JPS61292057A - 留分除去装置及び留分除去方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は大略的には分別装置（ｆｒａＣｔ　１ｎａｔ
ｏｒ）に関するものであり、より詳細には連続的な分別
装＠（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ　　ｆｒａｃｔ　ｉ　ｎａ
ｔｏｒ＞に関する。

（従来の技術） 分離技術としては遠心がしばしば採用されている。多く
の分野、例えば遺伝工学、においでは、材料はセシウム
クロリドまたは他の密度勾配管中において遠心および沈
降により分離される。遠心および沈降の後に、遠心管の
留分が取り除かれ、そして分析される。物質の密度はセ
シウムクロリド勾配中で物質が沈降する場所で決定する
。勾配中のこの位置は、回転の中心からの距離により特
定することが出来る。物質の密度は、勾配および回転の
中心から物質が沈降した場所までの距離を知ることによ
り決定することが出来る。従って、この方法により種々
の密度の物質を分離することが出来るばかりでなく、正
確な密度の決定もまた行なうことが出来る。

上述した説明から、達成された分離の程度、即ち物質の
密度を決定することが出来る正確さ、は、留分（または
層）を各層の間で混合させることなく分析の為に遠心管
から取り除くことが出来る程度に従属している。

連続的な分別の為の一つの装置が米国特許第４．１８１
，７００号明細書に開示されている。

この装置は、可動フレームに設けられたマイクロ注入器
と、遠心管からマイクロ注入器中へと液体を吸い上げる
為の吸入手段と、を備えている。マイクロ注入器は精密
な距離だけ遠心管中に下降され、この距離はマイクロメ
ータによって読まれ、そして記録される。次にはマイク
ロ注入器チップに対して吸入が行なわれ、遠心管の上部
から精密な分量の液体が取り除かれる。上述した方法は
多くの場合において許容できるが、高度な精密さが要求
される時には非常な困難が生じる。

上述した如く、精密さは各層間に発生する混合の程度に
従属している。マイクロ注入器を介して吸入が行なわれ
る時には、遠心管中に流れが生じる。層流の法則が適応
されるので、遠心管の中心部の液体は外縁部の液体より
も早く流れることは明白である。従って、巨大な量の混
合が生じることは避けられない。

米国特許第３，１５１，６３９号明細書に開示されてい
る他の装置は、高密度な液体を遠心管の底部に強制的に
送り込むことにより送り込まれた高密度な液体の容積に
対応した容積だけ遠心管中で他の液体の水平面を上昇さ
せることにより遠心管中から各層を連続的に取り除く。

遠心管中の液体は強制的に遠心管の外部に排出され、追
加された高密度流体の作用によってのみ留分収集器中に
集められる。この方法においては吸入が採用されていな
いが、高密度流体が加えられる度に遠心管中の全部の液
体の塊が上方に移動するので、大きな量の層流が発生し
、以前として各層間の混合が生じる。

（発明が解決しようとする問題点） この発明の大略の目的は、上述した従来技術における欠
点を解消することである。

この発明の一つの目的は、例えば遠心管を正確な留分に
連続的に分別する為の方法および装置の如き改良された
連続的な分別を提供することである。

この発明のもう一つの目的は、最少限の留分間の混合し
か生じさせないで遠心管を連続的に分別する為の方法及
び装置を提供することである。

この発明のさらなる目的は、遠心管に負圧を作用させる
ことなく遠心管を連続的に分別する為の方法及び装置を
提供することである。

（問題点を解決する為の手段１発明の作用および効果） これらのおよび他の目的は、毛細管および正圧を使用す
ることにより達成することが出来る。この毛細管は自身
の下端にＯリングを有している。

毛細管が遠心管中に配置された時、Ｏリングは遠心管中
で密封部材として機能する。遠心管中での毛細管の移動
が遠心管中の液体に負荷される圧力を生じさせ、液体を
強制的に毛細管中に送り込み、やがては収集室中へと送
り込む。次にはポンプで圧送されたチェース（ｃｈａｓ
ｅ）流体が収集室を横ぎり、収集室中の液体を出口孔を
介して強制的に留分収集器中へと送り込む。この発明の
装置および方法は手動により操作することが出来るし、
単一のマイクロプロセッサにより全部を自動的に制御す
ることも出来る。

以下この発明の実施例を図面を参照して説明する。

（実施例） 使用される遠心管は精密に形成されていることが好まし
い。言い換えれば、遠心管の内直径は実質的に均一でな
ければならい。この件に関して許容することが出来る誤
差の程度は、要求する精密さによって決定される。一般
的には、この発明の精密さは、遠心管の内直径の整合性
にお（）る変化の２倍に限定される。

使用される毛細管は内直径が小さく、そして容積は、流
れが生じる面積を出来る限り小さくする為に、所望のυ
ンプルの容積の略２倍以内であることが好ましい。遠心
管中に挿入される毛細管の端部は外方に朝顔形に広がっ
ており、遠心管の外縁側からよりもより早い割合いで遠
心管の中心部から液体が除去されるのを最少に（るのを
助ける為には、外方に朝顔形に広がった形状または円錐
形状であることが好ましく、この形状は隣接した複数の
水平方向の液体層間の好ましくない混合か最少になるよ
う機能する。

毛細管及び遠心管の両者は、それらが共通の中心軸に沿
って立つよう（同心的に立つよう）支持されていなけれ
ばならない。毛細管が垂直に下降されると、または垂直
な遠心管が上昇されると、精密な移動の為の適切な手段
により毛細管は朝顔形に広がった形状の端部を下降させ
て垂直な遠心管中に挿入される。精密な移動の為の手段
は、遠心管を垂直な軸に沿って毛細管に対して相対的に
移動させることだけを必要としている。従って、毛細管
および遠心管のいずれか一方またはこれらの両者を実際
に移動させることも出来る。開始位置が得られ、そして
毛細管または遠心管が移動した垂直方向の距離の測定が
例えば毛細管を下降させる為の手段に直接連結されてい
る目盛りマイクロメータの如き良く知られている適切な
手段により測定される。

毛細管が遠心管中に挿入された時には、朝顔形に広がっ
た形状の端部の直上方で毛細管の外周面上に位置してい
る０リングが遠心管の内周面に密封係合し、遠心管の内
部中の液体に対して圧力を負荷させる。毛細管をさらに
挿入させて遠心管中におけるそれの深さを増大させると
、これにより生み出された正圧力が液体の表面留分を毛
細管中に強制的に送り込み、最終的には、朝顔形に広が
った形状ではない毛細管の上端部に連結されている室中
へと送り込む。その室を毛細管に連結している開口に加
えて、その室は流体の水平方向移動（垂直軸に対して直
角に交差する方向）の為の出口孔と入口孔とを有してい
る。入口孔は室中に水平方向の流体圧力を負荷する為の
ポンプに連結されている。この水平方向の流体圧力は室
中のどのような液体をも出口孔から強制的に排出させる
。

出口孔は標準的な留分収集器に連結されている。

上述した記載からは、留分の除去中に遠心管中で流れの
混合が全く生じないか、またもし生じたとしてもそれは
補優かであるとゆうことが分る。

もちろん、毛細管中では大きな流れと大きな混合とが生
じる。とはゆうものの、所望のサンプルの寸法に比べて
毛細管の直径と容積とは比較的小さいので、精密さと正
確さとに及ぼすこの混合の効果は殆ど無視することが出
来る。

第１図に示した好ましい実施例１０においては、遠心管
１１（好ましくは、高精度石英管）または毛細管を垂直
軸に沿って相互により近づくように移動させる手段は、
伝達手段（図示されていない）を介してステップモータ
（第２図における参照符号５２）に連結されている精密
駆動ねじ１２である。この装置を使用することにより、
遠心管の上昇は±０．０００３ｃｍで制御することが出
来る。

静的な液体排出孔１４は第１図に示す如く連結された２
つの部分からなっている。液体排出孔１４の上部は、外
方管の間の１１１１＃Ｉの直径の水平な毛細管１８によ
り規定されている室１７を含んでいるブロック１６［ル
ーサイト（Ｌｕｃｉｔｅ）；１）ｕ　ｐｏｎｔ社のメタ
クリル酸メチルプラスチック材料の商標名、プレキシグ
ラス（ｐｒｅｘｉｇｌａｓｓ、または機械的強度が高い
他のプラスチック材料により適切に形成することが出来
、透明であることが好ましい］である。液体排出孔１４
の下部は外直径が３．１＃ｌｌｌ＋の垂直に設けられて
いるステンレス鋼製のシリンダ２４（ステンレス鋼であ
ることが好ましい）であり、シリンダ２４は円筒軸に沿
った０、３ＩｌｌｌＩ＋の直径の毛細管２５を格納して
いる。シリンダの底端に着座しているＯリング２６は、
シリンダが小さな石英製の遠心管１１の口内に挿入され
た時に、気密および液密な密封部材として機能する。シ
リンダ２４の底端の外方に朝顔形に開いている（好まし
くは略４５°）開口２８が遠心管内の内容物を毛細管２
５中へと導入する。シリンダ２４の上端はルーサイト製
のブロック１６に結合されていて、シリンダ２４の上端
から延出している垂直な毛細管２５は水平な毛細管１８
中に垂直に挿入されて、Ｔ型の連結を構成する。

上述した装置を操作する為に、要求に応じて数秒間に２
−３ｍを供給することが出来る螺動式または反復式注射
器ポンプ（第２図における参照符号５６および５８）が
連結管を介して装着部２０に連結されており、留分収集
器（第２図に於ける参照符号６６）は連結管を介して装
着部２２に連結されている。遠心管１１を保持する為の
受は器３０がそれの移動行程の下限まで移動され、そし
て分別される溶液を保持した石英製の遠心管１１が受は
器３０中に置かれる。

次に遠心管１１は、液体排出孔１４の底端が遠心管１１
の口内に入るまで、精密駆動ねじ１２により上昇される
。液体排出孔１４の挿入は、少量のシリコーングリース
をＯリング２６に適応することにより容易になる。遠心
管１１は次に、メニスカスにおいて溶液がステンレス鋼
製の毛細管２４．２５に入るまでゆっくりと上昇させら
れ、そして少量の液体がルーサイト製のブロック１６中
の水平な毛細管１８中に入るまで連続的に観察される。

この段階において開始位置が得られ、そしてマイクロメ
ータがゼロに設定され、または好ましくは装置の制御が
マイクロコンピュータ（第２図においては参照符号５０
）に取って替わられる。使用者は、個々の留分に対応し
ている半径方向距離の所望のインクレメントと所望の数
の留分とを入れる。

次には、所望の数の留分が収集されるまで以下の手続き
が人手の介在なしに行われる。（１）遠心管が所定の距
離だけ上昇される。（２）上昇により水平な毛細管中へ
と導入された所定の量の溶液が留分収集器中に設けられ
ている収集バイアル（収集小瓶）中へと２ないし３りの
運搬液体により洗い流される。（３）留分収集器が次の
収集バイアルへと送られる。

この発明の一つの使用例は、遠心力が先だって適用され
ている放射線標識された溶質の濃度勾配の測定である。

使用される運搬流体はシンチレーシヨン（ｓｃｌｎｔｉ
　ｌ　Ｉａｔｉｏｎ）でもよく、収集容器はガラス製の
バイアルであってもよい。

ガラス製のバイアルは、分別の後に個々の留分中の１つ
または複数の放射線ＩｌｉｗＡされた種の量の測定のた
めに、シンチレーション係数計中に置かれる。とはゆう
ものの、濃度勾配の数量化は放射線標識された溶質に限
られない。基本的には、例えば個々の留分中の酵素の量
を検定する為の酵素活動の含量検定の如き必要な感度の
どのような化学的または物理的な含量検定も使用するこ
とが出来る。

第２図はこの発明に従った自動分別装置を概略的に示し
ている。

マイクロコンピュータ５０はステップモータ５２に信号
を送り、精密駆動ねじ１２の回転により受は器３０を受
は器３０上の遠心管１１とともに上昇させる。受は器３
０は位置検知器５４を作動させ、位置検知器５４はマイ
クロコンピュータ５０に信号を送り、基準点を設定する
。マイクロコンピュータは、選択されたサンプル容量と
等しい容量の溶液を毛細管２５中に上昇させる為に十分
なインクリメント中で受は器３ｏを上昇させるようプロ
グラムされている。サンプルが毛細管２５中に流入した
後、それは室１７中に流入し、そしてマイクロコンピュ
ータ５０は自動ピペット機５６に信号を送り、自動ピペ
ット機５６は管路６０を介してチェース流体を貯蔵所か
ら吸引した後その流体を管路６２を介して室１７中へと
圧送し、これによりサンプルが管路６４中に追われて送
り込まれ、最終的には留分収集器６６中へと送り込まれ
る。留分収集器６６もまたマイクロコンピュータ５０に
より制御されており、留分番号に従った所定の手順で留
分を収集する。

例えばマイクロコンピュータ５ｏはエプソン１ｊＸ−２
０（Ｅｐｓｏｎ　　ＨＸ−２０）Ｔ’あることが出来、
自動ピペット機はオックスフォード自動ピペット機（Ｏ
ｘｆｏｒｄ　　ａｕｔｏｍａｔｉｃｐｌｐｅｔｔｅｒ）
であることが出来、留分収集器はギルラン２０１Ｂ留分
収集器（Ｇｉｌｓ。

ｎ２０１Ｂｆｒａｃｔｉｏｎ　　ｃｏｌｌｅｃｔｅｒ）
であることが出来る。

例− この発明は十分詳細に前述されており、Ｊス下の例は図
示の目的の為だけに与えられており、どのような意味に
おいてもこの発明の範囲を限定するものではない。

第３図および第４図は、２つの異なった条件の設定の下
で遠心された１３１１にＩ！識化された牛の血清のアル
ブミンの溶液の留分から得られた結果を示している。

第３図においては、１分間当りにカウントされた時に現
われたアリコート（ａｌ　１ｑｕｏｔ）中の相対的なタ
ンパク質濃度が、沈降速度実験の結果で測定された、遠
心中のアリコートの半径方向位置の関数としてプロット
されている。０．０４１１１１／ｉｄタンパク質溶液の
略１５０μ　がこの測定を行なう為に必要であった。デ
ータの結果は半径方向距離の１０ポイント／Ｍである。

プロットの左側の垂直線は溶液メニスカス（上方境界）
の位置を示しており、右側の垂直線は、データから計算
した時の沈澱タンパク質の航跡境界（ｔｒａｉｌｉｎｇ
　　ｂｏｕｄａｒｙ）の重量平均位置を示している。こ
れらのデータから計算された沈降係数は公知の値と良く
一致していた。

第４図においては、１ｎ（１分間当りのカウント）とし
て表現されているアリコート中の相対的なタンパク質濃
度が、沈降平衡の実験の結果で測定された、遠心中のア
リコートの半径方向位置の２乗の関数としてプロットさ
れている。０．０２＃Ｉｇ／　ａｔ！タンパク貿溶液溶
液４０μ　がこの測定を行なう為に必要であった。沈降
理論は、このプロットは沈降平衡における均質種の為に
線形でなければならないとゆうことを予言している。こ
のプロットの傾斜から計算されたタンパク質の分子量は
、公知の値と良く一致していた。

この発明は図示され記載された実施例に限定されるべき
でなく、この発明の概念から離れない限りどのような変
形例も可能であることを理解すべきである。例えば、こ
の発明は、種々の分ｍ機能を果たす為に、小さな直径の
管（例え毛細管の寸法よりも大きいとしても）の容積を
所望のサンプルの寸法の容積の略２倍以下に常に保った
ままで、寸法を実質的に増大することが出来る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の好ましい実施例を概略的に示す図
； 第２図は、この発明を自動化する為の好ましい実施例を
概略的に示す図： 第３図は、この発明を使用して得られた結果をグラフ化
して示す図；そして 第４図は、この発明を使用して得られた別の結果をグラ
フ化して示す図である。 １０・・・実施例、１１・・・遠心管、１２・・・精密
駆動ねじ、１４・・・液体排出孔、１６・・・ブロック
、１７・・・室、１８・・・水平な毛細管、２０．２２
・・・装着部、２４・・・ステンレス鋼製シリンダ、２
５・・・垂直な毛細管、２６・・・Ｏリング、２８・・
・朝顔形に開いている開口、３０・・・受は器、５０・
・・マイクロコンピュータ、５２・・・ステップモータ
、５４・・・位置検知器、５６・・・自動ピペット機（
注射器ポンプ）、５８・・・注射器ポンプ、６０．６２
・・・管路、６６・・・分別収集器。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、層状の液体を保持している保持管から所定の容積の
   留分を除去する為のものであって：個々の留分の容積の
   略２倍を超えない容 積を有しており、底端が略３０°と略６０°との間の角
   度で外方に朝顔形に開いており、朝顔形に開いた端の上
   方位置に設けられ保持管中で底外端を摺動自在に密封す
   る密封手段を有している、小さな直径の管と； 外方に朝顔形に開いた上記端を下方に向けた状態で垂直
   軸に沿って上記小さな直径の管を配置する手段と； 上記小さな直径の管の下方で上記垂直軸に沿って上記保
   持管を垂直に向けた状態に配置し、上記小さな直径の管
   を上記保持管中に挿入して上記密封手段を上記保持管の
   内表面に摺動自在に係合させる手段と； 外方に朝顔形に開いた上記端とは反対側の上記小さな直
   径の管の端に連結した室を規定する手段と； 上記小さな直径の管と上記保持管との相対的な接近移動
   を生じさせて液の１つの層を上記保持管から上記小さな
   直径の管中へと強制的に送り込ませ、ひいては上記室手
   段中へと送り込ませる手段と；そして 上記室中に水平方向に流体圧力を負荷し、 上記流体圧力により上記室中のどのような液体も上記室
   中の出口孔を介して上記室の外方へと水平方向に強制的
   に送る手段と； を備えていることを特徴とする留分除去装置。 ２、前記小さな直径の管は毛細管であり、前記保持管は
   遠心管であることを特徴とする特許請求の範囲第１項に
   記載の留分除去装置。 ３、前記遠心管が実質的に均一な内直径を有しているこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の留分除去
   装置。 ４、外方に朝顔形に開いた前記端とは反対側の前記毛細
   管の端と前記室との間の連結がＴ型連結を規定している
   ことを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の留分除
   去装置。 ５、前記室が２つの開口端とこれらの間の中間部とを有
   している毛細手段を有しており、上記中間部が前記毛細
   管に連結する為の開口を規定している手段を有しており
   、外方に朝顔形に開いた前記端の夫々がそれらに取り付
   けられる装着部を有しており、上記装着部の１つが流体
   圧力を負荷する為の前記手段に連結されていることを特
   徴とする特許請求の範囲第４項に記載の留分除去装置。 ６、前記外方装着部が留分収集器に連結されていること
   を特徴とする特許請求の範囲第５項に記載の留分除去装
   置。 ７、前記遠心管の長さに沿って基準点を決定する手段を
   備えていることを特徴とする特許請求の範囲第３項に記
   載の留分除去装置。 ８、マイクロコンピュータを備えており、上記マイクロ
   コンピュータが： 所望の数の留分を設定する手段と； 所望のサンプル容積を設定する手段と； 前記挿入手段を作動させる手段と； 前記深さ変更手段を作動させて上記所望の容積の液体サ
   ンプルを前記遠心管中から前記毛細管中へと移動させる
   手段と； 前記基準点を記録する手段と； 前記流体圧力負荷手段を作動させて前記室中のサンプル
   を前記出口孔を介して強制的に留分収集間中へと送り込
   む手段と； 上記留分収集器に留分番号に従って順序良く個々の留分
   を収集させる手段と； を備えていることを特徴とする特許請求の範囲第７項に
   記載の留分除去装置。 ９、遠心管から留分を除去する為のものであって： ａ）留分の容積を選択する工程と； ｂ）上記留分の夫々の容積の略２倍を超えない容積を有
   している毛細管を選択するものであって、上記毛細管が
   略３０°と略６０°との間の角度で外方に朝顔形に拡い
   た一端を有しているとともに上記遠心管の内直径よりも
   僅かに大きな外直径を有したＯリングを有しており、上
   記Ｏリングが外方に開いた上記一端の上方で上記毛細管
   の回りに取り付けられている、工程と； ｃ）上記毛細管を外方に朝顔形に開いた上記一端を下方
   に向けた状態で垂直軸に沿って保持する工程と； ｄ）内部に液体を保持している遠心管を上記毛細管の下
   方で上記垂直軸に沿って直立した状態に配置する工程と
   ； ｅ）上記毛細管を上記遠心管中に挿入して上記Ｏリング
   を上記遠心管の内表面に摺動自在に係合させる工程と； ｆ）挿入された上記毛細管の外方に朝顔形に開いた上記
   一端が上記遠心管中に挿入された深さを増大させて上記
   液体の上記選択された容量の第１の留分を上記毛細管中
   へと強制的に送り込む工程と； ｇ）挿入された上記毛細管の外方に朝顔形に開いた上記
   一端が上記遠心管中に挿入された深さをさらに増大させ
   て上記液体の上記選択された容量の少なくとも１つの追
   加の留分および上記第１の留分の少なくとも一部を上記
   毛細管に連結されている室中へと強制的に送り込む工程
   と； ｈ）上記室を水平方向に横切るよう流体圧力を負荷して
   上記室中の出口孔を介し上記一部を上記室の外に排出す
   る工程と； を備えていることを特徴とする留分除去方法。 １０、前記室の外に強制的に排出された前記部分を留分
   収集器中に収集する工程を備えていることを特徴とする
   特許請求の範囲第９項に記載の留分除去方法。 １１、前記ｆ、ｇ、およびｈの工程が連続的な分別の為
   に順次繰り返され、個々の繰り返し中に前記毛細管中に
   入り込む前記留分が前記毛細管中に入り込む全ての連続
   的な留分に関しての前記第１の留分とされることを特徴
   とする特許請求の範囲第１０項に記載の留分除去方法。