JPS61502074A - 接眼毒性の試験管内試験 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 接眼　毒性の飄゛　内試験 技術分野 本発明は人間の眼に対する物質の刺激性を試験する分野に関する。より詳しくは 、本発明は、特定の物質を人間の限に接触させた場合にそれが一時的または永久 的な損傷を生じさせる能力の予想を可能ならしめるｔｔ’Ｈｇ　内試験に関する 。

背景技術 米国その他の技術先進国では、一般大衆が眼を保護することなしに取り扱う傾向 のあるシャンプー、洗剤、化粧品その他の消費者製品が人間の眼に一時的または 永久的な損傷をどの程度生じさせる能力があるかを評価することが通常行われて おり、またしばしばこれが法的に要求されている。眼球組織は敏感で危険に曝さ れやすいため、限に対する刺激性の弱い一時的な刺激物質の場合には適当なラベ ル表示を行うとか、また極めて限を傷めやすい成分を含んでいる組成物の場合に は、その商業化を規制することが望ましく且つ必要なことは明らかである。米国 では、各種化粧品や家庭用製品について、人間の限に対するその育害性を調べる ため年間１００万回以上もの試験が行われていると推定される。特定の性質を調 べるため多数の回数にのぼる試験の実施を必要とする場合、迅速、安価で、信頼 できる手順をもつことが望ましい。確かに、！鳥゛Ｍｙ内試験が最も好ましいと 思われる。

かかるｔｔ’ｓｙ内試験は、限を刺激する恐れのある物質については現在用いら れていない。現在最も普通に用いられている選別法は、ＩｃＩＩ’（試験法、す なわち、Ｄｒａｉｚｅ　の兎限試験法（Ｄｒａｉｚｅ、　Ｊ、　Ｈ，、ｅｔ　ａ ｌ　Ｊ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｅｘ　ｔｌユ肚ユＬ（１９４４）　８２：３７７ ）である。この試験法の難点は多々ある。まず第一に、’ｌｌ”ｌ試験法である ため、ある程度実験動物の酷使を伴い、また費用が高くつくことである。第二に 、時間が長くかかることである。この方法は、被試験物質を３−９匹の白兎の限 に入れ、３−２１日間後に結膜、角膜および虹彩への刺激効果の度合を記録する ことからなる。勿論、結果の記録はある程度主観的なものとなる。また、実験動 物間の個体差により、結果は自ずから再現性のないものとならざるをえない。従 来、叶ａｉｚｅ拭験法を改良してその欠点を少なくしようとする多くの試みがな されてきた（例えば、Ｂａｔｉｓｔａ＋Ｓ、　Ｐ、＋ｅｔ　ａｌ、　Ｓｏｃ　Ｃ ｏｓｍｅｔ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ　（１９６５）　１６：１１９；　Ｋａｙ、　Ｊ 、　Ｉ（、＋ｅｔ　ａｌ、　Ａｍ　Ｐｅｒｆｕｍｅｒ　Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ　（ １９６５）　８０：６１：　Ｇａｕｎｔ、１．Ｆ、。

ｅｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｓｏｃ　Ｃｏｓｍｅｔ　Ｃｈｅ＋ｎ１ｓｔｓ　（１９６４） 　ｉ５：２０９　参照）。しかし、この試験法には固有の欠点があり、これが眼 に対する刺激性についての安価で信頼性、再現性、予知性のある試験法を得よう とする目的の達成を不可能ならしめている。

すなわち、すべての動物試験の場合と同様、人体への物質の影響との相関が不完 全である。しかしながら、Ｄｒａ　ｉｚｅ試験と同じ結果を出す、より簡単な試 験法が見出されれば、技術の現状に向上をもたらすことになるであろうという点 で、Ｄｒａ　ｉｚｅ　の試験法は充分高く認識されており、そのような試験法を 評価する目的にＤｒａｉｚｅの結果との相関を合理的に用いることができる。

明らかに拭゛鳥史管内試験法が望ましいことから、多くの研究者らは全動物試験 に対して細胞培養による試験法を考案するにいたった０例えば、Ｆｅｒｇｕｓｏ ｎ、　Ｔ、　Ｆ、　Ｍ、、ａｔ　ａｌ　の方法（Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｃｏｓｍｅ ｔ　Ｔｏｘｉｅｏｌ　（１９７４）ユ２：３５９　＞　は培養したマウスの繊維 芽細胞を用い、この細胞による三重水素化ウリジンの摂取に対する物質の抑制能 力を該物質の眼に対する刺激性の尺度として用いている。また５ｔａｒｋ、　Ｌ 、、　ａｔ　ａｌの方法（Ｃｈｅ＋ｗｉｃａｌ　Ｗｅｅｋ　（１９８３）　Ｍａ ｙ　２６　：　２７　）は、マウスの細胞培養体を刺激性物質に暴露し、この培 養体からの液が大食細胞の移動に対しどのような効果をもつかを評価するという ものである。またＣｈａｒ　Ｊｕｓｂｌａｔｔ＋　Ｍ、の方法（Ｖｉｓｉｏｎ　 Ｒｅｓ　（１９８１’）　２１　：　４５　）は、培養液中の兎の角膜細胞中の プラスミノゲン活性化因子のレベルを物質の限に対する刺激性の尺度として用い る。最後に、Ｌｉｔｔｅｒｓｔ、　Ｃ，ｔ＋、、　ｅｔ　ａｔ　は繊維芽細胞ま たはＨｅＬａ細胞における培養体成長の抑止効果を基準として用いている（Ａｒ ｃｈ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｈｅａｌｔｈ　（１９７１）　２虹４５４）。

以上のほか、マウスまたは兎の回腸を用いる二つの方法があり、それぞれ被試験 物質の浸透性（Ｍｕｉｒ＋　Ｃ，Ｋ、、　Ｔｏｘｉｃｏｌ−ｆｆｌ−シ已１シ」 （１９８３）旦：　３０９　）とニワトリの胚の漿尿膜の反応（Ｌｅｉｇｈｔｏ ｎ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ　ｏニーｔｈｅ　Ｓ　ｍ　ｏｓｉｕｍ、 。

Ｐｒｏｄｕｃｔ　５ａｆｅｔ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ、　Ａ、Ｍ、　Ｇｏｌｄｂ ｅｒｇ、　Ｅｄｉｔｏｒ、　ＭａｒｙＡｎｎ　Ｌｉｅｂｅｒｔ　Ｐｕｂｌｉｃａ ｔｉｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８３））を評価している。

上記の浅゛誘管内試験はすべて、組織培養下の活細胞または組織培養下の分離膜 の何れかを必要とする。これらはすべて、Ｄｒａｉｚｅ法の場合と同様、再現性 に欠けるとともに、客観性に欠け、また測定対象である性質との相関性に欠ける といス゛法の代替法を提供する反面、製造と貯蔵が可能な化学的試薬を使用して 正確に再現された試験から期待され得る簡易化と標準化を実現するにいったって いない０本発明の方法はこのような試験を提供する。この方法は、物質が人間の 限を刺激する能力を測る標準的で迅速性、再現性、客観性のある尺度を提供する 。そして、この方法は小動物を使用しないので小動物を維持、人種、飼養する費 用を必要としない。

発　明　の　開　示 本発明は、物質が人間の限に一時的または永久的な刺激を生じる能力を評価する ための試薬および方法を提供する０本発明の試薬試験方式により得られる応答の 大きさは被試験物質により眼に生じる刺激の強度に相関する。ここに言う試薬は 、標準化学試薬の長所と特性を有する物質の規定または準定混合物である。手順 は簡単かつ迅速性の高いものである。

試薬と被試験物質とは混合でき、また結果は計装を用いずに目視評価することが でき、また所望なれば、分析実験室で通常用いられる各種の実験用計測器を用い て定量することも可能である。

従って本発明は、−態様において、人間の眼に対する物質の毒性の予測に有益な 試薬であって、接眼刺激性物質の存在に対して定量的応答可能な蛋白質物質の混 合物から成る試薬に関する。また本発明は、他の態様において、本発明の試薬を 用いて物質の接眼毒性を予測する方法、ならびに前記方法の実施に有益なテスト キットに関する。

図面の簡単な説明 第１図は、ＢＡＣを標準として用いた代表的な検量曲線を示す。

本明細書において、人間の眼に対する物質の「毒性」、または「接眼毒性」とは 、該物質が限の組織への一時的または永久的損傷の形をもって大関の眼に負性反 応を生じさせる能力をいう、この毒性は痛みや、角膜または虹彩もしくはその両 方の白濁、虹彩の充血、膨張、出血、または破壊、あるいは結膜の充血または拡 張、あるいは分泌物の発生等を惹起することから証明される。従って、この意味 における「毒性」または「有毒」とは、広くは物質が人間（または他の鴫乳綱動 物）の眼と接触して存在することから生じる一切の不快感や傷害を含むものと定 義される。

「透明水性液」とは、実質的部分が水であり、且つ可視範囲の光に対して機能的 に？Ｓ朋な液体、通常には混合物であるものをいう。「可視範囲の光に対して機 能的に透明な」とは液の成分の沈澱時に試料が可測吸光を検知するに足る十分な 光を透過させる状態をいう。例えば、１ｃｍのキュベツト中で約０．８吸光単位 量という可視波長の吸光であっても、前記沈澱により生じた付加吸光についても 読み取り可能な範囲が得られる。勿論、かかる機能的に透明な試料の許容吸光度 は与えられた路程と、利用可能な計測器の可測吸光範囲に依存する。

「接眼刺激性物質」とは、人間の限と接触させた際に眼に対して毒性を示す能力 を有する物質をいう。

ｐＨおよび／またはイオン強度の「適合」条件とは、接眼刺激性物質の存在下に のみ沈澱する試薬の性質に対するこれらパラメータの適合範囲をいう。

「試薬」とは、試験対象サンプルと接触させる反応混合物をいう；また「調合物 」とは、溶剤およびサンプルで希釈すると試薬となる材料をいう。

Ｂ、二紋豊五見 ８、　１　試験手順の一般パラメータ 本発明は、接眼毒性を試験される物質と混合した場合にサンプルの毒性に応じて 定性的または定量的に測定可能な応答を与える試薬を提供する。サンプルを試薬 と混合することによる直接の応答は沈澱物の形成であり、その大きさは以下に詳 細説明する各種の方法を用いて評価することができる。沈澱物の形成は、大まか に言えば、刺激性物質により限に生じる反応を示す擬態的応答である。従って、 被試験物質への試薬の応答を該物質に対する眼球組織の反応の予測値として用い ることができる。

Ｂ、２　■ 試薬は、被試験物質と混合される透明水性液として使用する。しかし、これら物 質の試薬混合物の活性成分は固形物として調整することができ、この場合には、 調整後に溶解して透明水性液を形成したときに、接眼刺激性物質の存在下に沈澱 その他の反応が行われる。従って、所望量の成分の混合物を既に溶解された完成 試薬の形態で供給することが可能であるのみならず、固体の形態で、粉体、凍結 乾燥固形物、またはゲルとして供給し、これを後で再液状化して試薬を形成させ ることもできる。

いずれの場合においても、試薬は好ましくは所望成分の最終濃度のものよりも幾 分濃度の高い形態で供給し、これを希釈剤および試験対象サンプルと共に反応混 合物に加えるのがよい。

混合物それ自体は蛋白質物質と、アミノ酸と、炭水化物とイオン化合物の組成物 であり、ある意味において被試験物質と接触した際の人間の眼球組織の反応にあ たる擬態的応答を行うものである。

本発明の透明水性液試薬は、接眼刺激性物質が加えられるまで溶液状態またはコ ロイド状態を保持する溶質またはコロイド粒子を含むもので、該物質が加えられ たときに沈澱を生じる。このため、試薬は少なくとも１種の沈澱剤と少なくとも １種の安定剤を含み、適合したｐＨおよびイオン強度条件に維持されている。好 ましくは、少なくとも１種の増感剤を含ませるとともに、抗体と酵素抑止剤を供 給して試薬を劣化から保護する。

沈澱剤は接眼刺激性物質への試薬の反応を代表する。すなわち、沈澱して濁度を 生じ、あるいは混合物から分離可能な固形分を沈澱させるものである。効果的な 沈澱剤は球状蛋白質を含み、これは最も好適にはグロブリンＧ１．Ｇ２．Ｇ３等 数種の異なったグロブリンの混合物またはそれらのサブコンビネーションとして 用いられる。単一のグロブリンでも作用は得られるが、感度は劣る。完成試薬に おけるグロブリン全体の濃度は使用するグロブリンのクラスによりｏ、ｏｏｔ〜 １０％の範囲、好ましくは０．０１〜５％マある０本発明の試薬に好適な６お１ ．５工、よ、ヮえｉｆ　、トｔ。□ッ、あ６種。グ、１やミノグリカン、および 粘液蛋白質がある。

（前項および以下の項において、濃度範囲は（特に指定のないかぎり）完成試薬 の量に対する重量／容量比の数値である。典型的な調合物では、上述のごとく希 釈が可能なように濃度は５〜１０倍たかくなる。） 安定剤は沈澱剤の早期の凝集を防止するとともに、凝集の程度及び形態をより再 現可能ならしめる。好適な安定剤としては、例えばグリシン、グルタミン、バリ ン、リエーシン等のアミノ酸、２００〜５０００ダルトンのペプチド、およびア ルブミン等の非グロブリン蛋白質が含まれる。濃度と、安定剤の組み合わせとに ついては、実施可能な範囲は広範囲にわたる。−好適実施例では、グリシンを濃 度範囲的０．００５〜０．フχにおいて唯一の安定剤として使用することができ る。一般に、全体としての安定剤濃度は選択した安定剤の性質に応じて０．００ １χ〜１０χ、好ましくは０．１χ〜５χの範囲である。

適合ｐＨＩｔ＋８およびイオン強度は上記の要求される二つの成分、すなわち沈 澱剤および安定剤の緩衝能力とイオン状態を調整することにより、好ましくは適 当なイオン化合物または緩衝剤を用いることにより得られる。連合ｐＨ範囲は約 １〜１０であるが、好ましくは約２〜９である。ｐＨ価がこれより高くなると、 沈澱剤の特性を失わせ、接眼刺激性物質の存在下であってもこれを溶液のままに 止まらせ、またＰＨ４が低くなると、早期沈澱を生じる恐れがある。この範囲で の好適緩衝剤としては、燐酸塩、酢酸塩、トリス−０１、ビカーボネート、その 他公知の各種化合物が含まれる。イオン強度は約０．０５　？Ｉ　から０．５　 Ｍまで広範囲にわたり、一般的に（沈澱剤および安定剤中に荷電半休が存在する ため）付加塩の不存在下でも効果を示すに充分な程度に高い、しかし、このパラ メータは、所望なれば、ＮａＣ１，ＫＣＩ、　ＮａＮ（４等の通常得られる塩を 加えることにより増大させることができる。

また、絶対に必要というわけではないが、試薬中に増感剤を含めることが望まし く、これは接眼刺激性物質の存在下で沈澱剤の凝集を大にする如く沈澱剤の分子 と相互作用する。

かかる増感剤としては、最も代表的には、オボムコイド、ムコ多糖類等の糖蛋白 質；ムシンおよびグルコース等の炭水化物、ならびに燐脂質等の脂質である。勿 論、所望の濃度範囲は増感剤の性質により変わるが、一般的には０〜１０χの範 囲である。

試薬は、アジ化ナトリウム等の制菌剤または殺菌剤を加えることにより、またＮ −エチルマレイミド等の酵素抑止剤を用いることにより劣化を一層防止すること ができる。

上記の文節中で、出願人は得られる物質の所定量を用いた規定薬剤としての試薬 を構成するに必要なパラメータを記載した。しかし、適切な濃度の沈澱剤と安定 剤のほか、例えばグロブリン、ペプチド、アルブミンその他所型の試薬成分を含 む天然物質の抽出物を利用することにより増感剤等の選択的成分の適当な量を含 有させて有効な試薬としての結果を得ることも可能である。かかる抽出物が得ら れる特に好適な二つの天然物質として、卵白とタチナタマメその他の豆類があり 、これらとその組み合わせはすべてグロブリンを含んでいる。調合物は水または 塩溶液を希釈剤として用いて調製することができるが、しかし好ましくは、例え ばイオン化合物と緩衝剤、および／またはＥＤＴＡ等の補助成分を含む抽出溶液 を沈澱剤に影響するイオン濃度の調整のために用いて調製するのがよい。前記の ような天然の材料を用いる場合には、沈澱剤や安定剤はそれらの材料自体の中に 見出されるため、特に沈澱剤、安定剤を抽出溶液中に含有させる必要はない。

８、　３　里 本発明の方法の大きな長所はその単純性にある。手順の要点は単に本発明の試薬 を被試験物質と接触させることだけである。結果は沈澱物の量を直接定量測定す ることにより、または沈澱物の量を例えば比色定量装置により、またはサンプル に試薬を添加して順次希釈する方法を用いて設定した定量的応答の有無を確認し て間接的に測定することにより定量化することができる。沈澱物は、例えば遠心 分離、乾燥、秤量により混合物から分離することにより得ることができる。しか し、より好ましくは濁度を測定することであり、この方法はより迅速で、かつ乾 燥中における沈澱物の物理的変化による煩わしさが少ない。生じた濁りの量は分 光光度計または比色計で得られた標準吸光度の読み取り値を用いて測定すること ができる。この手順では、試薬自体に高分子種が存在することにより、またはサ ンプルにより若干の吸光または光散乱が生じるので、試薬とサンプルの両方をブ ランクとして用いることが重要である。一部のサンプルでは、サンプルと試薬の 各別による全吸光は路程ｃｏｔ当り０．８００単位以上の程度であり、従って吸 光度測定値を用いる場合には路程を短くするか、もしくはより高い吸光範囲に検 量された専用計測器を使用することが望ましい。勿論、サンプルと試薬の双方の 吸光度は試験サンプルの吸光度から差し引かれる。濁りによる光散乱は最も好適 には３４０　ｎｍまたは４３０で定量できる。狭い波長の解像は不必要である。

別法として、吸光度読み取りに代えて濁度測定法を用いることができる。事実、 場合によっては、この方法は好適である。この定量法は、概して、吸光度測定よ りも感度が高く、濃度範囲が広い。しかし、比色定量が極めて広く用いられてい ることからみて、この方法は大抵の商業用途向けに好適である。

沈澱物の量はまた蛋白質の量を測定することにより定量することができる。例え ば、上澄み遠心分離することにより沈澱剤を混合物から分離し、分離した沈澱剤 を例えば、Ｌｏｗｒｙ法（Ｌｏｗｒｙ、　Ｏ，Ｈ，ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ　Ｃｈｅ＋ｍ　（１９５７）　亜２６５）のような公知の標準蛋白質測定法で 測定する。あるいは、ポリアクリルアミドのゲル上で分離して診断バンドにＣｏ ｏｗａｓｓｉｅブルーまたはシルバーの染みをつける方法により分離する。

別法として、試薬の成分にラベルをつけ、沈澱物に随伴した物質の量を沈澱物に 存在する、または上澄みに残存するラベルの量で評価することにより定量評価す ることができる。

このラベルは、例えば、放射性物質、発色団、または発螢光団でよい、いかなる 場合にも、上澄みおよび沈澱物は分離され、ラベルの量はラベルの性質に適した 手段により所望の部分中で読み取られる。

沈澱物中のラベルを定量するときは、その存在量がサンプルの接眼毒性の直接の 尺度となる。また、ラベルが上澄み中で定量されるときは、その量は毒性に反比 例する。

蛋白性沈澱物は、１４ｃ、３Ｈ等の通常えられるβ放射性同位元素を用いる各種 の手段により容易に標識ずけすることができる。沈澱物中の放射能はその上でガ イガー計数管を使用して測定できる。また、上澄み中のそれはシンチレーション 計数器を用いて測定できる。他の同位体、例えば１２５□　または１３１■等も 蛋白質沈澱剤に共役させ、同様な方法を用いて算定することができる。共役発色 団および発螢光団は、上澄みの部分中で極めて好便に測定される。もっとも、こ れらも分離した沈澱物から可溶化して測定することも可能である。好便な発螢光 団としては、ダンシル、フルオレセイン、ロダミン染料等がある。また、好便な 発色団としては、例えばｐ−二トロアニリンがあり、これは４０５　ｎｍで吸光 する。

ラベルはまた酵素触媒反応の基質となるもので、この反応は標準速手段を用いて 定量することができる０例えば、ペルオキシダーゼ反応の基質はいずれも標識と して用いることができ、酵素は沈澱物の分離後、上澄みに加えられて、残存基質 の濃度が評価される。

Ｂ、４　結果の評価 上述したように、本発明の方法によりなされた試験の結果と物質が人間の眼を刺 激する能力との間に完全な相関が得られることが望ましい、しかし、試験の実施 が望まれる多数の刺激性物質に関する人間の経験の結果は検索可能な様式では容 易に得られない、多数の物質について、Ｄｒａｉｚｅの試験結果がある。したが って、本発明の試験法の予測効果の限界基準は、その試験結果と同じ物質につい ての１）ｒａＬｚｅ試験の結果との相関性である。

したがって、本発明の方法で試験物質により生じた濁度の評価に際して３４０ｎ ｍを用いて得た吸光度の読み取り値とトーレイで試験の結果との関係を示す検量 線図表を作成した。他の主要結果基準、例えば他の波長での吸光度、濁度測定値 、カラー試薬による吸光度、放射能等の検量にも同様の手順をもちいることがで きる。

典型的には、３４０ｎｍでの吸光は、個々の物質の特徴的レベルでの高原部を除 けば、試験物質の濃度が増大傾向をとった線型パターンを示している。これは、 吸光度測定では予想された挙動であり、従って吸光度曲線上に試験された各物質 について、読み取られるポジションを定めることが可能である。これらのデータ を用いて、特定の物質につき線型性の範囲で試験を行うことが可能で、これによ り当該物質が試験法の一般検量線に確実に適合する保証かえられる。

各被試験物質を、例えば、総容量１ｍＪ中でのサンプルサイズ１００μｍ、２０ ０μノ、５００μノについて読み取り値を確認することにより線型範囲内に示し たときは、これらのサンプルで得られた吸光度をＤｒａｉｚｓの試験結果の範囲 と相関ずけるように分類することができるａ　３４０　ｎ　ｍでの吸光度値を主 要試験基準として用いて得られた特定の相関に関するより詳細な説明はＣ，２， ｂ項に示しである。

Ｃ，ｌ１里 以下の実施例は本発明を説明するために例示したものであって、本発明を限定す るものではない。

ｃ、ｉ　試薬混合物の調１ 次のものは、緩衝溶液を用いて調製したものであり、場合により、卵白またはジ ャックビーン粉、またはその両者を抽出するため、植物または動物性グロブリン を含むものを用いた。卵白を用いた場合は、分離された白味を、緩衝剤２ｍＪに 対し卵白１ｍＪの割合により緩衝剤で希釈した。ジャックビーン粉を用いた場合 は、と−ン微粉末２　ｇｔ−１００ｍ７の緩衝剤中に２時間浸漬し、Ｗｈａｔｍ ａｎ　１１４０紙で２回濾過し、残分を除去した。

調合物Ａ−Ｃは示された調合物中の成分を濃縮したものであり、成分は典型的に は２〜１０回希釈して所望の完成試薬濃度を得た。

調合物　Ａ 最初の１６の成分は抽出緩衝剤より得、最後の６はジャックビーン粉より得た。

−」４遺ニー　Ｓ−二 ＣａＣ１ｇ　Ｏ，０２％ ＫＣ１０，０４％ Ｍｇ５Ｏａ　Ｏ，０１％ ＮａＨｚ　ｐｏ４　：Ｈ，００，０１％ＮａＣ１０，２Ｍ イソロイシン　０．００２％ グルタミン　０．０３２ ０イシン　０．００２％ リシン：）ＩＣ１ｏ、００４％ チロシン　０．００２％ バリン　０．００２％ ＮａＣＡｃ　Ｏ，ＩＭ ＥＤＴＡ　０．１％ Ｎ−エチルマレイミド　０．０１％ ＮａＮ５　Ｏ，０２％ グルコース　０．１ｚ グロブリン　Ｇｌ　Ｇ、１−０．２％ ムコ多糖類　０．１−０．１５％ アルブミン　０．１−０．３％ 炭水化物　０．２−０．３％ 脂質　０．３−０．５９４ サポニン　０．００１−０．０ｆ％ （以千先白） 調合物　Ｂ 最初の１４成分は抽出緩衝剤から、残り９は卵白から得た。

−エ匠令籾　濃度 Ｎａ０Ａｃ　０．０７Ｍ ＮａＣ１Ｏ１１５Ｍ ＥＤＴＡ、　０．０７％ Ｎ−エチルマレイミド　０．０７％ ｐＪ　ａ　Ｎ　２　０゜０１５％ Ｃａ　ＣＩ　ｔ　０９０１４％ ＫＣＩ　０．０２８％ Ｍｇ　ＳＯ４０，００７％ Ｎａ　Ｈｌ　ＰＯ，：Ｈｌ　Ｏ０，００７％リシン：Ｈｃｔ　ｏ、００７％ イソロイシン　０．００１％ チロシン　ｏ、ｏｏｉ％ グルタミン　０９０２１％ バリン　０．００１％ コナルブミン　３％ オバルブミン　２２％ 脂質　０．４％ グロブリン　ｃ、　０．５−２％ グロブリン　Ｏｆｆ　０．２−２％ グルコース　０．１％ 調合物　Ｃ 最初の１６成分を抽出緩衝剤から、最後の１０成分を卵白およびジャックビーン 粉から得た。

−１」ソ１−一　濃度 ＣａＣＩｚ　０．０２％ ＫＣＩ　Ｏ，０４％ Ｍｇ５ｏ、　ｏ、０１％ ＮａＨｚ　ＰＯ４：　Ｈｚ　Ｏ０，０１％ＮａＣｌ　０．１５Ｍ インロイシン　０．００１％ グルタミン　０．０２％ ロイシン　０．００１％ リシン：ＨＣｌ　ｏ、００２％ チロシン　０．００１％ バリン　０．００１％ Ｎａ０Ａｃ　０．８Ｍ ＥＤＴＡ　０．０５％ Ｎ−エチルマレイミド　０．１％ ＮａＮ５　Ｏ，０２％ グルコース　０．１％ グロブリン　Ｇ＋　１２％ グロブリン　Ｇｚ　１３％ グロブリン　Ｇ＋　１４％ コナルブミン　２％ オバルブミン　５％ オボムコイド　２％ 粘液素　１％ サポニン　０．１０％ 脂質　０，５％ 炭水化物　０．５％ 試薬１ノを調整するため、次の固体をフラスコまたはビーカーで７昆合する。

粉砕したジャックビーン　１０ｇ 塩化ナトリウム　Ｌｏｇ ＥＤＴＡ　５００ｍｇ アジ化ナトリウム　１０　Ｑｍｇ 蒸留水１リットルを　固体成分に加え、混合物を撹拌棒を用いて室温で１時間攪 拌した。シーライト３ｇを加えた後、攪拌を１０分間継続した。

混合物をシーライトで濾過し、清澄な又はやや乳濁光色の溶液を得た。この溶液 は４℃で貯蔵できるものであった。硼酸ナトリウムデカヒトレート３．８ｇを濾 液１ノに加え、硼酸塩が溶解するまで攪拌して、シーライトで濾過し、清澄な黄 色の濾液を得た。この濾液は４℃で貯蔵できるものであった。正負のコントロー ル溶液を次の通り得た。負のコントロール用として、蒸留水５００ｍＬに溶解し た硼酸２．５ｇとコントロール溶液トして、塩化ベンザルコニウム（Ｂ　Ａ　Ｃ ）　’；ｏｏ−ｚを５００ｍＺの蒸留水に溶解した。

−記録では、総容量ＩＩＩＩｌ中に調合物Ａ２００μノを用いた。逐次サンプル 量５００μノ、２５０μノ、１００μノ。

５０μノを用い、３４０ｎｍの光学的濃度をＢｅｃｋｍａｎ　ＤＶ−８ｇ分光光 度計で読み取った。得られた吸光度を接眼毒性の基準として用いた。約１．００ ０二二７ト以上の吸光度は接眼毒性を示すものと認められた。結果を次の広範囲 なカテゴリに配した。

非刺激性物質（Ｎ）＜１．０ 緩刺激性物質　（Ｍｉ）　１．０　２．０中度刺激性物質（Ｍｏ）　２．０　− 　２．５過酷刺激性物質　（Ｓ）＞２．５ 次の表１の結果はサンプルサイズ５００μノについての吸光度値を示す。結果の カテゴリ区分にいては、示された通りの任意の吸光度範囲基準を用いた。（濶１ の濃度は試薬混合物に加えられた５００μｍ部分中のサンプルの濃度を示す、） 表　１ 濃度／サンプル　ＯＤ３や２．　クラス　生体内針ａｉｚｅ１００χ　０．６３ 　Ｎ　Ｎ（１） ／　チルハ５　ヘン７０．２％　０．７５　Ｎ　Ｎ　（１）ベンザルコニウム クロリド／１χ　２．５１　＋１０−５”　１０．５χ　２．４３　ＭＯ−３Ｍ Ｏ−５（４）”　１０．１χ　２．４３　ＭＯ−Ｓ　問（２）レゾールジノル　 ／１００χ２．５２　間　ＭＯ（４）’　１５１　０．４０　Ｎ　Ｎ（４） ラウリル硫酸 ナトリウム／４０χ　１．００　旧　ＭＯ−３（２）プロピレングリ兆／２５１ ０．７４　８　Ｎ−旧（３）ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ／２χ　０．６９　Ｎ　Ｍｉ （４）”　１０．５χ　０．００２　Ｎ　Ｎ（４）１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ ｌｏｇｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇ１ｅｔ＋ｄａｌｅ、　ＣＡ。

２　ＧＲＴＦＦＩＴＨ，Ｊ、　Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｔｏｘ　ａｎｄ　Ａｐｐ ｌ　Ｐｈａｒｓ＋ａｃｏｌ（１９８０）ｌ虹 ３、Ｃｏｎｑｕｅｔ、　Ｔ、Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、　Ｔｏｘ　ａｎｄ　Ａｐｐｌ　 Ｐｈａｒ＊ａｃｏｌ　（１９７７）４、Ｂｕｒｓｔｅｉｎ、　Ｎ、　Ｌ、、５Ｕ ＲＶＥＹ　ＯＦ　Ｏｐｔｈａｍｏ＋　（１９８０）　２５：巨、Ｃ，２，８検量 調査結果 Ｃ，２，ａで得られた予備結果を、Ｄｒａｉｚｅ　の張体試験結果に対する相関 基準を作成することにより更に拡大した。

まず、従来のＤｒａｉｚｅ区分に対応する任意の区分スケールを以下のごとく考 案した。

Ｎ−Ｍｉ　ｌ、５　１−１− １Ｏ２，０１０１０− ２Ｏ−ＭＯ２，５２０２０− ４Ｏ３，０４０−６４ ０−６Ｏ３，５６０−８０ ３４，０８０−１１０ かくして、例えば、３．５のスケール格付けにもとず（平均吸光を受けた試験物 質はＭ　ｏ　−Ｓと区分された。２．０の平均スケール値のものはＭｉと区分さ れる。

区分平均は、三つのサンプル容量レベルで得られたクラス、即ち１　ｍ　ｌの反 応混合物中のサンプル容量５０μｍ、１００μ１．ｚｏｏμ）の平均をとり、次 の最高に丸めた。各サンプル容量について得られたクラスは、次のごとく定めた スケールにしたがって決定した。

ハＸ　１．０　圧　λ、０　２．５　３．０　３．５−　虹虹５０μＩ　Ｏ−０ ，４−０，８−１，２−２，０−２，５−３，０−０，４０，８１，２２，０２ ，５３，０３，５１００μ＋０．４−　０．８−　１．２−　２．０−　２．５ −　３．０−　＞３．５０．８　１．２　２．０　２．５　３．０　３．５これ らのクラスを用いて次の結果が得られた。

則Ｌ［１００μｍ　２００μｍ　王立　匹５％シメＵ９ル　ａｂｓ：　０．２１ 　．２９　．４３　Ｎスケール格付、ｏ　１．Ｑ　１．０　１．００．０５％ベ ンザル　ａｂｓ：　０．４０　０．８０　１．２５コニウムクロリド　スケ−１ に：　１．５　１．５　１．５　１．５　Ｎ−Ｍｉ７０％イソブＵパノール　ａ ｂｓ：　０．９３　１．４２　１．８５スケール：２．０　２．０　１．５　２ ．０　Ｍｉｏ、５％ベンザル　ａｂｓ：　２．１　３．０　３．２コニウムクｎ すＦｘスケール３．０　３．０　３．０　３．ＯＭ。

Ｃ，２，ＣＤｒａｉｚｅ法と本　日法との　較表２は、　Ｃ，２，ｂの検量系を 用いた本発明の試薬、ドレイズ眼試験および一般の人的経験の結果の比較を示す 。ドレイズ試験結果と人的経験に対するそれらの結果の比較はＧｒｉｆｆｉｔｈ 。

Ｊ、　Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｔｏｘ　＆　Ａｐｐｌ　Ｐｈａｒ＋ｗａｃｏｌ　 （１９８０）　５５　：　５０１により報告されている。

人的経験　Ｆし４ｉ眼試験　混合物Ａ ペン？ルコニウム／クロライＦ１０．１％　Ｍｉ−Ｍｏ　Ｍｏ　Ｍｏ−５酢酸／ ３％　Ｍｉ−Ｍｏ　Ｍｏ　Ｍｉ−Ｍ。

ラウリル硫酸ナトリウム／１０％　Ｎ　Ｍｏ　Ｎラウリル硫酸ナトリウム／２９ ％　Ｍｉ　Ｍｏ　ＭｉＮａＣ］Ｏｘ　Ｍｉ　Ｍｏ　Ｍｉ 参ルムアルデヒド７３８　％　旧　Ｓ″　（阻害剤）イソプロパツール７７０　 ％　Ｍｉ　Ｍｏ　Ｍ。

＊極過酷 さらに、家庭用化学物および通常の実験室用化合物（例えば、アイボリイ　リキ ッド（Ｉｖｏｒｙ　Ｌｉｑｕｉｄ　；商標）タイド（Ｔｉｄｅ　ｉ商標）、アセ トン、ソディウムボレート、セタルコ二つム　クロライド、チメロサル、および クロロクラス（Ｃｈｌｏｒｏｘ　；商標））の４５試料が試験された。このとき 、ＳＯＯμｌの試験試料が上記調合物Ｂの５００μｌに添加されたとき得られた 結果の視覚的評価を用いた。結果を、上記分類に従って、上記文献で報告された 標準ドレイズ試験の結果と比較した。その結果は３５試料の場合について実質的 に同一であった。他の５試料についての唯一の差は分類（例えば、ある試験にお いてはＭｏ　、他の試験においてはＳ）にあることがわがった、５つの場合にお いてのみ、バラツキがあり、ある試験で毒性が示され他の試験では示されなかっ た。ＩＩＭＳＯ，セルサンプル−およびブレル（Ｐｒｅｌｌ　；商運）は本発明 の試験では中程度の毒性を示したが、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ 　５ｃｉｅｎｃｅにより行われたドレイズ試験では非刺激性であった。アジャク ラス（Ａｊａｘ　；商ｉ）は５本発明の試験では非毒性結果を示したが、ドレイ ズ試験では中程度の毒性を示した。

表２の結果は１本発明方法により得られた結果が人的経験とほぼ相関シフ、かつ より多大な時間を要し高価でかつ非定量的なドレイズ試験から得られた結果と相 関する。

Ｃ，２，ｄ　澗人　Ｄに関する標゛試 種々の物質が調合物りおよび標準報告書を用いて本発明方法にて試験された。標 準試料を含む全試料を調製するに際し。

試薬が試料容器へまず添加され２次いで、必要に応じて、稀釈水そして試料が添 加された。添加の順序が重要である。

各試験は正のコントロールとしての０．１％ペンサルコニウムクロライド（ＢＡ Ｃ）に対して標準化されている。その標準曲線は一連のｌｌ１ｊ！試料量を用い て得られた。各試料量は調合物りで調製された試薬の０．５ｍｆｆ１と０．１％ ＢＡＣの種々の量とを含む、最も濃厚な標準試料は０．１％ＢＡＣＱ、５ｍｊ！ を含み、最も稀薄な標準試料は０．１％Ｂ　Ａ　Ｃ０，０５ｍ　ｌを含む。

攪拌後、これら試料は３４０ｎｍにて読みとられ、そして各々について正味の０ Ｄ３４゜が０．５＋＊７！オプタルミツク溶液と０．５ｍＡ試薬との一体物のＯ Ｄ、４゜を除去することにより得られた。この正味の０Ｄｘａｏは、第１図に示 された↑り微性物質の種類を特定するために用いられた０、１％ＢＡＣの量に対 してプロットされた。これらの種類は下記表３に示されたドレイズのスコアーに 対応している。

表３″ 刺激性の予測度合い　等価なＦレイズスコア−そこで、各試験物質の刺激性を次 の通り測定した。

標準曲線を得るため用いたシリーズと同様の試験物質の量を種々変更して用いて 試料を作成した。各試料の吸光度からブランクの００３４１１　（試薬プラス模 擬オブタルミンク溶液）とサンプルブランク（対応する試験物質量を水で希釈し てｌ　ｍｌとしたもの）を差し引いて正味のＯＤ、１４ｏ値を得た。試験物質０ ．２５ｍＪを使用した場合、００．、。の正味読み取り値が０．１〜１．０の範 囲にあるときには、試験物質０．２５ｍｆｆ１を含むサンプルの０Ｄｘａ。を用 いて、第１図の検量線から刺激性を直接読み取った。しかし、より大きい量また は小さい量が必要とされる場合には、標準曲線から結果を読み取るための°０． ２５１１１’値を得るため直線０．１〜１．０　００範囲で得た数値について。

相関係数を正味０Ｄｓａ。値に適用した。これらの相関を下記の表４の示す。

表４ ０．１〜１．０範囲において正味０Ｄ３４゜を生じるための試験　の　−丘監一 ０．５０　ｍｌ！　０．６ ０．２５　ｍｊ’　１．０ ０．１２５　ｖｐｌ　１．４ ０．０５０　２β　２．０ ０．０２５　ｔａβ　２．４ ｏ、ｏｏｓ　■Ｉ！３．４ 従って、たとえ試験物質が所望の０．２５ｎ＋ｊ！を含まない物質量の時にのみ ０．１〜１ｍｌ読み取り範囲にあっても、適切な係数を適用することにより適当 な数値を得ることができる。

すべての試料は、不正確な結果に導くことのないように。

試薬の応答を阻止する能力について試験された。この試験で。

０．５０＋／を試薬を含む総容量１　ｍｊｌ中の試験物質について、上記の通り 量を種々変えて用いた。しがし、容管には０．１００ＩｓＩ！ＢＡＣを加えて、 正味ＯＤ、４゜を測定した。非阻害物質の正味０Ｄ！４゜曲線は該試験物質のみ に関する正味の００３４゜曲線のわずか上方でかつそれに平行に位置する。阻害 物質は０．１％ＢＡＣ７！ｌ＜添加されたとき正味００ｓ＜。となる、これは、 試験物質のみの場合に観察される正味０Ｄ３４゜よりも低濃度ではより高くそし て高濃度ではより低い。

５０以上の物質が上記報告書を用いて試験された。これらの結果とドレイズ試験 で得られた結果との間に高い相関関係が認められた。

要約すれば２本発明は、ある物質の接眼毒性に関し予備データを得るための便利 で低価な検索法を提供する。その結果は全動物を含む比較的非定量的・非再現的 そして高価な方法から得られる結果にもしくはより複雑な生体内試験から得られ る結果に比較に値する信頌性をもつ。

Ｓｏ　１００　１５０　２００　２５０ＢＡＣ＋０．１１）風

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．人間の眼に対する物質の毒性を予測するに有益な試薬であって．該試薬は接 眼刺激性物質の存在下に沈澱能力を有する蛋白物質の混合物を含む試薬。
2. ２．人間の眼に対する物質の毒性を予測するに有益な試薬であって，該試薬は， （ａ）接眼刺激性物質の存在下に沈澱を生じるのに有効な濃度の少なくとも一種 のグロブリン蛋白と，そして（ｂ）接眼刺激性物質の不存在下で球状蛋白の沈澱 を防止するのに効果的な濃度の．アミノ酸，ペプチド，そしてアルブミンから成 る群から選ばれた少なくとも一種の物質とを，含み， 水性媒質と混合して，適合性のあるｐＨおよびイオン強度の透明水性液を提供す る試薬。
3. ３．前記グロブリン蛋白はグロブリンＧ１，グロブリンＧ２，グロブリンＧ３と それらの混合物から成る群から選ばれた請求の範囲第２項の試薬。
4. ４．グロブリン蛋白の濃度が試薬の０．００１％と１０％の間である請求の範囲 第２項の試薬。
5. ５．前記（ｂ）のアミノ酸，ベブチド．またはアルブミンの濃度が試薬の０．０ ２％と１０％の間である請求の範囲第２項の試薬。
6. ６．前記ｐＨが２と９との間であり，そして前記イオン強度が０．１モラーより も大である請求の範囲第２項の試薬。
7. ７．人間の眼に対する毒性を予測するに有益な試薬であって，該試薬は （ａ）接眼刺激性物質の存在下に沈澱を生じさせる効果を有すろ濃度の少なくと も一種の沈澱剤と，そして（ａ）接眼刺激性物質の不存在下に沈澱剤の沈澱を防 止する効果を有する濃度の少なくとも一種の安定剤とを含み、水性媒質と混合し て．適合性のあるｐＨとイオン強度の透明な水性媒質を提供する試薬。
8. ８．さらに増感剤を含む請求の範囲第７項の試薬。
9. ９．透明な水性液体混合物の形態にある請求の範囲第７項の試薬。
10. １０．前記混合物が，水性溶剤中に再懸濁可能な固形であり，透明水性液体混合 物を形成しうる請求の範囲第７項の試薬。
11. １１．前記混合物が水性溶剤中に再懸濁可能なゲルの形態をなし．透明な水性液 混合物を形成しうる請求の範囲第７項の試薬。
12. １２．人間の眼に対する物質の毒性を測定する方法であって、該方法は，該物質 を請求の範囲第７項の試薬と接触させることを包含する方法。
13. １３．沈澱の大きさを記録する段階をさらに包含する請求の範囲第１２項の方法 。