JPS61152278A - Cultivation of microorganism - Google Patents
Cultivation of microorganismInfo
- Publication number
- JPS61152278A JPS61152278A JP59279586A JP27958684A JPS61152278A JP S61152278 A JPS61152278 A JP S61152278A JP 59279586 A JP59279586 A JP 59279586A JP 27958684 A JP27958684 A JP 27958684A JP S61152278 A JPS61152278 A JP S61152278A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- microorganism
- inorganic phosphorus
- medium
- culture
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
技術分野
本発明は、遺伝子工学的手法によって形質転換された微
生物の培養方法に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION Technical Field The present invention relates to a method for culturing microorganisms transformed by genetic engineering techniques.
ざらに具体的には、本発明は、組換えDNA技術によっ
て所望外来性蛋白質を産生ずるJ:うに形質転換された
微生物を、まず、微生物増殖のための培養に付したのち
、ついで蛋白質合成能の誘導を伴う培養に付すことより
なる微生物の培養方法に関するものである。More specifically, the present invention involves the production of a desired foreign protein using recombinant DNA technology. The present invention relates to a method for culturing microorganisms, which comprises culturing with induction of microorganisms.
先行技術
現在、組換えDNA技術によって遺伝子工学的に有用物
質を産生ずる方法が確立されつつあり、具体的な方法に
ついては種々の成書や文献、公開特許公報および特許公
報を参照することができる。Prior art Currently, methods for producing useful substances through genetic engineering using recombinant DNA technology are being established, and for specific methods, various books, documents, published patent publications, and patent publications can be referred to. .
このような手法による物質の産生方法は、通常、所望物
質をコードする遺伝子を組込んで造成したベクターを用
いて微生物を形質転換し、得られた形質転換体を培養し
たのち、所望物質を回収することよりなるものである。This method of producing a substance usually involves transforming a microorganism using a vector created by incorporating a gene encoding the desired substance, culturing the resulting transformant, and then recovering the desired substance. It consists of doing.
ところで、上記方法によって非分泌性の蛋白質の生産を
行う場合、微生物細胞内で産生された蛋白質は宿主菌の
プロテアーゼによって分解(proc 、 Nat
l 、 Δcad 、Sci、USA、79.−
1830−1833 (1982))されるので所望蛋
白質を安定かつ大量に得ることができないという問題点
があった。また、このような非分泌性の蛋白質を回収す
るに際しては宿主微生物を物理的に破壊したのち、所望
蛋白質の分離・精製を行うものであるから、一般にこの
ような回収操作は複雑であり、(のため所望蛋白質の収
率が低かったり、活性を有するものは回収操作中に失活
する恐れもあるという問題点があった。By the way, when non-secreted proteins are produced by the above method, the proteins produced in microbial cells are degraded (proc, Nat) by the protease of the host bacteria.
l, Δcad, Sci, USA, 79. −
1830-1833 (1982)), the desired protein could not be obtained stably and in large quantities. In addition, when recovering such non-secreted proteins, the host microorganism is physically destroyed and then the desired protein is isolated and purified, so such recovery operations are generally complicated. Therefore, there are problems in that the yield of the desired protein is low, and that the active protein may be deactivated during the recovery operation.
そこで、上記問題点に対処ずべく、蛋白質の膜通過に関
与するシグナル配列〔蛋白質・核酸・酵素、26.38
6〜394 (1981))の作用を利用して、宿主微
生物細胞内で産生された蛋白質を細胞外あるいは細胞質
膜外に分泌させる方法が種々提案された(公開特許公報
昭55−19092号、同55−45395号、同5
6−137896号、同56−145221号、同56
−154999号各公報等)。そして最近、本発明者ら
の共同研究者らによってこのような手法を巧みに利用し
た蛋白質の製造方法が提案された(特願昭59−159
703号)く以下、先願発明という)。Therefore, in order to deal with the above problems, we investigated the signal sequences involved in the passage of proteins through membranes [Proteins/Nucleic Acids/Enzymes, 26.38
6-394 (1981)), various methods have been proposed for secreting proteins produced within the host microbial cell to the outside of the cell or the cytoplasmic membrane (Public Patent Publication No. 1981-19092, same). No. 55-45395, same 5
No. 6-137896, No. 56-145221, No. 56
-154999 publications, etc.). Recently, co-researchers of the present inventors have proposed a protein production method that skillfully utilizes such a method (Japanese Patent Application No. 59-159).
No. 703) (hereinafter referred to as the prior invention).
この先願発明の方法の一員体例においては、プラスミド
として、アルカリ性ホスファターゼ由来のプロモーター
およびシグナル配列を具備し、かつ、このシグナル配列
の直後に所望外来性蛋白質をコードする遺伝子の結合が
可能なプラスミドpTA1529を用いている。そして
実際には1)TA1529に外来性蛋白質をコードする
遺伝子〔例えばヒト上皮細胞成長因子(hUG/EGF
o以下単にhUGと記す)〕を組込んでキメラプラスミ
ド(hUGの構造遺伝子を組込んだものpTAi 52
2 )を造成し、このプラスミドを用いて微生物の形質
転換を行っている。従って、このようなプラスミドによ
って形質転換された微生物(以下、形質転換された微生
物を「宿主菌」と、微生物を単に「菌」と記載すること
もある)を培養すると、まず、宿主細胞内で外来性蛋白
質が発現され、ついで、この蛋白質はシグナル配列の作
用で菌体外に分泌される。ここで「菌体外に分泌される
」というのは、宿主菌が大腸菌のようなダラム陰性菌に
おいては、蛋白質が菌体内からペリプラズム(細胞膜と
外股との空間)に移行することを意味し、枯草菌のよう
なダラム陽性菌においては細胞外へ移行することを意味
する。そして、上記先願発明では蛋白質が菌体外に分泌
されるときにシグナル配列は脱酵素シグナル・ベプヂダ
ーゼによって水解されるので、シグナル配列の直後に結
合していた蛋白質が余分なアミノ酸を伴なうことなく完
全な成熟蛋白質として菌体外に分泌される。In one embodiment of the method of the prior invention, plasmid pTA1529 is used, which is equipped with a promoter and signal sequence derived from alkaline phosphatase, and into which a gene encoding a desired foreign protein can be ligated immediately after the signal sequence. I am using it. In reality, 1) TA1529 contains a gene encoding a foreign protein [for example, human epidermal growth factor (hUG/EGF)].
(hereinafter simply referred to as hUG)] to create a chimeric plasmid (incorporating the structural gene of hUG, pTAi 52
2) was constructed, and microorganisms are transformed using this plasmid. Therefore, when a microorganism transformed with such a plasmid (hereinafter, a transformed microorganism may be referred to as a "host microorganism" or simply a "bacterium") is cultured, first of all, inside the host cell, A foreign protein is expressed, and then this protein is secreted outside the bacterial cell under the action of a signal sequence. Here, "secreted outside the bacterial cell" means that in a Durham-negative host bacterium such as E. coli, the protein is transferred from the bacterial cell to the periplasm (the space between the cell membrane and the outer membrane). , in Durham-positive bacteria such as Bacillus subtilis, means that it migrates outside the cell. In addition, in the prior invention mentioned above, when the protein is secreted outside the bacterial cell, the signal sequence is hydrolyzed by deenzyme signal veptidase, so the protein bound immediately after the signal sequence is accompanied by extra amino acids. It is secreted outside the bacterial cell as a complete mature protein without any oxidation.
この先願発明に係る蛋白質の製造方法において、形質転
換された微生物のうちアルカリ性ホスファターゼ由来の
プロモーターを具備するものについては、以下のような
培養方法を採用している。すなわち、この培養方法は、
アルカリ性小スファターゼの合成は高濃度の無機燐存在
下では抑制され、低濃度の無機燐存在下で誘導される事
実[3iochem、 3iophys、 Acta
、 、 38.460(1960)、Nature、
183. 1529(1959))を利用したもので
ある。その−員体例を述べれば、まずhUGの構造遺伝
子が組込まれたpTA1522により形質転換された宿
主微生物E、coli K12C600(1)TA1
522)を20μg/Idのアンピシリンを含むL−培
地〔1%バクトドリブトン、0.5%酵母エキス、0.
5%NaC+、0.1%グルコース)80#11!で前
培養する。ついで、上記前培養した菌を0.64mMの
リン酸二水素カリウムを含む合成培地(上記B ioc
hem、 B 1ophys、Acta 、記載のT
G +’ 20培地)2.4.0に移し、37℃で一夜
振盪培養を行った(以下便宜的に「第一段階」とする)
のち、集菌し、菌体を32μMのリン酸二水素カリウム
を含む上記合成培地に移してさらに37℃で5時間振盪
培養を行う(以下便宜的に「第二段階」とする)という
ものである。ここでTG+20培地とは、グルコース2
’j/fJ。In the method for producing proteins according to the prior invention, the following culture method is adopted for transformed microorganisms that have a promoter derived from alkaline phosphatase. That is, this culture method
The fact that the synthesis of alkaline small sphatase is inhibited in the presence of high concentrations of inorganic phosphorus and induced in the presence of low concentrations of inorganic phosphorus [3iochem, 3iophys, Acta
, , 38.460 (1960), Nature.
183. 1529 (1959)). To give an example of such a member, first, a host microorganism E, coli K12C600 (1) TA1, transformed with pTA1522 into which the structural gene of hUG has been incorporated.
522) in L-medium containing 20 μg/Id ampicillin [1% Bactodributon, 0.5% yeast extract, 0.
5% NaC+, 0.1% glucose) 80#11! Pre-incubate with Next, the pre-cultured bacteria was cultured in a synthetic medium containing 0.64 mM potassium dihydrogen phosphate (the above Bioc
hem, B 1ophys, Acta, T described
G+'20 medium) 2.4.0 and cultured with shaking at 37°C overnight (hereinafter referred to as "first stage" for convenience)
Afterwards, the bacteria were collected, transferred to the above synthetic medium containing 32 μM potassium dihydrogen phosphate, and further cultured with shaking at 37°C for 5 hours (hereinafter referred to as the "second stage" for convenience). be. Here, TG+20 medium refers to glucose 2
'j/fJ.
NaCl 4.68g/、Q、KCl1.49g/j
、NH4Cl 1.09g/、11.Na2SO40
.43g/、Q 、M(I C+295.21rng/
、11 。NaCl 4.68g/, Q, KCl 1.49g/j
, NH4Cl 1.09g/, 11. Na2SO40
.. 43g/, Q, M(IC+295.21rng/
, 11.
CaCl 22.20my/l、FeCl3324、
lI2ug/R、Zn C12272,56uq/fr
、K1−1.、PO487,1my/11および0.
1Mトリス塩酸緩衝液(1)l−17,2)よりなるも
のである。このような培養方法によれば、第一段階で形
質転換された微生物の増殖を行い、ついで第二段階で蛋
白質合成能の誘導を伴う培養を行うことができる。CaCl 22.20 my/l, FeCl3324,
lI2ug/R, Zn C12272,56uq/fr
, K1-1. , PO487, 1 my/11 and 0.
It consists of 1M Tris-HCl buffer (1)l-17,2). According to such a culture method, the transformed microorganism can be propagated in the first step, and then culture can be performed with induction of protein synthesis ability in the second step.
ところで、一般に形質転換された微生物は、その微生物
中に導入されたプラスミドによって負荷をう【プる(
J ournal of GeneralMicrob
iology 。By the way, transformed microorganisms are generally loaded with plasmids introduced into the microorganism.
Journal of General Microb
iology.
118.253−261 (1980))ため、形質転
換されていない微生物に比べ増殖速度が遅く、また、導
入されたプラスミドは脱落しやすく、さらにプラスミド
の1112落した微生物は容易に優先種となることが知
られている(AnnalS of theNew Y
ork Academy of 5cience、 3
69 。118.253-261 (1980)), the growth rate is slower than that of non-transformed microorganisms, and the introduced plasmid is likely to be shed, and microorganisms that have shed the plasmid easily become the preferred species. is known (AnnalS of the New Y
ork Academy of 5science, 3
69.
1−14(1981)、上記J ournal ofG
eneralM icrobiology ) 。この
事実より派生する形質転換された微生物の高濃度培養が
難しいという問題点は、前記先願発明の培養方法によっ
て克服することができたのである。しかしながら、この
方法を工業的な物質の生産に応用する場合は、第一段階
でさらに高濃度培養をする必要がある。1-14 (1981), Journal of G
eneralMicrobiology). The problem of difficulty in cultivating transformed microorganisms at high concentrations resulting from this fact could be overcome by the culture method of the prior invention. However, when this method is applied to the production of industrial substances, it is necessary to culture at a higher concentration in the first step.
また、この方法の第二段階においては、菌を接種後、一
旦は蛋白質合成能の誘導が引き起こされるものの、ざら
に培養を続ける上で菌の生育に必要な無機燐がなくなっ
て、菌体自体を維持することができなくなるので、所望
蛋白質を大組に得ることができないという問題点がある
。In addition, in the second step of this method, after inoculating the bacteria, the protein synthesis ability is induced once, but as the culture continues, the inorganic phosphorus necessary for the growth of the bacteria runs out, and the bacterial cells themselves disappear. There is a problem that the desired protein cannot be obtained in large quantities because the protein cannot be maintained.
発明の概要
要 旨
本発明は上記の点に解決を与えることを目的とし、アル
カリ性ホスファターゼ由来のプロモーターを具備しかつ
所望蛋白質をコードする遺伝子が組込まれたプラスミド
を用いて形質転換された宿主微生物を、まず宿主微生物
の増殖のための培養に付し、・ついで蛋白質合成能の誘
S(実際には宿主菌に保持されているプラスミドのプロ
モーターの作用に誘導がかかる)を伴う培養工程に付す
という二段階の培養方法によりこの目的を達成しようと
いうものである。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention aims to provide a solution to the above-mentioned problems, and aims to provide a solution to the above-mentioned problems by using a host microorganism transformed with a plasmid having a promoter derived from alkaline phosphatase and into which a gene encoding a desired protein has been integrated. First, the host microorganism is cultured for propagation, and then it is subjected to a culture process that induces protein synthesis ability (actually, the action of the promoter of the plasmid held in the host microorganism is induced). The aim is to achieve this goal using a two-step culture method.
従って、本発明ににる微生物の培養方法はアルカリ性ホ
スファターゼ由来のプロモーターを具備するプラスミド
の該プラスミドの制御下に外来性蛋白質をコードする遺
伝子を組込んで造成したキメラプラスミドによって形質
転換した微生物を、まず、蛋白質合成能の誘導が起らず
、かつ、該微生物増殖のために必要な母の無機燐を含有
する培地で培養したのち、ついで無機燐を含有しない培
地に移し、さらにこの培地への無機燐若しくは無機燐を
含有する培地の定速流加を伴う培養に付すこと、を特徴
とするものである。Therefore, the method for culturing a microorganism according to the present invention involves transforming a microorganism with a chimeric plasmid constructed by incorporating a gene encoding a foreign protein under the control of a plasmid having a promoter derived from alkaline phosphatase. First, the microorganism is cultured in a medium that does not induce protein synthesis ability and contains the mother inorganic phosphorus necessary for the growth of the microorganism, and then transferred to a medium that does not contain inorganic phosphorus. It is characterized by being subjected to culture with constant rate feeding of inorganic phosphorus or a medium containing inorganic phosphorus.
効 果
このように本発明の微生物の培養方法は、形質転換され
た微生物の増殖のための培養(以下「第一工程」)と、
つづく蛋白質合成能の誘導を伴いかつ微生物の生育を維
持するための培養(以下「第二工程」)との二つのI
Pi!J:りなるものである。このように培養■稈を二
段階に分けることにより、下記のような効果が得られる
。Effects As described above, the method for culturing microorganisms of the present invention includes culturing for propagation of transformed microorganisms (hereinafter referred to as the "first step");
Next, the two I
Pi! J: That's what happens. By dividing the cultured culm into two stages in this way, the following effects can be obtained.
(1) 形質転換された微生物の高濃度培養が可能であ
る。(1) High concentration culture of transformed microorganisms is possible.
一般に組換えDNA技術において、プラスミドの移入に
よって宿主菌は負荷を受け、また、このように移入され
たプラスミドは不安定で宿主菌から脱落しやすいという
ことが知られており〔前記参照〕、従って、宿主菌を従
来技術のうち二段階に分りることなく培養して所望蛋白
質を産生させるという培養方法では、宿主菌に負荷がか
かってプラスミドの脱落頻度が高くなる。そして、この
ような培養においてはプラスミドの脱落した菌体のほう
が優勢〔前記参照〕となるため、プラスミドを保持した
菌の高濃度培養が難しかった。そこで、前記の本発明者
らの先願発明においては上記問題点に対処すべく、形質
転換体を、まず、宿主菌増殖のための培養(第一段階)
と、蛋白質合成能誘導のための培養(第二段階)とに分
けて培養する方法を利用したのであったが、しかしなが
らこのような方法においても、第一段階では工業的なレ
ベルに見あう程度の宿主菌の高濃度培養が難しかったの
である。In general, in recombinant DNA technology, it is known that host bacteria are loaded by the transfer of plasmids, and that plasmids transferred in this way are unstable and easily fall off from the host bacteria [see above]. In the conventional culture method in which a desired protein is produced by culturing a host bacterium in two steps without dividing, the host bacterium is burdened and the frequency of plasmid shedding increases. In such a culture, bacterial cells from which the plasmid has been shed become dominant (see above), making it difficult to culture the bacteria retaining the plasmid at a high concentration. Therefore, in the prior invention of the present inventors, in order to deal with the above problems, the transformant is first cultured for host bacterial growth (first step).
A method was used in which the culture was divided into two stages: culture for inducing protein synthesis ability (second stage); It was difficult to culture the host bacteria at high concentrations.
本発明による微生物の培養方法は、第一工程で、従来用
いていた培地の組成を変更(たとえば、前記T G −
1−20を後記複合培地(グルコース、トリブl−ン、
酵母エキス、MU So ・71−120゜Kl−I
PO、に2l−IPO4、アンピシリン〕に)づる
ことによってこの問題点を克服し、さらに工業レベルま
での宿主菌の高濃度培養を可能にしたものである。In the method for culturing microorganisms according to the present invention, in the first step, the composition of the conventionally used medium is changed (for example, the above-mentioned T G -
1-20 in a complex medium (glucose, tribune,
Yeast extract, MU So・71-120゜Kl-I
PO, 2l-IPO4, ampicillin] was used to overcome this problem and furthermore enabled high-density culture of host bacteria to an industrial level.
(2) 所望蛋白質を効率よく、かつ、大量に得ること
ができる。(2) A desired protein can be obtained efficiently and in large amounts.
従来は、第二段階においては、培地中の無機燐の吊が実
質的に無いに等しく、−口はプロモーターの作用に誘導
がかかつて蛋白質合成能が誘導されるものの、宿主菌の
成育に支障をぎたし、結局は、所望蛋白質を大量に得る
ことができなかったところ、本発明は第二工程において
無機燐を定期的に供給すること(具体的な方法は後記)
により無機燐の欠乏により生ずるこの問題点を克服して
効率よく蛋白質合成能の誘導を伴う培養方法を確立した
ものであるから、第一工程で高濃度培養を行った宿主菌
をざらに第二工程の培養に付すことによって所望物質を
大量に産生さぜることができる。Conventionally, in the second stage, there was virtually no inorganic phosphorus in the medium, and although protein synthesis ability was induced by the action of the promoter, it hindered the growth of the host bacteria. However, in the end, it was not possible to obtain a large amount of the desired protein, but the present invention involves periodically supplying inorganic phosphorus in the second step (the specific method will be described later).
As a result, we have established a culture method that efficiently induces protein synthesis ability by overcoming this problem caused by the lack of inorganic phosphorus. The desired substance can be produced in large quantities by subjecting it to the culture process.
また、本発明の培養に用いた宿主菌の好ましい具体例は
、シグナル配列を具備するプラスミドであってこのシグ
ナル配列を]−ドする遺伝子の直後に所望外来性蛋白質
をコードする遺伝子の結合を可能にしたもの(前記の本
発明者らの先願発明参照)、によって形質転換された微
生物である。In addition, a preferred specific example of the host bacteria used for the culture of the present invention is a plasmid having a signal sequence, which allows a gene encoding a desired foreign protein to be ligated immediately after the gene encoding the signal sequence. This is a microorganism transformed by a microorganism that has been transformed into a microorganism (see the above-mentioned prior invention of the present inventors).
従って、上記プラスミドが移入された宿主菌を培養すれ
ば外来性蛋白質は前記したようにシグナル配列の作用で
菌体外に分泌される。分泌された蛋白質は、宿主菌がダ
ラム陽性菌の場合は所望蛋白質は培地中に放出され、ま
た、宿主菌がダラム陰性菌の場合は所望蛋白質はペリプ
ラズムに放出され、そしてこのペリプラズムに蓄積した
蛋白質はオスモティックショック法(J、 Biol
。Therefore, when a host bacterium into which the above plasmid has been introduced is cultured, the foreign protein is secreted outside the bacterium by the action of the signal sequence as described above. When the host bacterium is a Durum-positive bacterium, the desired protein is released into the medium, and when the host bacterium is a Durum-negative bacterium, the desired protein is released into the periplasm, and the protein accumulated in the periplasm is released into the periplasm. is the osmotic shock method (J, Biol
.
Chem 、、240.3685 (1965))によ
って容易に菌体外に放出されるところから、蛋白質が放
出された培地ないし溶液はその構成成分が判っているの
で、蛋白質の回収が容易である。Chem, 240.3685 (1965)), the protein can be easily recovered from the culture medium or solution in which the protein has been released, since its constituent components are known.
以上のことから、前記本発明者らの先願発明に係るプラ
スミド(例えばpTA529.pTA1529)を利用
して形質転換された微生物を本発明の方法に従って培養
することにより所望蛋白質を効率よく、かつ、大量に得
ることができる。From the above, by culturing a microorganism transformed using the plasmid (for example, pTA529.pTA1529) according to the prior invention of the present inventors according to the method of the present invention, a desired protein can be efficiently produced and can be obtained in large quantities.
l1図1焦五ll
プラスミド
本発明に用いるプラスミドは、本発明の培養方法が、ア
ルカリ性ホスファターゼが無機燐の存在量により影響を
受けるという事実〔前記31ocheIIl。Plasmid The plasmid used in the present invention is based on the fact that alkaline phosphatase is affected by the amount of inorganic phosphorus present in the culture method of the present invention [see 31 above.
31ophys、 Acta 、 )を利用するもので
あるところから、アルカリ性ホスファターゼ由来のプロ
モーターを具備し、かつ、予定した宿主S胞内で増殖可
能なものであればよい。そして、さらに好ましいものと
しては、シグナル配列の機能(菌体外への蛋白質の分泌
)をも利用したプラスミドがある。31ophys, Acta, ), any promoter may be used as long as it has a promoter derived from alkaline phosphatase and can proliferate within the intended host cell. Even more preferred is a plasmid that also utilizes the function of a signal sequence (secretion of protein outside the bacterial body).
このような好ましいプラスミドの具体例としては、本発
明者らの共同研究者にJ一つて先に提案されたプラスミ
ドpTA529 (特願昭58−140748号)、p
TA1529(特願昭59−159703号)等がある
。これらのプラスミドはいずれもアルカリ性ホスファタ
ーゼ由来のプロモーターおよびシグナル配列を具備する
ものであり、かつ、シグナル配列をコードする遺伝子の
直後に外来性蛋白質をコードする遺伝子の結合が可能な
ものである。ここでpTA1529は、pTA529
(1)YK283 (E、coli K12C600
(pYK283)として微工研に寄託(微■研条寄第5
56号)〕をもとにしてこれを特願昭58−14074
8号の明細書に記載の方法に従って造成したもの)とp
l−181(このプラスミドは、pBR322(E、c
olt K12C600(pBR322)として微■
研に寄託(微工研条奇第235号)〕を制限酵素Eco
R■おJ:び I−l ind III T消化し、こ
のEcoRT−1−lind11部分を下記の合成リン
カ−ど買換したちのく特開昭59−71692号公報参
照))とから造成したものである。このプラスミドの造
成操作の詳細は特願昭59−159703号の明細書を
参照されたい。Specific examples of such preferable plasmids include plasmids pTA529 (Japanese Patent Application No. 140,748/1982), which was previously proposed by the joint researchers of the present inventors.
There are TA1529 (Japanese Patent Application No. 59-159703), etc. All of these plasmids are equipped with a promoter and signal sequence derived from alkaline phosphatase, and a gene encoding a foreign protein can be ligated immediately after the gene encoding the signal sequence. Here, pTA1529 is pTA529
(1) YK283 (E, coli K12C600
Deposited as (pYK283) at the Microtechnical Research Institute.
No. 56)], this was filed in patent application No. 58-14074.
(produced according to the method described in the specification of No. 8) and p
l-181 (this plasmid is pBR322(E, c
As olt K12C600 (pBR322)
Deposited with the Institute of Microtechnology (Feikoken Article No. 235)] was added to the restriction enzyme Eco
The EcoRT-1-lind11 portion was created from the following synthetic linker (see Japanese Patent Application Laid-open No. 71692/1983). It is something. For details of the procedure for constructing this plasmid, please refer to the specification of Japanese Patent Application No. 59-159703.
EcoRT l−1paI SmaT 1−
ItndI[[形質転換体
微生物の形質転換は、組換えDNA技術の分野におりる
公知の常法に従って行うことができる。EcoRT l-1paI SmaT 1-
ItndI[[Transformant microorganisms can be transformed according to conventional methods known in the field of recombinant DNA technology.
例えば、上記プラスミドに所望外来性蛋白質の構造遺伝
子を組込んでキメラプラスミドどし、これを用いて微生
物を公知の方法(例えばクシゴナ−法(Genettc
Engineerin(1,1978,17(19
78)))に従って形質転換したのち、所望の形質転換
体を取得(通常はプラスミドのマーカーを利用する)′
?lる合目的的な任意の方法によって行うことができる
。For example, a structural gene of a desired foreign protein is incorporated into the above-mentioned plasmid to create a chimeric plasmid, and this is used to culture microorganisms using known methods (for example, the Kushigona method (Genettc method)).
Engineerin (1, 1978, 17 (19
After transformation according to 78))), the desired transformant is obtained (usually using a plasmid marker)'
? This can be done by any convenient method.
このようにして形質転換しうる微生物は、その菌体内で
上記プラスミドが増殖し得るものであればよく、具体的
には大腸菌、酵母菌、枯草菌等がある。なかでも大腸菌
に12株が比較的よく利用されており、本発明の実施例
においてその変異株E、coli K12YK537
(微工研菌寄第7941号)を使用している。Microorganisms that can be transformed in this way may be any microorganisms as long as the above-mentioned plasmid can propagate within their cells, and specific examples thereof include Escherichia coli, yeast, and Bacillus subtilis. Among them, 12 strains of E. coli are relatively commonly used, and in the examples of the present invention, the mutant strain E, coli K12YK537
(Feikoken Bibori No. 7941) is used.
なお、上記プラスミドに組込む所望外来性蛋白質の構造
遺伝子としては、ホルモン、免疫関連物質、神経ペプチ
ドおJ:び酵素等のものが考えられる。これらの構造遺
伝子の調製方法としては、天然の染色体DNAより取得
する方法や、あるいは人工的に合成する方法等が考えら
れ、実際の構造遺伝子の調製方法については種々の底置
や文献を参照することができる(前記先願発明等)。The structural genes of the desired foreign proteins to be incorporated into the above-mentioned plasmids include hormones, immune-related substances, neuropeptides, enzymes, and the like. Methods for preparing these structural genes include methods for obtaining them from natural chromosomal DNA and methods for artificially synthesizing them.For actual methods for preparing structural genes, refer to various bases and literature. (The above-mentioned prior invention, etc.)
本発明において使用したこのような形質転換体は、プラ
スミドpTΔ1529(前記)に人工的に合成したhU
Gの構造遺伝子を絹込んでキメラプラスミドpTΔ15
22を造成し、ついでこれを用いてE、coli K
12YK537をクシュチー法により形質転換して4%
l’cものである(「。Such a transformant used in the present invention contains hU artificially synthesized in plasmid pTΔ1529 (described above).
Chimeric plasmid pTΔ15 containing the structural gene of G
22 and then use this to infect E and coli K.
12YK537 was transformed by Kushchi method and 4%
It's something like that (".
coli K12YK537(pTA1522))。coli K12YK537 (pTA1522)).
なお、形質転換体の造成操1作の詳細は後記参考例を参
照されたい。For details of the procedure for creating a transformant, please refer to the reference examples described below.
微生物の培養
本発明による培養は、アルカリ性ホスファターゼ由来の
プロモーターを具備するプラスミドで形質転換した微生
物を対象とするものであり、そして本発明の培養方法の
特徴は、形質転換された微生物が保持しているプラスミ
ドの性質(無機燐量に依存して蛋白質合成能に誘導がか
かったり、かからなかったりする〔前記3 ioche
m、 B 1ophys。Cultivation of Microorganisms The cultivation according to the present invention targets microorganisms transformed with a plasmid having a promoter derived from alkaline phosphatase, and the characteristics of the culture method of the present invention are that The properties of the plasmid (the protein synthesis ability may or may not be induced depending on the amount of inorganic phosphorus [see 3 above)
m, B1ophys.
Acta 、 、 Nature )を巧みに利用して
、形質転換された微生物を、まず蛋白質合成能の誘導(
プラスミドのプロモーターの作用の誘導)を伴わずに微
生物の増殖のみのための培養に付したのち、ついで蛋白
質合成能の誘導を伴いかつ微生物の生育を維持するため
の培養に付すという二つの培養工程よりなるということ
である。The transformed microorganism is first induced to have protein synthesis ability (Acta, Nature).
Two culture steps: first, culturing for the purpose of propagating the microorganism without inducing the action of the plasmid's promoter, and then culturing for the purpose of inducing protein synthesis ability and maintaining the growth of the microorganism. It means that it becomes more.
このような培養方法の詳細は、下記の通りである。Details of such a culture method are as follows.
1)培養方法
本発明による微生物の培養方法は、まず形質転換された
微生物を単細胞純粋分離培養し、ついで前培養に付した
のち(以上は微生物を培養する場合の公知の常法であり
、多数の文献や底置を参照することができる。例えば、
底置「微生物学実験法」 (講談社刊)、「微生物実験
法」 (共立出版刊)、「細菌学実習提要」 (丸善刊
)等がある。)微生物増殖のための培養(第一工程)に
続き、蛋白質合成能の誘導を伴う培養にイ]1−こと(
第二工程)よりなるものである。また、第一工程および
第二工程はともに通気撹拌培養の範崎に属するものであ
って、具体的には、培°養系において菌を接種したのち
培地に無菌空気(必要に応じて純酸素を混入したもの)
を導入し、これを物理的に撹拌しつつ、pH,温度、溶
存酸素濃度等を、培養する微生物の生育条件に適合させ
て好適な条件下に維持しながら培養を行うことからなる
。1) Cultivation method The method for culturing microorganisms according to the present invention involves first culturing a transformed microorganism in single-cell pure isolation, and then subjecting it to preculture (the above is a well-known conventional method for culturing microorganisms; You can refer to the literature and bottom position of
These include Sokoki's ``Microbiology Experimental Methods'' (published by Kodansha), ``Microbial Experimental Methods'' (published by Kyoritsu Shuppan), and ``Bacteriology Practice Recommendations'' (published by Maruzen). ) Following the culture for microbial growth (first step), culture with induction of protein synthesis ability is performed.
(second step). In addition, both the first and second steps belong to the aerated agitation culture, and specifically, after inoculating bacteria in the culture system, the culture medium is filled with sterile air (pure oxygen if necessary). (mixed with)
The microorganism is introduced into the microorganism, and the microorganism is physically stirred while the pH, temperature, dissolved oxygen concentration, etc. are maintained under suitable conditions to suit the growth conditions of the microorganism to be cultured.
このような培養は通常はジャーファーメンタ−を用いて
、行われ、そして適当なスケールアップが可能であるこ
とはいうまでもない〔載置「生物化学工学」 (上)、
(下)巻(東京大学出版会)参照〕。Such cultivation is usually carried out using a jar fermenter, and it goes without saying that appropriate scale-up is possible [see "Biochemical Engineering" (top),
(See Volume 2 (University of Tokyo Press)).
2)培 地
本発明の第一工程おJ:び第二工程の培地は、下記で説
明されるものである。2) Culture medium The culture medium used in the first and second steps of the present invention is as described below.
第一工程: この工程は、蛋白質合成能の誘導が起らず
に微生物の増殖を効率J:<行わせることを目的とする
ものである。従って、本発明の方法においてこのような
目的を達成させるには、培地どしてL B培地(トリジ
1〜ン、酵母エキス、NaCl)を基本培地とし、必要
に応じて他の成分を添加し、さらに蛋白質合成能の誘導
を抑制するために必要な是の無機燐を添加することによ
り調整したものを用いればよい。無機燐は燐酸塩として
添加することがふつうであって、具体的には例えば緩衝
効果を考えてKH2PO4とに2l−IPO4とを適量
組合せて用いる方法がある。First step: The purpose of this step is to allow microorganisms to grow efficiently without inducing protein synthesis ability. Therefore, in order to achieve this purpose in the method of the present invention, the basic medium is LB medium (tridine, yeast extract, NaCl), and other components are added as necessary. , and further prepared by adding inorganic phosphorus necessary for suppressing induction of protein synthesis ability. Inorganic phosphorus is usually added as a phosphate, and specifically, for example, there is a method in which a suitable amount of 2l-IPO4 is used in combination with KH2PO4 in consideration of the buffering effect.
このような培地の一具体例として本発明では、形質転換
体E、 coli K 12YK537 (pTA
1522)(後記〕の培地として、グルコース、トリプ
トン、MlエキスおよびM(Iso ・71−10に
、K+−12PO4およびに2 HPO4を添加したも
のを用いている。また、さらに本発明の一員体例では宿
主菌を安定に成育させるため、この培地にアンピシリン
を添加している。というのは、本発明の一員体例で宿主
菌に移入されたプラスミドはアンピシリン耐性の遺伝子
を具備するものなので宿主もアンピシリン耐性であり、
従って、培養中にプラスミドの脱落した菌(アンピシリ
ン感受性である)は培地中のアンピシリンによって成育
が抑制されるので、形質転換されたものであって該プラ
スミドが保持されている菌体のみが、生育することにな
るからである。このように培地への抗生物質の添加は、
宿主菌の生育上の便宜を図るための一手段である。なお
、本発明において上記目的を達成し得る無機燐の添加量
としては、無機燐として110OR,l〜2g/、11
の範囲が考えられる。本発明の一興体例では無機燐とし
て1.7g/、11になるように添加している。As a specific example of such a medium, the present invention uses transformant E, coli K12YK537 (pTA
1522) (described below), glucose, tryptone, Ml extract and M (Iso 71-10) to which K+-12PO4 and 2HPO4 were added. In order to stably grow the host bacteria, ampicillin is added to this medium.This is because the plasmid transferred to the host bacteria in the member example of the present invention is equipped with an ampicillin-resistant gene, so the host is also resistant to ampicillin. and
Therefore, the growth of bacteria that shed plasmids during culture (which are sensitive to ampicillin) is inhibited by ampicillin in the medium, so only transformed bacteria that retain the plasmid can grow. This is because you will have to do so. Thus, the addition of antibiotics to the culture medium
This is a means for facilitating the growth of host bacteria. In addition, in the present invention, the amount of inorganic phosphorus added that can achieve the above object is 110 OR, l to 2 g/, 11
A range of possible ranges is possible. In one example of the present invention, inorganic phosphorus is added in an amount of 1.7 g/11.
第二工程: この工程は、宿主微生物中に移入されたプ
ラスミドのプロモーターの作用の誘導(蛋白質合成能の
誘導)を伴い、かつ、第一工程で増殖させた微生物の生
育の維持のための培養である。プラスミドのプロモータ
ーの作用の誘導は、プロモーターがアルカリ性ホスファ
ターゼ由来のものなので、無機燐欠乏条件下で起こる〔
前記B iohem 、 31ophys、 Acta
、、 Nature )。Second step: This step involves inducing the action of the promoter of the plasmid transferred into the host microorganism (induction of protein synthesis ability), and culturing to maintain the growth of the microorganism grown in the first step. It is. Induction of the action of the plasmid promoter occurs under inorganic phosphorus-deficient conditions, since the promoter is derived from alkaline phosphatase.
Said Biohem, 31ophys, Acta
,, Nature).
また、微生物の生育を維持していくためには無機燐が必
要である。従って、上記の条件を満足させる具体的な方
法は、第一工程で増殖させた微生物を、まず、無機燐を
含まない培地(通常は合成培地を用いる)に接種しくこ
の段階で蛋白質の合成能が誘導される)、ついでこの培
地に無機燐若しくは無機燐を一定量を含む培地(本発明
の一具体例では、このような培地として複合培地を用い
ている)の定速流加を伴うものである(この操作で無機
燐が供給されるので菌の成育が維持される)。Additionally, inorganic phosphorus is necessary to maintain the growth of microorganisms. Therefore, the specific method to satisfy the above conditions is to first inoculate the microorganisms grown in the first step into a medium (usually a synthetic medium) that does not contain inorganic phosphorus, and at this stage, the microorganisms grown in the first step are inoculated into a medium that does not contain inorganic phosphorus. is induced), followed by constant-rate addition of inorganic phosphorus or a medium containing a certain amount of inorganic phosphorus (in one embodiment of the present invention, a complex medium is used as such a medium). (This operation supplies inorganic phosphorus, which maintains the growth of the bacteria).
第二工程における無機燐を含まない培地としては、M−
,9培地、ディビス(Davis)培地、TG+20培
地等(いずれも合成培地)の培地組成を基本培地として
これから無機燐を除去した組成のもの、を用いることが
できる。本発明の無機燐を含有しない培地の一具体例は
、グルコース、Na Cl、KCI、N1−I C1
,Na2SO4。The medium that does not contain inorganic phosphorus in the second step is M-
, 9 medium, Davis medium, TG+20 medium, etc. (all synthetic media) can be used as a basic medium, and a composition obtained by removing inorganic phosphorus from this medium can be used. One specific example of the inorganic phosphorus-free medium of the present invention is glucose, Na Cl, KCI, N1-I C1
, Na2SO4.
MOCI 、CaCl 、FeCl3゜ZnC12
およびトリス塩酸緩衝液からなる組成のものであり、さ
らに宿主微生物の栄養要求性のためにロイシンおよびチ
アミンを添加し、第一工程と同様の目的でアンピシリン
を添加したものである。MOCI, CaCl, FeCl3゜ZnC12
and Tris-HCl buffer, to which leucine and thiamin are added for nutritional requirements of host microorganisms, and ampicillin is added for the same purpose as in the first step.
また、本発明において、形質転換された微生物の維持に
必要な優の無機燐の補充は、無機燐または所要量の無機
燐を含む、培地の定速流加によって行うものである。こ
のような培地としてはトリプトンおよび酵母エキスより
なる複合培地がある。Furthermore, in the present invention, supplementation of the essential inorganic phosphorus necessary for maintaining the transformed microorganism is carried out by constant-rate feeding of a medium containing inorganic phosphorus or a required amount of inorganic phosphorus. Such a medium includes a complex medium consisting of tryptone and yeast extract.
この際の無機燐の定速流加速度は、菌濃度、培養液量、
トリプ]〜ンおにび酵母エギスの濃度により異なるが、
菌濃度として0D66oが5〜50.培養液量2β、ト
リプトン50g/、0.酵母エキスψ
2511の場合、定速流加速度として0.8me/分か
ら27/分の間が実用的である。本発明では、4d/分
または8d/分としている。At this time, the constant flow acceleration of inorganic phosphorus is determined by the concentration of bacteria, the amount of culture solution,
It varies depending on the concentration of the onibi yeast egisu,
0D66o is 5 to 50. Culture solution volume 2β, tryptone 50g/, 0. In the case of yeast extract ψ 2511, a constant flow acceleration of between 0.8 me/min and 27/min is practical. In the present invention, it is set to 4 d/min or 8 d/min.
ここで本発明において、「合成培地」とは化学的に組成
の知られている物質よりなる培地を意味し、「複合培地
」 (天然培地)とは、天然物質すなわち動植物体から
得た化学組成の明確でないものよりなるものを意味する
。In the present invention, the term "synthetic medium" refers to a medium made of substances with chemically known compositions, and the term "complex medium" (natural medium) refers to natural substances, i.e. chemical compositions obtained from plants and animals. It means something consisting of something that is not clear.
3)培養条件
(1)培養温度
第一工程の培養温度は、用いる微生物の増殖に適した温
度であればよい。通常用いる大腸菌および本発明に使用
した大腸菌の場合は、37℃が好適である。3) Culture conditions (1) Culture temperature The culture temperature in the first step may be any temperature suitable for the growth of the microorganisms used. In the case of commonly used E. coli and E. coli used in the present invention, 37°C is suitable.
第二工程の培養温度は、微生物の生育が維持でき(例え
ば25℃〜40℃)、かつ形質転換された微生物によっ
て産生された産物が安定である温度であればよい。その
ような温度として本発明のようなhUGを産生させる場
合は30℃が好ましい。The culture temperature in the second step may be any temperature at which growth of the microorganism can be maintained (for example, 25° C. to 40° C.) and at which the product produced by the transformed microorganism is stable. Such a temperature is preferably 30° C. when producing hUG as in the present invention.
(2)培養時間
第一工程では、菌体量が最大となるまで培養を行うこと
がふつうである。本発明の一興体例の場合は、第一工程
に菌を接種後約8.5時間で菌体量が最大となった。な
お、本工程においては、0D66oを微生物生育の指標
としこれを経時的に測定することによって培養時間を決
めるのが便利である。(2) Culture time In the first step, culture is usually carried out until the amount of bacterial cells reaches the maximum. In the case of the present invention, the amount of bacterial cells reached the maximum approximately 8.5 hours after inoculating the bacteria in the first step. In this step, it is convenient to determine the culture time by using 0D66o as an index of microbial growth and measuring it over time.
第二工程の培養時間は、経時的に培地中のグルコース量
、0D66o1生菌数および無機燐の量、また、宿主菌
体内での所望物質の産生量を指標として検討ずればよく
、本発明の一具体例の場合はhUGの産生量が最大とな
る約11〜13時間を好適な培養時間としている。なお
、グルコースの定量はグルコースオキシダーゼ法にュー
グルコスタット「フジサワ」のキットを利用。)に従っ
て行い、生菌数はアンピシリンを含むL−培地(前記)
の寒天上に生育するコロニーを計測することにより、無
機燐の定量は、モリブデンブルー法〔工場排水試験方法
:JIS K 0102)に従って行い、また産物
(hUG)の定量は、菌体をオスモディック・ショック
法(J、 Biol 。The culturing time in the second step may be determined using the amount of glucose, the number of viable 0D66o1 bacteria, and the amount of inorganic phosphorus in the medium over time, as well as the amount of production of the desired substance within the host microbial cells, as indicators. In one specific example, the preferred culture time is approximately 11 to 13 hours, at which time the amount of hUG produced is at its maximum. In addition, the glucose oxidase method was used to quantify glucose using the euglucostat ``Fujisawa'' kit. ), and the number of viable bacteria was determined using L-medium containing ampicillin (described above).
Inorganic phosphorus was quantified by counting colonies growing on agar according to the molybdenum blue method [industrial wastewater test method: JIS K 0102], and the product (hUG) was quantified by osmodic microorganisms. Shock method (J, Biol.
Chem 、、240.3685 (1965))によ
って処理後、この溶液を遠心して上清を得、ついで上清
をラジオリセブターアッセイ(RRA)法(J、 Bi
ol ’、 Chem 、 、 257.3053(1
982))によって分析する(hUG定量の詳細は後記
参考例および特願昭59−159703の明細書参照)
ことにより行っている。Chem, 240.3685 (1965)), the solution was centrifuged to obtain a supernatant, which was then subjected to the radioreceptor assay (RRA) method (J, Bi
ol', Chem, , 257.3053 (1
982)) (For details of hUG quantification, refer to the reference examples below and the specification of Japanese Patent Application No. 159703/1983)
This is done by doing this.
(3)培地のpl−1
1)Hは微生物の生育可能な範囲であればよく、用いら
れる微生物によって適宜好ましいp l−1を設定すれ
ばよい。本発明では大腸菌を用いているが、大腸菌の生
育可能なl)Hは通常4.6〜8.8であり、このうち
pl−(7,0〜8.0の間が特に好ましい。(3) Pl-1 of the culture medium 1) H may be within a range in which microorganisms can grow, and a preferable pl-1 may be appropriately set depending on the microorganism used. In the present invention, Escherichia coli is used, and the l)H at which Escherichia coli can grow is usually 4.6 to 8.8, with pl-(7.0 to 8.0 being particularly preferred).
(4)消泡剤
培養中発泡の著しいときは、消泡剤(高級アルコール、
植物油等)を添加するのが常套手段である。本発明の場
合において用いる消泡剤は無機燐の存在量によって微生
物の蛋白質合成能を制御するのであるから、無機燐を含
有しないものであることが肝要である。そのような消泡
剤の具体例としては、アンチホーム−AF−エマルジョ
ン(牛丼化学)がある。(4) Antifoaming agent If foaming is significant during culturing, use an antifoaming agent (higher alcohol,
It is a common practice to add vegetable oil, etc.). Since the antifoaming agent used in the present invention controls the protein synthesis ability of microorganisms depending on the amount of inorganic phosphorus present, it is important that it does not contain inorganic phosphorus. A specific example of such an antifoaming agent is Antifoam-AF-Emulsion (Gyudon Kagaku).
(5)溶存酸素(DO>
溶存酸素とは、液相中に溶解している分子状酸素のこと
をいう。(5) Dissolved Oxygen (DO> Dissolved oxygen refers to molecular oxygen dissolved in a liquid phase.
一般に通気撹拌培養に際しては、Doが過多の場合は微
生物の増殖は阻害され、一方Doがlppm以下になっ
ても同様に増殖が阻害されるということが知られている
。従って、DOfflを微生物生育の阻害因子とならな
いように制御することが好ましい。本発明の一具体例の
場合はDoシコンロール装置(オリエンタル電気(■F
C−4型〕によりDOitを41)111IIに保持し
ている。It is generally known that in aerated agitation culture, if Do is excessive, the growth of microorganisms is inhibited, while if Do is less than 1 ppm, growth is similarly inhibited. Therefore, it is preferable to control DOffl so that it does not become an inhibitory factor for microbial growth. In the case of a specific example of the present invention, a Dosicon roll device (Oriental Electric (■F
C-4 type] holds DOit at 41) 111II.
実 験 例
参考例 1
下記の方法に従って、形質転換体F、C01i K1
2YK537 (pTA1522)を造成した。Experimental Example Reference Example 1 According to the following method, transformants F, C01i K1
2YK537 (pTA1522) was constructed.
pTA1529(造成の詳細は特願昭59−15970
3 号+7) 明@ 書参照) 5 μg ヲ、50μ
ρの緩衝液〔10mMトリス−塩酸M笥液(以下T−r
is −1−ICI ) (+)l−17,5) 1.
10mMM!7C12,50mM NaC1)中で4
単位の制限酵素Hind11[(タノJう〕 (以下!
−1indll)を用いて37℃で1時間加水分解した
。ついで、エタノール沈殿を行い、得られた沈殿物を、
30μ(の反応液(67mM Tris −1−IC
I 。pTA1529 (details of construction are in patent application No. 59-15970)
No. 3 + 7) 5 μg, 50μ
ρ buffer [10mM Tris-HCl solution (hereinafter referred to as T-r)
is -1-ICI) (+)l-17,5) 1.
10mMM! 4 in 7C12, 50mM NaCl)
Unit of restriction enzyme Hind11 [(Tano J) (below!
-1indll) at 37°C for 1 hour. Then, ethanol precipitation was performed, and the resulting precipitate was
Reaction solution (67mM Tris-1-IC
I.
(pH8,8)、16.6mM硫酸アンモニウム(以下
<N’H,)2SO4) 、6.7mMエチレンジアミ
ン四酢酸酢酸塩下EDTA) 、0.66mMずつのd
ATP、dCTP、dGTP、TTP〕中で1単位の7
4−DNAポリメラーゼを用いて、37℃で15分間処
理した。ついで、エタノール沈殿にJ:つで得られた沈
殿物を、50μpの反応液(6mM Tris −H
Cl (1)H8,0)、6mM MoCI2,15
0mM NaC1)中で4単位の制限酵素3alI(
タカラ〕 (以下、5alIと記す)を用いて37℃で
1時間加水分解した。反応終了後、アガロースゲル電気
泳動によって、3900bpのDNA断片(第1図中■
)を ’tFJ1こ 。(pH 8,8), 16.6mM ammonium sulfate (<N'H,)2SO4), 6.7mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.66mM each d
1 unit of 7 in ATP, dCTP, dGTP, TTP]
The cells were treated with 4-DNA polymerase at 37°C for 15 minutes. Next, the precipitate obtained in J: was added to 50μp of reaction solution (6mM Tris-H) for ethanol precipitation.
Cl(1)H8,0), 6mM MoCI2,15
4 units of restriction enzyme 3alI (0mM NaCl)
Takara] (hereinafter referred to as 5alI) at 37° C. for 1 hour. After the reaction, a 3900 bp DNA fragment (indicated by
) 'tFJ1ko.
プラスミド1)BR321−hU’G (pBR322
(E、 coliK12c600 (ρ BR3
22>として寄託済み〈微工研条寄第235号〉)をE
C0RIおよび3al工で消化したものに人工的に合成
したhUG構造遺伝子をEC0RIおよび5alIで消
化した断片を組みこんだもの〕5μqを、50μカの反
応液(100mM Tris−l−IC’l (pH
7,5)、50mM Na Cl。Plasmid 1) BR321-hU'G (pBR322
(E, coliK12c600 (ρ BR3
22>, deposited as <Feikoken Article No. 235>).
5 μq of the artificially synthesized hUG structural gene digested with EC0RI and 5al was combined with 50 μq of the reaction solution (100 mM Tris-l-IC'l (pH
7,5), 50mM NaCl.
50mM MgCI 2 )中で4単位の制限酵素E
coRI (タカラ〕を用いて37℃で1時間加水分解
したのち、上記と同様にT 4. D N Aポリメラ
ーゼ処理を行い、さらに5alI処理を行ったのち、ア
ガロースゲル電気泳動によって160− 27 =
bpのDNA断片(第1図中■)を得た。4 units of restriction enzyme E in 50mM MgCI2)
After hydrolysis at 37°C for 1 hour using coRI (Takara), T4. A DNA fragment (■ in Figure 1) was obtained.
上記で調製した二つのDNA断片(第1図中■および■
)を、30μρの反応液(20mMTris−1−1c
I (1)I−17,5>、10mMM(l CI
、10mM DTT、0.5mMATP)中で300
単位のT、、DNAリガーゼ〔タカラ〕を用いて14℃
で16時間反応させた。The two DNA fragments prepared above (■ and ■ in Figure 1)
), 30μρ reaction solution (20mM Tris-1-1c
I (1)I-17,5>, 10mM(l CI
, 10mM DTT, 0.5mM ATP).
Unit T, 14℃ using DNA ligase [Takara]
The reaction was carried out for 16 hours.
反応終了後、これで大腸菌に12YK537を形質転換
させ、目的のプラスミド〔以下、pTA1522)(第
1図中■)を含有する形質転換株CF、coli K
12YK537(pTA1522)〕を得た。After the reaction is completed, E. coli is transformed with 12YK537, and the transformed strain CF, coli K, containing the target plasmid [hereinafter referred to as pTA1522] (■ in Figure 1) is obtained.
12YK537 (pTA1522)] was obtained.
実施例 1
形質転換体F、colt Kl 2YK537 (p
TA 15’ 22 )を以下の方法に従って培養した
。Example 1 Transformant F, colt Kl 2YK537 (p
TA 15' 22 ) was cultured according to the following method.
E、coli K12YK537(pTA1522)
を複合培地(トリ11210g/41.酵母エキス5
g /fJ 、 K トI Po
2 g /J)、、K 2 HPO47
g/fJ、アンピシリン20〜#)100dを含む50
0〆容の坂ロコルベンで37℃で一夜振一 28 −
緩培養した(前培養)。E. coli K12YK537 (pTA1522)
complex medium (bird 11210g/41.yeast extract 5
g/fJ, K toI Po
2 g/J), K 2 HPO47
g/fJ, ampicillin 20~#) 50 containing 100d
28 - Slow culture was performed overnight at 37°C in 0.0 volume of Sakalocolben (preculture).
ついで、この培養液10mをとり、複合培地(グルコー
スICI/、11.トリプトン10g/、o、酵母エキ
ス5g/Jl 、Mg80 ・7H200、!M/、
11 XK1−12PO42w/E 、に2 HPO4
’7y/J 、アンピシリン20my/fJ ) 2’
、I)に接種したのち3.ll容の小型通気撹拌培養装
置(ミニジャーファーメンタ−)中で培養した。培養温
度は37℃、通気量は0 、5 VVm (l VV
IIIは1volume−volume−minute
のことで、1分間あたり培養液1.0に対して1.ll
の空気が導入されることを意味する)、pHは4N
Na 0f−1,4Nl−IC’lで7.2に調製して
おき、溶存酸素(DO)濃度はDoコントロール装置に
より撹拌速度を変化させて41)l1m付近に保持した
。培養は、菌体量が最大(OD66o“−114)とな
るまで行った(菌を接種後約8.5時間)〔第一工程〕
。ついで、この培養液の半量(1()を取り出したのち
、遠心分離により集菌後、菌体を約500mf!の溶液
(NaC14,68g/fJ、KCI 1.49q/
41 、N1−14CI 3g# 、Na 2So4
0.43g/ρ、Ma CI20.2g/ρ)で洗浄し
、ここで得られた菌体を次の培養工程(第二工程)に供
した。なお、上記操作はすべて無菌的に行った。Next, 10 m of this culture solution was taken and mixed with a complex medium (glucose ICI/, 11. tryptone 10 g/, o, yeast extract 5 g/Jl, Mg80 7H200, !M/,
11 XK1-12PO42w/E, 2 HPO4
'7y/J, ampicillin 20my/fJ) 2'
, I) and then 3. The cells were cultured in a small aerated agitated culture device (mini jar fermentor) with a capacity of 1.5 liters. The culture temperature was 37°C, and the aeration rate was 0 and 5 VVm (l VV
III is 1 volume-volume-minute
1.0 per minute of culture solution. ll
), the pH is 4N
The concentration of dissolved oxygen (DO) was adjusted to 7.2 with Na 0f-1,4Nl-IC'l, and the concentration of dissolved oxygen (DO) was maintained at around 41)l1m by changing the stirring speed using a Do control device. Cultivation was carried out until the amount of bacterial cells reached the maximum (OD66o"-114) (approximately 8.5 hours after inoculating the bacteria) [First step]
. Next, half of this culture solution (1()) was taken out, and after collecting bacteria by centrifugation, the bacterial cells were collected in a solution of about 500mf! (NaC 14.68g/fJ, KCI 1.49q/
41, N1-14CI 3g#, Na2So4
0.43 g/ρ, Ma CI 20.2 g/ρ), and the bacterial cells obtained here were subjected to the next culture step (second step). Note that all of the above operations were performed aseptically.
第二工程では、第一工程で増殖された菌を無機燐を含有
しない合成培地(2,fl )に接種したのち、この培
地に無機燐を含有する複合培地(トップ1〜ン50g/
fJ、酵母エキス25g/、Q)を4me1分の割合で
定速流加しながら、37℃、通気量0、5vvm 、
pl−l 7.2、D O(/1. ppm)の条件下
でミニジャーファーメンタ−を用いて培養を行った。こ
こで第二工程で用いl〔無機燐を含有しない合成培地の
組成は、グルコース15ff/、1!、NaCl4.6
89/、Q、KCl 1.49!?/、Q、NHCl
3g/1Na2So40.43y/、11.MaC
l O,2y/1cac1223mg/fl 、Fe
Cl3325μg/、0 、Zn C12275μg
#、ロイシン40my/β、チアミン10my/lアン
ピシリン20my/D、トリス塩酸緩衝液0.1Mであ
る。そのときの培養時間OD 、生菌数、無機燐の量
、グルコース量、hUG量の経時変化は、第1表に示す
通りであつIC。In the second step, the bacteria grown in the first step are inoculated into a synthetic medium (2, fl) that does not contain inorganic phosphorus, and then this medium is added to a complex medium containing inorganic phosphorus (Top 1 to 50 g/fl).
fJ, yeast extract 25g/, Q) at a constant rate of 4me1 minute at 37°C, aeration rate 0, 5vvm,
Culture was carried out using a mini jar fermenter under the conditions of pl-l 7.2 and D O (/1.ppm). Here, the composition of the synthetic medium that does not contain inorganic phosphorus used in the second step is glucose 15ff/, 1! , NaCl4.6
89/, Q, KCl 1.49! ? /,Q,NHCl
3g/1Na2So40.43y/, 11. MaC
l O,2y/1cac1223mg/fl, Fe
Cl3325μg/, 0, Zn C12275μg
#, leucine 40my/β, thiamine 10my/l ampicillin 20my/D, and Tris-HCl buffer 0.1M. At that time, the culture time OD, number of viable bacteria, amount of inorganic phosphorus, amount of glucose, and amount of hUG over time were as shown in Table 1 and IC.
第 1 表
*アンピシリン耐性の細胞数
グルコースの定量はグルコースオキシダーゼ法(前記)
に従って行った。生菌数は、アンピシリン20m’J/
fJを含む1−一培地、(トップ1〜ン10g/β、酵
ilエキス5g/、0、NaC15g/p)の寒天プレ
ート上に出現するコロニーの数を8iす定することによ
り行った。0D66oは菌体量の指標として測定したも
のであり、無機燐の定量はモリブデンブルー法にJ:つ
て行った。hUGの定量は、下記の方法で行った。すな
わち培養液10dをとり、遠心分離して集菌し、この菌
体を20%シュークロース、0.03MTris −H
Cl (1)I−18,0)、エチレンジアミン四酢酸
([EDTA)0.001Mからなる溶液20dに懸濁
させ、室温で10分放置した。ついで、再度遠心して集
菌し、この菌体を20−の冷却水(0℃〜4℃)に懸濁
させ、水中で10分間放置した。そしてこの懸濁液を遠
心して上清を得、この上清をラジオリセブターアッセイ
(RRA)法によって分析した。Table 1 *Number of cells resistant to ampicillin Glucose quantification is by glucose oxidase method (described above)
I followed. The number of viable bacteria is ampicillin 20m'J/
The number of colonies appearing on an agar plate of 1-1 medium containing fJ (Top 1 to 10 g/β, Yeast IL extract 5 g/0, NaCl 15 g/p) was counted for 8 days. 0D66o was measured as an indicator of the amount of bacterial cells, and inorganic phosphorus was determined using the molybdenum blue method. Quantification of hUG was performed by the following method. That is, 10 d of culture solution was taken, centrifuged to collect the bacteria, and the bacteria were mixed with 20% sucrose and 0.03M Tris-H.
The suspension was suspended in a solution 20d consisting of Cl(1)I-18,0) and 0.001M of ethylenediaminetetraacetic acid ([EDTA), and left at room temperature for 10 minutes. Then, the cells were collected by centrifugation again, and the cells were suspended in 20-degree cold water (0°C to 4°C) and left in water for 10 minutes. This suspension was then centrifuged to obtain a supernatant, which was analyzed by radioreceptor assay (RRA).
RRA法は、まず、ヒト轟咽腔癌細飽由来のに’B細胞
(△TCCNoCCL17)を800dのフラスコ中で
ダルベツコ変法イーグル(DME)培地〔日本〕中で単
層培養を行った。ついで培地を除き1.0.05%のF
DTAを含むリン酸平衡化塩溶液(PBS)を用いて細
胞をはがして、細胞懸濁液を作成した。その後、20m
M l−1eperS(pH7,4>を含むHank
s平衡塩類溶液(HBSS)で2回細胞を洗浄した。細
胞を3indingsolution (D M E
培地・20mM ト1epes(’pi−17.4>
−0,3!M# NaHCO3・10’Oμg/dス
トレプトマイシン〕に懸濁後、細胞数を計算して30万
〜40万10.7B inding so+ut+on
となる様調整し、チューブに0、2In!!、ずつ分注
した。種々の′a瓜のhUGおよび125.1−mEG
F (マウス上皮細胞成長因子(以下mEGF))を含
む試料液0.2−をチューブに加えて、37℃で1時間
インキュベー1−シた。I胞を氷冷した)−IBSSで
3回洗浄後、10%のトリクロロ酢酸C以下、TCA)
に懸濁させ、グラスフィルターを用いて細胞を固定する
。アセトンでTCAを除いた後、液体シンチレーション
カウンターを用いて計数した。そしてhUGの吊をmE
GFに換算した。In the RRA method, first, Ni' B cells (ΔTCCNoCCL17) derived from human pharyngeal cavity carcinoma were cultured in a monolayer in Dulbecco's modified Eagle (DME) medium [Japan] in an 800 d flask. Then remove the medium and add 1.0.05% F.
Cells were detached using phosphate balanced salt solution (PBS) containing DTA to create a cell suspension. After that, 20m
Hank containing M l-1eperS (pH 7,4>
Cells were washed twice with balanced salt solution (HBSS). Cells were treated with 3inding solution (D M E
Medium: 20mM 1epes ('pi-17.4>
-0,3! M# NaHCO3・10'Oμg/d streptomycin], then calculate the number of cells and get 300,000 to 400,000 10.7 B inding so+ut+on
Adjust so that it becomes 0.2 In in the tube! ! , was dispensed in portions. hUG and 125.1-mEG of various 'aqua cucumbers
0.2 of a sample solution containing F (mouse epidermal growth factor (hereinafter referred to as mEGF)) was added to the tube and incubated at 37°C for 1 hour. I cells were ice-cold) - after washing three times with IBSS, 10% trichloroacetic acid C or less, TCA)
and fix the cells using a glass filter. After removing TCA with acetone, the cells were counted using a liquid scintillation counter. And mE hanging hUG
Converted to GF.
以上の結果より、実施例1の条件下では培養開始後13
.5時間でhUG量が最大となりその後急速に減少して
いるところから、培養時間は13.5時間がよいと思わ
れる。From the above results, under the conditions of Example 1, 13
.. Since the amount of hUG reached its maximum at 5 hours and then rapidly decreased, it seems that 13.5 hours is a good culture time.
実施例 2
第二工程の培養温度を30℃にしたこと以外は実施例1
と同様に実験を行った。そのときの第二工程での0D6
6o生閑数、無機燐の量、グルコース量、hUG量の経
時変化は、第2表に示寸通りであった。Example 2 Example 1 except that the culture temperature in the second step was 30°C.
The experiment was conducted in the same way. 0D6 in the second process at that time
The changes over time in the 6o blank count, the amount of inorganic phosphorus, the amount of glucose, and the amount of hUG were as shown in Table 2.
* アンピシリン耐性の細胞数
この結果より、hUG産生量は培養開始約11時間後に
最大<9.22m’J/β)となり、またさらに培養を
続(ブても(約19.5時間まで)I−muGの産生量
にはあまり彩管せず急速に産量が低下するということも
なかった。従って、実施例2のような条件下では第二工
程の培養時間は11時間程度でよいということがわかる
。*Number of ampicillin-resistant cells From these results, the hUG production amount reached a maximum of <9.22 m'J/β approximately 11 hours after the start of culture, and even if the culture was continued (up to approximately 19.5 hours). There was no significant change in the production amount of -muG and there was no rapid decrease in the production amount.Therefore, under the conditions as in Example 2, the culture time for the second step may be about 11 hours. Recognize.
実施例 3
第二工程の菌の接種量を増した(第一工程の培養液2f
lを集菌して得られる菌体をすべて接種)こと、また第
二工程の合成培地中、グルコース量を2!M/41にし
、その他の成分は上記実施例と同様に、そして無機燐を
含有する複合培地の定速流加速度を8d/分とすること
以外は上記実施例1と同様に行った。そのときの第二工
程におけるOD 、生菌数、無機燐の量、グルコース
量およびhUGffiの経時変化は、第3表に示す通り
であった。Example 3 The amount of bacteria inoculated in the second step was increased (2f of the culture solution in the first step).
Inoculate all the bacterial cells obtained by collecting 1 liter of bacteria), and in the synthetic medium in the second step, increase the amount of glucose to 2! M/41, other components were the same as in the above example, and the same procedure as in Example 1 was performed except that the constant flow acceleration of the complex medium containing inorganic phosphorus was 8 d/min. The time-dependent changes in OD, number of viable bacteria, amount of inorganic phosphorus, amount of glucose, and hUGffi in the second step at that time were as shown in Table 3.
第 3 表 * アンピシリン耐性の細胞数 ** 検出できなかった。Table 3 *Number of cells resistant to ampicillin ** Could not be detected.
この表より培養時間は、この実施例3の条件下ではhL
IG産生量がピークに達している11〜13時間が好ま
しいと思われる。From this table, the culture time is hL under the conditions of Example 3.
It appears that 11 to 13 hours is preferable when the IG production reaches its peak.
関連微生物の菌学的性質および受託番号本発明において
開示された微生物の菌学的性質および受託番号は下記の
通りである。Mycological properties and accession numbers of related microorganisms The mycological properties and accession numbers of the microorganisms disclosed in the present invention are as follows.
受託年月日
(1)昭和56年6月9日
(2)昭和58年4 月30日
(3)昭和56年6月9日
(4)昭和59年11月14日
*通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所の受託番
号
菌学的性質
(1) E、、 coliK 12C600この菌は、
ダラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気性等の大腸
菌属の一般属性を有する他、F因子を含まず、リープレ
ッザー遺伝子Eの機能を欠き、遺伝子組替えに関与する
ヌクレアーゼをコードするrecBcl伝子に欠陥を有
するものである。栄養要求性どしては、トレオニンとロ
イシンをその最小培地上での増殖に必要と覆る。また、
分類学上、腸内細菌科、大腸菌属に属するものである。Contract date (1) June 9, 1981 (2) April 30, 1988 (3) June 9, 1981 (4) November 14, 1980 *Ministry of International Trade and Industry Industrial Technology Accession number of the National Institute of Microbiology and Technology Mycological properties (1) E. coliK 12C600 This bacterium is
It is a Durham-negative bacillus that does not produce spores and has the general attributes of E. coli, such as being facultatively anaerobic. It also does not contain the F factor, lacks the function of the Reaprezer gene E, and has the recBcl gene, which encodes a nuclease involved in genetic recombination. The child has a defect. As auxotrophs, threonine and leucine are required for growth on minimal media. Also,
Taxonomically, it belongs to the family Enterobacteriaceae and the genus Escherichia coli.
なお、本閑に関する文献は以下の通りである。The literature related to Honkan is as follows.
(イ)、Genet ics、39.440(o)、
Nal二 ure、 21 7. 1 1 10(
2)E、coliKl 2C600(pYK283)こ
の菌は、ダラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気性
等の大腸菌属の一般属性を有する他、F因子を含まず、
サプレッサー遺伝子[の機能を欠き、遺伝子組替えに関
与するヌクレアーゼをコードするrecBcm仏子に欠
陥を有するものである。(a), Genetics, 39.440(o),
Nal 2 ure, 21 7. 1 1 10 (
2) E. coliKl 2C600 (pYK283) This bacterium is a Durham-negative bacillus, does not produce spores, has general attributes of E. coli such as facultative anaerobic properties, and does not contain F factor.
It lacks the function of the suppressor gene and has a defect in recBcm, which encodes a nuclease involved in genetic recombination.
栄養要求性としては、1へレオニンとロイシンをその最
小培地上での増殖に必要とする。phoA3ff伝子の
プロモーター−オペレーター領t*pAcYc177由
来の複製開始領域およびpBR322のbla 遺伝子
から構成されたプラスミドpYK283を含み、アンピ
シリンに対して耐性を示す。As an auxotrophy, it requires 1 heleonine and leucine for growth on its minimal medium. It contains plasmid pYK283, which is composed of the replication initiation region derived from the promoter-operator region t*pAcYc177 of the phoA3ff gene and the bla gene of pBR322, and exhibits resistance to ampicillin.
また、分類学上、腸内細菌科、大腸菌属に属するもので
ある。Furthermore, taxonomically, it belongs to the family Enterobacteriaceae and the genus Escherichia coli.
なお、プラスミド1)YK283由来の形質を除けば、
この菌株の菌学的性質はその親株E、coliKl 2
C600のそれと同じである。In addition, except for plasmid 1) YK283-derived traits,
The mycological properties of this strain are its parent strain E, coli Kl 2
It is the same as that of C600.
(3)E、coliKl 2C600(pBR322)
この菌は、ダラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気
性等の大腸菌属の一般属性を有する他、E因子を含まず
、サプレッサー遺伝子Eの機能を欠き、遺伝子組替えに
関与するヌクレアーゼをコードするrecBC遺伝子に
欠陥を有するものである。栄養要求性としては、トレオ
ニンとロイシンをその最小培地上での増殖に必要とする
。また、薬剤耐性プラスミドpBR322を含む。なお
、プラスミドI)BR322に関してはGene、2゜
95(1977)、大腸菌に12C600に関しては上
記Natureを参照することができる。(3) E, coli Kl 2C600 (pBR322)
This bacterium is a Durham-negative bacillus, does not produce spores, has the general attributes of the genus Escherichia coli, such as being facultatively anaerobic, and does not contain the E factor, lacks the function of the suppressor gene E, and does not produce nucleases involved in genetic recombination. It has a defect in the recBC gene it encodes. As an auxotroph, it requires threonine and leucine for growth on its minimal medium. It also contains drug resistance plasmid pBR322. For plasmid I) BR322, refer to Gene, 2°95 (1977), and for E. coli 12C600, refer to the above Nature.
pBR322由来の形質を除けば、E、colil(1
2C600(pBR322)の菌学的性質は親株のそれ
と同じである。Except for the traits derived from pBR322, E. coli (1
The mycological properties of 2C600 (pBR322) are the same as those of the parent strain.
(4) E、 coliK 12YK537大腸菌に1
2YK537は、公知株であるところの大腸菌に12株
(Hicrobiological Reviews
。(4) E. coliK 12YK537 Escherichia coli 1
2YK537 is a known strain of Escherichia coli with 12 strains (Hicrobiological Reviews
.
±4,1〜56(1980))の誘導体大腸菌に12R
R1(Gene、2,95.(1977)、Bioch
em、Biophys、Acta、 、 655 、2
43(1981))をさらに改変したものであり、下記
の性質を示し、伯の性質についてはに12RR1のそれ
と異なるところのない菌株である。±4,1-56 (1980)) derivatives of E. coli with 12R
R1 (Gene, 2, 95. (1977), Bioch
em, Biophys, Acta, 655, 2
43 (1981)), and exhibits the following properties, and is a strain that is no different from that of 12RR1 in terms of the properties.
(rec A 1 、Pho A8、pro” )(rec A1, Pho A8, pro”)
第1図は、E、coli K12Y537を形質転換
するために使用したプラスミドpTA1522造成のた
めのフローチャートである。
手続補正書
昭和61年3月W日
1 事件の表示
昭和59年 特許願 第279586号2 発明の名称
微生物の培養法
3 補正をする者
事件との関係 特許出願人
湧 水 製 薬 株 式 会 社4
代 理 人
8 補正の内容
明細書を下記の通り補正する。
(1) 第10頁第9行
「前記」を「前記文献」と補正。
(2) 第11頁第1行
「しかしながら」を削除。
(3) 第15頁第7〜9行
EcoRI l−1paI SmaI Hi
ndl[[Jを
EcoRI HpaI SmaI 1
lindllI(I)
ここで破線は制限酵素切断部位を示し、E COR■等
はその切断を行う制限酵素の名称を示す。」と補正。
(4) 第19頁下から第7行
rLB培地」を「L培地」と補正。
(5) 第23頁第4〜5行
ro、8mi!/分」を「o、8rd/時間」と補正。
(6) 同頁第5行
r20mf!/分」をI’20m/時間」ど補正。
(7) 同頁第6行
「4−7分または8威/分」を[4d/時間または8m
ジ/時間]と補正。
(8) 第31頁第10行
「分」を「時」と補正。FIG. 1 is a flowchart for constructing plasmid pTA1522 used to transform E. coli K12Y537. Procedural amendment written March W, 1986 1 Indication of the case 1988 Patent application No. 279586 2 Name of the invention Method for culturing microorganisms 3 Person making the amendment Relationship with the case Patent applicant Yusui Pharmaceutical Co., Ltd. 4
Agent 8 Amend the statement of contents of the amendment as follows. (1) Page 10, line 9, “said” was amended to read “said document.” (2) Delete “However” in the first line of page 11. (3) Page 15, lines 7-9 EcoRI l-1paI SmaI Hi
ndl[[J EcoRI HpaI SmaI 1
lindllI (I) Here, the broken line indicates the restriction enzyme cleavage site, and ECOR■ etc. indicate the name of the restriction enzyme that performs the cleavage. ” he corrected. (4) On page 19, line 7 from the bottom, "rLB medium" was corrected to "L medium." (5) Page 23, lines 4-5 ro, 8mi! / minute” was corrected to “o, 8rd/hour”. (6) Same page, line 5 r20mf! Correct "/minute" to "I'20m/hour". (7) Line 6 of the same page, change “4-7 minutes or 8 hours/minute” to [4d/hour or 8 meters
[time/time] and correction. (8) On page 31, line 10, "minute" was corrected to "hour".
Claims (1)
備するプラスミドの該プラスミドの制御下に外来性蛋白
質をコードする遺伝子を組込んで造成したキメラプラス
ミドによって形質転換した微生物を、まず、蛋白質合成
能の誘導が起らず、かつ、該微生物増殖のために必要な
量の無機燐を含有する培地で培養したのち、ついで無機
燐を含有しない培地に移し、さらにこの培地への無機燐
若しくは無機燐を含有する培地の定速流加を伴う培養に
付すことを特徴とする、微生物の培養方法。1. A microorganism transformed with a chimeric plasmid constructed by incorporating a gene encoding a foreign protein under the control of a plasmid containing a promoter derived from alkaline phosphatase is first transformed with a chimeric plasmid that has a promoter derived from alkaline phosphatase, and then transforms the microorganism with a chimeric plasmid that is constructed by incorporating a gene encoding a foreign protein into the plasmid. After culturing in a medium containing the necessary amount of inorganic phosphorus for the growth of the microorganism, the microorganism is then transferred to a medium containing no inorganic phosphorus, and further inorganic phosphorus or a medium containing inorganic phosphorus is added to this medium. A method for culturing microorganisms, characterized by subjecting them to culture with constant-rate feeding.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59279586A JPS61152278A (en) | 1984-12-26 | 1984-12-26 | Cultivation of microorganism |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59279586A JPS61152278A (en) | 1984-12-26 | 1984-12-26 | Cultivation of microorganism |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61152278A true JPS61152278A (en) | 1986-07-10 |
Family
ID=17613046
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59279586A Pending JPS61152278A (en) | 1984-12-26 | 1984-12-26 | Cultivation of microorganism |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS61152278A (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6439989A (en) * | 1987-08-05 | 1989-02-10 | Takeshi Kobayashi | Production of useful gene product by filtration culture |
-
1984
- 1984-12-26 JP JP59279586A patent/JPS61152278A/en active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6439989A (en) * | 1987-08-05 | 1989-02-10 | Takeshi Kobayashi | Production of useful gene product by filtration culture |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8148494B2 (en) | Signal peptide for the production of recombinant proteins | |
US20040005695A1 (en) | Method for producing recombinant proteins by gram-negative bacteria | |
Dresler et al. | Production of a recombinant polyester-cleaving hydrolase from Thermobifida fusca in Escherichia coli | |
JP2018536423A (en) | Microbial strains and methods for fermentation production without low molecular weight substances and protein antibiotics | |
CN106434510A (en) | Genetically engineered bacterium for producing L-aspartic acid through fermentation | |
KR101877286B1 (en) | Vector comprising mannose promoter and mannose promoter | |
US5496713A (en) | Process for producing 20 kD human growth hormone | |
CN111117942B (en) | Genetic engineering bacterium for producing lincomycin and construction method and application thereof | |
Sunitha et al. | Refolding and purification of Zymomonas mobilis levansucrase produced as inclusion bodies in fed-batch culture of recombinant Escherichia coli | |
CN110218736B (en) | Transformation method for improving AcdS production capacity of PGPR | |
US6955911B2 (en) | Method of culturing microorganism | |
JP4216719B2 (en) | Halogen compound-resistant novel formate dehydrogenase and method for producing the same | |
Lee et al. | Mass production of thermostable D‐hydantoinase by batch culture of recombinant Escherichia coli with a constitutive expression system | |
JPS61152278A (en) | Cultivation of microorganism | |
JP4287144B2 (en) | Novel formate dehydrogenase and production method thereof | |
CN116157530A (en) | Bacillus industrial fermentation process using temperature change | |
US4585739A (en) | Plasmid for foreign gene expression in B. subtilis | |
JP6795138B2 (en) | Adhesive fiber and its uses | |
Zhao et al. | Expression of pectate lyase A from Aspergillus nidulans in Bacillus subtilis | |
JPS61280292A (en) | Production of protein by exocytic secretion | |
JPS61152279A (en) | Cultivation of microorganism | |
Chaves et al. | Studies on growth kinetics and plasmid stability of a recombinant Escherichia coli expressing a Schistosoma mansoni antigen | |
US5585260A (en) | PSM112 plasmid vector for expression in bacillus subtilis | |
JPS62151193A (en) | Production of protein by extracellular secretion | |
JPS633800A (en) | Production of protein by extracellular secretion |