JPS61141900A - 機能的ステロイド受容体の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、細胞中の機能的ステロイド受容体蛋白質の
測定のための細胞培養測定に関し、そしてヒト組織から
の癌細胞のステロイド療法に対する感受性を決定するた
めに特に有用である。

〔従来技術〕

癌は、男性及び女性の両方について、心臓疾患に次ぐ主
たる死亡原因である。癌に対する闘いの中で多くの技法
が開発され、そして最近の研究の対象はこの疾患の性質
及び原因の理解、並びにその抑制又は治療のための技法
を提供することに向けられている。

はとんどの癌はステロイド標的組織である組織中に生ず
るので、ステロイド療法を用いる処置が有用である。幾
つかのステロイド（例えばプログステロン、グリココル
チコイド）及び抗ステロイド（側光ば抗エステロダン、
タモキシフェン）がほとんどの細胞において細胞分裂を
阻害する。薬理学酌量のエストロゲン、抗ニストロダン
、又はエストロゲンの減少（切除術による）の使用もま
た、乳癌の抑制の九めの有効々療法であることが証明さ
れている。グログスチンが子宮内膜癌の治療のために使
用されておシ、そしてグリココルチコイドが白血病の治
療のために使用されている。

それにもかかわらず、癌の各クラスの内ある集団はステ
ロイド療法に反応しないことが臨床的に見出されている
。多くの研究がこの理由を決定することに向けられてい
る。それは、臨床的な診断手段を得て、ステロイド療法
に反応しない癌を有する患者罠おいてステロイド療法に
よって時間を失うことがないようにするため、そしてさ
らにこの疾患の性質に対する知識を得るためである。

ステロイド“標的”組織及び”非標的”組織間の既知の
相違は、標的細胞中にはステロイドに対する特異的受容
体蛋白質（これは、このホルモンの作用において中介体
として機能する）が存在することである。標的細胞中で
のステロイドの作用の一般に容認されている機作は、１
）ステロイドの細胞への導入及びこれらのステロイドの
特異的受容体蛋白質への結合、２）このステロイド受容
体複合体の、細胞質又は核中の成る所から染色体物質上
の核アクセグタ一部位への移行及び結合、３）多数の遺
伝子の転写の変化、４）メツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）のプロセシング、及び５）これらのｍＲＮＡの、種
々の機能を行う又はそのために役立つ蛋白質への翻訳で
ある。

これらの受容体蛋白質を測定するための方法が開発され
ている。研究されたステロイド標的組織からの癌の約２
０％において、ステロイド受容体は非常に低濃度で存在
し、又は存在しない。予想通シ、これらの特定の癌はス
テロイド療法に反応しない。

しかしながら、受容体陽性癌患者でのステロイド療法の
研究において、これらの癌の約半分（すべての癌の約４
０％）のみがステロイド療法に反応スる。この例は、乳
癌のタモキシフェン治療及び子宮内膜癌のグロダステロ
ン治療において見出される。ステロイド作用経路におけ
る欠陥が、ステロイドのその受容体への結合に続く段階
に関連することが仮定されている。

不完全な（非機能的な）受容体が存在し、そして多くの
乳癌のステロイド療法に対する非反応性に役割を演する
ことがＬｓａｋ＠及び共同研究者によって報告された。

仁の明細書において受容体について使用する“非機能的
”なる語は、核移行及び遺伝子発現を変化させるための
染色体物質への結合を行うことができない受容体を示す
。この様な受容体はステロイドを結合することができる
が、ステロイド作用経路に関しては不完全である。この
グループによる研究は、４６１のエストロゲン受容体（
ＫＲ）陽性乳癌の２５〜３０％が核ニストロダン受容体
（ＥＲＮ）を示さないこと、すなわち受容体が非機能的
であることを報告した（Ｌａｌｎｇ等、ブリティッシュ
・ジャーナル・オプ・キャ／サー（Ｂｒｌｔ、Ｊ、Ｃａ
ｎｅｅｒ）　＋　４３　＋　５９　（ｃ９７７）　：Ｌ
ａａｋｅ等、デ・ランセット（Ｔｈ＠Ｌａｎｃｅｔ）、
１６８（ｃ９８１）］。これらの研究において、細胞質
ゾルエストロゲン受容体（ＥＲ（ａ）が腫瘍から単離さ
れ、そして標準的木炭受容体定量測定がＳ、Ｇ、Ｋｏｒ
ｅｎｎｍｎ。

ジャーナル・オプ・クリニアル・エンドクリノロジー・
アンド・メタ？リズム（Ｊ、ＣＩ　Ｉｎ−１）ｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌ。

Ｍｅｔａｂ、）２８．１２７（ｃ９６８）の方法に従っ
て行われた。ホモジナイズされた組織から得られた核ペ
レットｔ［３Ｈ）−エストラジオールと共にインキュベ
ートしそして存在するＥＲＮの量を測定することによっ
てＥＲＮが測定された。イン−ビトロ系を用いて粗（’
Ｈ）−ＥＲＣを単離された核と共にインキュベートしそ
して塩抽出された放射能を測定することにより、他の研
究室から同様の結果が得られた［Ｆａｚ＠ｋａｓ及びＭ
ａｅＦａｒｌａｎｅｙザーランセッ）　（Ｔｈｅ　Ｌａ
ｎｃｅｔ）、５６５（ｃ９８２））。両研究において、
該受容体の存在（すなわち、機能的受容体の存在）とス
テロイド療法に対する腫瘍の反応との間に７５〜１００
チの相関が見出された。

従って、機能的／非機能的ステロイド受容体を測定する
ために効果的な測足法は、単に受容体の存在又は不存在
を決定する測定法に比べて、患者がステロイド療法に反
応するか否かについて一層正確な予想を可能にする。こ
のタイプの確かな測定は、これらの患者の治療の方針を
計画するに当って臨床医にとって大きな助けとなシ、そ
して効果のない療法を使用することによる治療期間のロ
スが回避されるであろう。Ｌｅａｋｅ及びＭａｅＦａｒ
ｌａｎｅの方法は機能的及び非機能的該受容体の間の識
別において好結果を示したが、（ｅ）該受容体の単離を
必要とせず、（ｂ）無細胞インキュベーションを必要と
せず、（ｃ）少ない組織を必要とし、そして／又は（ｄ
）すぐに入手できる装置を用いて迅速に実施することが
できる改良された核生検測定の必要性が存在する。

〔発明の概要〕

この発明は、腫瘍細胞が機能的ステロイド受容体を有す
るか否かを迅速且つ正確に決定すること細胞培養測定法
に向けられる。この方法は細胞中の核結合ステロイドの
量を測定する。この測定は、研究者に、ＤＮＡｑ当り又
は細胞当りいがなる量の生物学的に活性な受容体が存在
するかについての迅速な示唆を与える。この測定法は有
意に少ない組織を必要とし、そして受容体の単離及び定
量を必要とする測定法、又は無細胞系への受容体の移行
を測定する方法に比べて一層迅速である。この方法を、
この明細書において１生検接結合測定法（ｂｌｏｐｓｙ
　ｎｕｃｌ＠ａｒ　ｂｌｎｄｌｎｇ　ａｓｓａｙ）”又
は＠謄＄”と称する。

〔具体的な説明〕

この発明の方法に従えば、測定されるべき組織を制御さ
れた条件下でコラ−ゲナーゼで熟理する。

細胞を無傷のまま単離し、そして適当な放射性ラベルさ
れたステロイドと共にインキュベートする。

細胞核を単離し、そして結合したステロイｒを測定する
。次に、ｌＯ■（湿重量）又はこれよシ多くの外科的生
検体から得られた核を加水分解し、そしてジフェニルア
ミン測定法のごとき標準法によＪ　ＤＮＡについて測定
する。この方法に代えて、非常に小さい組織サンプルを
使用する場合には、核の半分をＦ遇しないで螢光測定（
エチジウムブロミド）によるＤＮＡの測定に使用する。

後者の測定法はジフェニルアミン法よシも約５０倍感度
が高い。非常に小さい生検体を使用する場合ＤＮＡの定
量が制限因子であるから、螢光法の使用が、１〜５９ｍ
ｇの生検体片を機能的受容体及びＤＮＡの両者について
分析することを可能にする。

この発明の実施に当っては、例えば、正常な子宮内膜を
有する患者からの、今まで治療されてぃない子宮内膜癌
を有する患者からの、及び乳癌を有する患者からの外科
的生検によって得られる正常な組織及び疾患を有する組
織を得る。細胞培養物又は血液から４細胸を得ることが
できる。例において、すべての正常子宮内膜及び肺並び
Ｋはとんどの癌を閉経後の女性患者から得た。適当な組
織学的評価の後、代表的な生検サンダルを、好ましくは
手術４１２時間以内に、この発明の被結合測定において
すぐに使用するために周囲温度において無菌緩衝液中に
入れる。この期間内に凍結しそして一８０℃にて２週間
以内貯蔵した生検体も好結果をもりて測定することがで
きる。過剰の組織を深冷貯蔵してずでに開発されている
標準的受容体定量測定に使用することもできる。

ヒト組織からの生検サンプルを適当な栄養培地に移し、
そして例えば細切することＫよって断片化する。得られ
た組織断片を秤量し、そしてコラ−ゲナーゼを含有する
適当な培地に移す。すべてのタイプの組織を小さくする
ためには、組織η当シ約０．５〜１５ユニ、ト、好まし
くは約１〜５ユニ、トのコラーゲンの固定比率を用いる
のが好ましい。断片を穏やかに破壊しそして炉遇する。

残った組織を新たなコラーゲンと共に再びインキ−ベー
トする。第２回目の穏やか々破壊の後、懸濁液を再びＦ
遇する。Ｆ液中の細胞を遠心分離によりペレット化しそ
して洗浄する。最終細砲イレ。

トを栄養培地に再懸濁して放射性ラベルされたステロイ
ドと共にインキュベートする。複製測定の培地を約ｌＯ
〜１５−ラベル化ステロイド、例えば約２０〜３０　ｍ
Ｍ（３Ｈ）　７’ログステロン（又は〔３Ｈ〕エストラ
ジオール）に調整する。非特異的ステロイド結合の程度
を決定するため、典型的には、平行２連インキユページ
１ノを約２０〜３０ｍＭ（３Ｈ）プログステロン及び過
剰の非ラベルゾロｒステロン（又は約２０〜３０　ｍＭ
以上の〔３Ｈ〕エストラジオール及び過剰の非ラベルエ
ストラジオール）を用いて行う。インキュベーションは
約１８〜２５℃にて約０．５〜１．５時間、好ましくは
約２２℃にて約１時間行うことができる。

インキュベーションの後、チューブを約０〜１０℃に冷
却し、そして冷たい中性媒体（例えば、５ｍＭ　’ＫＥ
ＰＥＢ緩衝液）と混合する。冷遠心分離により細胞を沈
澱せしめる。次に、細胞ペレットを、日常の臨床実験室
条件に容易に適合させることができる微量核単離法にか
ける。細胞を、冷たい中性緩衝液、好ましくはシューク
ロース−グリセリン−ＫＯ２−Ｔｒｌｇ−）リドンｘｌ
ｏｏ（オクトキシノール−９，ローム＆ハース）媒体中
でホモジナイズする。このホモジネートを、シュークロ
ース、グリセリン、トリトンＸ−１００、Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｔ及びＫＣｌを含有する冷たい中性媒体上に重層する
。チューブを冷遠心する。精製された核のペレットを中
性溶液中に再懸濁する。Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ及び水性グリ
セリンを含んで成る水性溶液を、媒体と出発組織の重量
比を１：０．０５〜０．１５として、好ましくは１００
１１１９の出発組織に対して約１１１１の比率で使用す
るのがこの目的のために有用である。

次に、核をフィルター上に集めることＫより〔３Ｈ〕ス
テロイドの核結合について分析する。この場合、このフ
ィルターを乾燥し、そしてフィルターを酸加水分解しそ
して可溶化されたヌクレオチドをＢｕｒｔｏｎ　、バイ
オケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏａｈｅｍ、Ｊ、）６２
．３１５（ｃ９５６）Ｋ記載されているジフェニルアミ
ン法により定量することによりＤＮＡについて分析する
。次Ｋ、加水分解されたフィルターの放射能を測定する
。この方法は、全ＤＮＡ及び結合した放射能の測定を可
能にする。

核中に特異的に結合した〔３Ｈ〕ステロイドはＣＰＶ■
ＤＮＡとして表現され、そして特異的結合から非特異的
結合を差引くととＫよって得られる。〔３Ｈ〕ステロイ
ドは酸加水分解によって除去されない。

最初の量が約１〜５１Ｆ９である組織を用いて行うこと
ができる核結合の微量測定のため、ＤＮＡを、Ｋａｒｓ
ｔｅｎ等、アナリティカル・バイオケミストリー　（Ａ
ｎａｌ、Ｂｌｏｅｈｅｍ、）　、　４０　、１３５（ｃ
９７２）及（ｊ　Ｋ、Ｊ、Ａｎｄ＠ｒｓｏｎ等、アナリ
テイカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ　、Ｂｌｏｅ
ｈｅｍ、）　８３　、７０３（ｃ９７７）のエチジウム
プロミド螢光法により定量する。この方法においては、
−過に先立って約０．５〜５μｇのＤＮＡを含有する核
のアリコートを分離し、そしてプロテアーゼ（グロナー
ゼ）及びリゲヌクレアーゼで処理する。アリコートを冷
却し、エチジウムプロミドと混合し、そして螢光を測定
する。

ステロイド療法に対する腫瘍の有効な反応に必要な核結
合〔３Ｈ〕ステロイドのレベルは次のようにして予測す
ることができる。ｌａ）上記と同様なインキュベーショ
ン条件下での非ラベルステロイドの種々の濃度に対する
生物学的反応を測定し、そして同じ濃度の〔３Ｈ〕ステ
ロイドを用いて核結合ステロイドのレベルを評価する。

（特定の生物学的反応が、非ラベルステロイドについて
必要な暴露の長さを指示するであろう。細胞と〔３Ｈ〕
ステロイドとのインキュベーションは６０分間維持すべ
きである）。ｂ）インービゴにおいて生物学的反応のた
めに必要な又は正常な細胞核当りステロイｒ受容体の濃
度についての公表された報告を使用する。

典型的な値は、最小反応のために細胞該当シ約２０００
分子結合であり、そして最大反応のためＫは細胞該当シ
約６０００〜１００００分子である。

（ａ）ステロイド療法に対する臨床的反応に必要な核結
合の最小レベルは、臨床試行の終シに一層正確に決定す
ることができる。（反応する／反応しない腫瘍の各々は
核結合ステロイドのそのレベルに関して相関することが
できる。

）次に、この発明を次の詳細な例（例１）に言及するこ
とによってさらに説明する。後に記載する比較例におい
て従来法を説明する。第１図及び第２図に示すフローチ
ャートは、従来の受容体定量法及びこの発明のＢＮＢの
比較を容易にするためのものである。

以下余白 例１０機能的ステロイド受容体についての生検体核結合
測定 次の化合物は記載する入手源から入手することができる
。トリチウム化され九Ｒ５０２０及び非ラベルＲ５０２
０（ジメチル−１９−ノルプレグナ−４゜９−ジエン−
３，２０−ジオン）、トリチウム化グログステロン及び
エストｏｒン（４０〜１１５　Ｃ／　ｓｎ　ｍｏｔ）に
エーイングランドーニュクレア・コーＩ・。

？ストン、ＭＡ）：他のすべてのステロイド類及び追加
の他の化学物質はシグマ社（セントルイ、Ｘ、ＭＯ）又
はフィッシャー・サイエンティフィック社（ピッツバー
グ、ＰＡ）。すべての化学物質は分析銘柄の試薬である
。ステロイドは日常的に、逆相系での高圧液体クロマト
グラフィーを用いて分解について分析する。

標品（クーノや−・バイオケミカル、マルパーン。

ＰＡ）ｄ当り１１５−１７０ユニツトの活性を示す１．
０１１Ｉ９／ａ／コラ−ゲナーゼ酵素標品（シグマ−・
ケミカルス、セントルイス、ＭＯ：Ｃ−０１３０）を使
用した。ｌユニットの活性は、カルシウムイオンの存在
下でｐＩ（７，４ｅ３７℃にて、５時間に、コラ−ダン
から１μｍｏｌｅのし一ロイシン相当量を放出する。ア
ミノ酸を定量するためにニンヒドリンを使用した。

Ａ、　　　のコラ−ゲナーゼ処理 ヒト組織又はひよこの卵管からの生検体を周囲温度にお
いてＭＣＤＢ　−２０２媒体（ｐＨ７，４）　（Ｋ、Ｃ
，バイオケミカルス、レメキサ、カンサス）に入れ、そ
して実験室に輸送した。次に、すべての組織サンプルを
４ｗ／マ外のウシ血清アルブミンを含有する２０２媒体
に移し、そして最後に細切した。得られた組織断片を濾
過によってナイロンスクリーンに移し、秤量し、そして
コラ−ゲナーゼ処理を含有する２０２媒体に移す。すべ
てのタイプのために組織〜当り２ユニツトのコラ−ゲナ
ーゼの固定された比率を用いた。組織を消化するための
典型的な実験は、６．４ｍの２０２媒体中約４００〜の
組織及び１ダの組織当り２．０ユニツトのコラ−ダンを
２５−のエルレンマイヤーフラスコに入し、そしてロー
タリーシェーカー水浴上３７℃にて５０ｒｐｍにて３０
分間インキエペートすることを含む。

大穴自動ピ（ットに出し入れすることによって断片を穏
やかに破壊する（ｃ５分ごとに２５回）。

自動ピイットを用いる２回目の穏やかな破壊の後、４襲
のＢＳＡを含有する同容量の２０２媒体を加える。粗悪
濁液をナイロンガーゼ（ｓｏｏｘｓｏｏミクロン目）を
通して一過し小ガラスビーカーに入れる。フィルター上
の側面及び断片を、４％のＢＳＡを含有する同容量の２
０２媒体で洗浄する。フィルター上の未消化組織を新九
々酵素溶液に入れ、そして再消化する。Ｆ液中の細胞を
、５０Ｘ５Ｆにて１０分間遠心分離することによってイ
レット化し、そして４≦のＢＡＡを含有する２０２媒体
１０１１１への再懸濁及び遠心分離によって２回洗浄す
る。最終組Ｗ８−ｅレフトをＢＳＡを含まない２０２媒
体中に再懸濁し、ラベルされたステロイドと共にインキ
ユベートする。細胞の生存をトリノ々ンプルー排除法に
より測定する。この方法は懸濁液中の、色素に対して透
過性でない細胞の−を評価する。さらに、細胞の超構造
及び無傷の膜を顕微鏡により試験する。次に、上記の方
法により得られた細胞を後に記載するようにして、ステ
ロイド受容体による核結合について評価する。

Ｂ、　　［３Ｈ］スフ０イドとのインキエペーシ百ンコ
ラーグン処理により単離された細胞を１２．０ＩＩｊの
試験管中０．２ｍｌの２０２媒体に再懸濁する。この方
法は１〜ｓｏｑの生検体からの細胞を用いて行うことが
できる。外科的切除後２時間以内の新鮮な組織から又は
凍結組織から単離された細胞について行う。最小４個の
インキエペーシ盲ンを行う。２連の媒体は２５　ｎＭの
〔３Ｈ〕グロｒステロン（［３Ｈ）ｐ）（又は〔３Ｈ〕
エストラジオール）に調整する。平行して行う２個のイ
ンキエペーシ璽ンは２５ｎＭ（３Ｈｉｐ及び２．５μＭ
非ラベルグロダステロン（又は２５　ｎＭ［３Ｈ］エス
トラジオール及び２．５μＭ非ラベルエストラジオール
）の混合物を用いて行う。すべてのインキュベージ田ン
は２２℃にて１時間行う。子宮内膜癌についてプロゲス
テロン受容体官能価を評価する。乳癌において、ニスト
ロダン及びグログステロン受容体の官能価（組織許容）
を評価する。

インキエペーシッンの後、試験管を４℃に冷却し、そし
て５ｍｌの冷たい溶液Ａ　（５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　及び
０．２　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　ｐＨ７，４、４℃を含有
する）と混合する。細胞を、６０００ＸＰにて１０分間
４℃で遠心分離することＫより沈澱せしめる。細胞イレ
ットを２　ｙｓｌの冷たい溶液Ｂ（ｃ，０Ｍシェークロ
ース。

１０マ／マ％グリセリン、０．２％）リドンｘ−ｉｏｏ
。

０．１Ｍ　ＫＣｔ、０．５ＭＴｒｌｓ、ｐＨ７，４を含
有する〕中で、モーター駆動の鋸歯状のテフロン乳棒−
ガラスホモジナイデ−（０，００１インチクリアランス
）を用いるトーマスタイプ人ガラスホモジナイデーを用
いてホモジナイズする。このホモジネートを、１ｄの冷
たい溶液Ｃ［ｔ４Ｍシェークロース、１０マ／マ％　グ
リセリン、０．２％トリトンＸ−１００，０，０５Ｍ　
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　　０．１　Ｍ　ＫＣｔを含有す
る（ＰＨ７，４））上に重層する。チェープを４℃、６
０００×Ｇにて２０分間遠心分離する。核ペレットを溶
液Ｄ　（５０ｍＦｖ！　ＴｒｉＩＩ−ＨＣｔ、　１０マ
／マ≦グリセリン（ｐＨ７，４））に再懸濁する。次に
核のイレットをニトロセルロースフィルター上に集め、
フィルターを乾燥し、フィルター上のＤＮＡを定量し、
そして次Ｋｉ体シンチレーシヲンスイクトロメーターで
計数することにより、ｃ３Ｈ）ステロイドの被結合につ
いて分析した。この方法は、結合した放射能及び全ＤＮ
Ａの両者の測定を可能にする。具体的には、フィルター
を０．５　Ｎ　ＨＣｌＯ４中で加水分解（９０℃１５分
間）シ、そして可溶化したヌクレオチドをＢｕｒｔｏｎ
のジフェニルアミン測定により定量することによってＤ
ＮＡを測定する。次に１加水分解されたフィルターを乾
燥し、そしてｐｃｓ　−キシレン粉（アマ−ジャム−シ
ール、７−ＩＪントンハイツ、ＩＬ）ヲ用いてシンチレ
ーシ嘗ンカウンター中で計数した。

２０ｍｇより少ない組織を必要とする微量被結合アッセ
イのため、エチジウムプロミド螢光法によりＤＮＡを定
量する。後者の場合、核をフィルター上に集める前に核
のアリコート（約０．５〜５μｔのＤＮＡを含有する）
を０．２■のグロナーゼ（３７℃にて２時間前消化）及
び０．２１９のり？ヌクレアーゼ（９０℃にて１０分間
前消化）Ｋより処理する。

次に核アリコートを冷却し、そして２．５μ？のエチジ
ウムプロミドを加える。溶液を混合し、そして３０００
Ｘの吸光及び５９００Ｘの放射を用いて螢光光度計上で
螢光を測定する。〔３Ｈ〕ステロイドを用いる測定と（
ｓＨ）ステロイド＋１００倍過剰の非ラベルステロイド
を用いる測定との間の比として特異的に結合したＣＰＭ
／１＃ｇＤＮＡを計算する。

非特異的対照と共に１点測定を用いるＫｏｒｅｎｎｍｎ
のデキストラン木炭法によるＰＲ及びＥＲの定量は、各
ステロイド受容体のために最少的５００■の組織を必要
とする。外科手術から得られる実質上すべての生検体が
、１）この発明の被結合アッセイ、及び２）受容体の定
量を可能にするために十分な量である。言うまでもなく
、被結合測定に関連して全受容体の定量を行う必要はな
い。

Ｂ、細胞質ゾルの調製 すべての実験は４℃に〉いて行う。凍結組織を一８０℃
にて２箇月を越えない期間貯蔵する。この貯蔵は受容体
定量におけるロスを生じさせない。

新鮮な及び／又は凍結した組織を細切し、秤量し、そし
てチューブ中の溶液Ｆ　（５０ｍＭ　Ｔｒ　ｌ　ａ−Ｈ
Ｃｌ。

１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　１５−　モノチオグリセロー
ル、１０−モリブデン酸ナトリウム、　２　ｍＶ　ＰＭ
ＳＦ　、　１０マ／Ｖ％グリセリン（ＰＨ７，４））に
入れる。この緩衝液は受容体標品において最大の安定性
を維持することが示された。この場合、ＥＤＴＡは受容
体の凝集を最小にし、モノチオグリセロール／モリブデ
ン酸塩／グリセリンは受容体を安定化し、そしてＰＭＳ
Ｆは蛋白質分解を減少せしめる。要約すれば、凍結され
た生検体を、４体積の溶液Ｆ　（２００μ１１５０■組
織（湿重ｆｔ））中で、テフロン乳棒−ガラスホモジナ
イデーによりホモジナイズする。

このサングルを、４℃にてベックマノミクロヒュージ中
で２分間１０，０ＯＯＸＰで遠心分離して細胞質ゾル（
上清を得る）。イレットはＤＮＡ分析のために用いる（
下記参照のこと）。

ベンゼン／エタノール（９：１マ／マ）中の（’Ｈ）Ｒ
５０２０（８７Ｃ１／ｍｍｏｔｅ　）又は（３）１）工
ｘトラジオール（ｃ０２Ｃ１／ｍｍｏｔｅ）を凍結乾燥
し、そして同容量の無水エタノールに再溶解して５μＭ
〔！Ｈ〕ステロイド溶液を得る。このストックのアリコ
ートを細胞質ゾルに加えて１１００ｎ　（ＬＨ）ステロ
イドとし４℃にて４時間置く。この量は受容体部位を飽
和するのに十分な量である。これらの条件はまた、実質
上すべての内因性非放射性ステロイドを〔３Ｈ〕ステロ
イドにより交換することが示されている。ＰＲ測定のた
め、コルチゾルも凍結乾燥しそして同じエタノール溶液
に再溶解して［’Ｈ）ｐを含む５０μＭコルチゾル溶液
を行う。このステロイドは、グルココルチコイド受容体
にＲ５０２０が結合することによって生ずる混乱を除去
する。次に粗細脂質ゾルのアリコートを用いて、下記の
デキストラン木炭法によりステロイド受容体を定量する
。

各測定のため、各細胞質ゾルの１００μｌのアリコート
を対応する非ラベルステロイドの存在下又は非存在下で
、上記のようにして０℃にて４時間、〔３Ｈ〕ステロイ
ドと共にインキユベートする。合成グロダスチン（Ｒ５
０２０）は、測定をしばしば妨害する血清結合蛋白質に
結合しないので、検討される細胞質ゾル中でこれが主と
して使用される。

測定ｃ２重チェックとして標準的プロゲステロンを使用
することができる。ゾロデステロ／受容体の分析のため
、測定の１つは１１００ｎ［：３Ｈ）Ｒ５０２０＋１　
μＭ　コルチゾル（全結合を測定するため）及び１１０
０ｎの半分の（３Ｈ］Ｒ５０２０＋１０μＭ非ラヘルＲ
５０２ｏ＋１μＭコルチゾル（非特異的結合を測定する
ため）により行われる。エストロゲン受容体の分析のた
め、測定の１つは１００　ｎＭ（５Ｉ（）　ｘストラジ
オ−ルーＭ−β＋１０μＭ非ラベルエストラジオールに
より行う。

次に、各インキエペーション混合物を３容積（約５００
μｌ）の５　ｖ　／　ｖ％　ゲキストラン被覆木炭懸濁
液（ｃｍ　Ｏ１，５ｒｎＮｉ　　Ｍｇｃｔ２当り１０１
９の木炭及び１ダのデキストリンＴ−７０）で処理する
。４℃にて５分間インキ−ベートした後、溶液を１０’
Ｘ５Ｊ−にて２分間遠心し、そして２５０　／ｊｉずつ
の上清を放射能について測定する（すなわち、受容体結
合（！ＩＨ）ステロイド）。非特異的結合〔３Ｈ〕ステ
ロイドラベルされたステロイド及び非ラベルステロイド
を含む測定を全結合〔３Ｈ〕ステロイド（ラベル化ステ
ロイドのみを含む測定がら差引くことＫよシ特異的に結
合した〔３Ｈ〕ステロイドの量を得る７次に、後者を、
蛋白質ｍｇ当り又はＤＮＡｍｙ当す結合した〔３Ｈ〕ス
テロイドのｆ　ｍｏｔｅ又はｐ　ｍｏｔｅとしてグロッ
トする。組織ホモシネ−トイレットを０．５　Ｍ　Ｎａ
　ＣｔＯ４中に再懸ｆｉ（０，１１１７／”ｌｉ’組織
）し、９０″ＴＩＣＫて３０分間インキニベートし、そ
して冷却し、そして１００ＯＸＰで５分間遠心する。次
に、上清を上記のようにしてジフェニルアミン測定によ
りＤＮＡについて分析する。

以下余白 生検核結合（細胞培養）測定（ＢＮＢ−測定）により第
３図は、ＢＮＢ測定を用いる〔３Ｈ〕グロｒステロン（
パネルＡ）及ヒ〔３Ｈ〕ニストロダン（）臂ネルＢ）の
核結合を示す。例１に記載したように、全結合から非特
異的結合を差引いてステロイドの特異的核結合を得る。

後者は、各ステロイドの特異的受容体依存被結合を示す
。すなわち、時間依存特異的被結合を測定することがで
き、そして２２℃における６０分間のインキュペーシッ
ンが最適であることが見出された。

第４図は、測定において細胞培養のために単離された細
胞を得るためのコラ−ゲナーゼの使用が、組織培養のみ
の場合に比べて、測定感度を有意に増強する（５〜８倍
）ことを示している。示されているように、コラ−ゲナ
ーゼ処理により、卵管組織、乳癌組織及び子宮内膜組織
において、ステロイドの核取込みが増加する。篤くべき
ことに、過剰のコラ−ゲナーゼ処理（一層高い濃度）が
核におけ為ステロイド受容体の局在を阻害し得る。

測定のｄ当り約５０〜１００ＯＵのコラーダナーゼ活性
が最良の結果をもたらす。

第５図は、ラベルされたエストラジオール［！ＳＨ］Ｅ
、及びプログステロン（：３Ｈ）ｐの濃度変化が正常な
子宮内膜及び肺におけるこれらのステロイドの核結合に
与える効果を示す。予想されるように、非標的器官（例
えば正常な肺）はステロイド受容体を有しないだめほと
んど結合を示さない。これに対して、標的組織（正常な
子宮内膜）は機能的な受容体を有するため顕著な結合が
認められ、各ステロイドについて媒体巾約２５ｎＭのス
テロイド濃度において最大結合が生ずる。すなわち、飽
和した組織特異的被結合が示される。

第６〜９図は、この発明の測定法によって決定した場合
の、正常子宮内膜における（’Ｈ）ｐ及び（３Ｈ）Ｅの
核結合の４つの基本的性質を示す。第６図は、２２℃に
おけるインキエペーシ四ンに比べて、２℃において非常
に少ない特異的結合が生ずることを示している。一層高
い温度（例えば３７℃）は核結合の顕著な阻害を示す。

このことは核結合における受容体の関与を示す。なぜな
ら、約１０℃を超える温度の上昇によって達成される６
活性化”が可能でなければ、受容体は核部位に移行し、
そしてそれに結合しかいからである。受容体がステロイ
ドの核取込みに関与するという追加の証拠は、該結合の
ステロイド特異性である。

第７図は、非ラベルエストラジオールのみが〔３Ｈ〕エ
ストラジオールの核取込を減少せしめることをガ１丈。

（３Ｈ１ｐを分析する場合の同じ効果が観察される（デ
ータは示してない）。［’Ｈ）ｐの、ステロイド特異的
、組織特異的、時間及び温度依存性、飽和的核結合がこ
の発明の測定によって証明された。これらすべてがステ
ロイドの受容体依存性核結合に共通な性質である。

第８図は、被結合測定法が再現性を有することを示す。

パネルＡは全結合（［：”Ｈ）ステロイドのみを含む）
について実施した５つの別々の測定の結果を要約する。

各測定は２種類のインキーペーションから成る。この値
から非特異的結合（［３Ｈ）ステロイド＋１００倍の非
ラベルステロイドを含む測定）を差引けばＡネルＢに示
す特異的結合が求められる。計算された特異的結合の標
準誤差は平均値の±１０％Ｓ、Ｅであった。

測定される核結合放射能の量に対する組織の量の変化の
効果も検討した。第９図は、２５〜３００１ｎ９の正常
子宮内膜が核結合について同様の値をもたらすことを示
している。細胞培養法を伴うこの発明の測定法を用いる
乳癌生検体の分析は、正常な子宮内膜を用いるここに記
載した研究と同じ〔３Ｈ〕エストラジオールの核結合性
を示した。

モデル系としてヒナの卵管を使用して、ＢＮＢ測定法を
用いる核結合がインービデ核結合に類似するか否かを決
定した。未成熟ヒナ（生後７日）に注射当り５９ｍｇの
ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）を毎日、４〜２
０日間注射した。注射されなかったヒナの卵管は未分化
であるが、ニストロダン処理中に徐々に発育する。１６
〜２０日までに卵管は十分に発育する。第１０図は、イ
ン−ビデ条件とＢＮＢ測定との間の核結合の比較を示す
。これかられかるように、ＢＮＢ測定はインービデで達
成される核結合と同じレベルの飽和を示す。

第１１図は、子宮内膜癌を有する１２人の患者の分析を
示す。パネル１はこの発明のＢＮＢ測定の結果を示し、
そしてノ々ネルＢは常用の受容体定量測定（デキストラ
ン木炭吸着法）の結果を示す。

常用の９−８体定量測定（・（ネルＢ）は１２患者中１
１がプログステロンを用いる療法について陽性効果を予
想させるに十分なプログステロン受容体を有することを
示している。しかしながら、この発明の測雉（パネルＡ
　）　（ＢＮＢ測定）は、１２人の患者の内５人（全体
の４２％）のみがこの療法に反応するであろうことを予
想させる。この食い違いの理由は、適当なＰＲを有する
６人の患者（パネルＡ以上に星印を付しである）はステ
ロイド受容体の適当な核結合を水石ないことである。す
なわち、非機能的受容体が示される。この発明の測定の
他の検討は、研究された４６人の患者の内１７人（す寿
わち、全体の３７％）のみがグログステロン療法に反応
することが予想されることを示した。乳癌生検について
も同様の結果が得られた。

この発明の測定法により決定される場合、被結合ステロ
イドの量は、問題の癌中にどの程度の量の１生物学的に
活性な”受容体（すなわち、核アクセグタ一部位に結合
することができる受容体）が含まれているかについて迅
速な指標を研究者に与える。従って、この測定法は、常
用の受容体定量測定法に比べて、一層迅速Ｋ（ｃ日以内
に）そして一層正確に、ステロイドに反応する癌を予想
させる。さらに、この発明の測定法社、受容体の単離及
び定量を必要とする方法に比べて、又は無細胞系で単離
された核に結合する受容体を分析する方法に比べて、お
よそ１０分の１の組織を必要とする。所望により、この
測定で余った組織を使用して受容体を単離して常用法に
従って定量的又は定性的分析を行うことができる。

核ステロイド結合不足はすべてではないが主として、種
々の癌がステロイド療法に反応しない原因とあるであろ
う。このことは例えば肺癌、乳癌、子宮内膜癌、睾丸癌
、前立腺癌、リン・臂球癌及び骨髄腫、並びに下垂体癌
及び卵巣癌に妥当するであろう。従って、この発明の測
定は、用いるべき適切な療法を選択する臨床医の能力を
実質的に高め、そして有効な療法の選択に必要な時間を
節約するであろう。

この発明の測定方法はまた、ステロイド依存性細胞が関
連する他の非癌性の病的状態における機能的ステロイド
受容体の存否を決定するために有用であろう。例えば、
この発明の測定法は、肺性リンパ管筋腫症を有する患者
からの肺組織中の機能的グロダステロンをポジティブに
同定した。

Ｍ、Ｌ、　Ｇｒａｈａｍ等、マヨΦクリン・ゾロク（Ｍ
ａｙｏ。

Ｃｌ１ｎ、　Ｐｒｏｅ、）　、　５９　、３（ｃ９８４
）を参照のこと。

引用によりこの開示をこの明細書に組み入れる。

以上、この発明を具体例により説明したが、この発明の
範囲はこれらの具体例に限定されるものではない。

【図面の簡単な説明】

第１図は常用の受容体定量法の系統図である。 第２図はこの発明の方法の系統図でちる。 第３図はＢＮＢ測定法を用いる正常子宮内膜における〔
３Ｈ〕グロｒステロン及び〔３Ｈ〕エストラジオールの
被結合を示すグラフである。 第４図はＢＮＢ測定法における［３Ｈ）、の被結合に対
するコラ−ゲナーゼ処理の効果を示すグラフである。 第５図はＢＮＢ測定法における被結合に対する媒体中の
（”ＨＯＥ及び（’Ｈ）　ｐ濃度の効果を示すグラフで
ある。 第６図は２℃、２２℃、及び３７℃における正常な子宮
内膜の組織培養における〔３Ｈ〕グロｒステロンの被結
合を示すグラフである。 第７図はＢＮＢ測定法における〔３Ｈ〕エストラジオー
ルの被結合のステロイド特異性を示すグラフである。 第８図は機能的受容体についての組織培養測定の再現性
を示すグラフである。 第９図は組織培養測定における［：’５Ｒ）７’ログス
テロンの被結合に対する組織の量の効果を示すグラフで
ある。 第１０図はヒナ卵管−プロゲステロン系ニおける、ＢＮ
Ｂ測定法とインービゲ核結合との比較を示すグラフであ
る。 第１１図は子宮内膜癌の生検体における［３Ｈ）Ｐの被
結合及び受容体濃度を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、核ステロイド結合について組織サンプルを測定する
   ことにより機能的細胞性ステロイド受容体の存在を迅速
   に決定する方法であって、 （ａ）前記組織サンプルを断片化し； （ｂ）該断片化された組織をコラーゲナーゼで消化し； （ｃ）該消化された組織から細胞を単離し； （ｄ）該細胞を、前記受容体と複合体を形成することが
   できる放射性ラベルステロイドとインキュベートし； （ｅ）細胞核を単離し；そして、 （ｆ）結合した放射能及び該核の全ＤＮＡを測定する； ことを含んで成る方法。 ２、前記組織サンプルが癌組織である特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ３、前記癌が乳癌、子宮内膜癌、睾丸癌、肺癌、骨髄腫
   及び前立腺癌から成る群から選択される特許請求の範囲
   第２項記載の方法。 ４、約１〜１０００ｍｇの組織が断片化される特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ５、前記組織を、組織ｍｇ当り約０．５〜１５ユニット
   のコラーゲナーゼと接触せしめる特許請求の範囲第４項
   記載の方法。 ６、前記単離された細胞を約１０〜５０ｎＭの放射性ラ
   ベルされたステロイドを含む媒体中でインキュベートす
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、前記放射性ラベルされたステロイドが〔＾３Ｈ〕−
   プロゲステロン又は〔＾３Ｈ〕−エストラジオールであ
   る特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、前記インキュベートされた細胞のホモジネートを、
   シュークロース、グリセリン、オクトキシノール−９、
   Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及びＫＣｌを含んで成る冷たい中性の
   水性媒体上に重層し、そしてこの重層された媒体を遠心
   分離して精製された核のペレットを得ることにより核を
   単離する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９、前記ペレットをＴｒｉｓ−ＨＣｌ及びグリセリンを
   含んで成る中性溶液に分散せしめそして分散した核をろ
   過により集めることをさらに含んで成る特許請求の範囲
   第８項に記載の方法。 １０、前記核のＤＮＡをジフェニルアミン測定法によっ
   て測定する特許請求の範囲第１項記載の方法。 １１、前記核をプロテアーゼ及びリボヌクレアーゼで処
   理し、この処理された核をエチジウムブロミドと混合し
   、そして該核の螢光を測定することを含んで成る方法に
   より該核のＤＮＡを測定する特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 １２、組織サンプルを核ステロイド結合について測定す
   ることを含んで成る癌細胞中の機能的ステロイド受容体
   の存在を迅速に決定する方法であって、 （ａ）生検により組織サンプルを得； （ｂ）該組織サンプルを断片化し； （ｃ）該断片化された組織サンプルを、組織ｍｇ当り約
   １〜５ユニットのコラーゲナーゼと接触せしめることに
   より該組織サンプルを破壊し； （ｄ）該組織サンプルから細胞を単離し； （ｅ）該細胞を、前記受容体と複合体を形成することが
   できる放射性ラベルされたステロイドと共にインキュベ
   ートし； （ｆ）該インキュベートされた細胞をホモジナイズし； （ｇ）該ホモジネートを、シュークロース、グリセリン
   、オクトキシノール−９、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及びＫＣｌ
   を含んで成る冷たい中性の水性媒体上に重層し； （ｈ）該重層媒体を遠心して精製された核のペレットを
   得；そして （ｉ）該核の結合した放射能及び全ＤＮＡを測定する； ことを含んで成る方法。 １３、生検により約１〜２５ｍｇの組織を得る特許請求
   の範囲第１２項記載の方法。 １４、生検により約１〜５９ｍｇの組織を得る特許請求
   の範囲第１２項記載の方法。 １５、前記細胞を、約２０〜３０ｎＭ〔＾３Ｈ〕−プロ
   ゲステロン又は〔＾３Ｈ〕−エストラジオールを含んで
   成る媒体中にインキュベートする特許請求の範囲第１２
   項記載の方法。 １６、前記細胞を約１８〜３７℃にて約０．５〜１．５
   時間インキュベートする特許請求の範囲第１５項記載の
   方法。 １７、前記細胞を約２２℃にて約１．０時間インキュベ
   ートする特許請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、段階（ｈ）がさらに、精製された核のペレットを
   Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及びグリセリンを含んで成る中性水性
   溶液中に分散せしめ、そしてそれらを遠心分離によって
   集めることを含んで成る特許請求の範囲第１２項記載の
   方法。