JPS6091981A - 逆転写酵素多型成分の分離精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ニヮトすのトリ骨髄芽球症ウィルス（以ＦＡ
ＭＶと略称する）に存在する逆転写酵素（ＲＴａｓｅ　
）の精製法に関し、詳しく　Ｉｒｉ　ＡＭＶのもつα型
、αβ型３よσββ型の逆転写「・４Ｙ素（以「α型、
αβ型およびββ型金）忽称して多型という）をそれぞ
れ分離して精製する方法に関する。

一般に、レトロウィルスとよばれルＲＮＡ　ウィルスの
一群のものは、ＲＮＡウィルスが増殖する際に、遺伝子
ＩｔＮＡがＤＮＡに逆転写されて宿主細胞染色体に組込
まれ、その後ＤＮＡが転写されて、遺伝子ＲＮＡを再生
産するという機構を保有するだめ、宿主をガン化する活
性をもったウィルス群として知られている。また、前記
ＲＮＡをＤＮＡに逆転写する反応は、前記レトロウィル
ス粒子に微量成分として存在する逆転写酵素によって触
媒されるものであることも知られている。これらのこと
から、前記逆転写酵素はウィルスによるガン化の機構を
解析する利料として重要視される一面を持っている。

またこの逆転写酵素は、別に、遺伝子工学の領域におい
て極めで重要視されている特筆すべき一面がある。すな
わち、１１１伝子工学の分野で急速に発展した組換えＤ
ＮＡ技術により、動植物に関する遺伝子構造は次第に明
らかにされ、更に有用物質の生産などにも前記遺伝子工
学の方法が導入されて生物工学の技術革新が盛んとなっ
ている。そしてこれらの分野で必要となる特定の遺伝子
を単離する方法は、その遺伝子に由来するメツセンジャ
ーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ　）に相補的なりＮＡ　（ｃＤＮ
Ａ　）　ｆ：合成することを基本とするのであり、この
ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する方法の唯一のものが、
逆転写酵素を用いた酵素的方法である点に、該逆転写酵
奏が重要視される理由がある。

なお、前記逆転写酵素と密接に関係するレトロウィルス
の生物学的性状についてハ、トリレトロウィルス他マウ
スなどの哺乳動物、近時にはヒトのレトロウィルスにつ
いても復党が進んでいる。

しかしこれらレトロウィルスに微量に含まれる逆転写酵
素の分子的性状については、実際上、ウィルスを犬准に
生産できる特殊な系のものに限ってその調整が行なわれ
ていたという現実から、トリレトロウィルスＶこ由来す
る酵素についてのみよく理解されてきているにすぎない
。ちなみに、現在において商業的ルートから入手される
逆転写酵素は、ＡＭＶ由来のものであり、具体的には米
国Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅ
ａｌｔｈのガン特別研究の一環として開発された特定の
ＡＭＶ逆転写酵素生産系（ＡＭＶに感受性の高いハイラ
イン系のニワトリ）で大量生産されたＡＭＶに由来して
いる。

ところで、前述したように近時においてその重要性、必
要性が急速に高１っている逆転ｑ酵素は、その供給面に
おいて、唄的にまた質的に改善されるべき問題が指摘さ
れている。前記は的問題とは、需要に見合った惜の確保
を、前記したノ・イライン系のニワトリによる生産系に
全て依存するのでは、様々な形で問題を招くということ
である。また質的問題とは、次のような配慮すべき改善
の点として把握される。その一つは、従来のＡＭＶ由来
の逆転酵素の市販品は、一般に生化学において用いられ
ているイオン交換園脂（ＤＥＡＥセルロース、　ＣＭセ
ルロース）を利用したイオン交換クロマトグラフ　イＶ
Ｃ，１：　Ｄ　ｒ’ｉ４製されたもの（Ｈｏｕｔｓ　Ｇ
、Ｅ−＋Ｍｉｙａｇｉ　Ｍ、　ｒ　ＥｌｌｉＩＩＣ，、
Ｂｅａｒｄ　Ｄ、　ａｎｄ　Ｂｅａｒｄ　Ｊ、　Ｗ、；
Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　、　２９　、５１７　、１９７９
　）であるが、逆転写酵素は極めて不安定な酵素である
ため、前記１′８製においては犬ｌのウィルスから出発
しタン／？り濃度の低トを防ぐことが不可欠になるとい
う点である。他の一つは、近時において、トリレトロウ
ィルスにはα型。

αβ型、ββ型の３種の逆転写酵素が存在し、かつこれ
らの反応性には差のあることが知られるようになってき
ているため、高効率、良質の逆転写酵素として、３種混
合のものではなく、単離し精製して有用性の高い形とし
たものが望寸れるという点である。

更に前記３種の逆転写酵素の同定に関しては、既にいく
つかの研究が発表されている。例えばＪｏｋｌｉｋらが
行なったトリ肉腫ウィルス８７７株についてのもの（Ｈ
ｉｚｉ　Ａ、　ａｎｄ　Ｊｏｋｌｉｋ　Ｗ、　Ｋ、　：
　Ｊ。

Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　、　２５２　、２２８１　、１９
７７　）があり、また石浜らは、ＡＭＶについて前記３
種の同定を行なっている（　Ｕｅｎｏ　Ａ、　＋　Ｉｉ
ｓｈｉｈａｍａ　Ａ、　ａｎｄＴｏｙｏｓｈｉｍａ　Ｋ
、　；　、Ｌ旧ｏｅｈｅｍ、　９１　、３１１　、１９
８２）。

石浜らの研究は、ＡＭＶの精製粒子を非イオン性界面活
性剤で処理して脂質性皮膜を解離した後、塩化センラム
密度勾配遠心法で逆転写酵素を遠心管中間層に回収して
粗精製標品としくなお、この際ウィルスＲＮＡは沈澱に
、脂質皮ｊ換は遠心管上部に分離する）、前記標品音用
いて、ポリ７チクル酸アガロースを吸着剤としだカラム
クロマトグラフィーにより逆転写酵素３種成分を分離同
定したものである。

しかしながら、前記したＩリシチジル酸アガロースを用
いたカラムクロマトグラフィーでは、逆転写酵素３種成
分の相互の分離が不充分であり、また；１？　ＩＪシチ
ソル酸が損傷を受け易いという問題がある。この問題は
、具体的には高い逆転写酵素活性を持つα型およびαβ
型の分画のうり、α型分画にζχβ型の混在が認められ
ることとして認識式れ、更にこのような混在は、逆転写
酵素の粗精製標品中に混在するピリミジン／ｉ’＃異的
ＲＮＡ水解酵素がポリシチジル酸を損傷させていること
に起因する問題として把握される。

本発明者等は、前記した種々の問題を改善すべく鋭意研
究全型ねた結果、−生産の良好な新たなニワトリの系を
見い出すと共に、卯に由来する逆転写酵素多型成分を、
その粗精製標品がら効率よく、簡便に、再現性よく分離
精製する方法を発明するに至った。

すなわち、本発明者等はまず多数多糊のニワトリの系統
について一感受性を調べたところ、財団法人日本生物科
学研究Ｑｉにおいて、白色レグポーン極、ファヨウミ棟
を起源として離型さｉｚだ、特別な病諒体を含まないい
わゆるＳＰＦ　（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｐａｔｈｏｇｅｎ　
ｆｒｅｅ　）のニワトリ；ＬｉｎｅＭ系、　ＰＮＰ系。

ＧＳＮ／Ｉ系（ｌ″Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ
ｄｅｘ　ｏｆ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓ’
　；　Ｌｉｎｅ−Ｍ　Ｊ−Ｎｌ　、　ＰＮＰ　Ｊ−Ｎｌ
　＋　ＧＳＮ／ＩＪ−Ｎｉ　、　ｒ小渕沢１５年のあゆ
み」；昭和５７年５月１５日発行：日本生物科学１１Ｆ
死所）は、他の系に比べて発症率が商く、かつ個体当り
の血漿収量も高いことを見い出すに至った。

なお、前記ＳＰＦ糸を用いるのは、他のウィルス等の増
殖があると、目的とするＡＭＶが１１ノ、独には得らな
くなるので、これ全罐りるためである。

また水元り］４等は、前記Ｌｉｎｅ　Ｍ等のウィルス生
産量を検定するにあたり、従来法の複雑な操作等の緘点
を解消した新規かつ間易な検定法を開発した。これを少
し旺しく述べると、従来のウィルス増殖の測定は、ＡＭ
Ｖを接抽した幼雛の血漿中に放出されるウィルスの逆転
写酵素量１牛を測定するか、Ｃ０ＦＡＬ試吸で測定する
かによっているが、罰者では放射性同位元素を１史用し
なけｔｌ、はならず、後者では細胞培養、面体結合反応
を利用する復雑な方法となるなどの問題がある。−万、
本発明者等の開発した検定法は、ＡＴＰ水がｒ酢累（Ａ
ＴＰａｓｅ　）活性を指標とするものであり、極めてＩ
ハ］易な方法となった。前記ＡＴＰａｓｅは、従来よシ
ウイルス粒子に結合して存在することが知らノ′１．て
いたが、本発明者等は更に、このウィルス結合ＡＴＰａ
ｓｅ　活性と逆転写酵素活性との間に正比例的相関性が
あることを知見し、したがって測定法が既知であるＡＴ
Ｐａｓｓ活性を指標として逆転写酵素量を検定すること
を可能としたのである。

次ぎに、ＬｉｎｅＭ等を使用した場合のＡＭＶを得る工
程を参考的Ｑ（−以下に・１す。

■　ウィルスの接伸 ＡＭＶ及びＲＡＶ　（ラウスアソシ上イブッドウイルス
）−１，−２の混合したものを枦ｉウィルスとして使用
した。このウィルスはＤｒ、　Ｊ、　Ｄ、Ｂｅａｒｄ、
＋　Ｉ）ｒ−Ｒ，ｌ５ｈｌｚａｋｉ　ｊ　Ｄ分与さｉ＋
、ｉｊ４ので必る。（Ｈ＋ウィルスは一８０］′こｐｌ
ａｓｍａの状ｄで保存して使Ｊ旧１１１に急速７１Ｉｉ
球し、リン酸ちＭ　７備液（ＰＢＳ　）で希釈して生後
３日−ヒナの心１凧内に接１１にシた。・扱ｔｉｌｔ　
したヒナは２５　’Ｃの温度に１ｔｉｌｌ伺ルたアイン
レータ内で飼貸した。

■　トリの発病度と血漿内Ａ’ｆＰａｓｅ活性ウィルス
にはウィルスの外被タンパクに結合したＡＴＰａｓｅが
ありこのぞ古注を測定することによりウィルスの１杖を
６川定した。

トリの発病度のマーカーには肝１輩の肥大の程度を使い
、肝ｉ藏がｊ胸骨よりあきらかに出てｔまれの認めらｉ
Ｌるものを＋３、その中曲１−１−２．＋１としてはれ
の認められないものをｏとした。

血漿分採工１５！する時期は肝臓大が＋３となったとき
とした。

得られた血漿からＡＩ’ｉ’ＩＶを精製する操作概要は
次の辿りである。

血　漿 ↓ ２．５００回転で１０分間遠心 ↓ 上７ｎ ↓ ３４．０００Ｘｇで９０分間遠Ｉし ↓ 沈澱 ↓ ５０７トリスー塩酸緩衝液（Ｐｌｌ　７．８　）に懸濁
↓ ３秒間５回１波処理 ↓ １５％−３５％−５０％サッカロース督度勾配遠心↓ ３５係サツ力ロース層よりＡＭＶを回収上記操作による
ＡＭＶ鞘製結果の一例を下記表１に示す。

上記表１によってタンパク単位量当りのＡＴＰａｓｅ活
性は、血漿段階に比べて精製後１４８倍となっているこ
とが分かる。

なお、ＡＭｖの特性については充分解明されており、例
えは文Ｍ　（Ｂｌｏｃｈｅｍｉｃａ、　ｅｔ、　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ、　２４５−２７１　６５１巻
、１９８２　）を挙げることができる。

次き゛に、前記したＳＰＦニワトリ、ＬｉｎｅＭ等で増
殖させたＡＭＶ’ｆ出発桐料として用いた逆転写酵素多
型成分の分離相製法について述べる。

本発明は、ＡＭＶを原料として粗精製さｉした、逆転写
酵素の溶解分画を、透析処理した後ポリグアニル酸アガ
ロスを吸着剤としだカラムに通し、吸着したα型、αβ
型およびββ型の逆転写酵素の多型成分を、溶出液に含
まれる塩化ナトリウムの濃度を変化させてそれぞれ成分
毎に選択溶出させることを特徴とする。

前記において逆転写酵素（ＲＴａ　ｓ　ｅ　）多型成分
の粗精製操作ａ喪例を示せば次の辿りである。

梢　製　ＡＭＶ ＊　ＡＭＶ　ｔ＆　イｉ’ｆ宥’Ｆｌ。

↓ 同液に最終濃度０．１　ｍＭとなるようＶこジイソゾロ
ビルフルオロフォスフェートを、１ｍＭとなるようにフ
、ニールメチルサルフォニルフルオリドヲ深加↓ ３秒間、５回音波処理 ↓ 水中に３時間静置 ↓ ４ＭＣ５ＣＬ上に１．５　Ｍ　Ｃ５Ｃｔ　ｆ：重層した
ものに破砕されたＡＭＶを重層し、５Ｗ−５０，１０−
ター（ペックマン社）を用いて４２，０００回転で４０
時間遠ノし↓ 中　間　層　（第１図参照） なお以上の逆転写酵素多型成分の粗精製は、ｔ＋ｉＪ己
した石浜らの方法に準拠したものである。

本発明において、逆転写酵素の前記粗相製標品は、緩衝
液中で所定時間透析処理される。

前記緩１・ｆｒｊ液は、以下に述べるカラムクロマトダ
ラフィーの操作において、カラム基材を膨潤平衡化させ
る溶液として、また塩化ナトリウムを加えて使用する洗
浄液および溶出液として共通的に使用される。

本発明において使用される前記緩衝液としては、一般的
にはトリス−塩酸緩衝液が好ましく使用されるが、この
他にリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−（２−ヒド
ロキシエチル）ピペラジン−「＝２−エタンスルポン酸
）等を使用することができる。１だこれら緩衝液はｐｌ
（５〜９、女イましくはＰ１４７．４程度にして用いる
ことがよい。本発明において、逆転写酵素と吸着させる
カラム大月（吸着剤）として、ポリグアニル酸を結合し
たアガロースが用いられる。これは、該ポリグアニル酸
は逆転写酵素を好適に吸着し、しかも粗精製標品中に含
まれるピリミジン特異的ＲＮＡ水解酵素によっては損傷
されないという性質があることを、本発明者等が見出し
たことに主に基づいてお２す、こｉｔによシ逆転写酵素
多型成分の相互の分離が好適に達成される。

また、本発明において、溶出液に含まれる塩化ナトリウ
ムの濃度を変化させて、カラム大月に吸着した前記各型
成分を選択的に溶出させるとは、一般的には、低濃度か
ら高濃度に葭って溶出液の塩化ナトリウム濃度を直線的
に変化させることで、相互に重複し々いハ１定の濃度で
、α型、（χβ型およびββ型の逆転写酵素を溶出させ
ることをいうが、これは必ずしも直線的一度変化の場合
に限定されるものではない。前記各型成分は、塩化ナト
リウム濃度を１＠線的ないし段階的に低→高の変化させ
た場合には、初めにα型が溶出し、次いでαβ型が溶出
し、最後にββ型が溶出する。

第２図（テ）、（ロ）、（ハ）は同様の操作を用いて、
それぞれ、ポリシチジル酸（ポリ（Ｑという）アガロー
ス、ボリアデニール酸（ポリ（Ａ）という）アガロース
、ポリウリジル酸（ポリ（Ｌ］）という）アガロースを
カラム基材とした場合の逆転写酵素（ＲＴａｓｅ）の溶
出ノミターンを示したものであり、後記する本発明法に
従った実施例１の溶出パターン（第３図参照）に比較す
ると、ｄ”ＩＪ（Ｃ’ｌ（第２図←））では最初のピー
クにα型およびαβ型が混在してα型の単離ができない
欠点があシ、ポリ（Ａ）（第２図Ｏ１：Ｉ）　）および
ポＩＪ　（Ｕ）　（第２図（ハ））では、α型、αβ型
の溶出ピークが近接しているために、α型およびαβ型
の単離をするのに困難を伴う欠点がある。

これに比較して、本発明法においては実施例とした例示
し／こ第３図に示すように、α４１．ｑ　、αβ型およ
びββ型の溶出ピークが充分に離間しているのでそれぞ
れの高純度の単離が可能となる。またα型、αβ型の各
溶出ピークの分画にそれぞれの混在も認めらｈないとい
う効果が得ら３１．た。

なお前記したα型、αβ型およびββ型は、それぞれ分
子量がα型；６７０００．αβ型；１５９０００、ββ
型；　１８４０００　であることから、これらの分子量
を指標として電気泳動法によりそれぞれを同定した。

ββ型は逆転写酵素活性が低い。このため直接にはその
治用件は乏しいが、溶出させることによってカラノ・４
１３使用を図ることが望ましい。また以上の分離精製の
操作は温度Ｏ〜４℃の条件下で行なうことがよい。

以上の操作により、トリ骨髄芽球４１［ウィルスに由来
する逆転写酵素は、効率よく回収さｈＸ捷だ高い酵素活
性を示すα型およびαβ型に良好に分離され、これらの
性質の相違（反応性の相違）に応じてそれぞれに好適な
用途への効果的な適用が実現されるものとなった。

次ぎに、以上によって分離さｔしたα型、（χβ型の逆
転写酵素の高純度化について説明する。

前記のように精度よく分離されたα型およびαβ型の逆
転写酵素について本発明者宿・が史に詳細な検削を車ね
たところ、場合によって逆転写酵素の作用が充分に従さ
れないことのあるのが知見された。例えば、前記の操作
により分離精製された逆転写酵素を用いて組換えＤＮＡ
￥験智を行なう場合において、ｃＤＮＡの合成を微量な
ｍＲＮＡを出発月相として行なうと、目的とするｃＤＮ
Ａが効果的に合成されない場合が認められる。

この問題は、前記分離精製法によシ得られた逆転写ｗ累
のα型およびζχβ型の溶解画分には、微量に酵素ヌク
レアーゼ（ＲＮａｓｅ　、　ＤＮａａｅ　）が混在し、
これが逆転写酵素の使用に際してＲＮＡ　、　ＤＮＡを
水解する活性を示すことに原因すると考えられる。この
ような混在ヌクレアーゼの存在は、逆転写酵素の使用宗
件によっては１大な障害となる。

そこで本発明においては、前記逆転写酵素多型成分の分
離精製法を前提とし、史にこれを発展させてα型およσ
αβ型の逆転写酵素から混在ヌクレアーゼを除去して高
純度化するものとした。

而して本願の第２査目の発明は、前記分離精製法によっ
て得られた逆転写酵素のα型溶出分画から・−・９す７
アガロースをカラム基材（吸着剤）としたカラムクロマ
トグラフィーによシ混在ヌクレアーゼを除去することを
特徴とし、また本願の第３番目の発明は、同様に逆転写
酵素のαβ型溶出分画から、ＤＮＡセルロースをカラム
基材（吸着剤）としだカラムクロマトグラフィーにより
混在ヌクレアーゼを除去することを特徴とする。

α型逆転写酵素を高純度化する具体的操作概要は、前記
分離ｎ製法によシ得られた逆転写酵素α型溶出分画を、
緩１両液を用いて透析処理した後、同緩衝液により１彫
潤平衡化されたカラム内のヘパリンアガロースに通して
吸着させ、洗浄後、塩化ナトリウムを含む溶出液により
α型逆転写酵素をｔｅ＋出させることでなされる。

前記溶出液は、一般的には緩衝液に１ツ［定の範囲で塩
化ナトリウムの濃度を変化させて加えるようにして用い
られ、また緩衝液は、前記ポリグアニル酸アガロースを
用いた分離和製の場合と同様である。

前記においてへ・９リンとは、補乳動物にある抗凝血活
性を示すムコ多糖であり、この陰イオン性ポリマーであ
るへ／′ｔ′リンを結合したアガロースをカラム基材と
して用いると、一般に核酸と相反作用をし核酸に結合す
る酵素タンノ４りはカラムに吸着される。したがって前
記逆転写酵素のα型溶出分画ヲヘパリンアガロースカラ
ムにＩＩ＆着させ、その後例えば塩化す）　ＩＪウム濃
度を連続的に上げながら通液すると、所定の濃度（約Ｎ
ａＣ４０，１１Ｍ　）で鋭いピークを形成してα型逆転
写酵素は溶出され、この溶出分画（・マ、ＲＮａｓｅ　
＊　ＤＮａｓｅの活性が認めらり、ない高純度のα型逆
転写酵素として単離精製された。

゛またαβ型逆転写酵素を高純度化する具体的操作概要
は、カラム基材を、前記α型についてのヘパリンアガロ
ースＫ　代、ｔて、ＤＮＡをセルロースに結合シたＤＮ
Ａセルロースを用いるようにした他は同様であシ、Ｎａ
Ｃ６の濃度は約０．２４Ｍの濃度で鋭いピークを形成し
て溶出され、この溶出分画には、ＲＮａ　ｓｅ　、　Ｄ
Ｎａｓ　ｅの活性は認められず、高純度αβ型逆転写酵
素が精製された。

以下本発明の実施例について示す。

実施例１ 第１図に示した中間層に回収した逆転写酵素粗精候標品
を、２〜４℃で１０　ｍＭソチオスライ）　−ル（以下
ＤＴＴと略す。）、２０％ダリセロールを含む１０　ｒ
ｒＭ　トリス−塩酸緩衝液（Ｐｉ（７，４）中に一晩透
析する。透析後、同標品を上記緩衝液で膨ｉ１Ｊさせた
ポリグアニル酸アガロースに吸着させ、上記緩衝液に２
５　＋ｎＭ　ＮａＣｊを含む液で洗浄後、上記緩衝液に
２５　ｍＭからＬＭのＮａ　ＣＬの直線的ｍ度勾配をか
けて溶出させる。水洗で得られた溶出・Ｐターンは２．
ｇ３図に示すとおシであった。

実施例２ 実施例１により、ｊ５リグアニル酸アガロースカラムク
ロマトク０ラフイーで、Ｎａ０４ｇ度０．　ｉ　５　Ｍ
＋Ｊ近で溶出されてくるα型逆転写酵素分画を、１０１
ＴＩＭＤＴ’ｒ　、　２０チグリセロールを含む１０　
ｍＭ、　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）中に一晩透
析する。透析後、同標品ケ上記緩挿工液で１彰（蘭平衡
化したへ・ｅ　ＩＪンアカ゛ロースに吸水させ、上記緩
衝液に２５　ｍＭ　ＮａＣ１を含む准で洗浄後、上記緩
衝液に２５ｍＭからＩＭのＮａＣ４の直線的濃度勾配を
かけて溶出させる。水洗で得られた溶出・ぞターンは第
４図に示すとおりであった。

実施例３ 実施例１により　、ｉｇリグアニン酸アガロースカラム
クロマトグラフィーで、ＮａＣ４濃度０．４９　Ｍ　Ｈ
近で溶出されてくるαβ型逆転写酵素分画を、１０ｍＭ
ＤＴＴ　、２０チグリセロールを含む１０　ｍＭ　）リ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）中に一晩透析する。透析
佼、同標品を上記緩衝液で膨潤平衡化したＤＮＡセルロ
ースに吸潔させ、上記緩衝液に２５　ｍＭ　ＮａＣ１を
含む液で洗浄後、上記緩衝液に２５　ｍＭからＩＭのＮ
ａ　Ｃ１の直線的濃度勾配をかけて溶出させる。本状で
得られた溶出パターンは第５図に示すとおりであった。

以上の実施例１，２．３による結果を総合して示すと次
の辿シである。

すなわち、逆転写酵素の回収については、既にいくつか
の先行技術が提示されているが、これらに比べて本発明
法による逆転写酵素の回収率は極めて高いものであった
。この比較を次記表２に示す。

精製ＡＭＶ（タンパク１汁で６２．７ｍｇ）を出発材料
としだ前記各実施例１〜３に従った各鞘か２段階での逆
転写酵素油性を下記表３に示した。

上目己着３の矛１．果より、実施例２．３では、ヌクレ
アーゼ（ＲＮａｓｅ　、　ＤＮａｓｅ　）　ｋ含捷ない
逆転写酵素のα型、（χβ１１冴がそれぞれ中、離鞘製
さり、ていることがわかる。

なお、以上述べた逆転写酵素（ＲＴａｓｅ　）の活性測
定は次の方法に従った。

反応液。

１Ｍ　トリス−塩酸ｖｉ前ａ（ｐＨｓ、ｉ）　；　５１
１１１０．５Ｍ　ジチオスライトール　；　１〃５Ｍ　
ＮａＣＡ　；　ｌ　ｓ ＩＭ　ＭｇＣｌ２　；　１　Ｉ ２．５＋ｎＭ　［ＨＩＴＴＰ　；　２　ｔｒ（ｌ（？ノ
ベルしたチミジンミリン酸）５　ｕ／ｍｅ　ポリ（Ａ）
オリゴ（ｄＴ）　；２＃に測定標品２μｌを加え、史に
Ｈ２０ケ力（ｊえて最終量１００μｌとし、３７℃で３
０分間反応させた後、１０　％　）　’Ｊクロル酢酸ケ
１００　ｔｔｌｌ加えて酸不溶性物質への　１■のとり
込みにを測定する。ＲＴａ　ｓ　ｅの酵素活性単位は、
１０分間にｌｎｍｏｌの［１（ＩＴＴＰがとシ込−ｔｈ
る場合を１ユニッｌ−（Ｌｌ）として示した。

また、ヌクレアーゼ（ＲＮｎｓｅ　、　ＤＮａｓｅ　）
のイ１無の判定は次の方、宍に向った。

反応液。

１Ｍ）リス−１，Ｍ［Ａ＄＋ｍｊ敢（ｐＨ８，１）　；
　５１ＬｌＯ８５Ｍ　ノチオヌライＩ・−ル　；　１　
〃５Ｍ　ＮａＣ２：　ｉ　Ｎ Ｉ　Ｍ　ＭｇＣ１，、：　Ｉ　ＩＩ λファージＤＮＡ　；　０．２５μｇ またはウザギ１８ＳｒＲＮＡ（す、Ｉ（ソームＲＮＡ）
に測定標品を逆転写酵素活性を４０１３えて加え、史に
）Ｉ２０を力１１えて最終量１００μｌとし、３７℃で
１８時間反比、させた後、１５係アガロースを支持体と
する酸気泳動を行ない、反応ｆａｉｌのλＤＮＡまたは
ｒＲ１’ＪＡが断片化して分子知が減少するかどうかで
判定した。

【図面の簡単な説明】

第１図は塩化セシウム密度勾配遠心法により中間層に逆
転写酵素の粗精製標品が得られることを示す図、第２図
（イ）、←）、（ハ）は、それぞれ本発明法の操作を用
いて他の種類のカラム基材により多型成分を分１４１ｆ
ｉσせた場合の溶出／ｅターンに示す図、第３図は本発
明法実施例１により行なった冬型成分の分離溶出パター
ン葡示す図、第４図は実施例２のα型逆転写酵素の溶出
・ぐターンを示ス図、第５図は実施例３のαβ型逆転写
酵素の溶出パターンを示す図である。 １・・□・：・ｊ 代（４１ｊ人　合　山　輝　雄１・・′１“・・′岸　
１）　市　行１．１ ＋：１−１ η丁　部　興　治、１１ １ 第１図

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）トリ骨髄芽球症ウィルスを原料として粗精製され
   た、逆転写酵素の溶解分画を、透析処理した後月？リグ
   アニル酸アｆロースを吸着剤としたカラムに通し、吸着
   したα型、αβ型およびββ型の逆転写酵素の各成分を
   、溶出液に含゛止れる塩化ナトリウムの濃度を変化させ
   てそれぞれ選択溶出させることを特徴とする逆転写酵素
   冬型成分の分肉「イ青、製法　。
2. （２）トリ骨髄芽球症ウィルスを原料として粗精製され
   た、逆転写酵素の溶解分画を、透析処理した後目？リグ
   アニル酸アノｆロースを吸着剤としだカラムに通し、次
   いで塩化ナトリウムを含む溶液を用いてα型逆転写酵素
   を選択溶出させた分画を得、更にこれを透析処理した後
   へ・ぐリンアガロースを吸着剤とし／こカラムに通し、
   塩化ナトリウムを含む溶出液を用いてヌクレアーゼの混
   在がない高純度のα型逆転写酵素を溶出させることを特
   徴とする逆転写酵素冬型成分の分離に１１製法。
3. （３）トリ骨髄芽ＢＲ症ウィルスを原料として粗精製さ
   れた、逆転写酵素の溶解分画を、透析処理した後ポリグ
   アニル酸アガロースを吸着剤としだカラムに通し、次い
   で塩化ナト、リウムを含む溶出液を用いてαβ型逆転写
   酵素を選択溶出させた分両全得、更にこれを透析処理し
   た後ＤＮＡセルロースを吸着剤としたカラムに通し、塩
   化ナトリウムを含むｍ液を用いてヌクレアーゼの混在が
   ない高純度のαβ型逆転写酵素を溶出させることを特徴
   とする逆転写酵素冬型成分の分離イ゛Ｎ製法。