ｖｉｏｌａｃｅｏ
ｎｉｇｅｒ　）　（＝ゲリンン）。

例えばノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）のｙ口くグリコ
ペプチド抗生物質を産生し、本発明方法を特に有用（こ
適用でき、しかも本発明ベクターによって形質転換され
得るタイロシン感受性ストレプトマイセス類またはその
近縁種の非制限的な菌株である好ましい宿主細胞には、
以下の菌株から得られる非制限細胞が含まれる：ノカル
ジア・オリエンタリス（Ｎｏｃａｒｄｉａ　　ｏｒｉｅ
ｎｔａｌｉｓ　）およびＳ、ハラノマシＸ　７　シス（
Ｓ、　ｈａｒａｎｏｍａｃｈｉｅｎｓｉｓ　）　（ハフ
　）　フィツン）−ノカルジア・カンジダス（Ｎｏｃａ
ｒｄｉａｃａｎｄｉｄｕｓ　）（Ａ　−３５５１２、ア
ボパルシン）、Ｓ、ニブ０７．ポレウｘ　（Ｓ、ｅｂｕ
ｒｏｓｐｏｒｅｕｓ　）　（ＬＬ−ＡＭ３７４）、Ｓ、
パージ＝　ｘ　（Ｓ　、　ｖｉｒｇｉｎｉａｅ）（Ａ４
１０３０）並びにＳ、トヨ力エンシス（Ｓ。

ｔｏｙｏｃａｅｎｓｉｓ　）　（Ａ　４７９３４　）。

本発明に係るベクターを特をこ有用に使用でき、形質転
換できる、その他の好ましいタイロシン感受性ストレプ
トマイセスの非制限菌株宿主細胞には、例えば以下のよ
うな微生物の非制限細胞が含まれる：Ｓ・コエリカラー
（Ｓ　、　ｃｏｅｌ　１ｃｏｌｏｒ　）、Ｓ、グラ＝　
ｘ　ｏルーバー（Ｓ　、　ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂｅｒ　
）、５、ｏゼオスポーラｘ　（Ｓ　、　ｒｏｓｅｏｓｐ
ｏｒｕｓ　）、Ｓ。

リビダ：／　ス（Ｓ、　ｌ１ｖｉｄａｎｓ　）、Ｓ、テ
ネブラリウス（Ｓ　、　ｔｅｎｅｂｒａｒｉｕｓ　）、
Ｓ、アクリマインシス（Ｓ。

ａｃｒｉｍｙｃｉｎｓ　）％Ｓ　、グラウセツセンス（
Ｓ、ｇｌａｕ−ｃｅｓｃｅｎｓ　）、Ｓ、パルビリ７　
（Ｓ　、ｐａｒｖｉｌｉｎ）、Ｓ、ブリスチネスピラリ
ｘ　（Ｓ　、　ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌ　ｉｓ
）、Ｓ、ビオラセオルーバー（Ｓ　、　ｖｉｏｌａｃｅ
ｏｒｕｂｅｒ）、Ｓ、　　ヒｆ−＋ｚつ７．　（Ｓ、ｖ
ｉｎａｃｅｕｓ　）、Ｓ、エスピノサｘ　（Ｓ　、ｅｓ
ｐｉｎｏｓｕｓ　）、Ｓ、アズレウス（Ｓ、ａｚｕｒｅ
ｕｓ）、Ｓ、グリセオフス力ｘ　（Ｓ　、　ｇｒｉｓｅ
ｏｆｕｓｃｕｓ）、Ｓ、フ５　テ（ｘ−（Ｓ　、ｆｒａ
ｄｉａｅ　）、Ｓ、アボパルシンス（Ｓ　、ａｍｂｏｆ
ａｃ　１ｅｎｓ　）および５．ト：ｌカエンシｘ　（Ｓ
。

ｔｏｙｏｃａｅｎｓｉｓ　）。

本発明方法、並びに本発明に係る組換えＤＮＡクローニ
ングベクターは、広範囲な効用を有し、ストレプトマイ
セスおよび近縁微生物に使用するための好適なりローニ
ングビヒクルの必要性を満たすものである。その上、タ
イロシンに対する耐性を付与する本発明に係るベクター
の能力は、形質転換体を選択する機能的手段を提供する
ことにもなる。このことは、ベクターＤＮＡを獲得した
特定の細胞を決定し選択することか実際上必要であるか
故に重要である。

その存在を確認するための機能的な試験法のない他のＤ
　Ｎ　Ａセグメントもまた、本発明に係るベクター上を
こ挿入することができ、この非選択ｌＤＮＡを含有する
形質転換体を、タイロシンに関する選択によって単離で
きる。このような非選択性ＤＮＡセグメントは、プラス
ミドの機能並びに複製に必要な領域の内部、あるいはタ
イロシン耐性付与遺伝子の内部ａ外ならどの部位へも挿
入することができる。これには、抗生物質修飾酵素を特
定する遺伝子およびあらゆる型の調節遺伝子が含まれる
か、これらに限定される訳ではない。

さらに詳細に述べると、ある遺伝子を含む非選択性のＤ
ＮＡセグメントを、例えば、例示プラスミドｐｓｖＢ２
のチオストレプトン耐性遺伝子の中心に位置するＣ１ａ
ｉ制限部位に挿入することができる。かかる挿入をこよ
って、チオストレプトン耐性遺伝子が不活性化されるの
で、組換えプラスミドを含むストレプトマイセス形質転
換体を容易に同定することができる。即ち、この場合ま
ずタイロシン耐性によって選択し、次にチオストレプト
ン耐性でないタイロシン財性形質転換体を同定する。従
って、ストレプトマイセスおよび近縁細胞における抗生
物質耐性による選択能によって、目的とする特定の非選
択性ＤＮＡを含有するごく少数の細胞を効率的に単離で
きるようになる。

上記のタイロシン耐性についての機能試験（よ、さらに
、コントロール因子として作用し、個々の抗生物質耐性
遺伝子の発現を指令するＤＮＡセグメント位置決定にも
使用される。プロモーター、アテ二五エータ−、リプレ
ッサー、インデューサー結合部位、リボゾーム結合部位
等を含む（これらに限定される訳ではない）上記セグメ
ント（よ、ストレプトマイセスおよび近縁微生物の細胞
（こおける池の蹟に子の発現のコントロールに使用され
る。

本発明のタイロンン耐性付与ベクターは、結合したＤ　
Ｎ　Ａセグメントか宿主細胞中で幾世代にも渡って安定
に維持されることを保１するためにも有用である。タイ
ロンン朗性付与フラグメントと共有結合し、ストレプト
マイセス中で増殖するこれら遺伝子あるいはＤＮＡフラ
グメントは、非形質転換細胞（ことっては有町な濃度の
タイロンンにこの形質転換体をさらすことによって維持
できる。

そうすることにより、ベクターを失い、従って共付結合
したあらゆるＤＮＡを失った形質転換体は生育できず、
培地から除去される。このように、本発明に係るベクタ
ーは、所望のいかなるＤＮＡ配列をも安定化し維持する
ことができる。

本発明方法、並びにクローニングベクターおよび形質転
換体によれば、今日ストレプトマイセスおよび近縁細胞
内で生産されている数多くの生産物の収攬を向上させる
ために遺伝子をクローンすることができる。こうした生
成物の例として、ストレプトマイシン、セファロスポリ
ン類、アクタプラニン、アブラマイシン、ナラジン、モ
ネンシン、トフラマインンおよびエリスロマイシン等が
挙げられるが、これら番こ限定される訳ではない。

さらに本発明は、例えばヒトインンユリン、ヒトプロイ
ンンユリン、グルカゴンおよびインターフェロン等の商
業的に重要な蛋白質類；商業的をこ重要な工程および物
質に関連する代謝経路における酵素機能蟇または遺伝子
発現を改善するコントロール因子、を暗号化しているＤ
ＮＡ、％３列をクローンし、特性化し、再構成するのに
有用な選択可能なベクターを提供する。これらの望まし
いＤＮＡ配列とは、例えばストレプトマイシン、セファ
ロスポリン、アプラマイシン、アクタブラニン、ナラジ
ン、トフラマイシン、モネンシンおよびエリスロマイシ
ン誘導体等の誘導抗生物質の合成を触媒する酵素、また
は抗生物質もしくは他の生産物の生合成を仲介し増強さ
せる酵素をコードしているＤ　Ｎ　Ａを含むが、これら
に限定される訳ではない。

この様なりＮＡ上セグメント挿入し、安定化することが
できるので、ストレプトマイセスおよび近縁種か産生す
る抗生物質の収朧と利用性を向上することかできる。ス
トレプトマイセスはいくつかの培地から選ばれた任意の
ものを用いて様々な方法で培養することができる。培地
中に加える好ましい炭水化物源をこは、例えば糖密、ブ
ドウ糖、デキストリンおよびグリセリンがある。また、
窒素源（こは、例えば大豆粉末、アミノ酸混合物および
ペプトン類か含まれる。栄養成分である無機塩も又加え
られるか、それには、ナトリウム、カリ素 ラム、アンモニウム、カルシウム、リン酸、懸硫酸イオ
ンなどを生成し得る通常の塩類が挙げられる。他の微生
物の成長および発育に必要であるように、必須＠！１元
素も添加される。それらの徽ｑ元素は、通常池の培地成
分に付随する不純物の形で供給される。

ストレプトマイセスはＰＨ約５〜９の比較的広いｐ　Ｉ
−１域で、温度約１５〜４０℃の範囲において好気性条
件下に培養される。しかしながら、プラスミドの安定性
と維持のためには、培地のｐＨを約７．２から開始する
と共に培養温度をＦＪ３０℃に維持することか望ましい
。

図面の説明 第１図はプラスミドｐｓＶＢ２の制限サイトおよび機能
地文である。

第２図はプラスミドｐｌＪ７０２の制限サイトおよび機
能地図である。

第３図はプラスミドＰＳＶＢ１２の制限サイトおよび機
能地文である。

第４図はプラスミドＰＳＶＢ２３の制限サイトおよび機
能地図である。

第５図はプラスミドｐＳＶＢ１５の制限サイトおよび機
能地図である。

第６図はプラスミドｐｓＶＢ１８の制限サイトおよび機
能地文である。

第７図はプラスミドＰＳＶＢ２０の制限サイトおよび機
能地固である。

第８図はプラスミドＰＳＶＢ２２の制限サイトおよび機
能地文である。

第９図はファージｐｓＶＢ３３１０の制限サイトおよび
機能地図である。

第１Ｏ図はファージｐｓＶＢ３３１１の制限サイトおよ
び筬能地図である。

以下に実施例を挙げ、本発明の詳細な説明する。

本発明の組立てについての説明および実際の手法を適宜
記載した。

実施例１　プラスミドＰＳＶＢ２の単離Ａ、ストレプト
マイセス・リビダンスＴＫ２３／ＰＳＶＢ２の培聾 ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２３／ｐｓＶ１３
２（ＮＲ艮Ｌ１５８８０）の胞子約１０８個を、チオス
トレプトン１０μｇ／ｍ／を含有するＴＳＢ培地＊ （トリブチカーゼ・ソイ・ブロス　）ＬＯＷ／に接種し
、培養物か初期定常期に運するまで２９℃で増殖させた
。この培養物をホモジナイズし、ホモジナイズした培養
物５ｘｔを同じくチオストレプトン含有Ｔ　Ｓ　Ｂ　１
００　ｙｔｌに接種した。この１００　ｄの培養物を、
ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２３／ＰＳＶＢ２
細胞が定常期をこ達するまで２９℃でインキュベートし
た。

＊　　ＴＳＢは３０９／ｅの濃度で調製した。これは、
ベセスダ・リサーチ・ラボラトリイズ、インコーポレー
テツド、８７１７グローブセント・サークル、Ｉ’、０
．Ｂｏｘ　５７７、ガイザース／マーグ、メ７　’Ｊ　
−ラ：／　）−２０７６０（Ｂｅｔｈｅｓｄ２ＬＲｅｓ
ｅｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、　　ｌ　ｎｃ　
、、　８７１７　　ＧｒｏｖｅｍｏｎｔＣｉｒｃｌｅ、
　　Ｉ’、０．Ｂｏｘ　　５７７、　　Ｇａｉｃｈｅｒ
ｓｂｕｒｇ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ　　２０７６０　）　から入手した。

Ｂ、プラスミドの単離 細胞を集め、１０．３％シュクロース溶液で１回洗浄し
た。次いで、細胞を１０．３％／ユクロース２４＊Ｚに
懸濁し、５×リゾチーム１容液（１２５ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ％ｐＨ８，１２５ｍ　Ｍ　　Ｎ　ａ　２　Ｅ　Ｄ　
Ｔ　Ａ　。

ｐＨ３，１０ダ／　＋Ｉｌｔリゾチーム　および１０．
３％シュクロース）６ｎｔを加えた。混合した後、３０
℃で３０−６０分間インキュベートし、予め５０℃ｔｔ
ニー　７１０　温り、　テオイｆｔ−０，３ＭＮａＯＨ
１１１ＳＤＳＩＳ液約１８ｒ／を加え、混合した後、得
られた混合物を８０℃で１０分間インキュベートした。

次いで。

この混合物を室温に冷却し、フェノール５００ノ、６８
０８３５００ｇおよび水２００　ｚｒｌ中＋：　８−　
ヒ）−ロキシキノリン０．５ｇを含む混液約１８ｍｔを
加えて混合し、得られた混合物を８０℃で１０分間イン
キュベートした。次いで、この混合物を室温に冷却し、
フェノール５００ｇ、ＣＨＣｇ３５００９、および水２
００　ｙｔｌ中に８−ヒドロキンキノリン０．５ノを含
む混液１２ｍ１を加え、セル−エクストラクトで充分瘉
こｌ見合した。６０００−８０００ｒｐｍｘｌＯ分の遠
・ひにより、漕に分離した。上清ＦＪ　４５　；ｓｌを
得、これを清潔なビン）こ移した。

次いで、この上清に３　Ｍ　Ｎａ０ＡＣ４，５１ｎｔ　
（！：インプロパノール５０　ｊＩｅを加え、得られた
溶液を混合した後、室乙４で３０分間放置した。次いで
、この溶液を遠心（８０００ｒｐｍｘ３０分）し、上清
を捨てた。得られたペレットをＣｓＣ，ｅ８９を含んだ
’ｒＥバッファー（１０ｍＭ）リスートＩＣＩ％ｐｉ−
１８オヨび１　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　）　７．５　ｒ
ｘｌに懸濁した。エチジウムプロミド溶液（１０７１ダ
／ｍｌ　）　０．５　ｍｌを加えた後、得られた溶液を
２０℃（こおいて、４０，０００ｒｐｍ　　で４８時間
遠・口した。得られたプラスミドのバンドをＣ５Ｃ（ｌ
　　含有ＴＥバッファーで飽和させたインプロパツール
により、３−５回、抽出した。抽出後、試料を４倍虐の
ＴＥバッファーで希釈し、さらに総容遣の２．５倍のエ
タノールを８口えた。得られた溶液を混合し、−２０℃
で一夜インキユベートした。

一２０℃で一夜インキユベーンヨンすることによって析
出した沈殿を遠・Ｉ；　（１０，（ＪＯＯｒｐｍ　Ｘ３
（１分）して集め、乾燥した後、２回、再沈殿させた。

この沈殿処理は、ペレットをＴＥバッファーに懸濁し、
Ｎａ０ＡＣを０．３Ｍまで加え、さらに２．５倍黴のエ
タノールを加え、−７０℃で１０−１５分間冷却した後
、得られたＩ８液を上記の如く遠心すること（こより行
った。この方法によって約１００μｇのプラスミドＰＳ
ＶＢ２　ＤＮＡを得た。これをＴＥバッファー中（二虐
度ｌμｇ／μｅの′！＋ｊ合で溶かし、４℃で保存した
。

実施例２　プラスミドｐｌＪ７（Ｊ２の単這実施例１の
方法と実質上向様（こして、ストレプトマイセス・リビ
ダンス／　Ｐ　Ｉ　Ｊ　７０２　（ＡＴＣ（：３９１５
５）を培養し、プラスミドｐｌＪ７０２を単産した。チ
オストレプトン選択法（１０μｇ／ｌｌ　）　（こより
、プラスミドＰＬＪ７０２か維持されていることを確か
めた。得られたプラスミドｐｌＪ７０２約１００μｇを
Ｔ　Ｅ　ｌ　ｍｌに懸濁し、４℃で保存した。

実ｍ例：３　　プ５７．　ミｌ’　ｐ　５ＶＢＩ　２＃
ヨびｐＳＶＢ２３の組立て Ａ、プラスミドＰＳＶＢ２のに、。■消化、および〜２
．６ｋｂＫ、。Ｉ制限フラグメントの精製実施例１で単
離したプラスミドＰＳＶＢ２ＤＮＡＦＪ５０μｇ（５０
μｇ）を１０×ＫＰｎＩバツフアー１０　Ａ１　、制限
酵３に、、１５μｅ（５０単位）および水３５μｅと混
合し、３７℃で２時間、反応させた。熱的番こ不活化し
た後、この反応混合物をアガロースゲルに充填し、実質
上、マニアテイス（＞Ｉａｎｉａｔｉｓ）らの方法〔モ
レキュラー・クローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ　）　ｐｐ　、　１６４　１６６．１９８２
　）−こ従い、所望の〜２．６　ｋｂ　ＫＰｎＩ制限フ
ラグメントを精製した。タイロシン耐性付与遺伝子含有
〜２．６ｋｂＫ、。■制限フラグメント約１０μｇを得
た。これをＴＥバッファー１００μｅＧこ懸濁し、４℃
で保存した。

＊１（ＩＸＫＰｏＩバッファーの組成：５ＱｍＭＮｈＣ
１，５ＱｍＭ　　トリス−Ｈｃｇ　（ＰＨ７，５）、５
０ｍＭＭｇＣｌ’２．６　ｏ　ｍＭ　２−メルカプトエ
タノール、および　１ダ／屑Ｉ　　ＢＳＡ。

Ｂ、に、ｎＩ　　消化プラスミドｐｌＪ７０２の調製実
施例２で単離したプラスミドＰＩＪ７０２ＤＮＡ約１　
μｇ（１０μｇ）とｌ　ＯＸ　Ｋ　ｐ　ｎ　Ｉ　ハラ７
７　５１’　ＩＩ。

制限酵素に、。■２μＪ（１０単位）および水３３μｅ
　とを混合し、３７℃で２時間反応させたか６５℃で１
０分間熱的に不活化し、消化プラスミドを一２０℃で保
存した。

Ｃ，プ５７．　ミ）−ｐｓＶＢ１２およびＰＳＶＢ２３
（７）組立てのための、フラグメントのライゲーション
実施例３Ａで調製した〜２．５　ｋ　ｂ　Ｋ　ｐ。■制
限フラグメント（５μｅ）と実施例３Ｂで調製したＫＰ
ｎ１消化プラスミドｐｌＪ７０２（２５μｅ）とを混合
し、３Ｍ　Ｎａ０Ａｃ　　３μｍ１とエタノール７５μ
ｅを加え、−７０℃で３０分間冷却して沈殿させ、遠心
した。

得うれたＤＮＡペレットを１×リガーゼバツフア＊ −３９μｅおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ１μｇに懸濁し、
１６℃で一変インキユベートした。ライゲートシたＤ　
Ｎ　Ａは所望のプラスミドＰＳＶＢ１２およ０’ｐＳＶ
Ｂ２３を構成していた。これらのプラスミドは〜２．６
　ｋｂ　ＫＰｏＩ制限フラグメントの方向性に関しての
み異っている（第３因および第４図参照）。

＊　ｌＸリガーゼバッファーの組成：５ＢｍＭトリスー
　１−１（１：　ｌ　（ｐｉ−１７，８）、ｌ　ＯｍＭ
　Ｍ　ｇ　ＣＩＩ　２、加ｍＭジチオトレイトール、１
ｍＭＡＴＰ　および５０μｇａＩｅ　Ｂ　Ｓ　Ａ 実施例４　プラスミドｐＳＶＢ１５およびｐＳＶＢ１８
のＩ且立て Ａ、プラスミドＰＳＶＢ２のＰｓｃＩ消化および〜３４
３　ｋｂ　Ｐｓｔ　Ｉ　　制限フラグメントの精製実施
例１で単離したプラスミドｐＳＶＢ２ＤＮＡ約＊ ５０μｇ（５０μｇ）を１０）＜Ｐｓｔｌバッファー　
１０μｇ　、　　制御沢酵素ＰｓｔＩ５μｅおよび水３
５１１ｅと混合し、３７℃で２時間反応させた。実質上
、マニアテイスら（１９８２）の方法に従い、所望の〜
３．８ｋｂ　タイロンン耐性遺伝子含有Ｐ、−制限フラ
グメントを精製し、得られた〜ｌＯμｇの精製フラグメ
ントをＴＥバッファー１ｔｌＯμｅに懸濁し、４℃で保
存した。

１０　Ｘ　Ｐ、−バッファーの組成：　ＩＭＮａ（Ｊ。

１００ｍＭｌ−リス−ＨＣｅ（Ａ８７．５）、１００　
ｍＭＭ　ｇ　Ｃ（１２およびｌＩＩｇ／屑／ＢＳＡ。

Ｂ、プラスミドｐｌＪ７０２のＰ、−消化実施例２で単
離したプラスミドｐｌＪ７０ｚ約１μｇ（１０μｅ）を
ｌ　０ＸＰｓｔ１　ハ’７）７−５μｍ！　、制限酵素
Ｐ、−２μｅ（〜ＩＩＪ単位）および水３３μｅを混合
し、３７℃で２時間反応させた。６５℃で１０分間加熱
して反応を止め、ＰＳ−消化ＤＮＡを一２０℃で保存し
た。

Ｃ，プ５　スミｌ’ｐｓＶＢ１６およびｐｓＶＢ１８の
組立てのための７ラグメントのライゲーション実施例４
Ａで単産した〜３，８ｋｂ　タイロンン耐性心仏子含荷
１１．−制御恨フラグメント５μｅと実誰何４Ｂで単離
したｐ、、ｒ消化プラスミドｐＨ７０２２５μｅとを、
実質上、実施例３Ｃと同様にしてライゲートした。ライ
ゲートしたＤＮＡは、所望のプラスミドｐｓＶＢ１６と
ｐｓＶＢ１８を構成していた。これらのプラスミドは〜
３，８ｋｂ　Ｐｓｔｌ制限フラグメントの方向性に関し
てのみ異っていた（第５および第６図参照）。

実施例５　プラスミドｐｓＶＢ２０およびｐｓＶＢ２２
の組立て Ａ、プラスミ）−ｐＳＶＢ２のＢａｍＨＩおよびＢＩＩ
ＩＩ消化、並びに〜２．９　ｋｂＢａｍＨＩ−Ｂｇ（Ｉ
■　制限フラグメントの単離 実施例１で単離したプラスミドｐｓＶＢ２約５０μｇ　
（５０Ｍｇ）をｌ　ＯＸ　ＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ■ハツ７
７−＊１　ｔＪ　ｔｉｌｌ、制限酵素ＢａｍＨＩ　５１
１（１（〜５０単位）、制限酵素Ｂｇｅ１１５μｅ（〜
５０単位）および水３０μａと混合し、３７℃で２時間
反応させた。熱的に不活化した後、タイロシン耐性遺伝
子を含有している所望の〜２．９　ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ
　−Ｂｇｌ　■制限フラグメントを、実質上、マニアテ
イスらの方法（１９８２）に従って精製し、得られた！
＃製フラグメント〜１０μｇをＴＥバッファー１００μ
ｅに懸濁し、４℃で保存した。

１０　ｘ　ＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ　■バツフアーの組成：
１．２５　ＭＮａ（Ｊ、８０ｍＭ）リスＨＣ／ｌ　（ｐ
Ｈ７，７）、−８０ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃｇ　２．１００ｍ
Ｍメルカプトエタノールおよび１ダ／５ｌＢｓＡ。

Ｂ、プラスミドＰＩＪ７０２のＢｇｌ■消化実施例２で
調製したプラスミドｐＩＪ７０２ＤＮＡ　約１　μｇ（
１０μ６）　　とｌ　Ｏｘ　ＢｇＪロ　バッフｙ−＊５
μＬ制限酵素Ｂｇｌ　ＩＩ　２μｅ（２０単位）、並び
に水３３μｅを混合し、３７℃で２時間反応させた。６
５℃で１０分間処理して反応を不活化した後、ＢｇＪＩ
Ｉ　　消化プラスミドＤＮＡを一２０℃で保存した。

１０　ｘ　Ｂｇｌ　ｆｌハツ７７−（７）組成：　Ｉ　
Ｍ　ＮａＣ４。

１（ＪＯｍＭトリスＨＣｉｐＨ＝７．４）、１ｏｏｍＭ
Ｍ　ｇ　Ｃｅ　２．１００　ｍＭ２−メルカプトエタノ
ールおよびｌ　”ｆ　／　ｍｌ　ＢＳＡ＋＞ Ｃ，プラスミドｐｓＶＢ２０およびｐｓＶＢ２２ｃｌ）
組立てのための、フラグメントのライゲーション実施例
５Ａで単離したタイロシン耐性付与遺伝子含有〜２．９
　ｋｂ　ＢａｍＨＩ　−Ｂｇ（１（ｌ制限フラグメント
５μｅと、実施的５Ｂで調製したＲｇｌ■消イブラスミ
ドＰＩＪ７０２（２５μｅ）とを混合し、実質上、実施
例３Ｃと同様にしてライゲートした。ライゲートシたＤ
ＮＡは所望のプラスミドｐｓＶＢ２０およびｐｓＶＢ２
２　を構成していた（第７図希よび第８図参照）。Ｂａ
ｍＨｌおよびＢｇｌ口部口部−緒にライゲートすれば、
ｘｈｏＩＩ認識配列が形成されることに注目されたい。

プラスミドｐｓＶＢ２ｏとＰＳＶＢ２２ａは、挿入され
た〜２．９　ｋｂＢａｍＨＩ　−Ｂｇｅ口制限フラグメ
ントの方向性か異るだけであ私 実施例６　タイロンン耐性ストレプトフイセス・グリセ
オフスカス形質転換体の組立てＡ、溶液のリスト 以下に、実施例６および７において用いられる溶液を示
す。

１、　　Ｐ培地（〜１００ｘ／）’ 成　　　分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　量
シュクロース　　　　　　　　　　　１０．３９に２５
０４　　　　　　　　　　　　０．０２５９徽遣元素溶
液（凪３参照）　　　　　　０．２ｇ／Ｍｇ　Ｃ１２・
６Ｈ２００，２０３１ 水を加えて８０ｘｌとする。

オートクレーブ処理した後、 ＫＨ２ＰＯ４（０，５％）　　　　　　　　　　１ｍ１
ｃａｃ１２−２Ｈ２０（３，６８％）　　　　　　１０
ｒｘｌ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−１０１１’
メチル−２−アミノエタン・スルホン酸）、’ＴＥＳ’
バッファー、０．２５Ｍ、　　ｐＨ７，２を加える。

２、Ｌ培地（〜１００ｓｔ）’ 成　　　分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　量
シュクロース（１０，３％）　　　　　　１００．ｔＴ
ＥＳバッファー、ＰＨ７，２ｌｕｇｌ（０，２５Ｍ） Ｋ２ＳＯ３（２，５％）　　　　　　　　　　ｌｚｔ鍛
ｌ尤素溶液（１１＆ｉ３参照）０．２肩ｌＫＨ２ＰＯ４
（０，５％）１Ｍｔ ＭｇＣ（７２（２，５Ｍ　）　　　　　　　　　　　０
．１ｘｔｌＣａＣｅ２（０，２５Ｍ）　　　　　　　　
　　　ＩＩｌリゾチーム　　　　　　　　　　　　　ｌ
ダ／ｘｔｌＬ培地は、調製後、滅菌濾過する。

３、微量元素溶液（〜１ｅ）： 成　　　分　　　　　　　　　　　　　　　　　　量（
劃ＺｎＣ１１２４０ ＦｅＣ１１ａ・６Ｈ２０２００ ＣｕＣｅ２・２Ｈ２０１゜ ＭｎＣＡ’２・４Ｈ２０１Ｏ ＮａｚＢ４０７．ｌＯＨ２０１１ ０Ｈ２Ｏ１０（ＮＨ４）６．４Ｈ２０１０４、Ｒ２再生
培地（〜１ｇ）： 成　　　分　　　　　　　　　　　　　　　　　　置／
ユクロース　　　　　　　　　　１０３ｇＫ２ＳＯ４０
，２５ｇ 徽１元素溶液　　　　　　　　　　２ｐｘ１Ｍｇ　Ｃ（
１２’　６　Ｒ２０１０，１２９グルコース　　　　　
　　　　　　　ｌ（Ｈ’Ｌ−７，Ｘパラギア　−ｌ！１
２０　　　　　　　　　　　２．　（１９カザミノ酸　
　　　　　　　　　　　　　０．１ｆ寒天　　　　　　
　　　　　　　　　　２２ｆ水を加えて７００ｍ１とす
る。

オートクレーブ処理の後、 ＫＨ２１’０４（０，［）！Ｍ７１００ｍ＋？）　　　
　　　　　　　　　１００ｔｔｔｌＣａにｅ２（２，２
２ｇ／１００ｇ／）　　　　　　１００ｍ１ＴＥＳバツ
フアー（（５，７３９／　ｌ　Ｕ　０ｔｔｔｌ　）、　
　１００ａｒ／ｐＨ７，２） ＮａＯＨ（５Ｎ）　　　　　　　　　　　　　１ｔｔｔ
ｔ５、　　Ｔ培地（〜１４．５肩ｌ）： 成　　　分　　　　　　　　　　　　　　　　　　険ン
ユクロース（１０，３％）２．５肩ｌ蒸留水　　　　　
　　　　　　　　　　７．５１’ｉｎ元素溶液　　　　
　　　　　　　２０μｅ１００μｅ Ｋ２ＳＯ３（２，５多） ＣａＣｅ２（５Ｍ）　　　　　　　　　　２１７μｅ）
、リス−７Ｌ／イア＃！！、ＰＨ８（ＬＭ）　　　　　
５４３１１ｅポリエチレングリコール１０００　　　　
　　３・６３ダオートクレープ処理して全成分を滅菌す
る。液体成分を混合し、次いで適当この溶融ポリエチレ
ングリコールに加える。初めの４成分を予め混合してお
いたものは、室温で少くとも１力月間保存することがで
きる。

６、軟栄養寒天（ＳＮＡ〜１１）： テイフコ・ハクト（Ｄｉｆｃｏ　Ｂａｃｔｏ）　　　　
　８９栄養ブロス 寒天　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ７、Ｒ２ＹＥ
培地は、Ｒ２培地１１に２５多酵母エキス２０　ｒｘｌ
を加えたものである。

８、酵母エキス−麦芽エキス（ＹＥＭＥ〜１ｇ）：酵母
エキス　　　　　　　　　　　　　３ｇペプトン　　　
　　　　　　　　　　５ｇ麦芽エキス　　　　　　　　
　　　　３ｇグルコース　　　　　　　　　　　　１０
ｇｇ、　　ＹＥＭＥ＋３４％ソユクンス液体完全培シス
ＹＥＭＥにシュクロースを３４０９／（ｌの割合で加え
たものである。

ＩＱ、ＹＭＸ培地（〜ｌｅ）： 酵母エキス　　　　　　　　　　　　　　３ｇ麦芽エキ
ス　　　　　　　　　　　　　３ｆグルコース　　　　
　　　　　　　　　２ダ寒天　　　　　　　　　　　　
　　　２０ｆＢ、プロトプラストを調製するための、培
養物の増殖 ストレプトマイセス・グリセオフスカスＣ５８１（ＡＴ
ＣＣ２３９１６）ｋｏ、４％グリンンを補充したＴＳＢ
中、３０℃において２０時間、液中条件下で増殖させる
ことにより、栄養接種物を富法通り調製した。Ｓ、グリ
セオフスカスのプロトプラスト化（ｐｒｏｔｏｐｌａｓ
ｃｉｎｇ　）は以下のクロく（こして行った。Ｓ、グリ
セオフスカスの培養物をＹ　Ｍ　Ｘ寒天（０，３％酵母
エキス、０．３％麦芽エキス、０．２％デキストロース
および２％寒天）を含んだ平板上に播き、３０℃で約４
８時間インキュベートした。

次いで、このプレートから得た単独の細菌性コロニーを
Ｔ　Ｓ　Ｂ　ｌ　Ｏｔｔｔｔに接種し、この培養物をホ
モジナイズした後、３０℃で一夜インキユベートした。

−汝培養物約４ｖｔｌをホモジナイズし、０．４％グリ
シン浦充ＴＳ　Ｂ　１００ｘｌ＋こ加え、３０’Ｃで一
反インキユベートした。調製しだての一夜培養物を用（
・てｔ記の工程を繰返し行った。次いで、この培■勿（
こ５０（Ｖ／Ｖ）％グリセリン約５０３ＦＩ’を加え、
試料１５ｉ／を凍結して最高６力月間、−２０℃で保存
した。水を入れたビーカー内に凍結細胞のチューブを入
れ、室温で解凍した。次いで細胞をベンチ拳トップ遠心
機（ｂｅｎｃｈ　　ｔｏｐ　ｃｅｎｃｒｉ　−ｆｕｇｅ
　）で遠・ｕして収獲し、１０．３％シュクロース円で
３回洗浄した。この細胞ペレットをリゾチームＣ１Ｑ／
／：ｘｌ）を補充したＰ培地１０ｍ１Ｇこ懸濁し、３０
℃で２時間インキュベートした。次いで、この混合物を
遠心し、ペレットをプロトプラスト１じした。このペレ
ットを１０ｍ１のＰ培地により、その都度ポルテックス
（攪拌）しながら３回洗浄した。得られたプロトプラス
トをＰ培地２肩ｌに懸濁し、次の形質転換に用いた。

Ｃ６形質転換 ライゲーンヨン・バッファーに入れたプラスミ）−ＤＮ
ＡＦＪｌＯμｅとストレプトマイセス・グリセオフスカ
ス・プロトプラストＦＪ１５０μｅとを試捩管内で混合
し、次いで、Ｐ培地中、１０１μｅの５０％ＰＥＧ１ｏ
ｏｏを加えた。１〜２分間おいてから、Ｐ培地を加えて
８屯を１　ｍｌにした。形質転換した細胞をＲ２培地に
植え換え３０’Ｃで７〜１０日間インキュベートした。

形質転換体の同定のために、５０μｇ／ｓｌのクイロジ
ンを含有しているＹＭＸ培地にレプリカ平板を行った。

別法として、３０℃で一夜インキュベーショ７して得た
平板番こ、平板中のクイロジンの終濃度が５０μｆ／肩
ｌとなるのｔこ充分な量のタイロシンを含んだ軟Ｒ２培
地を重Ｎ　（ｏｖｅｒｌａｙｉｎｇ　）ｆることにより
、直接、形質転換体を選択することができる。得られた
タイロンン耐性のＳ、グリセオフス力スコｐニーは、既
知の方法で単離することかでき、これを、下記のグロく
にして培養し、同定する。次にこの形質転換体を用いて
プラスミドＤＮＡを生産、単層することかできる。

Ｄ、ストレプトマイセス・グリセオフスヵス形質転換体
の分析 単独のコロニーを得るために、上記の形質転換体をタイ
ロシン（５０μｇ／ｘｌ　）を補充したＹＭＸ寒天上で
培養した。得られた単独のコロニーを、これもまたタイ
ロシン（１０μｇ／肩ｔ）を含んだＴＳＢ培地１０！Ｂ
ｔｌこ接種した。これらの培養をホモジナイズした後、
ロータリー・ンエーカー１’３テ、３０℃において一夜
増殖させた。

分析のためのプラスミドの単離は実施例１のプロトコー
ルを／Ｊ＼スケールにして行った。実施例１におけるＣ
５ＣＪグラデイエンドの代りにエタノール沈殿を行った
。遠・口して菌糸体を集め、１ｏ、３％ンユクロースで
２回洗浄した後、１０．３％シュクロース１〜２ｇｔに
懸濁した。細胞混合物４（１０μｅを小さなチューブに
移し、５×リゾチーム溶液（実施例１）１００μｅを卯
えた。この懸濁液を３０℃で３０〜６０分間インキユベ
ートシ、次イテ、ｌ　％　Ｓ　Ｉ）　Ｓ　含有０．３　
Ｍ　Ｎ　ａＯＨ２５０１’　（ｌを加えて混合した。後
者のイ容液は予め５０　’Ｃに保っておいてから、細胞
混合物に加えられｆｃｏこの細胞混合物を８０℃で１０
分間保った後、室温に冷却し、）ｘ）　−ル：　ＣＨ（
Ｊ３（５０：５０）混合物１００μｅを用いて試料を抽
出した。水湯をきれいなチューブに入れ、Ｎａ０Ａｃ中
０．３Ｍの濃度に調製した後、ｌ容量のインプロパツー
ルを加えた。

室温で５分間保った後、遠・口してＤＮＡをペレット化
した。このペレットをＴＥバッファー４００μｅに溶か
し、Ｎａ０Ａｃ中で０．３　Ｍに調製した。

約２．５容量のエタノールを加えた後、−７０’Ｃで３
０分間冷却したＣ１遠・Ｕ後、再度沈殿させた後、プラ
スミドＤＮＡをＴＥバッファー５０μｇに懸濁した。反
応生成物に制現酵素による切断と電気泳動分析法を適用
し、プラスミド構造を決定した。

Ｅ、ストレプトマイセス・グリセオフスカス／ｐＳＶＢ
２、ｓ　、　クリセオフスカス／ＰＳｖＢ１２、Ｓ。

グリセオフスカス／ＰｓｖＢ１６．ｓ、グリセオフスカ
ス／ｐｓＶＢ１８、Ｓ、グリセオフスカス／ｐｓＶＢ２
０、Ｓ、グリセオフスカス／ＰＳｖＢ２２およびＳ、グ
リセオフスカス／ＰＳＶＢ２３の調製本実施例で示した
方法に従い、これらを別々に組立て、分析した。

実施例７　タイロシン耐性ストレプトマイセス・リビダ
ンス／ｐｓＶＢ１２、Ｓ、リビダンス／ｐｓＶＢ１５、
Ｓ、リビダンス／ＰＳｖＢ１８、Ｓ。

リビダンス／ｐｓＶＢ２０、Ｓ、ＩＪビダ７７．／ｐ　
Ｓ　Ｖ　Ｂ　２２　オヨびＳ、リビダンス／ＰＳｖＢ２
３の組立て 以下に示す方法で、ストレプトマイセス・リビダンス形
質転換体を生産し、分析した。プラスミＦｐＳＶＢ１２
、ｐｓＶＢ１６、ｐｓＶＢ１８、ｐｓＶＢ２０゜ｐｓＶ
Ｂ２２およびｐＳＶＢ２３を夫々別個に用いてＤＮＡを
形質転換した。

Ａ、プロトプラストの調製および保存 ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２３（ＮλＲＬ１
５８２６）を、３０℃において、３４％シュクロース、
５　ｍ　Ｍ　ＭｇＣｌ２および０．５％グリシンを却え
たＹＥＭＥ中で４０〜４８時間増殖させた。遠心（８０
０ｇ×１０分間、ベンチトップ遠・Ｄａ中）して菌糸体
を集め、１０．３％シュクロースで２回洗浄した。２５
〜５０　ｒｘｌの培寿から得た菌糸体をＬ培地３〜４ゴ
に懸濁し、３２℃で１時間インキュベートした。この間
、凝集物を分散するために１〜２回、懸濁物をピペット
で吸上げた。Ｐ培地５　ｔｒｔｔを加え、得られた懸濁
物を錦（わた）全（プラグ）２通して濾過した。遠、ｌ
＞（８００）×１０分間）してプロトプラストを集め、
Ｐ培地５ｘｌで２回洗浄した。次いで、４ｘｌのＰ培地
にプロトプラストを懸濁し、血球計算盤を用いて顕微鏡
的にプロトプラスト数を求めた。プロトプラストを直ぐ
に用いない場合をこは、プロトプラスト５×１０９〜１
０１０を含有するｌ（約１　ｒｓｌづつ）に懸濁液を分
け、滅菌したポリプロピレン製のスクリューキャップ・
チューブに入れた。次いで、このチューブを氷の容器に
入れ、この容器を一７０℃の場所に置くという方法で、
懸濁物を除々に冷凍した。要時まで、この温度下でプロ
トプラストを保存した。使用の際には、まずこの凍結５
ヒ濁物を３７℃の温水中に浸漬して解凍した。

Ｂ、プロトプラスト形質転換 遠心して約５×ｌＯのプロトプラストのベレットを得た
（８０（ＩＸＩＯ分間）。上清をデカントし、チューブ
内に残存している少黴の液体にプロトプラストを懸濁さ
せた。プラスミドＤＮＡを入れたＴＥバッファー（容置
は２０μｇより多くはない）を加え、その直後にＴ培地
０．５　ｍｌを加えた。この内容物を、１〜２回ピペッ
トで吸い上げてもとに戻すことにより、混合した。この
時点で、上記の懸濁物をそのまま植えつけるか、または
Ｐ培地０．５　ｍｌで希釈した後、植えつけた。いずれ
の場合蚤こも、Ｒ２ＹＥ培地の平板光りに、０．１ｘｌ
を接種して行った。

再生されたプロトプラストを、タイロシン５００μｇ　
／ｗｅを含んたＲ２ＹＥ培地を用いたレプリカ平板法に
適用し、タイロシン耐性形質転換体を選択した。別法と
して、再生したプロトプラストにタイロシンを含んだ軟
質の栄養ブロス・寒天を重層することにより、タイロシ
ン耐性形質転換体を選択することもできる。再生してく
る平板培聾を３０℃で１６〜２２時間インキュベートし
た後、１つの平板につき、拡散後の濃度か５００μｇ／
ｍｌになるのに充分な逝のタイロシンを含んだ５ＮＡ（
４５〜５０℃）２．５ｘｌを適用した。このＳＮＡ重層
物中にチロシンを７５０μｇ／ｌｌとなる様に加え、ｐ
ｌＪ７０２誘導体を含有している形質転換体によるメラ
ニンの産生の有無を調べた。即ち、無傷のテロンナーゼ
遺伝子を含有している形質転換体は、タイロシン存在下
で増殖させると黒色を呈した。

Ｃ，Ｓ、　　ＩＪビダンス形質転換体の分析実質上、実
施例６Ｄの方法に従い、得られた形質転換体を分析した
。

実施例８　大腸菌夏（１２ＢＥ４４７／ｐＫｃ３３１の
培醤およびファスミドｐＫｃ３３１の単離Ａ　大腸菌Ｋ
ｌ　２ＢＥ４４７／ＰＫＣ３３１の培養大腸菌に１２　
ＢＥ　４４７／ＰＫに３３１（ＮＲＲＬＢ−１５８２８
）の培養物２ｄをアンピシリン５０μｇ／肩ｌの存在下
、ＴＹ培地（１％トリプトン、０．５％Ｎａ（：／　　
および０．５％酵母エキス、ｐａ１７．４）中で定常期
をこ達するまで細胞増殖させたＯ次いでこの培養物２　
ｍｌを、アンピンリン５０μｇ／ｍｌを含んたＴ　Ｙ培
地１ｅを入れたフラスコに接種し、５５０ｎｍにおける
光学的密度が０．５０〜０．７５吸収単位を示すまで増
殖させた。０．Ｄ、５５０がｏ、ｓｏ〜０．７５の範囲
になれば、ウリジン（ｕｒｉｇｉｎｅ　）　ｌ　ｌを加
え、１５分後にクロラムフェニコール１フ０ダを加えた
。次いで１６時間、インキュベーションと培養を続けた
。

Ｂ、フγスミドｐＫＣ：３３１の単離 この培責を遠・ひして得られた細胞ペレットを２５％（
ｓｖ／ｖ）シｊ−りｏ−ス；　５０　ｍＭ　トリス−Ｈ
Ｃｇ（ｐＩ”１８）；および１ｍＭＥＤＴＡ　の混合溶
液１Ｏ１ｌｌに懸濁した。次いで、０．５ＭＥＤＴＡ２
ｍ／および０、５　Ｊ１５’　／　ｙｌリゾチームの０
．２５Ｍ）すｘ−１（ＣＩ（ＰＨ８）中溶液２ｔｌを腑
え、得られた混合物を室温で１５分間インキュベートし
た。インキュベーション後、５　Ｑ　ｍＭ　トリス−Ｈ
（Ｊ（ｐＨ３）、５ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％トリド
アＸ−１００を含む溶液約１４厘ｌを卯えた。次いでこ
のリゾチーム処理細胞を、さかさまにすることにより、
混合した。

この溶菌ミックスを、細、抱片がゆる（・ペレットを形
成するまで遠・むした。細胞片のペレットを捨てた後、
上清を緩１釘化（ＰＨ＝８）フェノールで抽出し、水層
をＮａＣｅ　０．２５Ｍ＋、ｌ’ｌ裂Ｌ、２倍（初エタ
ノールを加えた。得られた混合物を一７０℃に冷却し、
遠心して核酸をペレット化した。更に、エチジウムプロ
ミドによる塩化センウムグラディエントを用いて遠４＞
（４５，０（ｌｒｐｍｘ１６時間、２０℃）し、ファス
ミドＤＮＡをさらに精製した。

次いで所望のファスミドＰＫＣ：３３１を集め、常法通
り、エチジウムプロミドと塩化セシウムを除去した。こ
の方法で得た約１ダのファスミドｐＫＣ３３１ＤＮＡ　
をＴ　Ｅ　／ｅ　７フーｒ−（１０ｍＭ）リス−ＨＣＩ
Ｉ、ｐＨ８および１ｍＭＥＤＴＡ）　１ｍｌに溶がし、
−２０℃で保存した。

実施例９　ファージｐｓＶＢ３３１０　の組立てＡ、フ
ァスミドｐＫｃ３３１のＰｓｃｉ消化および〜３７ｋｂ
　Ｐｓｃｉ　制限フラグメントの単鑞実施例８で得たフ
ァスミドｐＫｃ３３１約１０ｐｇｃ　ｌ　Ｏｐｌ、）を
１０ＸＰｓｔＩ塩１０ｔｔｌ、制限酵素Ｐｓｔ７２μｌ
（〜１０単位）および水７８μｌｌＧ二がえた、静かに
混合した後、３７℃で２時間反応させることにより消化
させた。消化後、一般的なゲル電気泳動法によってファ
ージ−Ｃ３ｌ配列鯰脣する〜３７　ｋｂ　Ｐｓｔ（フラ
グメントを精製した。

得られた精製フラグメント（〜５μｇ）　をＴＥバッフ
ァー５μｅに懸濁した。

Ｂ、〜３．８ｋｂタイロシン耐性付与Ｐｓｔ（制限フラ
グメントと、ファスミドｐＫｃ３３１の〜３７ｋｂＰｓ
ｔＩ制限フラグメントとのライゲーション別の制限フラ
グメントを用いる外は実施例３Ｃと実質的に同様をこし
てライゲーションを行った。

即ち、この場合、実施例９Ａで得た〜３７　ｋｂＰｓｔ
ｉ制限フラグメント２．５μｅと実施例４Ａで得たフラ
グメント２μｅ　とをライゲートして所望（７）７７−
ジｐＳＶＢ３３１０　とｐＳＶＢ３３１１とを得ｆｃｏ
フｙ−ジｐｓＶＢ３３１１１１、〜３．ＢｋｂＰｓｃＪ
フラグメントの方向性に関してのみ、ファージ１）ＳＶ
Ｂ３３１０　　と異っている（第９および１０−参照）
、このライゲートしたＤ　Ｎ　Ａを用いてストレプトマ
イセスを形質転換し、感染性のファージ粒子を得た０次
いで、このファージ粒子を使用し、該ベクターの染色体
への組込みによってタイロンン耐性ストレプトマイセス
を調製した。

実施例１０　ストレプトマイセス・リビダンス／ｐｓＶ
Ｂ３３１０の組立て 実施例９ＢのライゲートしたＤＮＡ、ストレプトマイセ
ス・リビダンスのプロトプラスト２００μｅ、ストレプ
トマイセス・リビダンスの胞子１０８個、およびＰ培地
番こ入れた５５襲ポリ工チレングリコール５００μｇと
をポルテックスし、その一部、２５Ｍｇおよび２５０μ
ｇをとり、Ｒ２ＹＥトップ・アガー（こよるＲ２　ＹＥ
プレート上で平板培養した。上記の平板を３７℃でイン
キュベートした。プラークは、常に〜２０時間後に認め
られた。プラークが現われた後、それらを平板から除去
し、ファージ粒子をＴＳＢ培地で洗浄し、寒天を該培地
内に流し出した。連続的（こ希釈したファージ懸濁液を
調製し、その一部をとり、ストレプトマイセス・リビダ
ンスの胞子１０８個と混合した。上記の希釈は、平板上
でのプラークの良好な生成を得るために行った。この混
合物をＲ２ＹＥ平板上で３０℃において胞子形成蚤こ至
るまで平板培養した。この工程には約４日間を要した。

胞子形成か起きた後、５００μｇ／ｌｌのタイロシンを
含んだ、調製したばかりのＲ２ＹＥ平板上にレプリカ平
板法で移した。次いで、このレプリカ平板を３０℃で３
〜４日間インキュベートした後、得られたＳ、リビダン
ス／ＰＳＶＢ３３１０　タイロシン耐性コロニーを単離
し、既知の方法で培養して同定した。

実施例１０と同様にして組立てた代表的なトランスフエ
クタント（限定的ではない）には次の表３に示すものが
含まれる。

表　３　代表的なトランスフエクタント１、ストレプト
マイセスＲ／Ｒ”　（たｙし、Ｒはアンボファシエンス
、グリセオフスカスおよびリビダンス、Ｒ１は独立して
ファージｐＫｃ３３１０およびファージｐＫｃ３３１１
のいずれかを表すり

【図面の簡単な説明】

ＦＩＧ、１ ｓｔｌ ａｌｌ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、８ ｇｌｌｌ ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、１０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、組換えＤＮＡ含有ストレプトマイセス宿主細胞の選
   択方法であって、 ａ）形質転換、細胞分裂および培養可能なタイロシン感
   受性の非制限的なストレプトマイセス宿主細胞を、該宿
   主細胞内で自己複製または組込み可能であって、タイロ
   シン耐性を付与し得るＤＮＡ配列を含有している組換え
   ＤＮＡクローニングベクターにより形質転換し、 ｂ）形質転換された細胞を、タイロシン耐性の選択に適
   した条件下で培養することからなる方法。 ２、ベクターがプラスミドである第１項記載の方法。 ３、プラスミドが、プラスミドｐＳＶＢ２、ｐＳＶＢ１
   ２、ｐＳＶＢ２３、ｐＳＶＢ１６、ｐＳＶＢ１８、ｐＳ
   ＶＢ２０、またはｐＳＶＢ２２である第２項記載の方法
   。 ４、ベクターがファージである第１項記載の方法。 ５、ファージがファージｐＳＶＢ３３１０またはｐＳＶ
   Ｂ３３１１である第４項記載の方法。 ６、ストレプトマイセス宿主細胞が、ストレプトマイセ
   スのアンボファシエンス、オーレオファシエンス、グリ
   セオフスカス、リビダンス、シナモネンシスまたはトヨ
   カエンシス種である第１項〜第５項のいずれかに記載の
   方法。 ７、ａ）タイロシン耐性を付与するＤＮＡ配列を含有し
   、 ｂ）非制限的なストレプトマイセス宿主細胞内で自己複
   製または組込み可能であり、かつ、ｃ）第１項〜第６項
   のいずれかに記載の方法に用いるのに適した組換えＤＮ
   Ａクローニングベクター。 ８、プラスミドｐＳＶＢ２、ｐＳＶＢ１２、ｐＳＶＢ２
   ３、ｐＳＶＢ１６、ｐＳＶＢ１８、ｐＳＶＢ２０または
   ｐＳＶＢ２２、あるいはファージｐＳＶＢ３３１０また
   はｐＳＶＢ３３１１である第７項記載のベクター。 ９、第７項または第８項記載のベクターによって形質転
   換されたタイロシン感受性の非制限的なストレプトマイ
   セス宿主細胞。 １０、ストレプトマイセス・アンボファシエンスである
   第９項記載の宿主細胞。 １１、ストレプトマイセス・リビダンスである第９項記
   載の宿主細胞。 １２、ストレプトマイセス・アンボファシエンス／ｐＳ
   ＶＢ２である第１０項記載の宿主細胞。 １３、ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＳＶＢ３３
   １０である第１１項記載の宿主細胞。 １４、組換えＤＮＡ含有ノカルジア宿主細胞の選択方法
   であって、 ａ）形質転換、細胞分裂および培養可能なタイロシン感
   受性の非制限的なノカルジア宿主細胞を、該宿主細胞内
   で自己複製または組込み可能であって、タイロシン耐性
   を付与し得るＤＮＡ配列を含有している組換えＤＮＡク
   ローニングベクターにより、形質転換し、 ｂ）形質転換された細胞を、タイロシン耐性の選択に適
   した条件下で培養することからなる方法。 １５、ベクターがプラスミドである第１４項記載の方法
   。