JPS61212763A - 免疫学的測定試薬 - Google Patents
免疫学的測定試薬Info
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- JPS61212763A JPS61212763A JP5506685A JP5506685A JPS61212763A JP S61212763 A JPS61212763 A JP S61212763A JP 5506685 A JP5506685 A JP 5506685A JP 5506685 A JP5506685 A JP 5506685A JP S61212763 A JPS61212763 A JP S61212763A
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- serum
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は自己免疫疾患に出現する種々の自己抗体の免疫
学的測定試薬に関する。
学的測定試薬に関する。
（従来の技術）
自己免疫疾患は自己の抗原に対する免疫反応が原因とな
っているか、または関連している病態と定義されるが、
この自己の抗原に対する免疫反応の主役をなすのは穐々
の自己抗体であり、該自己抗体の測定は自己免疫疾患の
診断、病態の把撫のために極めて重要である。
っているか、または関連している病態と定義されるが、
この自己の抗原に対する免疫反応の主役をなすのは穐々
の自己抗体であり、該自己抗体の測定は自己免疫疾患の
診断、病態の把撫のために極めて重要である。
従来からの自己抗体の測定法としては、蛍光抗体法、ラ
テックス凝集反応、感作血球凝集反応、ラジオイムノア
ッセイ法などが知られているが、いずれの方法も一長一
短があり、満足すべき方法ではない。たとえば、蛍光抗
体法はスライドグラス上に付着させた核材（抗原）に被
検血清を反応させた後、蛍光色素標識抗ヒトｒ−グロブ
リンを反応させて生成する蛍光染色様式を判定すること
により行うが、自己抗体の種類によって様々の染色像を
呈し、その判定は専門家によらざるを得ない上に、極め
て定性的である。−！た、ラテックス凝集反応、感作血
球凝集反応法ｑ手技は簡単であるが被検血清中に存在す
る種々の干渉因子により非特異的凝集が起りうろことが
知られている。さらに、ラジオイムノアッセイ法では泥
量的測定も可能であるが、ラジオアイソトープを使用す
るため罠特別の設備を要するなど、手軽に実施できる方
法ではない。
テックス凝集反応、感作血球凝集反応、ラジオイムノア
ッセイ法などが知られているが、いずれの方法も一長一
短があり、満足すべき方法ではない。たとえば、蛍光抗
体法はスライドグラス上に付着させた核材（抗原）に被
検血清を反応させた後、蛍光色素標識抗ヒトｒ−グロブ
リンを反応させて生成する蛍光染色様式を判定すること
により行うが、自己抗体の種類によって様々の染色像を
呈し、その判定は専門家によらざるを得ない上に、極め
て定性的である。−！た、ラテックス凝集反応、感作血
球凝集反応法ｑ手技は簡単であるが被検血清中に存在す
る種々の干渉因子により非特異的凝集が起りうろことが
知られている。さらに、ラジオイムノアッセイ法では泥
量的測定も可能であるが、ラジオアイソトープを使用す
るため罠特別の設備を要するなど、手軽に実施できる方
法ではない。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明者らは、上記従来技術が有する問題点、即ち、主
観的、定性的である欠点、あるいは非特異的でるる欠点
、さらにはアイソトープを使用しなければならないとい
う欠点等を解決し、定量的で非特異反応の少ないしかも
手技が簡便であシ、通常の検査室で使用できる自己抗体
の測定方法を鋭意研究した結果、本発明を完成した。
観的、定性的である欠点、あるいは非特異的でるる欠点
、さらにはアイソトープを使用しなければならないとい
う欠点等を解決し、定量的で非特異反応の少ないしかも
手技が簡便であシ、通常の検査室で使用できる自己抗体
の測定方法を鋭意研究した結果、本発明を完成した。
（問題点を解決する之めの手段）
すなわち本発明は自己抗体に対応する抗原の１種又は２
棟以上を水不溶性担体に固定化した試薬体）、自己抗体
が属するヒト免疫グロブリンクラスに相当するヒト免疫
グロブリンをヒト以外の動物に免疫して得られる抗ヒト
免疫グロブリン抗体を動物赤血球に結合させてなる抗体
感作赤血球（Ｂ）、緩衝液ｔａｒおよび標準血清（Ｄ）
を含むことを特徴とする免疫学的測定試薬である。
棟以上を水不溶性担体に固定化した試薬体）、自己抗体
が属するヒト免疫グロブリンクラスに相当するヒト免疫
グロブリンをヒト以外の動物に免疫して得られる抗ヒト
免疫グロブリン抗体を動物赤血球に結合させてなる抗体
感作赤血球（Ｂ）、緩衝液ｔａｒおよび標準血清（Ｄ）
を含むことを特徴とする免疫学的測定試薬である。
自己免疫疾患に出現する自己抗体としては、現在までに
多数の自己抗体が知られているが、例を挙げるとりウマ
チ因子、抗咳タンパク抗体、抗ＤＮＡ抗体、抗サイログ
ロブリン抗体、抗ＫＮＡ抗体、抗ばトコンドリア抗体、
抗平滑筋抗体、抗アセチルコリン受容体抗体などである
。これらの自己抗体の測定によシ、全身性エリテマトー
デス（８ＩＪ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、全身性硬
化症（ＰＳＳ）、シエーグレン症候群、橋本病、バセド
ウ病、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）などの診断、鑑別
が可能である。
多数の自己抗体が知られているが、例を挙げるとりウマ
チ因子、抗咳タンパク抗体、抗ＤＮＡ抗体、抗サイログ
ロブリン抗体、抗ＫＮＡ抗体、抗ばトコンドリア抗体、
抗平滑筋抗体、抗アセチルコリン受容体抗体などである
。これらの自己抗体の測定によシ、全身性エリテマトー
デス（８ＩＪ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、全身性硬
化症（ＰＳＳ）、シエーグレン症候群、橋本病、バセド
ウ病、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）などの診断、鑑別
が可能である。
これらの自己抗体に対応する抗原も多穐多彩であるが、
例を挙げると、す９マチ因子に対するヒト変性免疫グロ
ブリン、ウサギ免疫グロブリン；抗ＤＮＡ抗体に対する
２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ ｉ抗ＫＮＡ抗体に対する
ＲＮＰ、Ｓｍなどが挙げられるが、これらは−例であっ
て、本発明に用いる抗原としてはこれらの抗原に限定さ
れるものではない。
例を挙げると、す９マチ因子に対するヒト変性免疫グロ
ブリン、ウサギ免疫グロブリン；抗ＤＮＡ抗体に対する
２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ ｉ抗ＫＮＡ抗体に対する
ＲＮＰ、Ｓｍなどが挙げられるが、これらは−例であっ
て、本発明に用いる抗原としてはこれらの抗原に限定さ
れるものではない。
本発明において抗原を固定化するのに用いる水不溶性担
体としては、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリメチ
、ルメタアクリレートなどのプラスチックの成型品でよ
く、特にこれらの原料で成型されたマイクログレートが
好適である。何故ならばマイクロプレートを用いると、
試薬、試料共に少量で済む上に、感作赤血球を反応させ
た後の肉眼判定が容易であるという利点を有する。さら
に市販の９６穴マイクロプレートを用いると一度に多量
の検体を処理できるという利点も有する。
体としては、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリメチ
、ルメタアクリレートなどのプラスチックの成型品でよ
く、特にこれらの原料で成型されたマイクログレートが
好適である。何故ならばマイクロプレートを用いると、
試薬、試料共に少量で済む上に、感作赤血球を反応させ
た後の肉眼判定が容易であるという利点を有する。さら
に市販の９６穴マイクロプレートを用いると一度に多量
の検体を処理できるという利点も有する。
これらのマイクログレートに抗原を固定化するには、公
知の化学的結合法を用いてもよいが、物理的吸着法で十
分である。物理的吸着法は抗原をＨ 適当な孕←を有する緩衝液に溶解し、その１００〜２０
０μｌ容量をマイクログレートの各穴に分注し、０℃〜
室温に数時間から一夜放置する。抗原はたいてい不安定
であるので２〜８℃、−夜が好適である。
知の化学的結合法を用いてもよいが、物理的吸着法で十
分である。物理的吸着法は抗原をＨ 適当な孕←を有する緩衝液に溶解し、その１００〜２０
０μｌ容量をマイクログレートの各穴に分注し、０℃〜
室温に数時間から一夜放置する。抗原はたいてい不安定
であるので２〜８℃、−夜が好適である。
しかる後、抗原を吸引除去し、必要ならば牛血清アルブ
ミンを適当量含む緩衝液で処理する。牛血清アルブミン
処理は抗原の吸着していない部分をブロックし、非特異
的結合を抑えるのに好適である。このようにして得られ
た抗原結合マイクロプレートは、好ましくは直ちに使用
するのがよいが、２〜８℃に保存すれば１〜２週間は使
用可能である。
ミンを適当量含む緩衝液で処理する。牛血清アルブミン
処理は抗原の吸着していない部分をブロックし、非特異
的結合を抑えるのに好適である。このようにして得られ
た抗原結合マイクロプレートは、好ましくは直ちに使用
するのがよいが、２〜８℃に保存すれば１〜２週間は使
用可能である。
本発明に用いる抗体感作赤血球の製造方法は公知方法で
十分である。たとえば、動物の赤血球、好ましくはヒツ
ジ由来赤血球をホルマリンで固定し、タンニン酸処理を
行った後、リン酸緩衝液などで洗浄する。さらに抗ヒト
ＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒ） ＩｇＡ抗体を
それぞれ、測定しようとする自己抗体のクラス別にもじ
て、前記洗沙済赤血球と接触させ、室温で数時間放置す
る。しかる後再度洗浄し、適当な緩衝液中に浮遊させて
得られる。必要ならば凍結乾燥してもよいし、このよう
にした抗体感作赤血球は長期間安定である。
十分である。たとえば、動物の赤血球、好ましくはヒツ
ジ由来赤血球をホルマリンで固定し、タンニン酸処理を
行った後、リン酸緩衝液などで洗浄する。さらに抗ヒト
ＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒ） ＩｇＡ抗体を
それぞれ、測定しようとする自己抗体のクラス別にもじ
て、前記洗沙済赤血球と接触させ、室温で数時間放置す
る。しかる後再度洗浄し、適当な緩衝液中に浮遊させて
得られる。必要ならば凍結乾燥してもよいし、このよう
にした抗体感作赤血球は長期間安定である。
標準血清とは、リウマチ因子、抗ＤＮＡ抗体などの自己
抗体含有量が定まっている血清でちゃ、国内外の研究施
設より入手可能である。
抗体含有量が定まっている血清でちゃ、国内外の研究施
設より入手可能である。
次にこのようにして得られた抗原結合マイクロプレート
を用いて自己抗体を測定する方法について説明する。
を用いて自己抗体を測定する方法について説明する。
まず、自己抗体の有無を検査しようとする被検血清を緩
衝液ｔｃ＋で適当に希釈する。この緩衝液はたとえばリ
ン酸緩衝液、などが好適である。界面活性剤は非特異的
結合を抑えるのに有効で、トリトンＸ−１００、ツイー
ン２０、Ｂｒ１ｊ ３５などが好適である。被検血清の
希釈倍率は５０〜１００倍が適当である。
衝液ｔｃ＋で適当に希釈する。この緩衝液はたとえばリ
ン酸緩衝液、などが好適である。界面活性剤は非特異的
結合を抑えるのに有効で、トリトンＸ−１００、ツイー
ン２０、Ｂｒ１ｊ ３５などが好適である。被検血清の
希釈倍率は５０〜１００倍が適当である。
ｏ℃〜呈温に数時間から一夜、好ましくは１５℃〜室温
に１〜２時間放置する。この時、自己抗体含有量の判っ
ている標準血清（Ｄｌを被検血清と同様に操作する。
に１〜２時間放置する。この時、自己抗体含有量の判っ
ている標準血清（Ｄｌを被検血清と同様に操作する。
次に前記のように反応させた抗原結合マイクロプレート
（Ａ）から余剰の被検血清標準血清を吸引除去し、洗浄
する。洗浄は水道水でもよいが、生食水、リン酸緩衝食
塩水が好ましい。しかる後、抗体感作赤血球（Ｂｌを反
応させる。このようにして得られた抗体感作赤血球浮遊
液２０〜１００μｌ容量、好ましくは２５〜５０μｌを
前記洗浄後の抗原結合マイクロプレートｃＡ）の各穴に
添加し、０℃〜室温に数時間から一夜、好ましくは１５
℃〜室温に５時間から一夜放置する。この時、５時間以
上の反応は抗体感作赤血球ｔＢ）の結合を安定化するの
に極めて重要である。
（Ａ）から余剰の被検血清標準血清を吸引除去し、洗浄
する。洗浄は水道水でもよいが、生食水、リン酸緩衝食
塩水が好ましい。しかる後、抗体感作赤血球（Ｂｌを反
応させる。このようにして得られた抗体感作赤血球浮遊
液２０〜１００μｌ容量、好ましくは２５〜５０μｌを
前記洗浄後の抗原結合マイクロプレートｃＡ）の各穴に
添加し、０℃〜室温に数時間から一夜、好ましくは１５
℃〜室温に５時間から一夜放置する。この時、５時間以
上の反応は抗体感作赤血球ｔＢ）の結合を安定化するの
に極めて重要である。
反応後、被検血清での抗体感作赤血球ＣＢ＋の結合度合
を肉眼にて、標準血清（Ｄ）でのそれと比較照合し、被
検血清中の自己抗体量を測定する。被検血清中の自己抗
体濃度が高い場合には、標準血清（Ｄｌと同じように、
抗原結合マイクロプレー） （Ａ）の各穴を真上から視
た時、拡がった赤い円輪が見られる。一方、被検血清中
に自己抗体が無い場合には、各穴の中心に赤い小さな点
が見られるのみであり、自己抗体のｓ度が高いほど赤い
円輪の拡がりは大きくなる（第３図ａおよびｂ）。
を肉眼にて、標準血清（Ｄ）でのそれと比較照合し、被
検血清中の自己抗体量を測定する。被検血清中の自己抗
体濃度が高い場合には、標準血清（Ｄｌと同じように、
抗原結合マイクロプレー） （Ａ）の各穴を真上から視
た時、拡がった赤い円輪が見られる。一方、被検血清中
に自己抗体が無い場合には、各穴の中心に赤い小さな点
が見られるのみであり、自己抗体のｓ度が高いほど赤い
円輪の拡がりは大きくなる（第３図ａおよびｂ）。
（作用）
従来の感作血球凝集反応やラテックス凝集反応と本発明
（受身混合凝集反応（Ｍｉｘｅａ ＰａａｓｉｖθＨａ
ｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ、 ＭＰＨＡ） ）とは
原理的に全く異る方法である。即ち（１）従来の感作血
球凝集反応では測定しようとする自己抗体に対応する抗
原を感ラス（工ｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ等が知られている
）に対応して、各々のクラスの免疫グロブリンをヒト以
外の動物に免疫して得られる各々の抗体を感作している
点で全く異なる。
（受身混合凝集反応（Ｍｉｘｅａ ＰａａｓｉｖθＨａ
ｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ、 ＭＰＨＡ） ）とは
原理的に全く異る方法である。即ち（１）従来の感作血
球凝集反応では測定しようとする自己抗体に対応する抗
原を感ラス（工ｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ等が知られている
）に対応して、各々のクラスの免疫グロブリンをヒト以
外の動物に免疫して得られる各々の抗体を感作している
点で全く異なる。
さらに、従来の感作血球凝集反応やラテックス凝集反応
はその検出できる抗体のクラスが殆どＩｇＭに限定され
ている。これに反して本発明では、工ｇＭ、 ＩｇＧお
よび工ｇＡ の各クラスの抗体がそれぞれ対応するクラ
スの抗ヒト免疫グロブリン抗体感作血球を用いることに
より独立に測定し得る点にある。例えばあるリウマチ患
者血清中のりウマチ因子を測定する場合、その血清中の
リウマチ因子は１ｇＭクラスのものが通常、他のクラス
の抗体よりも多量に含まれている。従って感作血球凝集
反応やラテックス凝集反応では最大量の１ｇＭクラスの
もののみを検出し、他のクラスのものは検出されない。
はその検出できる抗体のクラスが殆どＩｇＭに限定され
ている。これに反して本発明では、工ｇＭ、 ＩｇＧお
よび工ｇＡ の各クラスの抗体がそれぞれ対応するクラ
スの抗ヒト免疫グロブリン抗体感作血球を用いることに
より独立に測定し得る点にある。例えばあるリウマチ患
者血清中のりウマチ因子を測定する場合、その血清中の
リウマチ因子は１ｇＭクラスのものが通常、他のクラス
の抗体よりも多量に含まれている。従って感作血球凝集
反応やラテックス凝集反応では最大量の１ｇＭクラスの
もののみを検出し、他のクラスのものは検出されない。
特殊なケースで、１ｇＧクラスのりウマチ因子が１ｇＭ
クラスのものより多量に含まれている場合でも、１ｇＭ
の方が工ｇＧよりもはるかに凝集効率が高いため、こう
したケースでも従来の方法ではＸｇ、Ｍクラスのみを検
出してしまう。
クラスのものより多量に含まれている場合でも、１ｇＭ
の方が工ｇＧよりもはるかに凝集効率が高いため、こう
したケースでも従来の方法ではＸｇ、Ｍクラスのみを検
出してしまう。
従来法と′本発明との違いを図面を用いて説明する。従
来の感作血球凝集反応は第２図に示すように、抗原感作
血球（１）と被検血清とをマイクロプレートのウェル（
３）の中で反応させ、被検血清中に自己抗体（２）が存
在すれば凝集を起すことから自己抗体の有無を判定する
方法である。これに対し、本発明は第１図ａに示すよう
にマイクロプレートのウェル（６）の内壁に抗原（８）
を結合させておき、第１段階で被検血清中の自己抗体（
５）を反応させ、余剰の血清を洗浄して取り去る。この
工程は従来の感作血球凝集反応が有する欠点、即ち被検
血清中に存在する種々の干渉因子により非特異凝集が起
るという欠点を解消するため非常に重要である。何故な
らば、洗浄することによりこのような血清中の種々の干
渉因子を除去することができ、非特異的な反応を起りに
＜〈シているからである。
来の感作血球凝集反応は第２図に示すように、抗原感作
血球（１）と被検血清とをマイクロプレートのウェル（
３）の中で反応させ、被検血清中に自己抗体（２）が存
在すれば凝集を起すことから自己抗体の有無を判定する
方法である。これに対し、本発明は第１図ａに示すよう
にマイクロプレートのウェル（６）の内壁に抗原（８）
を結合させておき、第１段階で被検血清中の自己抗体（
５）を反応させ、余剰の血清を洗浄して取り去る。この
工程は従来の感作血球凝集反応が有する欠点、即ち被検
血清中に存在する種々の干渉因子により非特異凝集が起
るという欠点を解消するため非常に重要である。何故な
らば、洗浄することによりこのような血清中の種々の干
渉因子を除去することができ、非特異的な反応を起りに
＜〈シているからである。
次に、第１図すに示すように本発明で用いる抗体感作血
球（７）を反応させると、自己抗体が存在すれば、その
上にさらに結合し、自己抗体の量に応じて抗体感作血球
（７）の結合量は変化する。この時、自己抗体の童の判
明している標準血清を用いた場合と比較解合することに
より、被検血清中の自己抗体量を測定することができる
。
球（７）を反応させると、自己抗体が存在すれば、その
上にさらに結合し、自己抗体の量に応じて抗体感作血球
（７）の結合量は変化する。この時、自己抗体の童の判
明している標準血清を用いた場合と比較解合することに
より、被検血清中の自己抗体量を測定することができる
。
（実施例）
次に実施例を用いて説明するが、本発明はこれらの実施
例によって限定されるものではない。
例によって限定されるものではない。
櫃潰≠ヰ
実施例Ｉ ＩｇＧ型およびＩｇＭ型リウマチ因子の測
定 ａ） 抗体感作赤血球の調製 ヒツジ赤血球１容に対し、３チホルマリン溶液を８容加
え、４ゝに２４時間反応させた後、冷ホルマリン原液２
容をさらに加え、４℃で２４時間反応させた。しかる後
生食水で洗浄し、生食水中ｌθ％（Ｖｖ）の赤血球浮遊
液とした。次に、等容のｏ、ｏｏｓチタンニン酸溶液を
加え、４℃で１時間振盪した後、リン酸緩衝食塩水（Ｐ
ＢＸ）で洗浄し、１０％（Ｖｖ）となるようＰＢＳに浮
遊させた。
定 ａ） 抗体感作赤血球の調製 ヒツジ赤血球１容に対し、３チホルマリン溶液を８容加
え、４ゝに２４時間反応させた後、冷ホルマリン原液２
容をさらに加え、４℃で２４時間反応させた。しかる後
生食水で洗浄し、生食水中ｌθ％（Ｖｖ）の赤血球浮遊
液とした。次に、等容のｏ、ｏｏｓチタンニン酸溶液を
加え、４℃で１時間振盪した後、リン酸緩衝食塩水（Ｐ
ＢＸ）で洗浄し、１０％（Ｖｖ）となるようＰＢＳに浮
遊させた。
次に、等容の抗ヒトＩｇＧ抗体（カッベル社）２■およ
び抗と） ＩｇＭ抗体（タボ社）２ｒＩ！Ｉｉをそれぞ
れ前記赤血球浮遊液に添加し、４℃で１時間給合させ、
ＰＢＳにてそれぞれを洗沖後、再度１０チ（ｖ／ｖ）と
なるようにＰＢＳに浮遊させ、抗ヒトＩｇＧ抗体および
抗ヒトＩｇＭ抗体感作赤血球とした。
び抗と） ＩｇＭ抗体（タボ社）２ｒＩ！Ｉｉをそれぞ
れ前記赤血球浮遊液に添加し、４℃で１時間給合させ、
ＰＢＳにてそれぞれを洗沖後、再度１０チ（ｖ／ｖ）と
なるようにＰＢＳに浮遊させ、抗ヒトＩｇＧ抗体および
抗ヒトＩｇＭ抗体感作赤血球とした。
血清アルブばン（ＢＢＡ） ５Ｆ、ツイーン２００．１
ノを加えた緩衝液を調製し、ＢＢＡ−ＰＢＳとした。
ノを加えた緩衝液を調製し、ＢＢＡ−ＰＢＳとした。
Ｃ）ＩｇＧ型およびＩｇＭ型リウマチ因子の測定９６穴
マイクロプレート（コースタ−社）の各穴にウサギエｇ
Ｇを５０μｌ／ｍｌとなるようＰＢＳで希釈し、１００
μｌ宛分注し、４℃に一夜放置後、生食水で洗浄し、１
％ＢＡｋ溶液をｉｏｏμｌ宛添加し、室温に１時間放置
し、生食水で洗浄して抗原結合グレートとした。次に慢
性関節リウマチ患者の血清、健康人血清およびＲＡ標準
血清ｉ ＢＳＡ−ＰＢＳで５０倍に希釈し、前記の抗原
結合グレートに１００μｌ宛疹加し、室温に２時間放置
した。各検体血清につき２連で行った。しかる後抗原結
合プレートを生食水で洗浄した。次に各検体２連の内、
一方には抗ヒトＩｇＧ抗体感作赤血球を、他方には抗ヒ
トＩｇＭ抗体感作赤血球をそれぞれ５０μｌ宛添加し、
室温に５時間放置し、肉眼で判定した。判定はＲＡ標準
血清と同程度の赤血球結合度を示す場合をθ棒）とし、
以下結合度が小さい順に（ロ））、（妹←）とした。（
＋）〜（惜）はリウマチ因子陽性とし、←）はりウマチ
因子陰性とした。
マイクロプレート（コースタ−社）の各穴にウサギエｇ
Ｇを５０μｌ／ｍｌとなるようＰＢＳで希釈し、１００
μｌ宛分注し、４℃に一夜放置後、生食水で洗浄し、１
％ＢＡｋ溶液をｉｏｏμｌ宛添加し、室温に１時間放置
し、生食水で洗浄して抗原結合グレートとした。次に慢
性関節リウマチ患者の血清、健康人血清およびＲＡ標準
血清ｉ ＢＳＡ−ＰＢＳで５０倍に希釈し、前記の抗原
結合グレートに１００μｌ宛疹加し、室温に２時間放置
した。各検体血清につき２連で行った。しかる後抗原結
合プレートを生食水で洗浄した。次に各検体２連の内、
一方には抗ヒトＩｇＧ抗体感作赤血球を、他方には抗ヒ
トＩｇＭ抗体感作赤血球をそれぞれ５０μｌ宛添加し、
室温に５時間放置し、肉眼で判定した。判定はＲＡ標準
血清と同程度の赤血球結合度を示す場合をθ棒）とし、
以下結合度が小さい順に（ロ））、（妹←）とした。（
＋）〜（惜）はリウマチ因子陽性とし、←）はりウマチ
因子陰性とした。
第１表に、慢性関節リウマナ患者血清４０例、健康人血
清４０例について、本発明方法でリウマチ因子を測定し
た成績を示した。また第２我には比較例に示した従来法
での測定成績を示した。
清４０例について、本発明方法でリウマチ因子を測定し
た成績を示した。また第２我には比較例に示した従来法
での測定成績を示した。
第２表から明らかなように、従来法では非特異的反応の
影響と思われろ偽陽性、偽陰性例が多いのに対して、本
発明は第１表に示すように、それらが全く認められず、
特異性の筒い方法であることを示している。さらにＩｇ
Ｇ型と１ｇＭ型のりウマチ因子は同時に測定できること
も示されている。
影響と思われろ偽陽性、偽陰性例が多いのに対して、本
発明は第１表に示すように、それらが全く認められず、
特異性の筒い方法であることを示している。さらにＩｇ
Ｇ型と１ｇＭ型のりウマチ因子は同時に測定できること
も示されている。
第２表
実施例２ 抗ＤＮＡ抗体の測定
抗体感作赤血球および緩衝液の調製は実施例１と同様に
行った。
行った。
９６穴マイクロプレート（コースタ−社）の各穴に、２
本鎖ＤＮＡ （シグマ社）を５０μｌ／ｍｌとなるよう
ＰＢＳで希釈し、１００μｌ宛分注し、４℃に一夜放置
した後ＰＢＳで洗浄した。次にｌチＢＳＡを含むＰＢＳ
を１００μｌ宛添加し、室温に１時間放置し、洗浄して
抗原結合プレートとした。
本鎖ＤＮＡ （シグマ社）を５０μｌ／ｍｌとなるよう
ＰＢＳで希釈し、１００μｌ宛分注し、４℃に一夜放置
した後ＰＢＳで洗浄した。次にｌチＢＳＡを含むＰＢＳ
を１００μｌ宛添加し、室温に１時間放置し、洗浄して
抗原結合プレートとした。
このようにして得られた抗原結合グレートの各穴に、全
身性エリテマトーデス（ＳＬＩ！ｉ）の患者血清、健康
人血清およびＳＬＦの標準血清をそれぞれ実施例１で得
た緩衝液にて５０倍に希釈し、１００１ｉ／ 充分注し
、室温で１時間反応させた。反応後ＰＢＳで洗浄し、実
施例１で得た抗ヒトエｇＧ抗体感作赤血球ｉ５０μｌ宛
添加し、室温で５時間反応させ肉眼で判定した。判定は
実施例１と同様にして行った。
身性エリテマトーデス（ＳＬＩ！ｉ）の患者血清、健康
人血清およびＳＬＦの標準血清をそれぞれ実施例１で得
た緩衝液にて５０倍に希釈し、１００１ｉ／ 充分注し
、室温で１時間反応させた。反応後ＰＢＳで洗浄し、実
施例１で得た抗ヒトエｇＧ抗体感作赤血球ｉ５０μｌ宛
添加し、室温で５時間反応させ肉眼で判定した。判定は
実施例１と同様にして行った。
結果は第３表に示すように、ＳＩＪ患者で高率に陽性が
認められ、本発明方法によシ抗ＤＮＡ抗体の測定が可能
であることを示している。
認められ、本発明方法によシ抗ＤＮＡ抗体の測定が可能
であることを示している。
第３表
実施例３ 抗ＫＮＡ抗体の測定
ａ） ＦＪＮＡ［原溶液の調製
ウサギ胸腺アセトン抽出粉末１．５７にＰＢＳを１０Ｍ
ｔ添加し、４１で５時間抽出した。抽出後１０．０００
ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行い、その上清をＦ！ＮＡ
抗原溶液とし次。
ｔ添加し、４１で５時間抽出した。抽出後１０．０００
ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行い、その上清をＦ！ＮＡ
抗原溶液とし次。
ｂ）抗ＫＮＡ抗体の測定
抗体感作赤血球および緩衝液の調製は実施例１と同様に
行った。９６穴マイクロプレート（コースタ−社）の各
穴に、ａ）で得たＫＮＡ抗原溶液２００μグ／ｙｓｌと
なるようＰＢＳで希釈し、１００μｌ宛分注し、４″に
一夜放置した後ＰＢＳで洗浄した。次に１チＢＳＡを含
むＰＢＳをｉｏｏμｌ宛添加し、室温に１時間放置し洗
浄して抗原結合プレートとした。
行った。９６穴マイクロプレート（コースタ−社）の各
穴に、ａ）で得たＫＮＡ抗原溶液２００μグ／ｙｓｌと
なるようＰＢＳで希釈し、１００μｌ宛分注し、４″に
一夜放置した後ＰＢＳで洗浄した。次に１チＢＳＡを含
むＰＢＳをｉｏｏμｌ宛添加し、室温に１時間放置し洗
浄して抗原結合プレートとした。
このようにして得られた抗原結合グレートの各穴に、Ｓ
ＬＥ患者血ｉ４０例、ＭＣ！ＴＤ患者血消ｌＯ例、健康
人血清２０例および標準血清をそれぞれ実施例１で得た
緩衝液で５０倍に希釈し、１００μｌ宛分注し、室温で
１時間反応させた。反応後ＰＢ８で洗浄し、実施例１で
得た抗ヒトエｇＧ抗体感作赤血球を５０μｌ宛添加し、
室温で５時間反応させ、肉眼で判定した。判定は実施例
１と同様にして行った。
ＬＥ患者血ｉ４０例、ＭＣ！ＴＤ患者血消ｌＯ例、健康
人血清２０例および標準血清をそれぞれ実施例１で得た
緩衝液で５０倍に希釈し、１００μｌ宛分注し、室温で
１時間反応させた。反応後ＰＢ８で洗浄し、実施例１で
得た抗ヒトエｇＧ抗体感作赤血球を５０μｌ宛添加し、
室温で５時間反応させ、肉眼で判定した。判定は実施例
１と同様にして行った。
結果は第４表に示すように、ＳＬＥ患者およびＭＣＴＤ
患者で高率に陽性例が認められ、本発明方法による抗Ｋ
ＮＡ抗体の測定が有用であることを示している。
患者で高率に陽性例が認められ、本発明方法による抗Ｋ
ＮＡ抗体の測定が有用であることを示している。
第４表
比較例 感作血球凝集反応法によるリウマチ因子の測定
ａ）感作血球の調製
ヒツジ赤血球１容に対し、３％ホルマリン溶液を８容加
え、４℃に２４時間反応させた後冷ポルマリン原液２容
をさらに加え、４℃で２４時間反応させた。しかる後生
食水で洗浄し、１０％（ｖ４）の浮遊液とし、等容のＯ
，ＯＯ５チタンニン酸浴液を加え、４″で１時間振盪し
た後、生食水で洗浄し、１０％（／ｖ）となるようリン
酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に浮遊きせた。
え、４℃に２４時間反応させた後冷ポルマリン原液２容
をさらに加え、４℃で２４時間反応させた。しかる後生
食水で洗浄し、１０％（ｖ４）の浮遊液とし、等容のＯ
，ＯＯ５チタンニン酸浴液を加え、４″で１時間振盪し
た後、生食水で洗浄し、１０％（／ｖ）となるようリン
酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に浮遊きせた。
一方、ヒト免疫グロブリンを６３℃、２０分間加熱して
調製したヒト加熱変性免疫グロブリン５ηを前記赤血球
浮遊液と等容で混合し、４℃で１時間結合させ、ＰＢＳ
で洗浄し、Ｐ＋度１０％（Ｖ／Ｖ）となるようＰＢＳに
浮遊させ抗原感作血球とした。
調製したヒト加熱変性免疫グロブリン５ηを前記赤血球
浮遊液と等容で混合し、４℃で１時間結合させ、ＰＢＳ
で洗浄し、Ｐ＋度１０％（Ｖ／Ｖ）となるようＰＢＳに
浮遊させ抗原感作血球とした。
ｂ） リウマチ因子の測定
９６穴マイクロプレート（コースタ−社）の各穴に、慢
性関節リウマチ患者の血清および健康人血清を緩衝液で
それぞれ２０倍に希釈し、５０μｌ宛分注した。次に、
ａ）で調製した抗原感作血球全５０μｌ宛添加し、マイ
クログレートハキサーで攪拌し１時間静置して判定した
。判定は凝集の起った場合をリウマチ因子陽性（利、凝
集の起らない場合をリウマチ因子陰性（−）とした。
性関節リウマチ患者の血清および健康人血清を緩衝液で
それぞれ２０倍に希釈し、５０μｌ宛分注した。次に、
ａ）で調製した抗原感作血球全５０μｌ宛添加し、マイ
クログレートハキサーで攪拌し１時間静置して判定した
。判定は凝集の起った場合をリウマチ因子陽性（利、凝
集の起らない場合をリウマチ因子陰性（−）とした。
第１図ａ、ｂは本発明方法による反応原理を模式的に示
しブこ図であり、第２図は従来の感作血球凝集反応法の
反応原理図であや、第３図ａＸｂは本発明方法における
反応像を第１図における矢印方向（真上）から祝た図で
ある。 特許出願人 東洋紡績株式会社 ＄１１ｉｌｌｃＩ 第１１２ ｂ５
自ヒ’Ｘ’ｉｔ俸 ６ ウェル ７ 篇４参裕作に球 ｓ ｗＬ片、 第２１２１ 第３訊Ｑ 自己Ｍ祷１易・１主の４合 ｙＩｈ３凹す 疵わトが私・焉令
しブこ図であり、第２図は従来の感作血球凝集反応法の
反応原理図であや、第３図ａＸｂは本発明方法における
反応像を第１図における矢印方向（真上）から祝た図で
ある。 特許出願人 東洋紡績株式会社 ＄１１ｉｌｌｃＩ 第１１２ ｂ５
自ヒ’Ｘ’ｉｔ俸 ６ ウェル ７ 篇４参裕作に球 ｓ ｗＬ片、 第２１２１ 第３訊Ｑ 自己Ｍ祷１易・１主の４合 ｙＩｈ３凹す 疵わトが私・焉令
Claims (1)
- （１）自己抗体に対応する抗原の１種又は２種以上を水
不溶性担体に固定化した試薬（Ａ）、自己抗体が属する
ヒト免疫グロブリンクラスに相当するヒト免疫グロブリ
ンをヒト以外の動物に免疫して得られる抗ヒト免疫グロ
ブリン抗体を動物赤血球に結合させてなる抗体感作赤血
球（Ｂ）、緩衝液（Ｃ）および標準血清（Ｄ）を含むこ
とを特徴とする免疫学的測定試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5506685A JPS61212763A (ja) | 1985-03-18 | 1985-03-18 | 免疫学的測定試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5506685A JPS61212763A (ja) | 1985-03-18 | 1985-03-18 | 免疫学的測定試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61212763A true JPS61212763A (ja) | 1986-09-20 |
Family
ID=12988315
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5506685A Pending JPS61212763A (ja) | 1985-03-18 | 1985-03-18 | 免疫学的測定試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61212763A (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5994068A (ja) * | 1982-11-20 | 1984-05-30 | Sogo Seibutsu Igaku Kenkyusho:Kk | 血中膵ラ氏島細胞膜抗体のロゼット形成法による検出法 |
| JPS59174760A (ja) * | 1983-03-25 | 1984-10-03 | Teijin Ltd | 膠原病診断用固定化ｅｎａ抗原およびそれを用いた抗ｅｎａ抗体の測定法 |
-
1985
- 1985-03-18 JP JP5506685A patent/JPS61212763A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5994068A (ja) * | 1982-11-20 | 1984-05-30 | Sogo Seibutsu Igaku Kenkyusho:Kk | 血中膵ラ氏島細胞膜抗体のロゼット形成法による検出法 |
| JPS59174760A (ja) * | 1983-03-25 | 1984-10-03 | Teijin Ltd | 膠原病診断用固定化ｅｎａ抗原およびそれを用いた抗ｅｎａ抗体の測定法 |
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