JPS61500930A - 膜結合系の検知 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 膜結合系の検知 本発明は、生細胞のような膜結合型生化学的系内でおこる電気化学的反応の検知 に関する。Ｘ核細胞の場合、他の膜結合組織、例えば呼吸に関与する文トコンド リアや光合成組織で光合成に関与する葉緑体などは外細胞膜に含まれる。これら の号ブシステムは、ｔｉｌｌからｊｌＭして別々に研究することが可能である。

しかしながら、ｔａｎしている完全ＩＩｍ？中でそれらをその場で研究すること がしばしば望まし％’ｓ、Ｉ！結合過　−程の機能を検知する一つの方法は、賎 を包囲する媒体中の要求される反応体またはこの媒体中に目的とする系により放 出される生産物の濃度をｉＩ測することである。

＠能している完全ｔｌｌｉ！内に現存する系でこれらを研究することはしばしば 不可能である。なぜなら、ｍ１ｉｉ！膜は代謝物と検出装置との間のパリ十とな るからである。

生細胞は、たとえば酵母によるエタノールの生産、微生物による抗生物質の生産 、あるいは植物細胞に対する除草剤の試験など種々の産業工程に利用されている 。

製造業者がＩ膜結合系内で生ずることをより直接的に追跡しうるような方法は、 製造工程の綿密な制御を可能にしたり、或いは種々の生物学的過程への新しい化 学物質のｉｔを試験したり、或いはその系の１部を構成する生物体の活力や健康 を評価する濠に極めて価値がある。今回、膜結合系内でおこる成る種の生化学的 反応を９１超された組織中でも細胞内のその場でも検知する方法が見出された。

本発明によれば、膜結合系内で生ずる反応の検知方法が提供され、この方法は電 気化学的反応を受けうるｌＩ透過性反応分子を膜結合系に接する媒体中に導入し 、かつ電極を含む媒体中で擬似反応体の変化を観察することを特徴とする。

「ゼ似反応体」という用ｉ≦は、天然反応体と同様な方法で目的の特異的反応を 受けうるような化合物を意味する。しかしながら、天然反応体と異なり、擬似反 応体は膜を通過することができ、かつ生化学的部位を検出用電極の両者と反応す ることができる。このことは、擬似反応体の変化を検知しうる外部の横加装置に より細胞内の特異的反応の情報が得られることを！味する。

用いられる擬似反応体は、研究すべき反応に１に存する。適する化学物質の選択 には、要求される程度の特異性を得るべく生化学的反応機構をＦ！解することが 必要である。原理的には、この方法で極めて広範囲の生物電気化学的反応を検知 することができ、ただしいずれの場合にも、目的部位の生化学的知識と擬似反応 体の電気化学的技術がａ・要である。

たとえば、本発明は１）コンドリアや葉緑体の内部で生ずる特異的反応の研究に 応用できる。これらの組織は、部分的に単純化された系を与えるようｆｉ胞から 分離して研究することができる。しかしながら、組織が機能している完全細１ミ 中にまだ存在している場合にも同じ反応を検知しうろことが判明した。完全細胞 は、水性媒体の懸濁物として研究することができる。このようにして、細菌、藻 類および酵母の懸濁物につきｖｒ究した。連結１１１ｉｉ！組織（たとえば正富 植物組穐やカルス１１織）並びに細胞懸濁物は、ａｌｌ糧の細胞壁と接している 水性媒体中に１を極をいれてこの方法で研究できる。一般に生化学的反応は、ま だ細胞内に存在する際、恐らく（世の制御機構が働いているため、より複雑とな る１頃向を有する。

研究すべき膜結合系と接触している外部媒体は、例えば浸遇により、或いは１臭 を通過したり擬似反応体やそのｆＪ！察に使用する手段に悪影響を及ぼしうるよ うな毒性物質の含存などによって、膜結合系が国書されないようにｉ！沢される ８機能に悪影響を与えずに上糸を分散させるのに通した液体媒体は公知である。

この種の媒体は一般に水性である。

擬似反応体としての選択条件は次の通りである。

＋ａ＋　目的部位とのみ迅速に反応せねばならプ；い。

ｔｂ）　目的部位で可逆的に反応せねばならない。

ｔｅｌ　股を通過することができ、しかも水性媒体中に十分時間蕾まりうるよう な範囲内の水と脂質とに対する分配係数を持たねばならない。

＋ｄｌ　その媒体中で観察用の１１極と可逆的に反応できねばならない。

（ｃｌ　反応体の存在により生物系のｖｉ能が影響されないような極めて低い濃 度で使用できねばならない。

Ｎ似反応体として使用しうる化合物の例は、キノン類（或いはそれに対応する還 元型、すなわちキノール類）である。

細胞内代謝過程で特異的に反応するキノン系を使用することができる。生物系と 反２させる隙、酸化型と還元型との比は問題となる特殊な代謝過程の活性に応じ た量で変化し、その変化を上記のように電気化学的に検知することができる。キ ノンが細Ｉｔ！　１２を通過できるようにキノンの物理的性質を変化させること により、この技術は生細胞系並びに単離された細胞亜両分に通用できる。

置換されたｐ−ベンゾキノン類の使用可能な特的例を下記に示す。

本発明の技術を用いて、研究しうる特定反応は、ミトコンドリアと葉緑体でそれ ぞれ生ずる。今回、除草剤のような化学物質がこれらの反応に顕著な影響を与え うろことを突き止めた。ミトコンドリアにおいては、呼吸連鎖の内生ユビキノン −１０成分の流入および流出速度の変化を研究することができる。この目的で、 本発明においては、擬似反応体としてユビキノン−１もしくはテトラメチル−ｐ −ベンゾキノンを用いた。ユビキノン−１は２，３−ジメトキシ５−メチル−６ −イソブレニル−ｐ−ベンゾキノンである。

葉緑体において、光エネルギーＦＭ獲用光合成系の２つの異なる型の両者に効果 のある内生プラストキノン−９プールの変化を研究できる。この目的で、擬（以 反応体としてプラストキノン−１，プラストキノン−２あるいはトリメチル−ｐ −ベンゾキノンを用いた。プラストキノン−１４’！２．３−ジメチル−５−イ ソプレニル−ｐ−ベンゾキノンであり、プラストキノン−２は２．３−ジメチル −５−ゲラニル−ｐ−ベンゾキノンである。

これらは上記の基準に基づいて選択され、ただしそれらの熱力学中間点ポテンシ ャルは、内生成分が酸化還元状態を変化させる隊に、その酸化還元状態をいちじ るしく変化させるような程度であるという付加的な特徴をさらに有する。

電位にセントして使用する擬似反応体の酸化−還元状態を測定することである。

かくして、バラ−ベンゾキノン類は、電子がキノンもしくはキノールと電極の間 を通過するように電極の表面で相互作用しうる。しかしながら、機械的理山によ り、反応は「電気化学的に不可逆」であつて、酸化波と還元波とが全く別々とな り、キノン系の熱力学ポテンシャル全体の平衡にほとんど関係がなくなる。この ことは、特殊な媒体中に存在する酸化型及びｉ１元型キノンの比を検知するため に電位差測定技術を使用しえないことを！味する０代案として、電流測定技術が 用いられる。ＩＩｔｉは、酸化型キノンのみ或いは還元型キノンのみを検知する 電位に設定することができる。たとえば、ｐｔ＋７ではガラス質炭素の電位をＳ ＨＥ　（標準水素電極）に対して一２５０ｍＶに設定することにより、′１１流 はユビキノン−１の濃度に比例して流れる。或いは、＋２５０ｍＶの電位を使用 してユビキノール１のみを検知でき、その場合ユビキノン−１は影響しない。

キノールかキノンのいずれかの濃度に比例する電流が、炭　“素電極と白金線カ ウンター電極間を流れる。基準電圧は、１艮−塩化銀基準電極によって与えられ る９次いで、擬似反応体の酸化還元状態の変化を、作動１ｉ極とカウンター電極 との間の電流の変化として検知する。溶液を攪拌し、一般に１〜１０ナノアンペ ア程度の電流が生ずる。擬似反応体の使用濃度は１−５００ナノモルの範囲であ るが、これはより鋭敏な信号増幅によってさらに減少が可能である。

下記する例では、３種の電極（作動、カウンター、基準）を用いた。しかしなが ら、作動電ｂｉ１位の小さな変化が電流を使用できる。ある状態では、他の電気 化学的技術が通している。細胞内へのあるいは綱胞外への拡散が極めて遅い場合 、平衡が生ずるために十分な時間が経過した後、定常状態の酸化還元の測定値を 得るために単一掃引電圧測定法を用いることができる。他の場合、キノンあるい はキノールを生産しかつ生産された種類がリング電極に達する前に生物系により どの程度消費されたかを決定するには、回転式環状乏Ｚｈを用いることができる 。

以下、本発明を実施例により説明する。

実施例！ ｊｌｌｄｌしたラット肝臓のミトコンドリアを憲法で調製し、１００ｍＭ　Ｋｃ ｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（エチレンジアミンテトラアセテート）と１０ｍＭリン 酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，２）を含む液体媒体に再懸濁させた。ラット肝臓ミ トコンドリアの濃度は２■タンパク質／■】であった、上記混合液の試料を、ガ ラス買戻Ｓ電極と白金線電極との２つの電極を含むガラス容器に入れた。容器内 容物と接する液体中の謹−塩化を艮半電池は基準電極を与える。炭素電極は作動 電極であり、ユビキノール−１からユビキノン−１への変換に対する最高時電流 電位よりも高い電位にセントする。かくして、炭素１１極にかかる電位は損、塩 化銀基準に対し＋３フＱ　ｍ　Ｖであった。

２９０ｎＭのユビキノール−１を加え、液状媒体を攪律しながら、ガラス質炭素 電極と白金電極との間を流れる電流を記録した。

１０ｍＭのピルビン酸をミトコンドリアのエネルギー源として加え、次いで４０ ０μＭのアデノシンニリン＠　（ＡＤＰ）を加えた。

上記の材料を加えた都度、電流の急激な変化が生じた。

ＡＤＰの添加後、電流は上昇し始める前に数分間冷んど一定であった。定′Ｗ１ 流の期間は、ＡＤＰからＡＴＰ　（アデノシンニリン酸）への変化に相当すると 解釈される。

得られた結果は、ミトコンドリア内でおこる反応を本発明に従い外部電極によっ て測定しうろことを示している。

ミトコンドリアの不存在下ではピルビン酸やアデノシンニリン酸を添加してもｉ ｆｔｆｔ比変化察されなかった。

験を行なった。豆葉緑体の濃度は０．２２ｗ＋ｇ／ｓｌであつた。

使用した擬似反応体はプラストキノール−１である。

プラストキノール−１を添加すると、電流の急激な増加に続き低下が生じた。波 長６４５ｎｍの光で容器を照射すると、定常高レベルまで電流は急激に増加した 。アデノシンニリン酸（Ａｔ）Ｐ　４００μＭ）を添加すると、１ｆＬの増加に 続いて低下がおこり、これは全ＡＤＰがアデノシンニリン酸（ＡＴＰ）に変化す ることに関係する。

葉は体の帯電状態を阻害することが知られた塩化アンモニウム（ＮＨ２Ｃｌ　） を添加すると、を流が顕著に変化した。

得られた結果は、明らかに、葉緑体内でのみ生ずる反応が電捲外の媒体中におけ る電掻間の電流に影響することを示している。

Ｋ敷にニ ブラストキノン−１を含む緩衝液中でＮＬＩＩホルミジウム・ラミノスム（Ｐｈ ｏｒｓｉｄｉｕｍ　ｌａｍｉｎｏｓｕ＋ｍ）の完全細胞の１！！濁液を用いて実 施例】と同様に実験を行なった。容器を波長７１５ｎｍの光に露出すると、１！ 極間で電流の減少がおこった。光を遮断すると、１１流は再び増加した。

Ｋ反沢玉 ｔｉｒｒｉｉの完全細胞を用いて実施例１と同様に実験を行なうた。

ユビキノン−１を含むｐＨ７，２のｔｌｉ衡液中のロドシェードモナス１スファ エロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ　ｇｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）を 用いた。容器に波長６１０ｎｍの光をあてると、初期のｉｉ流のわずかな上昇に 続いて相当に低下した。光を遮断すると、短時間電流が減少し続け、次いで再び 増加した。

におけるエビキノール−１／ユビキノン−１の酸化還元反応に対する作用によっ て検出される。

上記実施例に加えて、大麦および酵母細胞からのプロドブさらに、完全豆の葉す なわち連結細胞組織を用いて実験を行なった。クチクラを除去し、Ｎ極を露出表 面に載置した。

国際調査報告 Ａｈ”ｋｒＥＸ　：ｏ　Ｔ”　！Ｎ’：ＥＬ’ｌＡＴ！０ＮＡＬ　Ｓ二人スｃ五 　ＲＥ：’ＣＲＴ　ＯＮ−・嗜・勘−一拳・＋僧・―・＋＋拳−・・＋聯−自＋ −・−＋＋會−−＋＋＋＋骨・＋拳−−ＺＮＴＥＲＮＡＴＺＯＮＡＬ　入？Ｐ（ ＪＣＡ：！ＯＮ　Ｎｏ、　ＰＣ’−／Ｃ；３　＋＋５０００２２　（ＳＡ　５７ ４６）φ　彎・＋＋＋＋・−・・・−・・−一―・＋−・−一−・＋ｍ−−骨・ ―−＋＋＋＋―・−・＋＋　−・−一働−＋＋＋＋咎ゆ

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．電気化学的反応を受けうる膜透過性反応分子を膜結合系に接する媒体中に導 入しかつ電極を含む媒体中で擬似反応体の変化を観察することを特徴とする膜結 合系で生ずる反応の検知方法。
2. ２．電気化学的反応が酸化還元反応である請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．擬似反応体がキノンもしくはキノールである請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．キノンがユピキノン−１，プラストキノン−１またはそれに対応するキノー ル類である請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の方法。
5. ５．擬似反応体の変化を、電極を通る電流の測定によつて観察する請求の範囲第 １項乃至第４項のいずれかに記載の方法。
6. ６．電極をミトコンドリアまたは葉縁体の懸濁液中に浸漬する請求の範囲第１項 乃至第５項のいずれかに記載の方法。
7. ７．電極を完全細胞の懸濁液中に浸漬する請求の範囲第１項乃至第６項のいずれ かに記載の方法。
8. ８．電極を連結細胞組織と接触させて媒体中に設置する請求の範囲第１項乃至第 ７項のいずれかに記載の方法。