JPS61254854A - 歯周病検出用の唾液診断試験 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の属する技術分野］ 本発明は歯周病を検出するための診断試験に関する。

［先行技術及び問題点］ 歯周炎、口内炎、歯肉炎等のような歯周病は、通常１局
所刺激による口腔組織の炎症性変化を特徴とする口内の
炎症症状である、破壊的な炎症過程は細菌、食物かす１
口内白面球、及び歯と歯根膜周辺の上皮付着部の間の相
互作用によるものであり、その結果として骨（歯根周囲
の支持骨）の吸収と上皮付着部から上の部分（歯肉表面
と上皮付着部のみとの間）を含めたヒトの歯を直接取巻
く組＃ｉ！（歯肉）に炎症が起こる１、このような炎症
症状の早期検出は適切な歯科治療に非常に重要である。

本発明により、体が炎症部位において増加知られた事実
を活用して、このような検出を行なっている。炎症症状
があると、ＰＨＮ白血球の数が増えると共にペルオキシ
ダーゼ活性も高まる。

１９８４年２月２７日出願された［歯周病を検出するた
めの唾液診断試験］と題する我々の先行係属中の合衆国
特許出願番号筒５８４．０１３号において、フェノール
自体が色素原溶液中のカップリング剤を構成する場合の
唾液過酸化酵素試験が記述されている。しかし、このフ
ェノールの物理的性状のため、このような色素原溶液は
、本発明の色素原溶液が凍結乾燥されるようには凍結乾
燥できない。

従って、本発明は先行出願に対して改良をなすものであ
る。

［問題点を解決する手段］ 本発明は歯周病による炎症の存在を検出するための簡単
な唾液試験を提供している。−これは、無色の水素（共
与体（すなわち色素原）を酸化して。

比色的に測定可能な着色生成物に変えるペルオキシダー
ゼの知られた化学的能力を利用したものである。このペ
ルオキシダーゼ試験法は迅速で信頼性があり、唾液試料
中におけるペルオキシダーゼの存在とこのような疾病の
存在との間に強力な正の相聞関係をもっている。

ペルオキシダーゼ活性の測定は、本発明で、カップリン
グ剤としてのフェノール成分をも含有する緩衝剤水溶液
中において、基質としての過酸化水素と色素原としての
４−アミノ２ンチピリンとの試薬混合物によって達成さ
れる。このフェノール成分は、（ｉ）２−ヒドロキシ−
３，５−ジクロロベンゼンスルホン酸ナトリウム、（ｉ
ｉ）ｐ−ヒドロキシ安息香酸、　（ｉｉｉ）　ｌ）−メ
トキシフェノール、又は（ｉｖ）２゜６−ジクロロフェ
ノールからなる群から選ばれる一員である。４−アミノ
アンチピリンは唾液試料からのペルオキシダーゼの存在
下に過酸化水素によって酸化され、生ずる発色の強さは
酵素濃度に、また従って歯周の炎症程度に比例している
。

便宜上１次の記号が各フェノール成分に対して使用され
る。

（ｉ）２−ヒドロキシ−３，５−ジクロロベンゼンスル
ホン酸ナトリウム（好適）　　ＨＤＣＢＳ（ｉｉ）　　
ｐ−ヒドロキシ安息香酸　　　　　１）Ｎ　ＢＡ（ｉｉ
ｉ）叶メトキシフェノール　　　　　ｐＨＰ（ｉｖ）　
２．６−ジクロロフェノール　　　　ｄＣＰ反応は、計
量した色素原溶液及び基質溶液を計量した唾液と混合す
ることによって行われる。反応は過酸化水素基質と唾液
との接触によって開始されるため、混合順序はまず色素
原と基質溶液を混合し、この混合物に唾液を加えるか、
又はその代わりに色素原溶液と唾液を混合してから基質
溶液を加えるようにする。

検定の終点は明らかに使用の特定検定条件に依存してい
る。例えば、色素原及び／又部基質濃度を最適濃度まで
高めると、発色が強まる。すなわち、反応によって生ず
る色を観察する時間が短縮されよう。このため、都合の
よい時期に検定の終点が観察できるように、色素原と基
質の濃度を所定のパラメータの範囲内で調整するのが有
利である。このような任意の調整はわかりやすいもので
あり、検定実施者がこれにある程度慣れると実行は容易
である。

色素原及び基質が最少限度の濃度であると、例えば１時
間を越える長い検定１時間が必要であるが下に示す最大
濃度範囲までの好ましい濃度を使用すると、邑の強さを
観察するのに室温（２０−２６℃）で約２分ないし約６
０分、及び好ましくは約３分なの温度（すなわちペルオ
キシダーゼ酵素の不活性化温度より下の温度）も使用で
きる。

発色がないことは正常状態、すなわち唾液中にＰＨＮ白
血球がないことを示し、このことが歯周病にかかつてい
ないことを示す。しかし、発色は歯周病の存在と相互に
関係し、色の強さは疾病の程度と相互に関係がある。各
フェノール成分に好都合な１−４の採点方式は次のとお
りである。

嘔庄　　　些　　　江　　せ− １＝正常　　　　　□発色なし□ ２・軽症　　　　　□薄桃色□ ３・相当程度　　　素がかった　　未化がかった　羽−
かった　紫がかった桃色　　　　　　赤色　　　　　赤
色　　　桃色４−重症　　　　　暗紫色　　　　　暗赤
色　　　　暗赤色　　　暗紫色色素原溶液は４−アミノ
アンチピリン色素原と、フェノール性カップリング剤、
及び反応条件に対して約４−９．好ましくは６８±０．
０５の望ましいｐＨを得るための適当な緩衝剤、好まし
くは慣用のアルカリ金属（ナトリウム又はカリウム）燐
酸塩緩衝剤からなる。

４−７ミノアンチピリン　　　　　０．００１−０．１
５　Ｑ　　　　　Ｏ，０１７Ｇフェノール成分： ＨＤＣＢＳ　ｌ１ｌ）ヒき　　　　　　　　　　０．０
７−１．０　ｇ　　　　　　　０．４２　ＱＤＨＢＡ　
　、＋　　　　　　　　　　　０．１０−１５．０　ｇ
　　　　　　Ｌ５　ＱｏＨＰ　　　・＋　　　　　　　
　　　４．１−１３０．０　ＩＱ　　　　　２５．０−
〇ｄＣＰ　　　、・　　　　　　　　　６．５−１００
０．Ｏｍｇ　　　　６５．０　ｓ。

燐酸カリウム（−塩基性）　　　　０．１５−１２．Ｏ
ａ　　　　　　１．５　ａ燐酸カリウム（二塩基性）　
　　虹坦亘虹虹虹　　　−しｌユ水（全量で）　　　　
　　　　　　　　ＴＯＯｉｆ　　　　　　　ｉｏｏ　ｓ
ｌヒドロペルオキシド基質溶液は、過酸化水素の希水溶
液である。

！竺 肚　　　　　　　　　■　　　　　　■過酸化水素＋３
０％ｌ　　　　　　　　Ｏ，００１−１０ｓＩ　　　　
　　Ｏ，！１５　ｍｌ水（全って）　　　　　　　　　
　　１００　ｍｌ　　　　　　１００．００　ｍｌ概し
て本発明方法は、唾液の単位容量当り約２−１５屯位容
量の色素原溶液と約０１−２単位容呈の基質溶液を利用
する。しかし、最適有効量は色素原及び／又は基質の濃
度と、試験に使用される特定検定技術によって変わりう
る。下になおも詳しく記）２３されているように、この
ような技術は試験管やフィルターパッド材料、磁器製水
溜め、分光光度計等を包含する。上記の好ましい色素原
及び基質溶液の場合１例えば試験管又は磁器製水溜めを
使用する時は、単位容量の唾液当りそれぞれ約２甲位容
量の基質及び色素原溶液が好ましく、フィルターパッド
材料（例えばディスク）を使用する時は単位容量の唾液
当り約２単位容量の色素原溶液と１単位容量の基質溶液
が好ましく、また分光光度計機器を使用する時は単位容
量の唾液当り約１５単位容量の色素原溶液と０．１単位
容量の基質溶液が好ましいことを我々は発見した。

−貫して信頼性のある発色を得るためには、Ｅ）Ｈと過
酸化物濃度を調整しなければならない。緩衝剤として例
えば燐酸塩（好適）、フタル酸塩、くえん酸塩、トリス
、ホウ酸塩、こはく酸塩等の緩衝剤をあげることができ
る。それらのｐＨ値と容量は反応混合物が約４０ないし
約９．０、及び好ましくは約６８のｐＨ値をもつように
選ばれる。色素原溶液と過酸化物基質溶液を混合する時
、基質溶液中の過酸化水素のモル当り約１．ｌＸ１０＝
モルないし約１８９モルの４−アミノアンチピリンと、
約２゜５Ｘ１０　　ないし約８．５７Ｘ１０　　モルの
ＨＤＣＢＳ　、約５．９３ＸＩＯモルないし約２．１４
Ｘ　１０＋モルのｐＨＢＡ、又は約３．１３ｘ１０−今
ないし約２．３９Ｘ１０　　モルのｐＨ８又は−＋ 約３．７７Ｘ　１０　　ないし約１．３９Ｘ　１０３モ
ルのｄｃＰをそれぞれ色素原溶液中に使用するのが有利
である。

これらの反応体の各々に対する当量比は、基質溶液中の
過酸化水素のモル当り色素原溶液巾約７．５−３　　　
　　　　−λ Ｘ１０　　ないし約１．９Ｘ１０　　モルの４−アミノ
アンチピリン及び、約０．１５ないし約０．３６モルの
ＨＤＣＢＳ、又は約０．８８モルないし約２．１４モル
のｐＨＢＡ、又は約０、０１９ないし約０．０４５モル
のｐＨ８、又は約０．０３８ないし約０．０９１モルの
ｄｃＰであるのが好ましい。

色素原・溶液を乾燥粉末型に凍結乾燥すると、溶液自体
より容易な貯蔵、長い貯蔵寿命及び取扱いの便宜を提供
するので好ましい。凍結乾燥段階は慣用的な周知の方法
に従って行われる。

本発明方法は、溶液又は凍結乾燥型の色素原用及び唾液
試料用の目盛り付きスボイ１−を備えた簡便な試験キッ
トの形で使用できる。試、験キットは例えば１回以上の
試験に対して十分な量の緩衝された色素原及び過酸化物
の溶液を包含しうる。試験実施に当っては、過酸化物溶
液を試験管中の色素原に添加し、続いて予め目盛り付き
スポイトで集めた計量済みの、すなわち試験に十分な量
の唾液試料を加える。試験管に再び栓をし、Ｓ蕩してか
ら指定された時間の間装置する。色反応が完了した後、
キットで提供されている色指示チャートで、生ずる発色
を直ちに比較して、炎症性歯周病の有無・と程度が見て
取れるように、試験管を静置させる手段が提供できる。

このように本発明は炎症性歯周病の存在を検出するため
の、以下の別個に含有さ机る成分を含むキットを提供し
ている。

（ａ）過酸化水素溶液、及び （ｂ）４−アミノアンチピリン；２−ヒドロキシ−３，
５ジクロロベンゼンスル丞ン酸ナトリウム、ｐ−ヒドロ
キシ安息香酸、ｐ−メトキシフェノール、及び２．６−
ジクロロフェノールからなる群から選ばれるフェノール
成分：及び凍結乾燥・試薬と過酸化水素溶液との接触時
に約４−９のｐＨを提供するための緩衝剤からなる凍結
乾燥試薬。凍結乾燥試薬の代わりに既に述べた色素原の
Ｈ衝水溶液をキットは包含しうる。

代わりの方法として、磁器水溜めを使うものがあり、こ
れは少量の反応体での検定実施にすぐれた容器であって
、検定の着色結果を観察するのに白い背景を提供してい
る。また、適当な吸収材料例えば市販のフィルターパッ
ドを単位試験に都合のよい形１例えばディスク形に切っ
たものを使うこともあり、これは全反応体を漏らさず保
持するため、検定の着色結果が容易に識別できる。また
慣用の分光光度計機器を使うと試験検定液の「色の読取
り」が自動的に行われる。

［実施例］ 以下の実施例は、本発明を例示する目的で記載されてい
る。

実施例１ と比較し関連づけた。各患者を臨床的に検査し、炎症性
歯周病の有無とその程度を測定した。各臨床診断結果、
を１（正常）から４（重症）の段階に採点した。計２２
名の男女患者が試験に参加した。

各患者に口内衛生又は食物摂取を控えるように求めてか
ら、起床時に約５１の唾液を集めた。各患者に唾液回収
管に盾をはくように求めた。各唾液試料を分析し、次の
試験管法に従ってペルオキシダーゼの存在を検出した。

試験管法二室温で試験反応を次のように行なった。

ａ）５０μｊの好ましい色素原溶液を試験管内で凍結乾
燥した。

ｂ）　　１１０μｍの好ましい基質溶液を凍結乾燥され
た色素原に添加した。

ｃ）　　３０μｍの唾液試験試料を添加して反応を開始
させた。

ｄ）唾液添加の３０分後、唾液中のペルオキシダーゼ酵
素の存在による発色の有無と強度を上記の１から４の尺
度で採点した。

２２名の患者の各々に対する臨床試験での臨床診断結果
と生体外＠液検定結果とを第１表に示す。

！１衣 出願人：リチャードンンーヴイックス インコーポレーテッド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、歯周病にかかつている疑いのある人からの唾液試料
   を、ｐＨ約４−９に緩衝された２−ヒドロキシ−３，５
   −ジクロロベンゼンスルホン酸ナトリウム、ｐ−ヒドロ
   キシ安息香酸、ｐ−メトキシフェノール及び２，６−ジ
   クロロフェノールからなる群から選ばれるフェノール成
   分と４−アミノアンチピリンとの水溶液、及び過酸化水
   素溶液と混合し、このような存在を指示するものとして
   の呈色を観察することからなる、歯周病の疑いがある人
   での炎症性歯周病の存在を検出する方法。 ２、フェノール成分が２−ヒドロキシ−３，５−ジクロ
   ロベンゼンスルホネートである、特許請求の範囲第１項
   の方法。 ３、フェノール成分がｐ−ヒドロキシ安息香酸である、
   特許請求の範囲第１項の方法。 ４、フェノール成分がｐ−メトキシフェノールである、
   特許請求の範囲第１項の方法。 ５、フェノール成分が２，６−ジクロロフェノールであ
   る、特許請求の範囲第１項の方法。 ６、木質的に次の成分：￥％ｗ／ｖ￥ ４−アミノアンチピリジン０．００１−０．１５ｇフェ
   ノール成分： ￥％ｗ／ｖ￥ ＨＤＣＢＳの場合　　　０．０７−１．０ｇｐＨＢＡの
   場合　　　　０．１０−１５．０ｇｐＭＰの場合　　　
   　　４．１−１３０．０ｍｇｄＣＰの場合　　　　　６
   ．５−１０００．０ｍｇＫＨ＿２ＰＯ＿４　　　０．１
   ５−１２．０ｇＫ＿２ＨＰＯ＿４　　　￥０．１５−１
   ３．０ｇ￥水　　　　　　　　　　１００ｍｌ からなる色素原溶液約２−１５単位容量と、本質的に次
   の成分： ￥％ｖ／ｖ￥ 過酸化水素（３０％）　０．００１−１０ｍｌ水（全量
   で）　　　　　１００ｍｌ からなる基質溶液約０．１−２単位容量を、炎症性歯周
   病にかかつた疑いのある人からの唾液試料１単位容量と
   混和し、このような存在を指示するものとしての色を観
   察することで成立する、歯周病の疑いがある人での炎症
   性歯周病の存在を検出するための特許請求の範囲第１項
   の方法。 ７、色素原溶液が本質的に次の成分： ￥％ｗ／ｖ￥ ４−アミノアンチピリン　　　０．０１７ｇ２−ヒドロ
   キシ−３，５−ジクロロベンゼンスルホン酸ナトリウム
   　　　　０．４２ｇ ＫＨ＿２ＰＯ＿４（一塩基性）５．９８ｇ Ｋ＿２ＨＰＯ＿４（二塩基性）６．２７ｇ 水（全量で）　　　　　　　　１００ｍｌ からなり、また基質溶液が本質的に次の成分：￥％ｖ／
   ｖ￥ 過酸化水素（３０％）　　　　０．５５ｍｌ水（全量で
   ）　　　　　　　　１００ｍｌ からなる、特許請求の範囲第６項の方法。 ８、色素原溶液が本質的に次の成分： ￥％ｗ／ｖ￥ ４−アミノアンチピリン　　　０．０１７ｇｐ−ヒドロ
   キシ安息香酸　　　１．５ｍｇ ＫＨ＿２ＰＯ＿４（一塩基性）５．９８ｇ Ｋ＿２ＨＰＯ＿４（二塩基性）￥６．２７ｇ￥水（全量
   で）　　　　　　　　１００ｍｌ からなり、また基質溶液が本質的に次の成分：￥％ｖ／
   ｖ￥ 過酸化水素（３０％）　　　　０．５５ｍｌ水（全量で
   ）　　　　　　　　１００ｍｌ からなる、特許請求の範囲第６項の方法。 ９、色素原溶液が本質的に次の成分： ￥％ｗ／ｖ￥ ４−アミノアンチピリン　　　０．０１７ｇｐ−メトキ
   シフェノール　　　２５．０ｇ ＫＨ＿２ＰＯ＿４（一塩基性）５．９８ｇ Ｋ＿２ＨＰＯ＿４（二塩基性）￥６．２７ｇ￥水（全量
   で）　　　　　　　　１００ｍｌ からなり、また基質溶液が本質的に次の成分：￥％ｖ／
   ｖ￥ 過酸化水素（３０％）　　　　０．５５ｍｌ水（全量で
   ）　　　　　　　　１００ｍｌ からなる、特許請求の範囲第６項の方法。 １０、色素原溶液が本質的に次の成分： ￥％ｗ／ｖ￥ ４−アミノアンチピリン　　　０．０１７ｇ２，６−ジ
   クロロフェノール　２５．０ｍｇＫＨ＿２ＰＯ＿４（一
   塩基性　５．９８ｇ Ｋ＿２ＨＰＯ＿４（二塩基性）６．２７ｇ 水（全量で）　　　　　　　　１００ｍｌ からなり、また基質溶液が木質的に次の成分：￥％ｖ／
   ｖ￥ 過酸化水素（３０％）　　　　０．５５ｍｌ水（全量で
   ）　　　　　　　　１００ｍｌ からなる、特許請求の範囲第６項の方法。 １１、以下の別個に述べる成分を含む、炎症性歯周病の
   存在を検出するためのキット。 ａ）過酸化水素溶液、及び ｂ）木質的に４−アミノアンチピリン；２−ヒドロキシ
   −３，５−ジクロロベンゼンスルホン酸ナトリウム、ｐ
   −ヒドロキシ安息香酸、ｐ−メトキシフェノール及び２
   ，６−ジクロロフェノールからなる群から選ばれるフェ
   ノール成分；及び凍結乾燥試薬と過酸化水素溶液との混
   和時に約４−９のｐＨを提供するための緩衝液からなる
   凍結乾燥試薬。 １２、フェノール成分が２−ヒドロキシ−３，５−ジク
   ロロベンゼンスルホネートである、特許請求の範囲第１
   １項のキット。 １３、フェノール成分がｐ−ヒドロキシ安息香酸である
   、特許請求の範囲第１１項のキット。 １４、フェノール成分がｐ−メトキシフェノールである
   、特許請求の範囲第１１項のキット。 １５、フェノール成分が２，６−ジクロロフェノールで
   ある、特許請求の範囲第１１項のキット。