JPS6131088A - 新規ｄｎａおよびその用途 - Google Patents
新規ｄｎａおよびその用途Info
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- JPS6131088A JPS6131088A JP59156181A JP15618184A JPS6131088A JP S6131088 A JPS6131088 A JP S6131088A JP 59156181 A JP59156181 A JP 59156181A JP 15618184 A JP15618184 A JP 15618184A JP S6131088 A JPS6131088 A JP S6131088A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- promoter
- yeast
- gene
- pal2
- vector
- Prior art date
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- Granted
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、酵母から得られたプロモーターを含む新規Ｄ
ＮＡおよびその遺伝子工学へめ用途に関する。
ＮＡおよびその遺伝子工学へめ用途に関する。
従来の技術
組み換えＤＮＡ技術が広く利用されるようＫなって、有
用なポリペプチドの原核生物や真核生物を用い九生産が
可能になってきた。これまでこれら物質の大量生産には
主として大腸蔭が利用されてきたが、特に薬理学的に重
要なポリペプチドの生産には真核生物の利用が望まれる
。酵母は真核生物でｓｂ他の真核生物、とくに哺乳動物
細胞と数々の共通点を有しているために哺乳動物由来の
蛋白質遺伝子を発現させるのに有利である。さらに酵母
細胞はエンドトキシンを含有しないこと、酵母は微生物
であるために培養が容易であること、古くから大量培養
が工業的になされておシ、その安全性が確認されている
こと、その遺伝生化学的解析が数多くなされていること
などの理由から、酵母を宿主として利用することに注目
が集まっている。
用なポリペプチドの原核生物や真核生物を用い九生産が
可能になってきた。これまでこれら物質の大量生産には
主として大腸蔭が利用されてきたが、特に薬理学的に重
要なポリペプチドの生産には真核生物の利用が望まれる
。酵母は真核生物でｓｂ他の真核生物、とくに哺乳動物
細胞と数々の共通点を有しているために哺乳動物由来の
蛋白質遺伝子を発現させるのに有利である。さらに酵母
細胞はエンドトキシンを含有しないこと、酵母は微生物
であるために培養が容易であること、古くから大量培養
が工業的になされておシ、その安全性が確認されている
こと、その遺伝生化学的解析が数多くなされていること
などの理由から、酵母を宿主として利用することに注目
が集まっている。
現在、遺伝子クローニングの丸めの酵母ベクターはいく
つか知られているが、異種遺伝子を効率よく発現させる
ための強力な酵母プロモーターはあまシ知られていない
。
つか知られているが、異種遺伝子を効率よく発現させる
ための強力な酵母プロモーターはあまシ知られていない
。
酵母サツカロマイセス・セレビシェの細胞破砕液中には
二種類のアルカリ性ホスファターゼの存在が知られてい
る。その一つは無機リン酸によってその生産が抑制され
、基質特異性の広い抑制性アルカリ性ホスファターゼで
あシ、他の一つはｐ−ニトロフェニルリン酸のみを基質
にし、かつ構成的に産生される特異的ｐ−ニトロフエニ
〃ホスファターゼである。抑制性アルカリ性ホスファタ
ーゼ活性を欠く突然変異体としてｐｈｏ８ 変異体とｐ
ｈｏ９変異体が分離されておシ、ｐｈｏ８遺伝子は抑制
性アルカリ性ホスファターゼの構造遺伝子であ）、ｐｈ
ｏ９ば遺伝子はｐｈｏｇ転写以後に必須で液胞内加水分
解酵素群の前駆体を活性化させると考えられている。一
方、特異的ｐ−ニトロフェニルホスファターゼ突然変異
体は分離されていない。
二種類のアルカリ性ホスファターゼの存在が知られてい
る。その一つは無機リン酸によってその生産が抑制され
、基質特異性の広い抑制性アルカリ性ホスファターゼで
あシ、他の一つはｐ−ニトロフェニルリン酸のみを基質
にし、かつ構成的に産生される特異的ｐ−ニトロフエニ
〃ホスファターゼである。抑制性アルカリ性ホスファタ
ーゼ活性を欠く突然変異体としてｐｈｏ８ 変異体とｐ
ｈｏ９変異体が分離されておシ、ｐｈｏ８遺伝子は抑制
性アルカリ性ホスファターゼの構造遺伝子であ）、ｐｈ
ｏ９ば遺伝子はｐｈｏｇ転写以後に必須で液胞内加水分
解酵素群の前駆体を活性化させると考えられている。一
方、特異的ｐ−ニトロフェニルホスファターゼ突然変異
体は分離されていない。
発明が解決しようとする問題点
現在、遺伝子クローニングのための種々の酵母ベクター
が知られておシ、利用が可能である。しかし同種もしく
は異種遺伝子を効率よく発現させるためには、用いる宿
主に適した強力な酵母プロモーターを選択する必要があ
る。
が知られておシ、利用が可能である。しかし同種もしく
は異種遺伝子を効率よく発現させるためには、用いる宿
主に適した強力な酵母プロモーターを選択する必要があ
る。
問題点を解決するための手段
本発明者らは、酵母のｐ−ニトロフェニルホスファター
ゼプロモーター（Ｐ１１０１３プロモーターと称する。
ゼプロモーター（Ｐ１１０１３プロモーターと称する。
）に着目し、ｐ−ニトロフェニルホスファターゼをコー
ドする領域をクローン化し、その塩基配列を決定したと
ころ該プロモーターは新規なりＮＡであること、これを
用いて同種もしくは異種遺伝子を効率よく発現させるこ
とができること、および同種遺伝子の一つであるｐ−ユ
トロフエ＝ルホスファターゼをコードする構造遺伝子を
発現させて得られたｐ−ニトロフェニルホスファターゼ
は、新規な酵素であることを見出し、これらに基づいて
さらに研究した結果、本発明を完成した。
ドする領域をクローン化し、その塩基配列を決定したと
ころ該プロモーターは新規なりＮＡであること、これを
用いて同種もしくは異種遺伝子を効率よく発現させるこ
とができること、および同種遺伝子の一つであるｐ−ユ
トロフエ＝ルホスファターゼをコードする構造遺伝子を
発現させて得られたｐ−ニトロフェニルホスファターゼ
は、新規な酵素であることを見出し、これらに基づいて
さらに研究した結果、本発明を完成した。
本発明は、（１）ＰＨ０１３プロモーター、（２）ＰＨ
０１３プロモーターが組み込まれたベクター、（３１Ｐ
Ｈ０１３プロモーターおよびその下流に構造遺伝子が組
み込まれたベクターで形質転換された形質転換体、（４
）ＰＩ（０１３プロモーターおよびその下流に構造遺伝
子が組み込まれたベクターで形質転換された形質転換体
を培地に培養し、培地中に生成蓄積された遺伝子産物を
採取することを特徴とする遺伝子産物の製造法、および
（５）ｐ−ニトロフェニルホスファターセ（ｐ−ＮＰＰ
ａｓｓ ）である。
０１３プロモーターが組み込まれたベクター、（３１Ｐ
Ｈ０１３プロモーターおよびその下流に構造遺伝子が組
み込まれたベクターで形質転換された形質転換体、（４
）ＰＩ（０１３プロモーターおよびその下流に構造遺伝
子が組み込まれたベクターで形質転換された形質転換体
を培地に培養し、培地中に生成蓄積された遺伝子産物を
採取することを特徴とする遺伝子産物の製造法、および
（５）ｐ−ニトロフェニルホスファターセ（ｐ−ＮＰＰ
ａｓｓ ）である。
本発明（（転）における構造遺伝子の例としては、たと
えばｐ−ニトロフェニルホスファターゼをコードする構
造遺伝子が挙げられ、また遺伝子産物と７−ｃえ１゛ してハン丁二−トロフエニμホスファターゼが挙げ）れ
る。
えばｐ−ニトロフェニルホスファターゼをコードする構
造遺伝子が挙げられ、また遺伝子産物と７−ｃえ１゛ してハン丁二−トロフエニμホスファターゼが挙げ）れ
る。
本発明のＰＨ０１３プロモーターおよびｐ−ＮＰ Ｐ
ａｓｓ をコードする構造遺伝子（ＰＩＩＯ１３と称
する。）を含むＤＮＡは、酵母菌体から分離、採取する
ことができる。
ａｓｓ をコードする構造遺伝子（ＰＩＩＯ１３と称
する。）を含むＤＮＡは、酵母菌体から分離、採取する
ことができる。
該酵母としては、いずれのものでもよいが、とくにサツ
カロマイセス（Ｓａｏｏｈａｒｏｍｙｃｅａ ）属菌
が好ましく、たとえばサツカロマイセス・セレビシェ（
Ｓ、 ｏｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）が挙げられ、具体的に
は（以下、余白） たとえば市販のパン酵母が挙げられる。
カロマイセス（Ｓａｏｏｈａｒｏｍｙｃｅａ ）属菌
が好ましく、たとえばサツカロマイセス・セレビシェ（
Ｓ、 ｏｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）が挙げられ、具体的に
は（以下、余白） たとえば市販のパン酵母が挙げられる。
酵母からＤＮＡを抽出するには、たとえばＭｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 ｖｏＬ １２
！ Ｐ、 １３〜４４（１９７５）に記載の方法ある
いはこれに準じた方法によって行われる。
ｓ ｉｎ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 ｖｏＬ １２
！ Ｐ、 １３〜４４（１９７５）に記載の方法ある
いはこれに準じた方法によって行われる。
次に、得られたＤＮＡを適当な制限酵素で処理したのち
、同じ制限酵素あるいは同じ接着末端を生じさせる制限
酵素で処理したプラスミド、あるいはファージに上記で
得られたＤＮＡ断片を組み込んでシーンパンクを作製す
る。該プラスミドとしては例えばｐＢＲ３２２や大腸菌
−酵母シャトルベクターＹＥｐ１３ （Ｇｏｎｅ ８．
１２１（１９７９） １９照〕が、またファージとして
はｃｈａｒｏｎ系ファージ（、Ｔ、 Ｖｉｒｏニー幻、
５５５ （１９７９）参照〕などが用いられる。また
必要により、例えば大腸菌−酵母シャトルベクターＹＥ
ｐ６ ＣＧｅｎｅ ８．１７（１９７９）＃照〕など
を用いてさらにサブクローニングする。
、同じ制限酵素あるいは同じ接着末端を生じさせる制限
酵素で処理したプラスミド、あるいはファージに上記で
得られたＤＮＡ断片を組み込んでシーンパンクを作製す
る。該プラスミドとしては例えばｐＢＲ３２２や大腸菌
−酵母シャトルベクターＹＥｐ１３ （Ｇｏｎｅ ８．
１２１（１９７９） １９照〕が、またファージとして
はｃｈａｒｏｎ系ファージ（、Ｔ、 Ｖｉｒｏニー幻、
５５５ （１９７９）参照〕などが用いられる。また
必要により、例えば大腸菌−酵母シャトルベクターＹＥ
ｐ６ ＣＧｅｎｅ ８．１７（１９７９）＃照〕など
を用いてさらにサブクローニングする。
このようにしてクローン化されたＤＮＡを保持するベク
ターで、宿主微生物を形質転換する。
ターで、宿主微生物を形質転換する。
宿主微生物としては、酵母が好ましく、たとえばサツカ
ロマイセス属菌などが挙げられる。さらに具体的には、
サツカロマイセス・セレビシェＮＡ７５−２Ａ株、ＮＡ
７４−３Ａ株などが挙げられる。
ロマイセス属菌などが挙げられる。さらに具体的には、
サツカロマイセス・セレビシェＮＡ７５−２Ａ株、ＮＡ
７４−３Ａ株などが挙げられる。
なお、上記宿主微生物唸、ｐｈｏ９ の酵母であるこ
とが好ましい。
とが好ましい。
上記ＮＡ７５−２Ａ株、ＮＡ７４−３Ａ株は、通常の交
雑法（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｇａｎｅｔｉｃｓ Ｐ
３６６Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅａｓ 、 Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ １９７４ ） Ｋ従って得ることができる。すなわ
ちＮｉ２５−２Ａ株は、ＡＬ２１１−１２Ｂ株（” ＋
ｐｈｏ３−１ 、 ｐｈｏ８゜ａｒｇ６ ） （Ｍｏ
Ｌ Ｃｅ１ｌ ＢｉｏＬ ２．１２７（１９８２））
。
雑法（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｇａｎｅｔｉｃｓ Ｐ
３６６Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅａｓ 、 Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ １９７４ ） Ｋ従って得ることができる。すなわ
ちＮｉ２５−２Ａ株は、ＡＬ２１１−１２Ｂ株（” ＋
ｐｈｏ３−１ 、 ｐｈｏ８゜ａｒｇ６ ） （Ｍｏ
Ｌ Ｃｅ１ｌ ＢｉｏＬ ２．１２７（１９８２））
。
ＡＨ２２株（ａ 、 １＠ｕ２．ｈｉｓ４．ｃａｎｔ）
ＣＰｒｏｃ。
ＣＰｒｏｃ。
ＮａｔＬ Ａｃａｄ、 Ｓｏｉ、 ＵＳＡ ８０．１
（１９８３） ） 、 ＤＩ ３−ＩＡ株（ａ 、 ｔ
ｒｐｌ 、ｈｉｓ３．ｇａ１２． ＥＩＵＣ２）（Ｐｒ
ｏｏ、ＮａｔＬ Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ 、
７６ 、１０３５（１９７９ン〕およびＹＡＴ２２８株
（ａ 、 １ａｕ２゜ｌｙａ １０ ＊ ｏｙｈ 、ｋ
ａｒｌ−１） （Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。
（１９８３） ） 、 ＤＩ ３−ＩＡ株（ａ 、 ｔ
ｒｐｌ 、ｈｉｓ３．ｇａ１２． ＥＩＵＣ２）（Ｐｒ
ｏｏ、ＮａｔＬ Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ 、
７６ 、１０３５（１９７９ン〕およびＹＡＴ２２８株
（ａ 、 １ａｕ２゜ｌｙａ １０ ＊ ｏｙｈ 、ｋ
ａｒｌ−１） （Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。
口互、１４２１（１９８１））を交雑する仁とによって
、また）ｆＡ７４−３Ａ株はＡＬ２０３−９Ａ株（α、
ｐｈｏ３−１ 、 ｐｈｏ９ 、 ｔｒｐ５ ） （
ＭｏＬ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ。
、また）ｆＡ７４−３Ａ株はＡＬ２０３−９Ａ株（α、
ｐｈｏ３−１ 、 ｐｈｏ９ 、 ｔｒｐ５ ） （
ＭｏＬ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ。
２．１２７（１９８２） ） 、 Ａ １１２２株、Ｄ
Ｉ３−ＩＡ株を交雑することによってそれぞれ取得でき
る。
Ｉ３−ＩＡ株を交雑することによってそれぞれ取得でき
る。
このようにして得られたシーンバンクあるいはサブクロ
ーンを用いて、ｐｈｏ９ の酵母を形質転換すること
によＪＰＨＯ１３＠ＰＨ０１３プｐモーター流にｐ−７
ＰＰｌＬ４ｉ をコードする構造遺伝子が連結されたベ
クターを保持する形質転換体が得られる。
ーンを用いて、ｐｈｏ９ の酵母を形質転換すること
によＪＰＨＯ１３＠ＰＨ０１３プｐモーター流にｐ−７
ＰＰｌＬ４ｉ をコードする構造遺伝子が連結されたベ
クターを保持する形質転換体が得られる。
形質転換するには、公知の方法たとえばＰｒｏｃ。
ＮａｔＬ Ａｃａｄ、 Ｓｏｉ ＵＳＡ ７５ 、１９
２９（１９７８） 。
２９（１９７８） 。
Ｎａｔｕｒｅ ２７５ 、１０４（１９７８） 、 Ｃ
ｏ１ｃｌ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ、 Ｑ
ｕａｎｔ ＢｉｏＬ ４３ 、１３０５（１９７９）、
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｏｉ、 Ｕ
ＳＡ ７６ 、１０３５（１９７９） に記載された方
法あるいはこれに準じた方法によって行われる。
ｏ１ｃｌ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ、 Ｑ
ｕａｎｔ ＢｉｏＬ ４３ 、１３０５（１９７９）、
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｏｉ、 Ｕ
ＳＡ ７６ 、１０３５（１９７９） に記載された方
法あるいはこれに準じた方法によって行われる。
後述の実施例１で製造された形質転換体であるサツカロ
マイセス・セレビシ／工ＮＡ７５−２Ａ／ＰＡＬ２
は、昭和５９年７月５日に財団法人発酵研究所（ＩＦＯ
）に受Ｗｆ、番号工Ｆ’０ １０１３３として寄託され
、また本微生物は昭和５９年７月１３日に通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番号Ｆ
ＩＲＭ Ｐ−７７１２として寄託されている。
マイセス・セレビシ／工ＮＡ７５−２Ａ／ＰＡＬ２
は、昭和５９年７月５日に財団法人発酵研究所（ＩＦＯ
）に受Ｗｆ、番号工Ｆ’０ １０１３３として寄託され
、また本微生物は昭和５９年７月１３日に通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番号Ｆ
ＩＲＭ Ｐ−７７１２として寄託されている。
上記方法で得られた形質転換体が、ＰＨ０１３プｐモー
ターおよびｐ−Ａ／ｆＰ＾υ５をコードする構造遺伝子
を保持するかどうかは、次に記載の方法によシ確認する
ことができる。すなわち、該形質転換体を例えばパーク
ホルダー改変培地（Ｊ、Ｂａｃ−ｔｅｒｉｏｌ、 １１
３．７２７（１９７３））上にコロニーを形成させる。
ターおよびｐ−Ａ／ｆＰ＾υ５をコードする構造遺伝子
を保持するかどうかは、次に記載の方法によシ確認する
ことができる。すなわち、該形質転換体を例えばパーク
ホルダー改変培地（Ｊ、Ｂａｃ−ｔｅｒｉｏｌ、 １１
３．７２７（１９７３））上にコロニーを形成させる。
次にこれらコロニーをクロロホルム蒸気で処理したのち
、ｐ−ニトロフエニｙ リン酸を含有する寒天を重層す
る。ブロモ−ターおよびｐ−ニトロフェニルホスファタ
ーゼ遺伝子を含ムＤＮＡがクローン化されていればコロ
ニーが黄色を示すことがらｐｕｏ ｉ ３遺伝子の存在
を確認することができる。次にＰＨ０１３遺伝子を含む
形質転換体からプラスミドを抽出し、これをたとえば制
限酵素で切断後、たとえばアガロ−スゲ／Ｌ／ＳＦＬ気
泳動あるいはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
挿入された遺伝子を含むＤＮＡを単離することができる
。この一連の基本操作はすでに公知であう、たとえばＭ
ｏ１ｅｏｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８２） Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙに詳しく記載されている。
、ｐ−ニトロフエニｙ リン酸を含有する寒天を重層す
る。ブロモ−ターおよびｐ−ニトロフェニルホスファタ
ーゼ遺伝子を含ムＤＮＡがクローン化されていればコロ
ニーが黄色を示すことがらｐｕｏ ｉ ３遺伝子の存在
を確認することができる。次にＰＨ０１３遺伝子を含む
形質転換体からプラスミドを抽出し、これをたとえば制
限酵素で切断後、たとえばアガロ−スゲ／Ｌ／ＳＦＬ気
泳動あるいはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
挿入された遺伝子を含むＤＮＡを単離することができる
。この一連の基本操作はすでに公知であう、たとえばＭ
ｏ１ｅｏｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８２） Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙに詳しく記載されている。
ｐ−ニトロフェニルホスファターゼ遺伝子ヲ含むＤＮＡ
の塩基配列は、たとえばジデオキシヌクレオチド合成緩
停止法（Ｐｒｏｃ、 ＮａｔＬ Ａｃａｄ Ｓｏｉ。
の塩基配列は、たとえばジデオキシヌクレオチド合成緩
停止法（Ｐｒｏｃ、 ＮａｔＬ Ａｃａｄ Ｓｏｉ。
ＵＳＡ ７４．５４６３（１９７７）） 、 Ｍａｘ
ａｎＩ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法（Ｐｒｏｏ、 Ｎａｔｌ、
ＡａａｃＬ Ｓｃｉ ＵＳＡ 、 ７４ 、５６０（１
９７７））などの方法を用いて決定できる。ＤＮＡ中の
ｐ−ニトロフェニルホスファターゼ遺伝子の位置は決定
されたＤＮＡの塩基配列に基づいて解読されるオープン
リーディングフレームの存在から推定されるウデロモー
ターはそのオープンリーディングフレーム上流にあるこ
とが予想され、この上流部分を欠除したプラスミドを作
製することによシｐ−ニトロフエニμホスファターゼ活
性が低下あるいは欠失することによってプロモータ−の
存在を知ることができる。このようＫして知っｆＦ−ｆ
ロモーターを含むＤＮＡ断片をプフスミドに組み込み所
望のグフヌミドを得ることができる。
ａｎＩ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法（Ｐｒｏｏ、 Ｎａｔｌ、
ＡａａｃＬ Ｓｃｉ ＵＳＡ 、 ７４ 、５６０（１
９７７））などの方法を用いて決定できる。ＤＮＡ中の
ｐ−ニトロフェニルホスファターゼ遺伝子の位置は決定
されたＤＮＡの塩基配列に基づいて解読されるオープン
リーディングフレームの存在から推定されるウデロモー
ターはそのオープンリーディングフレーム上流にあるこ
とが予想され、この上流部分を欠除したプラスミドを作
製することによシｐ−ニトロフエニμホスファターゼ活
性が低下あるいは欠失することによってプロモータ−の
存在を知ることができる。このようＫして知っｆＦ−ｆ
ロモーターを含むＤＮＡ断片をプフスミドに組み込み所
望のグフヌミドを得ることができる。
このようにして得られた形質転換体の培養に用いられる
培地としては、たとえばそれ自体公知のＢｕｒｋｈｏｌ
ｄｅｒ最小培地（Ｐｒｏｏ、 ＮａｔＬ Ａｏａａ ８
ｃｉ。
培地としては、たとえばそれ自体公知のＢｕｒｋｈｏｌ
ｄｅｒ最小培地（Ｐｒｏｏ、 ＮａｔＬ Ａｏａａ ８
ｃｉ。
ＵＳＡ ７７．４５０５（１９８０））が挙げられる
。
。
また培養温度９時間などの条件は、目的とする遺伝子産
物の産生が最高になるよう定められるが、一般に温度は
通常的１５℃〜４０℃、好ましくは約２４℃〜３７℃、
また時間は約１０時間〜９６時間、好ましくは約２４時
間〜７２時間であシ、必要によシ通気や攪拌を加えるこ
ともできる。
物の産生が最高になるよう定められるが、一般に温度は
通常的１５℃〜４０℃、好ましくは約２４℃〜３７℃、
また時間は約１０時間〜９６時間、好ましくは約２４時
間〜７２時間であシ、必要によシ通気や攪拌を加えるこ
ともできる。
培養物中に蓄積された遺伝子産物値、当分野における通
常の方法、たとえばザイモリエース（キリンビール株式
会社製）など溶菌酵素を用いる方法、ガラスピーズを用
いる機械的破砕法、などによって菌体を破砕して目的物
を抽出する。なお必要により、トリトン−Ｘ１００など
の界面活性剤や塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤を加え
、目的物の抽出を容易にすることもできる。このように
して得られた抽出液からの目的物の分離精製は、通常知
られている蛋白質の精製方法、たとえば、沈殿剤による
沈殿法、透析法、電気泳動法、イオン交換樹脂などＫよ
るクロマトグラフ法、ゲ〃ろ醜法、抗体カラムを用いる
方法などを組み合せて行うことができる。
常の方法、たとえばザイモリエース（キリンビール株式
会社製）など溶菌酵素を用いる方法、ガラスピーズを用
いる機械的破砕法、などによって菌体を破砕して目的物
を抽出する。なお必要により、トリトン−Ｘ１００など
の界面活性剤や塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤を加え
、目的物の抽出を容易にすることもできる。このように
して得られた抽出液からの目的物の分離精製は、通常知
られている蛋白質の精製方法、たとえば、沈殿剤による
沈殿法、透析法、電気泳動法、イオン交換樹脂などＫよ
るクロマトグラフ法、ゲ〃ろ醜法、抗体カラムを用いる
方法などを組み合せて行うことができる。
このようにして得られた遺伝子産物のうち、ｐ−ニトロ
フェニルホスブアターゼＨ１ｐ−ニトロフェニルホスフ
ェイトを加水分解するので、試薬として用いることがで
きる。
フェニルホスブアターゼＨ１ｐ−ニトロフェニルホスフ
ェイトを加水分解するので、試薬として用いることがで
きる。
本明細書１図面で用いられる記号の意義は、以下のとお
シであシ、また、本発明において、アミノ酸を略号で表
示する場合、ＩＵＰＡＣ−工ＵＢＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎ
ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔ
ｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に
基づくものとする。また、アミノ酸に関し光学異性体が
ちりうる場合は、特に明示しなければＬ一体を示すもの
とする。
シであシ、また、本発明において、アミノ酸を略号で表
示する場合、ＩＵＰＡＣ−工ＵＢＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎ
ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔ
ｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に
基づくものとする。また、アミノ酸に関し光学異性体が
ちりうる場合は、特に明示しなければＬ一体を示すもの
とする。
ＤＮＡ ： デオキシリボ核酸
Ａ ： アデニン
Ｔ ： チミン
Ｇ ： グアニン
Ｃ：Ｓ’）シン
Ｍθｔ ： メチオニン
Ｔｈｒ ： スレオニン
Ａｌａ ： アフニン
Ｇｌｎ ： グルタミン
Ｇ１７ ： グリシン
Ｍａｌ ： バリン
Ｐｒｏ ： プロリン
１１ｅ ： イソロイシン
Ｉｙｓ ： リジン
Ａｓｎ ： アスパラギン
Ｇｌｕ ： グルタミン１ｆＬ
ｐｈθ ： フェニルアラニン
Ｌａｕ ： ロイシン
Ａｓｐ ： アスパツギン酸
Ｔｙｒ ： チロシン
Ｃｙａ ： システィン
Ｔｒｐ ： ）リブトファン
Ｓｅｔ ： セリン
Ａｒｇ ： アルギニン
Ｈ１８： ヒスチジン
Ｈ：ＨｌｎｄｌｌＩ
Ｅ ： ｇｃｏＲＩ
Ｂ ： ＢａｍＨＩ
Ｍｂｏ ： ＭｂｏＸ
Ｐ：ＰｓｔＩ
Ｘ：ＸｈｏＩ
Ｂｇ ： ＢｇｌｌＩ
Ｓ：５ａｌＩ
実施例
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
実施例１ 形質転換体の製造：
酵母−大腸菌シャトルベクターＹＥｐ１３のＢａ ｍＨ
１切断部位に酵母染色体ＤＮＡのＭｂｏＩ部分分解断片
を挿入して作製した酵母（サツカロマイセス・セレビシ
ェ）Ｊ伝子バンク（米国コールトスプリングバーパー研
究所 Ｊ、 Ｂ、 １ｉｃｋ博士より入手）のプラスミ
ドＤＮＡを用いてサツカロマイセス・セレビシェＮＡ７
４−３Ａ（ＭＡＴａｐｈｏ９−１，１ｅｕ２−３．１２
ｈｉａ４−５１９ ）を形質転換し、ｐ−ニトロフェ
ニルリン酸を基質としたコロニー染色ｆｆ１（Ｂｉｏｃ
ｈｔｍ Ｂ１０ｐｈｙ＆ ＡＯｔ＆ ４２８ 。
１切断部位に酵母染色体ＤＮＡのＭｂｏＩ部分分解断片
を挿入して作製した酵母（サツカロマイセス・セレビシ
ェ）Ｊ伝子バンク（米国コールトスプリングバーパー研
究所 Ｊ、 Ｂ、 １ｉｃｋ博士より入手）のプラスミ
ドＤＮＡを用いてサツカロマイセス・セレビシェＮＡ７
４−３Ａ（ＭＡＴａｐｈｏ９−１，１ｅｕ２−３．１２
ｈｉａ４−５１９ ）を形質転換し、ｐ−ニトロフェ
ニルリン酸を基質としたコロニー染色ｆｆ１（Ｂｉｏｃ
ｈｔｍ Ｂ１０ｐｈｙ＆ ＡＯｔ＆ ４２８ 。
１８２（１９７６））で、アルカリ性ホスファターゼ産
生能を示すもの（Ａｌｐ＋）をスクリーニングした。
生能を示すもの（Ａｌｐ＋）をスクリーニングした。
約１６Ｘ１０’個のＬｅｕ＋形質転換体を調べたところ
、５個のＡｌｐ＋形質転換体が得られた。そのうち３個
は抑制性アルカリ性ホスファターゼの基質となるα−ナ
フチμリン酸に対して活性を示さず、ｐｈｏ９突然変異
の表現型の一つである胞子形成能についても回復してい
なかった。残シの２個のＡｌｐ＋形質転換体は、ａ−ナ
フチルリン酸に対して活性を示し、かつ胞子形成能も回
復していた。
、５個のＡｌｐ＋形質転換体が得られた。そのうち３個
は抑制性アルカリ性ホスファターゼの基質となるα−ナ
フチμリン酸に対して活性を示さず、ｐｈｏ９突然変異
の表現型の一つである胞子形成能についても回復してい
なかった。残シの２個のＡｌｐ＋形質転換体は、ａ−ナ
フチルリン酸に対して活性を示し、かつ胞子形成能も回
復していた。
これらの結果から、前者にはｐ−ニトロフェニルホスフ
ァター−！遺伝子がクローン化されていると考えられた
。
ァター−！遺伝子がクローン化されていると考えられた
。
この３個のＡｌｐ＋形質転換体からＣａｍｅｒｏｎらの
方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｏｉ＋ｉｓ Ｒｅｓ、 ４．
１４２９（１９７７））に従って＋１１１１１１したプ
ラスミドＤＮＡでＥ、 ｏｏｌｉ ＪＡ２２１ （、Ｔ
、 ＭｏＬＢｉｏＬ １２０ 、５１７（１９７８））
を形質転換した。３ｗｉのＤＮＡそれぞれから得られた
アンピシリン耐性テトフサイクリン臘受性形質転換体を
１株ずつ選びＢｉｒｎｂｏｉｍ ＆Ｄｏｌｙの方法（Ｎ
ｕｏｌｅｌｏ Ａｏｌｃｌａ Ｒｅｓ、 ７ 、１５１
３（１９７９））に従ってそれぞれのプラスミドＤＮＡ
を分離し、制限酵素を用い工解析した。その結果、Ｅｃ
ｏＲＩ分解パターンが同じであることから、すべて同一
のプラスミドと考えられ、このプラスミドをｐＡＬ２
と命名した。このようにｐｈｏ９突然変異体を宿主と
し、ｐ−ニトロフェニルリン酸に対する活性を回復させ
るプラスミドとして分離されたｐＡＬ２は、ｐｈｏ１３
宿主についてもｐ−ニトロフェニルホスファターゼ活性
を回復させるので、ｐＡＬ２Ｋａｐ−ニトロフェニルホ
スファターゼ会会匪会串会す構造遺伝子がクローン化さ
れていることが強く示唆された。
方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｏｉ＋ｉｓ Ｒｅｓ、 ４．
１４２９（１９７７））に従って＋１１１１１１したプ
ラスミドＤＮＡでＥ、 ｏｏｌｉ ＪＡ２２１ （、Ｔ
、 ＭｏＬＢｉｏＬ １２０ 、５１７（１９７８））
を形質転換した。３ｗｉのＤＮＡそれぞれから得られた
アンピシリン耐性テトフサイクリン臘受性形質転換体を
１株ずつ選びＢｉｒｎｂｏｉｍ ＆Ｄｏｌｙの方法（Ｎ
ｕｏｌｅｌｏ Ａｏｌｃｌａ Ｒｅｓ、 ７ 、１５１
３（１９７９））に従ってそれぞれのプラスミドＤＮＡ
を分離し、制限酵素を用い工解析した。その結果、Ｅｃ
ｏＲＩ分解パターンが同じであることから、すべて同一
のプラスミドと考えられ、このプラスミドをｐＡＬ２
と命名した。このようにｐｈｏ９突然変異体を宿主と
し、ｐ−ニトロフェニルリン酸に対する活性を回復させ
るプラスミドとして分離されたｐＡＬ２は、ｐｈｏ１３
宿主についてもｐ−ニトロフェニルホスファターゼ活性
を回復させるので、ｐＡＬ２Ｋａｐ−ニトロフェニルホ
スファターゼ会会匪会串会す構造遺伝子がクローン化さ
れていることが強く示唆された。
上記ＬＪｐＡＬ２で酵母サツカロマイセス・セレビシェ
ＮＡ７５−２Ａ（ＭＡＴａ、ｐｈｏ８．ｔｒｐｌ、１ｅ
ｕ２．ｈｉａ４．ｏａｎｌ ）を形質転換し、得られ
ｌＦ［［検体をサツカロマイセス・セレビシェＮＡ７５
−２Ａ／ＰＡＬ２ （ＩＦＯ１０１３３゜ｒａｉｎ
Ｐ−７７１２）と称する。
ＮＡ７５−２Ａ（ＭＡＴａ、ｐｈｏ８．ｔｒｐｌ、１ｅ
ｕ２．ｈｉａ４．ｏａｎｌ ）を形質転換し、得られ
ｌＦ［［検体をサツカロマイセス・セレビシェＮＡ７５
−２Ａ／ＰＡＬ２ （ＩＦＯ１０１３３゜ｒａｉｎ
Ｐ−７７１２）と称する。
実施例２ ホスファターゼの産生：
次の表１に示す酵母菌をそれぞれパークホルダー改変培
地１００ｇ１を含む５０Ｍ容坂ロフラスコ中で３０℃、
１８時間振とり培養したのち菌体を集め、これをフレン
チプレスを用いて破砕し粗酵素液を調製（ＭｏＬ Ｃａ
１１． Ｂｉｏｈ 、！ 、 １２７（１９８２）〕し
、文献ＭｏＬＣｅｌＬ、Ｂ１ｏＬｆｉ、１２７（１９８
２） ｊＢｉｏｏｈｉｍｉｏａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙ
ｓｉｃａ Ａｏｔａ ４２８ 、１８２（１９７６）記
載の方法に従ってアルカリ性ホスファターゼ活性を測定
した。結果を表１に示す。
地１００ｇ１を含む５０Ｍ容坂ロフラスコ中で３０℃、
１８時間振とり培養したのち菌体を集め、これをフレン
チプレスを用いて破砕し粗酵素液を調製（ＭｏＬ Ｃａ
１１． Ｂｉｏｈ 、！ 、 １２７（１９８２）〕し
、文献ＭｏＬＣｅｌＬ、Ｂ１ｏＬｆｉ、１２７（１９８
２） ｊＢｉｏｏｈｉｍｉｏａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙ
ｓｉｃａ Ａｏｔａ ４２８ 、１８２（１９７６）記
載の方法に従ってアルカリ性ホスファターゼ活性を測定
した。結果を表１に示す。
表１ ｐＡＬ２で形質転換された酵母によるアルカリ
性ホスファターゼの生産性 Ｐ−２８−２４Ｇ 野性型 ０．１３ ０
．０３ ０．３２ ０．１８ＮＡ７５−２Ａ／ｐＡＬ２
ｐｈｏ＆−２（ｐＡＬ２）Ｚ２７ ０．００ ２．．７
７ ０．００ＩｆＡ７４−３Ａ／ｐＡＬ２ ｐｈ０９−
１（ＰＡＬ２） Ｚ７１ α００ ２．４０ ０．０
ＯＮＡ７５−２ム ｐｈｏ８−２ ｏ、ｏ ９
０．００ ０．０７ ０．００ＮＡ７４−３Ａ
ｐｈｏ９−１ ０．０７ ０．００ ０．０９
０．００＆）高すン酸、低リン酸はｌＴ１２ＰＯ，濃
度それぞれ１．５岬／Ｍｔ、０．０３岬／譚ｌを示すｂ
）ホスファターゼに関する遺伝子型のみを記した ｃ） ｐ［’Ｐ、αＮＰはそれぞれｐ−ニトロフェニ
ルリン酸、α−ナフチρリン酸を示す 表１から明らかなように、サツカロマイセス・セレビシ
ェＮＡ７５−２Ａ／ｐＡＬ２およびサツカロマイセス・
セレビシェＨＡ７４−３Ａ／ＰＡＬ２は、ｐ−ニトロフ
ェニルリン酸のみに対して活性を示し、その値はリン酸
濃度によって影響をうけず、その産生量社宿主株サツカ
ロマイセス・セレビシェＮム７５−２Ａ、Ｎム７４−３
Ａの約によるものと考えられる。
性ホスファターゼの生産性 Ｐ−２８−２４Ｇ 野性型 ０．１３ ０
．０３ ０．３２ ０．１８ＮＡ７５−２Ａ／ｐＡＬ２
ｐｈｏ＆−２（ｐＡＬ２）Ｚ２７ ０．００ ２．．７
７ ０．００ＩｆＡ７４−３Ａ／ｐＡＬ２ ｐｈ０９−
１（ＰＡＬ２） Ｚ７１ α００ ２．４０ ０．０
ＯＮＡ７５−２ム ｐｈｏ８−２ ｏ、ｏ ９
０．００ ０．０７ ０．００ＮＡ７４−３Ａ
ｐｈｏ９−１ ０．０７ ０．００ ０．０９
０．００＆）高すン酸、低リン酸はｌＴ１２ＰＯ，濃
度それぞれ１．５岬／Ｍｔ、０．０３岬／譚ｌを示すｂ
）ホスファターゼに関する遺伝子型のみを記した ｃ） ｐ［’Ｐ、αＮＰはそれぞれｐ−ニトロフェニ
ルリン酸、α−ナフチρリン酸を示す 表１から明らかなように、サツカロマイセス・セレビシ
ェＮＡ７５−２Ａ／ｐＡＬ２およびサツカロマイセス・
セレビシェＨＡ７４−３Ａ／ＰＡＬ２は、ｐ−ニトロフ
ェニルリン酸のみに対して活性を示し、その値はリン酸
濃度によって影響をうけず、その産生量社宿主株サツカ
ロマイセス・セレビシェＮム７５−２Ａ、Ｎム７４−３
Ａの約によるものと考えられる。
実施例３ ｐＨ０１３遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵
素地図の作成： 実施例１で得られたｐＡＬ２ ＤにＡ（１μｆ）に制
限酵素反応緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＥＣＩ。
素地図の作成： 実施例１で得られたｐＡＬ２ ＤにＡ（１μｆ）に制
限酵素反応緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＥＣＩ。
ｐＨ７，５，１０ｍＭ ＭｇＧ１２．５０ｍＭ ＮａＣ
１）中で４〜６ユニツトの各種制限酵素（Ｂａｗｌ １
、 ＢｇｌＩｆ 、 ＥｏｏＲＩ、 Ｂｉｎｄｌ［、
ＰａｔＩ、 ８ａｌＩ、 ＸｈｏＩ ）を単独または二
種類組み合せて作用させ、３７℃で１時間反応させた。
１）中で４〜６ユニツトの各種制限酵素（Ｂａｗｌ １
、 ＢｇｌＩｆ 、 ＥｏｏＲＩ、 Ｂｉｎｄｌ［、
ＰａｔＩ、 ８ａｌＩ、 ＸｈｏＩ ）を単独または二
種類組み合せて作用させ、３７℃で１時間反応させた。
反応液を１％アガロース電気泳動Ｋかけ、生じたＤ１ｆ
Ａ断片の分子量を推定し制限酵素切断地図を作成して第
１図に示した。
Ａ断片の分子量を推定し制限酵素切断地図を作成して第
１図に示した。
実施例４ クローン化されたＤＮＡ断片上のＰＨ０１３
遺伝子の位置の推定： りｐ−ン化されたＤＮＡ断片上のＰ１１０１３遺仏子の
位置を推定するため、ｐＡＬ２の欠失誘導体を作製した
。ＰＡＬ２１３μｆ）を４ユニツトのＭｏｏＲＸ を
加えた制御！Ｉ！酵素度応緩衝液５０μｊ中で３７℃、
５分間反応させた後、６５℃で１０分間加熱して反応を
停止させ部分分解物を得た。
遺伝子の位置の推定： りｐ−ン化されたＤＮＡ断片上のＰ１１０１３遺仏子の
位置を推定するため、ｐＡＬ２の欠失誘導体を作製した
。ＰＡＬ２１３μｆ）を４ユニツトのＭｏｏＲＸ を
加えた制御！Ｉ！酵素度応緩衝液５０μｊ中で３７℃、
５分間反応させた後、６５℃で１０分間加熱して反応を
停止させ部分分解物を得た。
この反応液４０μｍを含むＴ４１Ｊガーゼ反応液（５ｍ
Ｍ Ｍｇ０１２ １０ ｍＭ ジチオスレイトール、
０．０５ｍＭＡＴＰ、Ｔ４リガーゼ３ユニット）１００
μＩを４℃で１８時間に応させて分解物を再結合させた
。次に１０μｍのＴ４４リガ一ゼ応液を用いてΣ、ｏｏ
ｌｉ ＪＡ２２１を形質転換させ、得られた形質転換体
から前述のＢｉｒｎｂｏｉｎ＋ ＆ Ｄｏｌｙの方法に
従ってプラスミドＤＮＡを分離し、欠失プラスミドｐＡ
Ｌ２−ＤＩ、ｐＡＬ２−Ｄ５．ｐＡＬ２−Ｄ６．ｐＡＬ
２−Ｄ７を得た。一方、ｐＡＬ２ＤＮＡ（７−３μｇ）
を６ユニツトのＨ１ｎ４１［で３７℃。
Ｍ Ｍｇ０１２ １０ ｍＭ ジチオスレイトール、
０．０５ｍＭＡＴＰ、Ｔ４リガーゼ３ユニット）１００
μＩを４℃で１８時間に応させて分解物を再結合させた
。次に１０μｍのＴ４４リガ一ゼ応液を用いてΣ、ｏｏ
ｌｉ ＪＡ２２１を形質転換させ、得られた形質転換体
から前述のＢｉｒｎｂｏｉｎ＋ ＆ Ｄｏｌｙの方法に
従ってプラスミドＤＮＡを分離し、欠失プラスミドｐＡ
Ｌ２−ＤＩ、ｐＡＬ２−Ｄ５．ｐＡＬ２−Ｄ６．ｐＡＬ
２−Ｄ７を得た。一方、ｐＡＬ２ＤＮＡ（７−３μｇ）
を６ユニツトのＨ１ｎ４１［で３７℃。
１時間処理したのち、前記と全く同様にして加熱処理、
Ｔ４リガーゼ処理、 Ｅ、 ｏｏｌｉ ＪＡ２２１の形
質転換を行い、アンビンリン耐性形質転換体を得た。得
られた欠失誘導体プラスミドＤＮＡでサツカロマイセヌ
・セレビシェ１１Ａ７４−３Ａｔ”形質転換させ、Ｌｅ
ｕ＋形質転換体１０株のＡｌｐ表現型を調べ、Ａｌｐ＋
を示したプラスミドをＰＡＬ２−Ｄ９とした。以上の欠
失プラスミドとＡｌｐ表現型との関係を第２図に示した
。この結果から、ＰＨ０１３遺伝子はＨｌｎｄｌｌ［切
断部位とＥｏｏＲＩ切断部位にはさまれた断片上（第２
図の一部分）附近に存在すると予想された。
Ｔ４リガーゼ処理、 Ｅ、 ｏｏｌｉ ＪＡ２２１の形
質転換を行い、アンビンリン耐性形質転換体を得た。得
られた欠失誘導体プラスミドＤＮＡでサツカロマイセヌ
・セレビシェ１１Ａ７４−３Ａｔ”形質転換させ、Ｌｅ
ｕ＋形質転換体１０株のＡｌｐ表現型を調べ、Ａｌｐ＋
を示したプラスミドをＰＡＬ２−Ｄ９とした。以上の欠
失プラスミドとＡｌｐ表現型との関係を第２図に示した
。この結果から、ＰＨ０１３遺伝子はＨｌｎｄｌｌ［切
断部位とＥｏｏＲＩ切断部位にはさまれた断片上（第２
図の一部分）附近に存在すると予想された。
実施例５ＰＨＯ１３遺伝子存在位置の確認：ｐａｏｔａ
Ｊ伝子の位置をａ１認するためＫｐＡＬ２−Ｄ９をもと
にしてさらに欠失プラスミドを構築した。ｐＡＬ２−Ｄ
９ Ｄ Ｎ Ａ （５μｇ）をそれぞれ６ユニツトのＨ
ｌＭＩ［およびＢｇｌ亘を含む５０μｍの制限酵素反応
液中で３７℃、１時間反応させ、生じたＺ９ｋｂのＤＮ
Ａ断片を１％低融点アガロース電気泳ｍＦｃよって分離
Ｍ製し、３０μＪのＴＥ緩衝液（１０１１１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，６、１ｍＭＩＤＴＡ）Ｋ溶解させ
た。一方向様の操作でＢｉｎｄｌ［、ＢａｍＨ１処理し
たＹＥｐ１３（１μｇ）を６５℃１ｏ分間加熱した。、
得られた反応液５μｍと先に得たＨｌｎｄｌ［−Ｂｇｌ
Ｉ［Ｄ Ｎ Ａ断片（２，９ｋｂ）溶液２０μｍとを加
えたＴ４リガーゼ反応液１００μｊを４℃で１８時間反
応させ、その２０μｊを用いてＬｃｏｌｉ ＪＡ２２１
を形質転換した。アンピシリン耐性を示す形質転換体か
らプラスミドを分離し、これをｐＡＬ１５と名づけた。
Ｊ伝子の位置をａ１認するためＫｐＡＬ２−Ｄ９をもと
にしてさらに欠失プラスミドを構築した。ｐＡＬ２−Ｄ
９ Ｄ Ｎ Ａ （５μｇ）をそれぞれ６ユニツトのＨ
ｌＭＩ［およびＢｇｌ亘を含む５０μｍの制限酵素反応
液中で３７℃、１時間反応させ、生じたＺ９ｋｂのＤＮ
Ａ断片を１％低融点アガロース電気泳ｍＦｃよって分離
Ｍ製し、３０μＪのＴＥ緩衝液（１０１１１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，６、１ｍＭＩＤＴＡ）Ｋ溶解させ
た。一方向様の操作でＢｉｎｄｌ［、ＢａｍＨ１処理し
たＹＥｐ１３（１μｇ）を６５℃１ｏ分間加熱した。、
得られた反応液５μｍと先に得たＨｌｎｄｌ［−Ｂｇｌ
Ｉ［Ｄ Ｎ Ａ断片（２，９ｋｂ）溶液２０μｍとを加
えたＴ４リガーゼ反応液１００μｊを４℃で１８時間反
応させ、その２０μｊを用いてＬｃｏｌｉ ＪＡ２２１
を形質転換した。アンピシリン耐性を示す形質転換体か
らプラスミドを分離し、これをｐＡＬ１５と名づけた。
同様にしてｐＡＬ２−Ｄ９（５μｇ）を６ユニツトのＸ
ｈｏＩを加えた制限酵素反応液５０μｊ中で処理したの
ち、ＬＥＵ２遺伝子と２μプフスミドのレプリコンとを
含むｘｈＯＩ断片（ａ６ｋｂ）をアガロース電気泳動で
分離精製して、３０μｊのＴｌ１ｌ衝液にとかした。一
方、ｐＢＲ３２２（３，２μｇ）を６ユニツトの５ａｌ
Ｉを加えた制限酵素反応液５０μｊ中で３７℃、１時間
反応させた後、６５℃、１０分間加熱処理を行った。
ｈｏＩを加えた制限酵素反応液５０μｊ中で処理したの
ち、ＬＥＵ２遺伝子と２μプフスミドのレプリコンとを
含むｘｈＯＩ断片（ａ６ｋｂ）をアガロース電気泳動で
分離精製して、３０μｊのＴｌ１ｌ衝液にとかした。一
方、ｐＢＲ３２２（３，２μｇ）を６ユニツトの５ａｌ
Ｉを加えた制限酵素反応液５０μｊ中で３７℃、１時間
反応させた後、６５℃、１０分間加熱処理を行った。
次に、５ａｌＩ処理したｐＢＲ３２２反応液５μｍとＸ
ｈｏＩ Ｄ Ｎ Ａ断片（６，６ｋｂ）溶液２０μｍと
を加えたで４リガ一ゼ度応液１００μｊを４℃で１８時
間反応させたのち、その２０μｍを用いてΣ、ｏｏｌｉ
ＪＡ２２１を形質転換した。アンビクリン耐性を示し、
ロイシン非要求性を示す形質転換体からプラスミドＤＮ
Ａを分離しこれをｐＡＬ１６と名づけた（第２図、第３
図）。第２図から明らかなようにｐＡＬ１５を保持する
形質転換体はｐ−ニトロフェニルホスファターゼ活性’
に示Ｌ７’Ｃ０またｐＡＬ１６を保持する形質転換体の
ｐ−ニトロフェニルホスファターゼ活性が低下すること
から、Ｘｈ ｏＩサイトより右側の部分にプロモーター
があると予想された。第３図に示されるようにｐＢＲ３
２２のＳ ａ Ｉ Ｉ切断部位附近にはＰＨ０１３逍伝
子と同方向に酵母で働きうるプロモーターの存在も推定
できるのでｐＡＬ１６保持菌の弱いｐ−ニトロフェニル
ホスファターゼの活性はこの配列によると考えられる。
ｈｏＩ Ｄ Ｎ Ａ断片（６，６ｋｂ）溶液２０μｍと
を加えたで４リガ一ゼ度応液１００μｊを４℃で１８時
間反応させたのち、その２０μｍを用いてΣ、ｏｏｌｉ
ＪＡ２２１を形質転換した。アンビクリン耐性を示し、
ロイシン非要求性を示す形質転換体からプラスミドＤＮ
Ａを分離しこれをｐＡＬ１６と名づけた（第２図、第３
図）。第２図から明らかなようにｐＡＬ１５を保持する
形質転換体はｐ−ニトロフェニルホスファターゼ活性’
に示Ｌ７’Ｃ０またｐＡＬ１６を保持する形質転換体の
ｐ−ニトロフェニルホスファターゼ活性が低下すること
から、Ｘｈ ｏＩサイトより右側の部分にプロモーター
があると予想された。第３図に示されるようにｐＢＲ３
２２のＳ ａ Ｉ Ｉ切断部位附近にはＰＨ０１３逍伝
子と同方向に酵母で働きうるプロモーターの存在も推定
できるのでｐＡＬ１６保持菌の弱いｐ−ニトロフェニル
ホスファターゼの活性はこの配列によると考えられる。
実施例６ 塩基配列の決定：
ｐＡＬ２に挿入されたＤＮＡの塩基配列をＭａｘａｍ
＆ Ｇ１１ｂｅｒｔ法（前出）に従って決定し、第４図
に示した。実施例４，５で予想した通シ、口でかこった
ＡＴＧからＴＡＧまでがｐ−ニトロフェニルホスファタ
ーゼをコードする領域と考えられる。したがって、ＰＥ
０１３榊造遺伝子が発現するｐ−二トロフェニルフオス
ファターゼのアミノ酸配列拡、第５図に示すものとなる
と考えられる。プロモーターは、該ＡＴＧよシ上流のＸ
ｈｏＩ切断部位を含む塩基配列中に存在することが予想
される。
＆ Ｇ１１ｂｅｒｔ法（前出）に従って決定し、第４図
に示した。実施例４，５で予想した通シ、口でかこった
ＡＴＧからＴＡＧまでがｐ−ニトロフェニルホスファタ
ーゼをコードする領域と考えられる。したがって、ＰＥ
０１３榊造遺伝子が発現するｐ−二トロフェニルフオス
ファターゼのアミノ酸配列拡、第５図に示すものとなる
と考えられる。プロモーターは、該ＡＴＧよシ上流のＸ
ｈｏＩ切断部位を含む塩基配列中に存在することが予想
される。
実施例７ ＰＨ０１３プロモーターを利用した発現ベ
クターの構築： ＰＩｌ［０１３グロモーターを利用した発現ベクターの
構築の概略は第６図に示す通シである。まずｐＡＬ２Ｄ
ＮＡをＥｃｏＲＩで処理して得られるＱ、７ｋｂのＤＮ
Ａ断片をＤｄｅＩで処理したのち、ＡマａＩで部分分解
することによって６６４ｂのＤＮＡ断片が得られる。こ
の接着末端をＤＮＡポリメレースＩラージフフグメント
で修復したのち、５ａｌＩリンカ−を連結させる。これ
を５ａｌＩで処理したのち、同様にｐＢＲ３２２の５ａ
ｌＩ切所部位に挿入してプラスミドｐＡＬ１００を得る
。次にｐＡＬｌｏｏを８ａｕＢＡ、 ５ａｌＩ で同時
分解して６４５ ｂｐのＤ）ｉＡ断片を得、これをＢ’
ａｍＨ工。
クターの構築： ＰＩｌ［０１３グロモーターを利用した発現ベクターの
構築の概略は第６図に示す通シである。まずｐＡＬ２Ｄ
ＮＡをＥｃｏＲＩで処理して得られるＱ、７ｋｂのＤＮ
Ａ断片をＤｄｅＩで処理したのち、ＡマａＩで部分分解
することによって６６４ｂのＤＮＡ断片が得られる。こ
の接着末端をＤＮＡポリメレースＩラージフフグメント
で修復したのち、５ａｌＩリンカ−を連結させる。これ
を５ａｌＩで処理したのち、同様にｐＢＲ３２２の５ａ
ｌＩ切所部位に挿入してプラスミドｐＡＬ１００を得る
。次にｐＡＬｌｏｏを８ａｕＢＡ、 ５ａｌＩ で同時
分解して６４５ ｂｐのＤ）ｉＡ断片を得、これをＢ’
ａｍＨ工。
５ａｌＩで同時処理したｐ Ｓ Ｉ’ｌ１９ （ＭｏＬ
Ｃｅ１Ｌ ＢｉｃＬ４．７７１（１９８４））に挿入
することによって発現ベクターｐＡＬ２００が得られる
。得られたｐＡＬ２００の５ａｌＩ切断部位にプロモー
ターの向きに合せて同種あるいは異１４遺伝子を挿入す
れば目的とする遺伝子産物の発現プラスミドが得られる
。
Ｃｅ１Ｌ ＢｉｃＬ４．７７１（１９８４））に挿入
することによって発現ベクターｐＡＬ２００が得られる
。得られたｐＡＬ２００の５ａｌＩ切断部位にプロモー
ターの向きに合せて同種あるいは異１４遺伝子を挿入す
れば目的とする遺伝子産物の発現プラスミドが得られる
。
発明の効果
本発明のＰ１１０１３プロモーターを用いた発現ベクタ
ーは、各ｔｌ！ｔａ伝子発現に有利に用いることができ
る。たとえば、本発明のｐ−ニトロフェニルホスファタ
ーゼは、他のホスファターゼが抑制性であるのに対し、
構成的に産生されるため、本発明のＰＨ０１３プロモー
ターを用いると、各種遺伝子産物が有利に製造される。
ーは、各ｔｌ！ｔａ伝子発現に有利に用いることができ
る。たとえば、本発明のｐ−ニトロフェニルホスファタ
ーゼは、他のホスファターゼが抑制性であるのに対し、
構成的に産生されるため、本発明のＰＨ０１３プロモー
ターを用いると、各種遺伝子産物が有利に製造される。
また、本発明のｐ−ニトロフェニルホスファターゼハ１
ｃ１５トして有利に利用できる。
ｃ１５トして有利に利用できる。
第１図はｐＡＬ２挿入部の制限酵素切断地図を、第２図
は各種欠失プラスミドとＰ−ニトロフェニルホスファタ
ーゼ活性発現との関係を、第３図はｐＡＬ １６の構造
を、第４図はｐＨ０１３プロモーターとＰＥｌ０１３を
コードする構造遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列を、第５
図ｄＰＨ０１３をコードする構造遺伝子とその遺伝子産
物であるｐ■０１３のアミノ酸配列を、第６図はＰＨ０
１３プロモーターを利用した発現ベクターの構築をそれ
ぞれ表わす。 ８７Ｍｂｏ Ｂ／Ｍｂ。 □遁舷チｌ？伺気 ｐＡｔ、２−ｏｓ
−ρＡＬ２−Ｄ６−１− ｇｐ
ＡＬ２−Ｄ７ ｍ ＋ｐ
ＡＬ２−ＤＩ
−ｐＡＬ２−０９
＋Ｘ Ｉ ： ｐＮＰＰＯ８ｅ ・ ｐ
−ニトソフエニＪレオＳ（ファクーｌ×２° Ｗ
： Ｗｅａｋ 第４図 （そσ ＧＴＧＧＣＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＴＴＴＴＧＡＧＴＧＧ
ＴＡＴＴＧＡＡＣＧＡＴＴＡＴＣＣＡＡＧＡＣＣＴＡＡ
ＡＴＴＴＴＡＣＡＴＴＧＡＡＴＡＡＴＧＡＧＴＴＡ沈下
回ドＧＡＧＣＡＡＴＧＣＡＡＡＡＴＣＴＡＡＴＡＴＴＣ
ＡＧＧＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴＴＡＴＧＴＡＡＧＴＴＴ
ＡＡＴＡＴＡＴＡＴＴＧＴＡＣＡＴＧＴＱＴＴＴＴＴＣ
ＣＧＧＡＡＣＣＧＡＡＧＡＧＡＧＡＡＣＣＴＴＧＡＡＧ
ＡＴＴＴＣＧＣＴＡＡＡＣＴＴＧＧＴＧＡＣＡＴＣＴＡ
ＣＧＣＣＴＴＡＡＣＣＡＡＧＧＧＧＴＡＧＡＡＴＴＡＣ
ＴＴＴＴＴＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＯＴＡＴＧＡＴＴＴＧ
Ａ、ＴＡＴＡＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡ第５図 、ＡＴＧ ＡＣＴ ＧＣＴ ＣＡＡ ＣＡＡ
ＧＧＴ ＧＴＡ ＣＣハＭｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒ。 （その１） 第５ ＴＧＴ ＧＴＴ ＡＴＴ ＣＣＴ ＧＧＧ ＴＴ
Ａ ＧＡＣＡＣＧ１６２ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｉｌｅ
Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ ＴｈｒＣＴＧ
ＣＡＧ ＴＡＴ ＴＴＧ ＣへＧＡへＧ ＧＡ
Ｔ ＴＣＴ１８０ Ｌｅｕ Ｇｌｎ 下ｙｒ
Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ八
Ｃへ ＴＴＣＣＣＧ ＣＡＡ ＡＡＧ ＧＧＴ
ＴＡＴ ＡＣ八へ９８ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｙｒ ＴｈｒＴＴＧ
ＧＣＡ ＴＴＣＴＣＡ ＴＣＴ ＡＡＴ ＡＧＧ
ＡＧＧ２１６ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｈｅ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ２
５２ Ｖａｌ Ｇ−１ｙ Ａｓｐ Ａｒｇ
Ｌｅｕ Ａｓｎ 丁ｈｒ ＡｓｐＧＧＣＡＣＡ Ｃ
ＴＡ ＣＴＣＧｎ ＴＴＧ ＡＧＴ ＧＧＴ２７０
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓ
ｅｒ ＧｌｙＴＣＧ ＣＡＣＧＡＴ ＴＡＴ ＣＣ
Ａ ＡＧＡ ＣＣＴ ＡＡＡ２８８ Ｓｅｒ
Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌ
ｙｓＧＣＣＴＴＡ ＡＣＣＡＡＴ ＡＡＴ ＧＡ
Ｇ ＴＴＡ ＴＡＧ３０６ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔ
ｈｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｌｅｕ図 （その２
）
は各種欠失プラスミドとＰ−ニトロフェニルホスファタ
ーゼ活性発現との関係を、第３図はｐＡＬ １６の構造
を、第４図はｐＨ０１３プロモーターとＰＥｌ０１３を
コードする構造遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列を、第５
図ｄＰＨ０１３をコードする構造遺伝子とその遺伝子産
物であるｐ■０１３のアミノ酸配列を、第６図はＰＨ０
１３プロモーターを利用した発現ベクターの構築をそれ
ぞれ表わす。 ８７Ｍｂｏ Ｂ／Ｍｂ。 □遁舷チｌ？伺気 ｐＡｔ、２−ｏｓ
−ρＡＬ２−Ｄ６−１− ｇｐ
ＡＬ２−Ｄ７ ｍ ＋ｐ
ＡＬ２−ＤＩ
−ｐＡＬ２−０９
＋Ｘ Ｉ ： ｐＮＰＰＯ８ｅ ・ ｐ
−ニトソフエニＪレオＳ（ファクーｌ×２° Ｗ
： Ｗｅａｋ 第４図 （そσ ＧＴＧＧＣＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＴＴＴＴＧＡＧＴＧＧ
ＴＡＴＴＧＡＡＣＧＡＴＴＡＴＣＣＡＡＧＡＣＣＴＡＡ
ＡＴＴＴＴＡＣＡＴＴＧＡＡＴＡＡＴＧＡＧＴＴＡ沈下
回ドＧＡＧＣＡＡＴＧＣＡＡＡＡＴＣＴＡＡＴＡＴＴＣ
ＡＧＧＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴＴＡＴＧＴＡＡＧＴＴＴ
ＡＡＴＡＴＡＴＡＴＴＧＴＡＣＡＴＧＴＱＴＴＴＴＴＣ
ＣＧＧＡＡＣＣＧＡＡＧＡＧＡＧＡＡＣＣＴＴＧＡＡＧ
ＡＴＴＴＣＧＣＴＡＡＡＣＴＴＧＧＴＧＡＣＡＴＣＴＡ
ＣＧＣＣＴＴＡＡＣＣＡＡＧＧＧＧＴＡＧＡＡＴＴＡＣ
ＴＴＴＴＴＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＯＴＡＴＧＡＴＴＴＧ
Ａ、ＴＡＴＡＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡ第５図 、ＡＴＧ ＡＣＴ ＧＣＴ ＣＡＡ ＣＡＡ
ＧＧＴ ＧＴＡ ＣＣハＭｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒ。 （その１） 第５ ＴＧＴ ＧＴＴ ＡＴＴ ＣＣＴ ＧＧＧ ＴＴ
Ａ ＧＡＣＡＣＧ１６２ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｉｌｅ
Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ ＴｈｒＣＴＧ
ＣＡＧ ＴＡＴ ＴＴＧ ＣへＧＡへＧ ＧＡ
Ｔ ＴＣＴ１８０ Ｌｅｕ Ｇｌｎ 下ｙｒ
Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ八
Ｃへ ＴＴＣＣＣＧ ＣＡＡ ＡＡＧ ＧＧＴ
ＴＡＴ ＡＣ八へ９８ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｙｒ ＴｈｒＴＴＧ
ＧＣＡ ＴＴＣＴＣＡ ＴＣＴ ＡＡＴ ＡＧＧ
ＡＧＧ２１６ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｈｅ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ２
５２ Ｖａｌ Ｇ−１ｙ Ａｓｐ Ａｒｇ
Ｌｅｕ Ａｓｎ 丁ｈｒ ＡｓｐＧＧＣＡＣＡ Ｃ
ＴＡ ＣＴＣＧｎ ＴＴＧ ＡＧＴ ＧＧＴ２７０
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓ
ｅｒ ＧｌｙＴＣＧ ＣＡＣＧＡＴ ＴＡＴ ＣＣ
Ａ ＡＧＡ ＣＣＴ ＡＡＡ２８８ Ｓｅｒ
Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌ
ｙｓＧＣＣＴＴＡ ＡＣＣＡＡＴ ＡＡＴ ＧＡ
Ｇ ＴＴＡ ＴＡＧ３０６ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔ
ｈｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｌｅｕ図 （その２
）
Claims (7)
- （１）次の配列で示される塩基配列もしくはその部分か
らなるプロモーター活性を有するＤＮＡ断片（ＰＨＯ１
３プロモーター）： 【塩基配列があります】 - （２）ＰＨＯ１３プロモーターが組み込まれたベクター
。 - （３）ＰＨＯ１３プロモーターおよびその下流に構造遺
伝子が組み込まれた特許請求の範囲第２項記載のベクタ
ー。 - （４）ＰＨＯ１３プロモーターおよびその下流に構造遺
伝子が組み込まれたベクターで形質転換された形質転換
体。 - （５）宿主が酵母である特許請求の範囲第４項記載の形
質転換体。 - （６）ＰＨＯ１３プロモーターおよびその下流に構造遺
伝子が組み込まれたベクターで形質転換された形質転換
体を培地に培養し、培地中に生成蓄積された遺伝子産物
を採取することを特徴とする遺伝子産物の製造法。 - （７）次の配列で示されるアミノ酸配列を有するｐ−ニ
トロフェニルホスファターゼ： 【アミノ酸配列があります】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59156181A JPH062062B2 (ja) | 1984-07-25 | 1984-07-25 | 新規ｄｎａおよびその用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59156181A JPH062062B2 (ja) | 1984-07-25 | 1984-07-25 | 新規ｄｎａおよびその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6131088A true JPS6131088A (ja) | 1986-02-13 |
| JPH062062B2 JPH062062B2 (ja) | 1994-01-12 |
Family
ID=15622124
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59156181A Expired - Lifetime JPH062062B2 (ja) | 1984-07-25 | 1984-07-25 | 新規ｄｎａおよびその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH062062B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021022140A1 (en) * | 2019-08-01 | 2021-02-04 | Danisco Us Inc | Over-expression of pho13 for increased ethanol production by yeast |
-
1984
- 1984-07-25 JP JP59156181A patent/JPH062062B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021022140A1 (en) * | 2019-08-01 | 2021-02-04 | Danisco Us Inc | Over-expression of pho13 for increased ethanol production by yeast |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH062062B2 (ja) | 1994-01-12 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |