JPS60502154A

JPS60502154A - マラリア感染症に対する感染防御免疫応答に関する方法と材料

Info

Publication number: JPS60502154A
Application number: JP59503202A
Authority: JP
Inventors: リステイツク　ミオドラグ; チルバート　メアリー　リン
Original assignee: ユニヴア−シテイ　オブ　イリノイ
Priority date: 1983-08-19
Filing date: 1984-08-15
Publication date: 1985-12-12
Also published as: JPS60502206A; EP0136215A3; WO1985000976A1; EP0136215A2; US4767622A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】マラリア感染症に対する感染防御免疫応答に関する方法と材料本発明は、１９８３年８月１９日出願の共同係属米国特許出願番号５２４．９１９の一部継続出願である。

宣−員本発明は、ヒトを含むを椎動物のマラリア感染症に対する免疫防御応答に関して有効な方法と材料に関する。

ヒトのマラリアは、ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属の寄生性微生物種によって起こる。

この寄生虫は、蚊の体液中に有性生殖母体内の形で存在し、蚊を媒介としてヒトに感染する。つまり、蚊の体内でこの寄生虫は、有性生殖を経て、スポロゾイト　（胞子体）となり、蚊がヒト等を刺す時に新しい宿主に感染する。新しい宿主では、このスポロゾイトは、肝臓で“赤血球外（ｅｘｏｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ　）”のサイクルを経て増殖するが、その間、臨床症状は示されない。この赤血球外で繁殖したメロゾイト　（分裂体）は、宿主の赤血球に侵入し、赤血球中で増殖し、マラリア特有の臨床症状を引き起こす。赤血球細胞の破壊は、Ｐ、ν １ｖａｘ　（三日熱マラリア原虫）　、Ｐ、ｏｖａｌｅ　（卵形マラリア原虫）　、Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　（熱帯熱マラリア原虫）が病原体である場合、４８時間サイクルで起こり、Ｐ、ｍａｌａｒｉａｅ　（四日熱マラリア原虫）が病原体である場合、７２時間サイクルで起こる。マラリアに特有の悪寒・発熱・発汗などの症状は、スキツオント（繁殖体）によって感染赤血球細胞の破壊が起こり、メロゾイドが放出されて新しい赤血球に侵入するサイクルと一致する。赤血球外での繁殖段階に比べると赤血球内のメロゾイドは、宿主内での体液性応答をもつが、これは補体結合テスト、沈降テスト、凝集テスト、蛍光抗体テストによって検出される血清抗体ができることで示される。

肝臓からの感染メロゾイドが放出されるとマラリアが再発する。マラリア原虫の赤血球内での繁殖期に対する赤血球細胞の体液性防御が、同時感染、年令、外傷、もしくは他の衰弱要因によって、なくなるか、衰退するとマラリアの再発が起こり、再び宿主の体液性及び胸腺依存細胞仲介応答で、赤血球内でのサイクルが制御されるまで続く。遅延性の赤血球外のサイクルもしくは、赤血球感染の再発に対して、真性の再発は、ｈ■胆とによるものでは５年以内に、Ｐ、ｏｖａｌｅによるものでは２〜３年以宵に起こる。Ｐ、ｍａｌａｒｉａｅによるものは赤血球感染によってのみ再発し、最初に感染した後３０年もしくはそれ以上経てから再発することもある。７によるマラリアは短期間で再発するが、肝臓で増殖するメロゾイドによる真性の再発は起こらない。というのも、Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍは、赤血球外の肝臓では増殖しないからである。

マラリア感染症に対する免疫体制に関する情報は、長年にわたって調べられている。例えば、Ｆｕｄｅｎｂｅｒｇ等のＢａ５ｉｃ　＆Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　＋　３ｒｄ　Ｅｄ、、　Ｃｈａｐｔｅｒ　４１．　ｅｄｓ、ｌ：Ｌａｎｇｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　Ｌｏｓ　Ａｌｔｏｓ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　（１９８０）　）を参照のこと。これらの情報の大部分は、マラリアがよく再発するアフリカで得られる。例えば、アフリカで、熱帯熱マラリアに対する耐性が、徐々に長い時間をかけてではあるが得られることがある。−例を示すと、生後三ケ月以上の子供の場合、マラリアの徴候を示した何年か後、耐性が示される（最初の受動防御は、胎盤を経て母性のＩｇＧ　（免疫グロブリンＧ）によって得られる）。アフリカでは５才以下の子供を中心として、毎年マラリアで死ぬ人が百万人いるとの報告がある。子供のとき感染して生き残っても、大部分の大人は血清中に、“防御用の（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）″抗プラスモジウム抗体をもっているにもかかわらず、マラリアに感染する可能性があり、周期的に寄生虫が発見される。アフリカのマラリアの頻発する地域では、大部分の人が一生、程度の差はあるが、熱帯熱マラリアに感染する可能性がある。予防のための免疫応答として、メロゾイドが宿主の赤血球に侵入するのを阻害する補体独立抗体の生産が考えられている。マラリアにかかると、血清中の免疫グロブリンの量は種類にかかわらず高くなるが、なかでもＩｇＧの量はマラリア予防（或いは急性のマラリア発現制御）と関係がある。

数十年の間、マラリアに対しては免疫療法よりも化学（薬）療法の方がよくきくとされてきた。抗マラリアワクチンの開発の最初のアプローチは、紫外線、ホリマリン、機械的破壊によってスポロゾイトを抑制して防御免疫をつくろうとするものである。この方法で、赤血球外のスポロゾイト感染に対してのめ、短期間の、胸腺依存の、種及び株特異性をもつ免疫作用がみられた。この方法は紫外線照射した蚊からスポロゾイトを採取したり、接種したりするのによく用いられた。

この場合、成熟したスポロゾイトのみが免疫原性をもっており、アジュバントは必要なかった。この方法は、ワクチンの貯蔵が困難なこと、培養が不可能なため免疫抗原を大量に得られないこと、ワクチンは静脈内投与する必要があること、ワクチンを投与してもメロヅイド感染の可能性があること（肝臓でのスポロゾイトの増殖が起こり得る）等の理由から限界がある。

最近、遺伝子操作技術によってずへてのスポロソイトフラグメントに対する防御免疫能をもつ特異的タンパクの分離が試みられている。この試みが成功すれば、上述した問題を軽減できるであろう。しかし、もし１個のスポロゾイト（−匹の蚊の媒介で何百もの接種ができる）でも宿主のワクチンによる免疫応答に生き残れば、重大な赤血球内感染が起こり得る。Ｍａｒｓｈａｌｌ。

５ｃｉｅ−ｎｃｅ、　２１９．　ｐｐ、　４６６−４６７　（１９８３）参照。

免疫化に対する第二番目の遺伝的アプローチは、死んだ或いは弱ったメロゾイトワクチンを使うことである。Ｃｏｈｅｎ、　Ｐｒｏｃ。

Ｒｏｙａｌ、Ｓｏｃ、−！型具す２ルー２０３．　ｐｐ、３２３−３４５　（１９７９）参照。この分野での研究では、Ｔｒａｇｅｒ　ａｎｄ　Ｊｅｎｓｅｎ　（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　１９３＋　ｐｐ、　６７３−６７５　（１，９７６）　）が考えた方法が非常に役立つ。これは、赤血球内段階の寄生虫を試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で繁殖させて連続培養する方法である。

、メロゾイドワクチンは、種々の抗体を誘導すると考えられているが、そのいくつかは、赤血球細胞の表面に付着して感染細胞を選択的に凝集させて、種及び株特異的な臨床症状を緩和する。スボゾイド若しくは赤血球外のサイクルに対する防御機構がないので、新しい感染についても研究中である。しかし、体液性抗体力価が高い限り、メロゾイト　（生殖母体ではない）は破壊され、症状は進行しない。

ｐ、に１０ｗ１ｅｓｉのメロゾイト　（このマラリア原虫に感染すると通常はすくに死ぬ）のワクチンをＲｈｅｓｕｓ　ｍｏｎｋｅｙに接種すると、１８ケ月十分な防御が可能であるという報告がある。

フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ　）若しくは合成アジュた核型選択似ゆｕｓ　ｍｏｎｋｅｙを使った最近の報告によると、ＦＣＡの延命効果があることがわかっている。またｒｈｅｓｕｓ　ｍｏｎｋｅｙを用いた免疫実験では、ヘルパーＴ細胞、他の細胞媒体作用機構、体液性抗体などの全てが免疫に関係しており、補体がないと、細胞外メロゾイドはＩｇＧやＩｇＭによって特異的に活動を抑制される。Ｒｈｅｓｕｓ　ｍｏｎｋｅｙを使っての実験では、先天性免疫では感染症の再発が起きたり、薬剤療法では慢性の寄生虫血症になったりするのに対して、免疫療法では、１〜３週間で寄生虫の完全駆除ができる。免疫化はおそら（先天性の免疫というより、可溶性の循環抗原と関係がある。これは、サプレッサー細胞（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｃｅｌｌ）若しくはリンパ球分裂促進因子を選択的に刺激して、寄生虫生存に作用するのであろう。メロソイドの免疫化が困難である理由は、メロゾイドワクチンを造る際にメロダイト培養中に血中成分が混在するので、ワクチンの供給、コストの点で問題があることである。

最近、ＭｃＣｏｌｍ等がＰａｒａｓｉｔｅ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＋　４．　ｐｐ、　３３７−３４５　（１９８２）において、メロゾイドワクチンに関する報告をしている。

この報告はメロヅイドワクチンの効能に対する種々のアシユバａｓｉｔｏｌｏ　ｙ、　３８．　ｐｐ、６−１３　（１９７５）の報告に続くものである。

メロヅイドワクチン開発に直接かかわる研究はさておき、最近４０年間は、マラリア原虫の赤血球内での生活環における、宿主と寄生虫抗原の免疫学的特性に焦点があてられている。例えば、１９３９年初期には、急性マラリアにかかったサル、アヒル、ネズミ、ニワトリ、ヒト等の血漿若しくは血清中のマラリア原虫由来の抗原タンパクが検出された。例えば、ニワトリやサルを使った攻撃感染に対して、ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｇａｌｌｉｎａｃｅｕｍ及びｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｋｎｏｗｌｅｓｉ抗原由来の血漿が発見されて、部分的防御が示された［Ｔｏｄｏｒｏｖｉｃ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ、Ｔｒｏｐ、Ｍｅｄ、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、＋　６ｉｌｐｐ。

１１７−１２４　（１９６，７）　；Ｃｏ１１ｉｎｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｍ、Ｊ、Ｔｒｏｐ、Ｍｅｄ、　＆　Ｈｙｇ。

、ｐｐ、３７３−３７６　（１９７７）　）　、　Ｔｏｄｏｒｏｖｉｃ等は〔担ｎ、Ｊ、Ｔｒ　、Ｍｅｄ。

”　ｌｌｙｇ、１ニア、　ｐｐ、６８５−６９４　（１９６Ｂ）　；　ＡｍＪ、Ｔｒｏｐ、Ｍｅｄ、　＆　Ｈｙｇ、。

！７．　ｐｐ、６９５−７０１　（１９６８１）　；　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓ、Ｒ，Ｓｏｃ、Ｔｒｐ、Ｍｅｄ、Ｈｙｇ、、　６Ｌ　ｐｐ、５］、−５７（１，９６８）　〕、可溶性のＰ４ａｌｌｉｎａｃｅｕｍ血清抗原に特異的に結合する蛍光抗体が、フリーのメロヅイトと反応してマクロファージを活性化すると発表した。この抗原は、６５・Ｃ以上で不安定になり、タンパク質分解酵素に弱く、脂肪成分を含む。更に、もし赤血球中に成熟マラリア原虫が存在すると、この可溶性抗原に結合した蛍光抗体は、感染赤血球細胞質とマラリア原虫の両者に反応する。しかし、赤血球中に未成熟の丸い原虫か存在する場合には、原虫のみが染色される。更に研究か続けられた結果、温度、酵素分解、マラリア感染動物の血漿中の抗原抗体複合体は、これらの抗原の免疫原性を破壊して、ワクチンとしての有用性を減少する要因であることがわかった。

ＭｃＧｒｅｇｏｒ、　ｅｔ　ａｌ、、ＣＬａｎｃｅｔ、　Ｌ　ｐｐ、８８Ｌ８８４　（１９６８）　］　；Ｗｉｌｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、（Ｌａｎｃｅｔ、　２．　ｐｐ、２０１−２０５　（１９６９）　）　；ＭｃＧｒｅｇｏｒ、　ｅｔ　ａｌ、、（Ｔｙ、ａ、ｎｓ、Ｒ，５ｏｑ−、Ｔｒｏ凱Ｍｅｄ−Ｈｚｇ、、　６５．　ｐｐ、］］３６−１５１　（１９７］、）　）　；ａｎｄ　Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　ｅｔ　ａｔ、、［Ａｆ、Ｊ、Ｍ、、ｅｄ、Ｓｃｉ、、　４゜ｐｐ、２９５−３０７　（１９７２）　’］　、によって均−堕尺律肛ｍのアフリカ種に感染したヒトの血漿中に、可溶性の抗原が存在することがわかった。この血清中の可溶性抗原の特性としては、１０（Ｍｃに熱しても熱安定性があることがあげられるＣＷｉｌｓｏｎ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｉｍｍｕｎ＜＋−１ｏｇｙ、　、３．ｐｐ、３８５−３９８　（１，９７３）　’Ｊ。

その結果、彼等はこの抗原を“Ｓ　”抗原と命名した。Ｓ抗原の分子量は６０．０００から２１０．０００ダルトンである。血清中で必ずしもみられない可溶性プラスモジウム抗原（“Ｌａ”、“Ｌｂ”。

”Ｒ”抗原）とＳ抗原は性質が異なる。Ｉ、抗原はＳ抗原よりも免疫原性か強く、血清中の可溶性抗原抗体複合体を生しる抗原にすみやかに反応する（Ｗｉｌｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｌａｎｃｅｔ、　２．　ｐｐ、２０１−２０５　（＋９６９）　；Ｈｏｕｂａ、　ｅｔ　ａｌ、ｔ　Ａｆ、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｓｃｉ、、　４．　ｐｐ、３０９−３１７　（１９７２）　：ａｎｄ　Ｗｉｌｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、↓ｍｍｕｎｏ１ｏｇ７．Ｌｐｐ、３８５−３９８　（１９７３）　）　。５ａｕｌ　ｅｔ　ａｌ、、　［Ｔｒｏｐｅｎｍｅｄ、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、、　２８．３０２−３１．８　（＋９７７）　）は可溶性タンパクを含む免疫原は、Ｐ、ｂｅｒｇｈｑし原虫を超音波処理して冷食塩水で洗うと得られると報告している。更に、Ｋｒｅｉｅｒ等のクループは（ＧｒｏｕＬｈａｕｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｆｅｃｔ、　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１．　ｐｐ、２４５ −２５３　（１９８０）　］　、生の原虫よりも、可溶性にした原虫の方が免疫性が強いことを４：ｌｉ告している。

マラリアに感染した血漿中のｐｌａμ唸吋−関連抗原は、感染した赤血球から放出されると提案されている。…−ｐｌｅｓｉに感染した赤血球の膜を免疫学的に分析すると、Ｌａりｗｌ−ｅ−ｓｉ由来の分子１ｔ５０．ｏｏｏから６５０．０００ダルトンのタンパクがいくつがみられる［Ｗａｌｌａｃｈ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｍｅｄ、、　２．　ｐｐ、１１９−１３６　（１９７７）　；ａｎｄ　Ｄｅａｎｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、□−η− ｐｐ、３３３−３４４　（１９７８）ごく最近、イギリスのＷｅｌｌｃｏｍｅ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎで、マラリア原虫の赤血球内でのサイクルと関連した抗原フラクメントを調へるとその起原かわかるという報告があった。公表されたイギリス特許出願番号２．０９６．８９３及び２．０９９．３００に゛メロＪソイト（ｍｉシｒｏｚｏｉｔｅ）と関連のある抗原タンパクの多様けについての研究を試みた。然し、宿主の防御反応を誘導する非特異的な抗原は即離されなかった。

”とある。公表された出願は両方とも、“Ｐｌｐ−ｑｍｏｄｉ□胛属の寄生虫の抗原を誘導する防御゛につぃて言及しており、メロゾイド及びスキッオント（ｓｃｈｉｚｏｎｔ）の抗原の短離には親和性を利用する（モノクローナル抗体等）方法が有用たとしている。

この研究に関して、イギリスの公表された出願では、ｍｕｒｉｎｅ特異性のマラリア原虫、揚Ａ堕輯…ＬＬｅｌ尤りと関係のある抗原のｉ離が開示しである。要約すれば、マウスのマラリア感染細胞の赤血球を溶解して、遠心した後、種々の界面活性剤で可遣也して、上澄みを取り出すと、その中には赤血球の可溶性タンパク、赤血球の膜タンパク、　寄生虫抗原の約７０％″′が含まれる。この可溶化物をモノクローナル抗体が結合している免疫吸着剤カラムに通す。この抗原／抗体吸着剤の溶出液を濃縮して透析すると、分子量２．３５　ｘ　１０’或いは１．９５　×１０５の非糖付加抗原（ｍｅｒｏｚｏｉ　ｔｅと５ｈｉｚｏｎｔに関係のある抗原）が得られる。

この単離された抗原は、Ｐ、ｙｏｅｌｉｉ寄生虫の致死的攻撃に対してマウスでは、防御のためにフロイントの完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔ）と共に使用するとうまくいくという報告がある。

この出願では、適当なモノクローナル抗体を用いて、月旦ｓｍｏｄｉＬ＋μＪ見匹カリμ」−感染した赤血球から一つ或いはそれ以上の抗原、若しくは抗原フラグメントを単離する試みについて検討している。得られた抗原は、試験管内でＰ、ｙμ±は抗原を用いて交差反応試験を行っているが、生熊内で（ｉｎ　ｖｉｖｏ）の実験（抗体生産或いは攻撃感染）は行っていない。

公表された英国特許出願番号２，０９６，８９３と２，０９９，３００の方法に従って、ムハ江並肛叩のスキツオントとメロゾイド抗原の単離を行うと、Ｌ１卑 ■暉、抗原に関する報告と同し位の価値があるとすると、この単離された可産捗タンパクはヒトのワクチン組成の有効成分になるかもしれない。然し、抗原を大規模に生産するには多くの困難がある。例えば、寄生虫に感染したヒトの血を大量に得ること、赤血球細胞成分を含まない赤血球を大量に可溶化すること、親和性を用いて抗体を精製するためのカラムの維持や操作などである。

前述したように、ＴｒａｎｇｅｒとＪｅｎｓｅｎ＋　５ｕｐｒａ−によるマラリア原虫のｍでの連続培養の方法は、メロゾイドワクチン生産や赤血球内でのマラリア原虫の研究に非常に有用である。ある意味では、宿主の代謝や免疫システムに影響されない可溶性抗原の検出・単離の方法にも使える。多くの研究者によって後期無性生殖やメロソイトの再交の間、最大量のタンパクが培養液中に蓄積することがわかっている。Ｉ’、ｋｎｏｗｌｅｓｉ　（Ｃｏｈｅｎ＋　ｅｔａｌ、、　１９６９　）　、Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　（Ｗｉｌｓｏｎ、　１９７４　；　Ｗｉｌｓｏｎ　ａｎｄ　Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ、　１９７５）　、Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉ　（Ｗｅｉｓｓｂｅｒｇｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９７９）を培養すると、培養液上澄みにＰｌａｓｍｏｄｉｕｍと関係ある物質が存在することが報告されている。ＷｉｌｓｏｎとＢａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ　（１９７５）は、熱安定性な抗原、一部熱不安定な抗原、効耐性をもつ抗原を検出して、それぞれＳ抗原り抗原、Ｒ抗原と命名した。Ｊｅｐｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、　ＣＡｃｔａ、Ｐａｔｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、５ｃａｎｄ、、　５ｅｃｔ、　Ｃ，８９，９９１０３（１９８１）　）は、ヒト赤血球中のＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの培養液中からＳ抗原及びＲ抗原に分類される二つの異なった抗原を単離した。免疫吸着剤技術を用いた単離過程では、培養液８００ｍ＋＋から３ｍｇの２種類の抗原が得られる。この結果、“培養液から他の抗原をｊ４．離すること、単離された抗原の化学的、生物的性質を調べることができる。”ことがねかっγこ。同様に、Ｔｈｅｌｕ。

ｅｔ　ａｌ、、　ＣＷＨＯＢｕｌｌｅｔｉｎ、　６０．　ｐｐ、７６１−７６６ ’（１９Ｂ２）　）は、Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍを培養して“抗原Ｅ”をクロマトグラフで単離し、マラリアの発生する地域のヒトの血清中の物質と抗原との関係を示した。

免疫学的な研究、なかでも免疫学的アジュバントには興味がもたれるが、アジュバントがマラリアワクチンへのとりごみに有用であるという報告は興味がある。

“免疫学的強化作用（ｉｍｍｕｎｏｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒｓ）″をもつものとして、アジュバントは種々の役割をする。例えば、免疫応答の速度を速めたり、作用期間を延長したり、作用を強めたり、免疫応答以外の他の作用を助長したすする。アジュバントは、細胞と免疫応答一般に作用する強化剤、或いはある一定の抗原にのみ特異的に作用する強化剤に分けられる（　”Ｂａ５ｉｃ　＆　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”＋　５ｕｐｒａの２４章参照）。

抗マラリアワクチンの成分として有効な非胞子体物質は、免疫原性が弱いのでフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ　’）のような、油、水アジュバントが必要である。そのようなアジュバントは人体への使用は認められていない。抗マラリア抗原の発見に際して、ワクチン使用のために既存のアジュバント或いは新しいアジュバントのスクリーニングにはかなりの努力なされている。例えば、米国特許番号３，８４９，５５１には、マラリアワクチンのアジュバントとして、Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ　ｂａｃｉｌｌｕｓ　（ＢＣＧ）種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ｂｏｖｉｓの使用が提案されている。また、５ｃｈｅｎｋｅ１．　ｅｔ　ａｌ、　（Ｊ、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、、　６１．　ｐｐ、５４９− ５５０　（１９７５）　）は、より有用な手段としてＢＣＧとＡｊｕｖａｎｔ　６５を一緒に使うことを提案している。Ｄｅｓｏｗｉｔｚ　（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ＋　３８＋ｐｐ、６−１３　（＋９７５）　）は、Ｐ、ｂｅｒｇｈｅｉ感染の血から得た可溶性抗原を使って種々のアジュバントを広くスクリーニングしたことが開示されている。多（の研究の結果から、アルミニウムー　ミョウバンで沈澱する抗原は防御能があるのに、鉄ミョウバンと塩化アルミニウムで沈澱する抗原は免疫原性をもたないことがわかった。前述したようにＭｉｔｃｈｅｌｌ等、５ｕｐｒａは、メロゾイト抗原に対するアジュバントの効果について研究しているが、彼等はワセリン中のｍｕｒａｍｙｌｄｉｐｅｐｕｔｉｄｅがやや有用で、また、サポニンにも効果があると結論している。５ｉｄｄｉｑｕｉ、　ｅｔ　ａｌ、　（Ｎａｔｕｒｅ、　２８９．　ｐｐ、６４−６６　（１９８１）　）は、′死んだマラリア原虫とＮ１Ｎ−ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−Ｎ　’　、Ｎ″−ｂｉｓ　（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙＬｐｒｏｐａｎｅ−ｄｉａｍｉｎｅ）のサルに対する免疫能”について報告している。

　ＭｃＣｏｌｍ等。

５ｕｐｒａは、死んだ原虫のワクチンを使って種々のアジュバントをテストし、ＦＣＡ　、水酸化アルミニウム、ｃ−ｐａｒＶｕｍはがなり免疫性を増加させるが、サポニンが最も効果があると結論した。

同様に、前述した公表された英国特許出願２，０９６，８９３と２，０９９゜３００の報告でも〜予防接種テストでＦＣＡが単離抗原に対して最も有効性を示すことが分がっているが、その報告にもワクチンを使う際の“便利な（ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ）　”アジュバントとしてサポニン、Ｃ，ｐａｒｖｕｍ、水酸化アルミニウムが挙げられている。

以上、本発明の背景について述べてきたが、多くの研究者の努力にもかかわらず、抗マラリアワクチンの防御免疫原として有用な物質はみつけられていない。

！−竹本発明は先づ、抗マラリアワクチンの組成について調べた。

このワクチンの有効性は一つ或いはそれ以上のタンパク質性の免疫原を用いて調べて公式化している。用いた免疫原は、（１）マラリア感染赤血球内のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍを試験管内で培養増殖し、その培養液上澄み（赤血球と原虫は含まれない）及び／或いは（２）その赤血球を低張液で洗浄した洗浄液からすみゃかに、＃蹄した。

１９０．０００から２１０，０００ダルトンのもので、マラリアに感染した際に使った赤血球を洗った洗浄液から単離した。本発明の単離した免疫原は、分子量がそれぞれ４３，０００．５４，０００．２００．０００クルトンの抗原をもつ。

ワクチンに使われる免疫原は、マラリアに感染した赤血球を試−騨、」貞で培養した際の“未精製の（ｃｒｕｄｅ）　”上澄み液全体を含んでいるが、好ましくはクロマトグラフ的に精製した（特に陽イオン交換クロマトグラフで）方が良い。

また、本発明は、ワクチンの成分として次のようなタンパク質性の免疫原を含む。即ち、上述したような培養をもとにした免疫原、微生物、宿主細胞を用いて組み替え法によ−、て得１こ免疫原、タンパク合成特におけるアミノ酸の重合によって得た免疫原などである。

好ましいワクチン成分を造る際乙こは、適当な運搬体（例えは、均衡塩類溶液、ＰＢＳや培養液など）と免疫学的な受容アンユｉ＜ント（例えば、サポニン、水酸化アルミニウムなど）が必要である。

本発明の他の態様としては、ヒトの抗マラリアワクチンに例外的に適した成分として、水酸化アルミニラｌ、アシｊ−／＼ントと結合した、上述の培養液から造った細胞を含まない抗原かある。

この点に関して、出願人は、そのようなアジュバントが、タンパク質性の抗原に対するワクチンの免疫学的応答をかなり強化するだけでなく、その反応の速さや期間をも強化することが分かっている。ワクチンの成分として、現在使われている水酸化アルミニウムは、Δｌｈｙｄｒｏｇｅｌ　（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ）である。

又、本発明の他の態様としては、マラリア原虫感染のヒト赤血球を大量に得るため、長期ヒト赤血球培養における試験管内でのｈ組尺」肛憇生育の最適条件や、培養液上澄み或いは洗浄液から免疫原を得る方法についてふれている。簡隼に述べると、培養成いは継代培養は、組織適合性因子（例えは、市な血清クループなど）や、　温暖（ｃｏｌｄ）”及び　寒冷（ｃｏｌｄ）”抗原／抗体反応における赤血球に対する血清の不適合性などを、前もってスクリーニングした細胞や血７Ｎを用いて行った。

本発明における他の点や利点については、以下の好ましい実施例において明白となるであろう。

趙緻莢岐所以下の例証的な本発明の実施例においては、活性のあるタンパク質性の免疫原を得る方法、抗原とアジュバントを利用してワクチンの組成を示す方法、プラスモジウム原虫に感染し易いを椎動物の防御免疫性を得るため、ワクチンを使用する方法について検討している。

更に詳述すると、実施例■と実施例Ｈにはヒト及びヒト以外の赤血球を培養して、Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ寄生虫を試％Ｊで青で培養する方法を示している。

実施例■は、寄生虫培養液と感染赤血球洗浄液から抗原を単離する方法を示している。実施例■は、得られた抗原の物理的性質と試験管内での免疫学的性質を示している。実施例■は、サポニン及び水酸化アルミニウムなどのアジュバントと共に培養液から造った抗原を使う発明によって特殊な組成のワクチンを得たことを述べている。

実施例■は、本発明によって得たワクチンを、５ｑｉｒｒｅｌ　ｍｏｎｋｅｙに接種した実験について述べている。ここでは、抗原投与前後の体液性応答及び抗原投与の臨床例によって、サポニンアジュバントを含むワクチン組成に対する実験動物の免疫応答にふれている。

実施例■は、水酸化アルミニウムアジュバントを含むワクチンを実験動物に接種した後の体液性応答について述べている。

実施例■は水酸化アルミニウムアンユノ＼ントと共に本発明のワクチンを使って、５ｑｉｒｒｅｌ　ｍｏｎｋｅｙにワクチン接種及び抗原投与を行った実験である。実施例■では、ワクチンを投与した動物の免疫血清を用いて、試験ｔｒでの成長阻害を検討した。

実施例Ｘは、培養液上澄みからの免疫原草刈と、単離抗原を取り込み易いワクチンの組成検討のためのタンパク質精製方法に関する。実施例ＸＩは、本発明で得たワクチンを用いた５ｑｉｒｒｅこの実施例は、５ｑｉｒｒｅｌ　ｍｏｎｋｅｙ　（Ｓａｉｍｉｒｉ　５ｃｉｕｒｅｕｓ）から採取した赤血球中の旦郵ｍｏｄ　ｉ−明ゴ先坏±Ｒニーの戊験貴血ての培養方法に関する。Ｕａセゴｐａ鼎川用！ｎｄｏｃｉｎａ　ｌ単雑種し土、ソヨージア州、アトランクの疾病コンＩ・ロールセンター（Ｔｈｅ　Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ、　Ａｔ１ａｎｔａ、　Ｇｅｏｒｇｉａ）のＤｒ、　Ｃ，Ｃ，Ｃａｍｐｈｅｌｌから得た。これはマラリア感染したヒ１−のｆｌ胞から単離したものであるか、」 −育か良＜　、５ｑｉｒｒｅｌ　ｍｏｎｋｅｙ及びヒトに村し２て病原性をも５つてい゛る。

Ａ、じタターｙ、ヤニー七傅く障ζ−再ｔ１；化哺乳類の赤血球中の揚ｆａｌ− ｃｉｐ刈すの一戊狼貴血培養における第一段階は、感染細胞（動物起源及び培養超厚の）を凍結保存した“スタビレート（ｓＬａｂｉｌａｔｅ　）　”を準備することと、培養開始時にそのスタビレートを再活性化することである。

動物起源及び培養中の感染細胞起源のスタビレートを準備する際、先つ、ヘパリン化した感染血液全部、或いは培養液から感染赤血球を取り出しそれを洗浄したものと、２０％グリセロールを含む均衡塩類溶液を１　；１の容積比で混合する。この均衡塩類溶液の組成は、蒸留水（１ｐ）、デキストロース（Ｉｇ）、ＫＨｚＰＯ４（６０ｍｇ）　、Ｎａ２ＨＰＯ４＋　７Ｈ２０（３５８ｍｇ　）　、フェノール・し７ド（１０ｍｇ）　、ＭＣＩ　（４００ｍｇ　）　、ＮａＣｌ　（８ｇ）　、ＭｇＣ１ｚ　Ｈ６Ｈ２０（２００ｍｇ　）　、Ｍｇ５Ｏ，−７Ｈ２０（２００ｍｇ　）　、ＣａＣＩｚ　・２ＨｚＯ（１８６ｍｇ　）である。培養液中の感染赤匍球を洗浄したものには、かわりに当量の冷防腐剤溶液を加えてもよい。これは、０９％塩化ナトリウムを含む４．２％ソルヒトーノ噛容７夜１８０ｍｆｆに、り、リセロールを７０ｍ　ｎ加え、無菌ろ過して調整する。この混合操作の後、液体窒素保存のため、細胞をずみや力弓こヌンク（Ｎｕｎｃ）社のバイアルに移す。

再活性化は、３７°Ｃて、掻き混ぜないようにして解凍し、液体窒素を除き、細胞溶解が起こらないように細胞スラリーをつくる。赤血球を緩やかに遠心（５００ｘＨ）　シて沈降させ、上１９ゐを捨てる。その後、当量の３．５％の塩化ジトリラム洗浄液をゆっくりと各細胞に加えて室温で５分間放置する。これを再び緩やかに遠心し、上澄みを捨て、２倍の容量の血清を含む完全培地（以下に示す）を細胞６４二加える。これを遠心して、未感染赤面球を加える準備をする。

培養に用いる細胞及び血清を前もってスクリーニングすることである。候補となる赤血球の測定パラメーターとして先つ、その浸透圧安定性があげられる。つまり、各未感染細胞約５ｍβを血清を含まない培養液で３回洗浄する。もし、洗浄中に細胞溶解が起こるならば、その細胞は培養するにはあまりにも脆過ぎるので除くべきである。

候補にあがっている血清と血漿が培養に使う感染細胞、或いは非感染細胞に対して組織適合性かあるがどうかのスクリーニングが必要である。それにはマイクロプレートにそれらを混合したものを入れて室温で放置し、凝集反応が起こるがどうかを顕微鏡で確認する方法がある。例えば、Ａ細胞に対する抗Ａ抗体のような、血清に含まれる成分に相反作用のあるものはこの操作で除外される。室温での凝集反応を利用するスクリーニングによって、所謂（Ｎ及びＰ赤血球抗原に対する）″寒冷抗体（ｃｏｌｄ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）　″をもっ血清も除外できる。もし、凝結反応も凝集反応も起こらなければ、プレートの蓋をして３７°Ｃの恒温インキュベーターに放置し、１時間、３時間、オーバーナイト時の凝集反応を確認する。これによって、例えば抗−１１ｉｙａ　−ｐｙｂ２抗−ＪＫａ、及び抗−にのような“温暖抗体（１１ａｒｍ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）　”による凝集反応を検出することができる。Ｒｈ因子による適合性スクリーニングは、本発明による試験管内培養操作では必ずしも必要ではない。例えば、Ａ゛或いは八−細胞内ではマラリア原虫は良く繁殖する（Ａ−細胞内の方が好ましい）。

上述したスクリーニングによって得た血清或いは血漿中で、赤血球の培養が可能であるがこの場合、培養温度範囲内では、赤血球抗原は、血清或いは血漿中の塩類や不安定な抗体とは反応しない。

大量培養を始める前の最終的な細胞と血清のスクリーニングとして寄生虫感染感受性テストがある。寄生虫に感染した赤血球の１０％懸濁液を、血清を含む培地１８０μβと１０％未感染赤血球懸濁液とを一緒に３つのマイクロプレートに植えて、初発寄生虫感染が０．２５〜０，４％になるようにする。このプレートをインキュベートして、３日間以上毎日ギムザ染色を行い、最小寄生虫感染が３〜６％になるまで培養する。

Ｃ，サルの細胞における寄生虫培養マラリア原虫の培養法は、ＴｒａｇｅｒとＪｅｎｓｅｎ等、　５ｕｐｒａの方法を改良して実施した。マラリア原虫をフアシヨンの３５　Ｘ　１０ｍｍ細胞培養用ペトリ皿（１０％！、ｉ濁液／ベトリ皿の１．５ｍｊり、ろうそく瓶、コーニングの２５ｃＪ培養フラスコ（５，０ｍρ／フラスコ）で、３７°Ｃで、６％０ □、１０％ＣＯ２，８４’％Ｎｚに調整したガスの中で培養する。培養上澄み液の交換は、毎日１回或いは２回行う。

培養維持のため培養液には１０％のサル血清が含まれる。

０．５％〜５％の感染赤血球をもつ動物の血を、試験管内培養を始める際に使う。この場合は、ＲＰｌ’ｌＩ　１６４０に重炭酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ　（ＰＨ７，０）　、１５％正常サル血清を加えた培地で、感染サル赤血球の５〜１０％懸濁液（初発感染赤血球が０．５〜０．８％）を使って培養を開始する。

ゲンタマイシン（Ｇｅｎｔｏｉｃｉｎ、　Ｓｃｈｅｒｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、　Ｋｅｎｉｌｏｗｏｒｉ。

Ｎ、Ｊ、　）を抗菌物質として０．１μｇ／ｍｅから１．０μｇ／ｍＩ２の濃度で完全培地に加える。これは１０μｇ／ｍ７！以上の濃度で加えると原虫に毒性を持つ。

試験管内では活性化したマクロファージが、マラリア感染した赤血球を破壊するので、感染サル赤血球を培養したり、正常サル赤血球を使って継代培養する前に、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ＋　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ＋　Ｎｕ、　）で白血球から活性マクロファージを除去する。

培養中の感染赤血球のパーセンテージは、ギムザ染色を行って顕微鏡で確認する（ギムザ：　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ＋　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）　。

培養を開始してから終了するまでは、５〜２１日間である。毎日顕微鏡でＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの増殖を観察する。初発感染が０．５％の場合、７２時間で平均４％の感染になる。ラインを維持するためには、２〜４％の感染時に継代を行った方が良い。５〜６日継代をしないでおくと、約８．５％の感染になる。

原虫の増殖は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの生活環中の全ての形、つまり胞子小体で始まり、栄養型、繁殖体、分裂小体を経るうちの全ての形がみられるかどうかで判断できる。最小必須培地（Ｅａｇｌｅ１３８５ｐｅｃｉａｌ、　Ｇ１１ｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　Ｎ、Ｙ、）を使っても５ｕｑｉｒｒｅｌ　ｍｏｎｋｅｙ赤血球中のＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍを培養できるが、ＲＰＭＴ　１６４０培地よりもＭＥＭを使った方が良いということはない。ペニシリンストレプトマイシンを含む１９９培地は：この初代培養システムではＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　Ｉｎｄｏｃｉｎａ　１種を培養することができない。

茅！　４？ｌＩ□ｌ前スクリーニング操作を含む実施例■の方法は、ヒトの赤血球／−血清液中のＰ、ｆａＩｃｉハｍ吋培養システムにも利用できる。この方法で、４種のＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍがヒト赤血球（Ａ陽性）とＣａＣｌ２・２Ｈ２０中で再構成された血清或いは血漿中で培養できることがわかった。これらの株はＩｎｄｏｃｉｎａ　Ｉ　、　Ｈｏｎｄｕｒａｓ、　Ｇｅｎｅｖｅ　（Ｓｅｎｅｇａｌ　）とＬｉ１ｉである。５番目（ヒト−サル）は、感染したＳａｉｍｊｒｉ　ｍｏｎｋｅｙからヒトの赤血球と血清を含む培養液に、１ｎｄｏｃｉｎａＴに感染した赤血球を移植し、適応させて得た。要約すれば、上述の方法を利用すると、ヒトの細胞及び血清存在下でのサルの感染赤血球の培養や、プールしたＳａｉｍｉｒｉ血清存在下でのヒトの感染赤血球の培養が、同様な培養システム下で、可能であるということである。

ヒトの抗原生産のため、Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの適当な株のスタビレートのバイアルを何本か、混合ガスを使って５ｍβ或いは１５ｍ　１２のフラスコに入れて再活性化する。同時に、Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの各株をハックアップシステムとして、ろうそく瓶培養法で二つの３５ｍｍディシュで培養する。３日〜１週間以内に再活性化のため、感染赤血球を精密ガスを使った連続フローへセルに加えて、６〜１０個のフラスコ（１５０ｃ＋＋りに継代する。プラスモヂウム株は、３日か４日におきに（例えば、１週間に２回）継代するとよい。

フローへセルのみを使う場合、３回継代する間に８０ｍ　ｊ！の感染赤血球懸濁液から３ＱＱ　ｍｌ　、８０００ｍ　ｎの培養上澄みが得られる。

この方法が一番労力が少なくてすむ。培養ラインのロスなしに最大量の寄生虫感染を得るためには、寄生虫を培養開始４日後に、寄生虫感染レベルを、約０．２％にして継代するが、培養開始３日後に寄生虫感染レヘルを約０４％にして紙代するとよい。

その結果、培養期間中ずっと大体同し位の寄生虫感染レヘルが維持できる。

以下にヒトの細胞システムから抗原生産をするための、特別な培養方法と混合ガスを示す。マイクロプレート或いは３５ｍｍのディシュで培養した寄生虫を、Ｐｌａｓｕｍｏｄｉｕｍ−の生育に必要な酸素減圧を得るため、ろうそく瓶に移す。２５ｃｍ１フラスコ、７５ｃｎｔフラスコ、ｌ’５０　ｃｔ＆フラスコ或いはフローへセルで寄生虫を生育するためには、６％酸素、１０％ＣＯ２，８４％窒素の混合ガス下で行う。フローへセルでは、インキュベーターにこの混合ガスを充たすのではなく、ガスラインを直接フローへセルにひく。プレート或いはフラスコでは、培養懸濁液は安定した状態におかれる。これに対してフローへセルでは、継代時に培養液と感染赤血球と非感染赤血球を混合した後、約２０分間くらい、ガスをゆっくりとした速度で流し、その後フローへセルをロックして安定した状態におく。寄生虫をうまく生育するためには、フローへセルを１日２回、約１５分間くらいずつロックして、適当に栄養分が混ざるようにした方がよい。

実施例−１この実施例は、実施例■と■て述へた方法でＰ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍを培養、増殖して得た可）容性タンパク質抗原を短離する操作に関する。

培養して得た物質の取り扱いによって３つのタイプの抗原調製物質が感染赤血球の培養から得られる。この３つの調製物質は、それぞれ　Ｌ澄み（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）　、洗浄液（ｗａｓｈ）　、低張洗浄液（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ　ｗａｓｈ）　抗原をさす。

上澄み抗原　は、寄生虫の生育を維持するため、毎日完全培養液を交換するが、その際に集めた培養液−ヒずみから得られる。

洗浄液抗原　は感染赤血球を継代する際に得られる。培養液上澄みを除去した後、等量の不完全（血清を含まない）培地を感染赤血球に加える。この懸濁液をゆるやかに遠心して赤血球のペレットをつくる。この時の上ずみ液から洗浄液抗原か得られる。たとえば、フローへセルでは８ｍ７！のパックした感染赤血球と７５ｍ　７！の不完全培地をまぜて、１時間半口、ツクすると、口、カーがとまったときに、赤血球は沈んでいるがその赤血球を除いた上ずみ液から洗浄液抗原が得られる。

低張洗浄液抗原　は、洗浄した感染赤血球懸濁液に、不完全培地を用いて上述の洗浄を再度行って、血清を含む完全培地からの汚染を除いた後の感染赤血球懸濁液から得られる。２度目の洗浄の際の上ずみ液をまず捨てる。残った感染赤血球に、７５ｍρの標準低張液（不完全培地６０ｍ　ｅと減菌痰留水３０ｍβを７昆せてつくる）を加える。このＱ’ＩＢ液を３７°Ｃで約１時間半、混合ガス下でロックする。ロッカーがとまると、赤血球は沈んでいるが、約２４時間後に、培養上ずみ液を集める。この操作中、低張液は細胞が溶解せずに膨潤するのに役立つ（これによって、低張洗浄液中に赤血球成分か大量に流れ出すのを防き、細胞が継代に使えるよう維持てきる。）。上澄め液　洗浄液、低張洗浄液抗原調製試料は遠心して、赤血球と寄生虫細胞と細胞のかすを除いて　−７０°Ｃに凍結保存する。抗原調製試料をプールしたものは、０．４５ｐと０．２２μミリポアフィルタ−（Ｓｙｂｒｏｎ／Ｎａ１ｇｅ。

Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、Ｎ、Ｙ、）を通して、透析圧で１０〜１５倍に濃縮する。

犬扇セ１−−−■− この実施例は、実施例■の方法によって得たタンパク質抗原調製物質の性質に関するつ法として、抗原抗体反応の定性にしばしば用いられるオフテルロニーのテスト（二次元の二重拡散法）がある。ヒト由来の培養上澄み抗原と洗浄液抗原を混合したものを、さまざまなン農度にして（１，２５ｘ　、　２．５ｘ、５ｘ　、　１０ｘ　、　１７ｘ　、６８ｘなど、これは正常細胞の培養上ずみ液と感染細胞の培養上すみ液の濃度を示している）、寒天をコートした平板上で、抗体をまん中の穴にいれ、そのまわりの穴にこの混合液をいれる。抗原と抗体は寒天中をそれぞれ移動するか、もし抗原と抗体の間で反応がおこるならば、等価になったところに沈降線かできる。この沈降線の相対的な位置によって、寒天中の抗体濃度に対する抗原の濃度がわかる。各々の反応の局所的濃度は、穴の中の物質の絶対的な濃度と分子量及びゲル中の拡散率による。

オフテルロニーのテストは、ＨｕｄｓｏｎとＨａｙ、　１９７６による方法の改良法によって行った。平板にはハルヒタール緩衝液にとかした１％ノープルアカ −をコートした。改良した点は陽性反応の沈降線を濃縮するために、ケルに４％ポリエチレンクリコールを加えたことである。寒天か固まった後、鋳型を使って穴をあけ、その部分の寒天を真空吸引で取り除く。この穴にそれぞれの液をいれる。その後この平板を２４時間、恒湿箱の中で室温におく。もし何の沈降線もみられない場合は　この平板を４°Ｃて２４時間インキユヘーヒトる。この方法の利点は、１つの抗体に対しての多くの抗原、もしくは濃度の異なる１つの抗原の反応か比較できることである。このように抗原間の相同性か決められる。反応には以下のタイプがある。つまり、抗原が互いに等し７い反１：５　、抗原が同し抗原決定基や抗原決定要素をもたない反応、抗°原が異なるが抗原決定要素は同しである反応かある。

二重拡散ゲルを使−９た２つのテストシステム、によ−、て適切な情報が得られる。まず、１つめのテストシステムは、抗原として正常ヒト血清と正常Ｓａｉｍｉｒｉ血清（両方とも濃縮しなし）で用イル）ヲ用いたコントロールシステムである。この場合、抗皿清穴にはウサギの抗ザルグロブリン（２倍に濃縮して用いる）、ウサギの抗ヒトグロブリン（２倍に濃縮して用いる）をいれる。

このコントロールテストシステムによって、両抗血清に関するヒトとサルの血清の部分的同一反応が得られた。このことから、（１）ヒトとサルの血清の間の共通抗原、（２）ヒト血清にあるがサル血清にはない抗原があることかわかる。その結果、抗プラスモジウム反応の干渉や貧血をさけるためには、サルのワクチン接種研究に用いられるヒト由来の七すみ抗原を精製することが好ましいと結論した。

２つめのテストシステムは、ヒＩ・由来の未精製−１−ずみ抗原と、実施例■のザル由来の■ＦＡ陽性抗血清（この場合−Ｌすみ抗原と水酸化アルミニウムアジコーハンＩ・を−１祭に接種している）を用いたものである。この感受性テストは行われていないので、反応をみやすくするために、抗原調製試料を６８倍に濃縮した。免疫応答物質間の陽性の沈降線の検出によゲで、ヒｌ−細胞培養１−澄み液中のＰＪ復皐揶ｒｕｍ　１ｎｄｏｃｈｉｎａ種の可ｉ８　ｈ抗原として認１められる、可溶性抗原ワクチンとその抗体か反応したことが示される。

Ｂ、　別す１−？ゼ悲アじ冬ＩＪ−花ゴ泊−Ｕケー些り旦しへ４七少ノセ−１よる一力１斤−抗原調製試料をドデシル硫酸ナトリウム　ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯ３−ＰＡＧＥ）で分析した。１ハ↓Ｃ律ｉ１１’　ｌ；−ｍのｌｎｄ。

ｃｈｉｎａ　Ｌ　）Ｉｏｎｄｕｒａｓ、　Ｍｏｎｋｅｙ−）１ｕｍａｎ種の培養Ｇこよって得た培養−Ｌすめ抗原調製試料をン農縮しまたもの、もしくは未心縮のものを用意する。タンパクをトリクロル酢酸を用いて沈澱さ−Ｕて、それを洗浄乾燥して、１％ＳＯ５と１％２−メルカプトエタノールを含むリン酸緩衝液（０，ＯＩＭ　、ｐＨ７，ｌ：１１００　ｐ　ｅに溶解する。この試料を１００　 ’Ｃて３分間煮沸する。

この試料を３分間煮沸する。その後、冷却して１．０１％ソロモフェノールブルーと２−メルカプトエタノールをそれぞれ５μｅ加える。７５％もしくは１０％ポリアクリルアミドケルに上記試料を５μｒ添加して電気泳動する。

正常培養上澄みと同様に、前述のム几凡並肛叩種から得たタンパク試料は、低分子量のタンパク標準物質（Ｂｉｏ−ＲＡＤ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃａ１．）たとえば、フォスフォリラーゼＢ（分子量１００．０００）、仔牛の血清アルブミン（分子量６８，０００）　、オブアルブミン（分子量４３，０００）　、炭酸脱水酵素（分子量２９，０００）、大豆のトリプシン阻害物質（分子量２２，０００）　、リゾチーム（分子量１４，０００）と比較して泳動される。それを染色して、分子量を計算すると表１に示したような結果になる。これをみると未濃縮のＴｎｄｏｃｈｉｎａ、　Ｈｏｎｄｕｒａｓ、サル／ヒト上ずみ抗原、及び濃縮したＩｎｄｏｃｈｉｎａ上ずみ液（ヒト細胞培養から得た）は分子量約４９．０００ダルトンのハンドを１木もっていることがわかる。

１０％ゲルを用いて、Ｉｎｄｏｃｈｉｎａ　（ヒト細胞）培養上ずみ液（８倍に濃縮した）をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うと、４９，０００の単一ハンドの上に２本のハントがみられた。この２本のハンドの分子量は５４，０００と４６．０００である。ＴＣＡ（）リクロル酢酸）によって可溶性抗原が部分的に沈澱した可能性があるので、特別なゲル電気泳動は行わなかった。

培養上ずみ液は＾１１ｉｃ＋）ｎｄｉａｆｌｏシステムを用いて透析圧で濃縮した。濃縮した培養上ずみ液は、凍結乾燥して蒸留水で再溶解し、２倍に濃縮してＳＤＳを含むリン酸緩衝液で透析した。２倍に濃縮した上ずみ液１００ｍ　（ｌを３７℃で３時間インキユヘヒトした。試料は室温においた。この１００ｍ　Ａのタンパク混合物ニ５ｍｌの２−メルカプトエタノール及び５ｍｎの０．２５％ブロモフェノールブルーを加える。電気泳動用のトラックに７ｍ７！をのせて、１５０ミリアンペアで１時間半、予備泳動する。次いで１９０ミリアンペアで４時間半電気泳動して、染色する。この方法の工夫したところは、抗原を取り出すためには１００”Ｃで３分間煮沸するよりも、３７℃で３時間インキユヘヒトする方がよいということである。また、未濃縮の上すみ液から３４倍に濃縮した上ずみ液まで上ずみ液の濃度を調べたところ、この抗原を検出するのに最も適した上ずみ液濃度は２倍に濃縮したものであることが判明した。

上述の方法によって、Ｉｎｄｏｃｈｉｎａ種に感染したヒト赤血球の培養上ずみ試料には、２木のハントがはられた（非感染のものはハンドがない）。続いて３つの実験を行ったところ、この２木のハントの分子量は各実験で４０．７３８とり、２８６．４０．７３８と５６，２３４．４５．７０９と５３，７０３であることが確認された。この各実験の結果から２本のハンドの平均分子量を計算すると４２，３９５と５３．７４１であった。

２つのワクチン接種実験（以下）に用いた上すみ液の実験と、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の各々のコントロールがらＳａｉｍｉｒｉ血清を含む上すみ液のタンパクのハンドの数とその位置は、ヒト血清を含むものとは異なることがねがった。同様の結果が相当するコントロールの試料からも得られている。しかし、何本かのハンドは同じ位置にあり同一性を示している。たふん、Ｉｎｄｏｃｈｉｎａ種（ヒト細胞）培養上すみ液を分析すると、前述した２木のハンド（分子Ｍ３Ｌ　＋５３と５１．２８６）が示されるだろう。少なくとも２木のハンドは２回のワクチン接種実験で使胞のコントロールにはみられない）。

初代培養からとったホルマリン処理の上ずみ液を、ワクチン接種実験（以下）に使ったＩｎｄｏｃｈｉｎａ種（ヒト細胞）培養からとったホルマリン処理の上ずみ液と同様に、ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べた。ヒトからのものと初代培養のものとは、（１）タンパクハンドの消失（明らかになくなっている）、（２）ハンドの存在に関してパターンがかなり似ている。ホルマリンで処理すると、ホルマリン未処理の感染上すみ液にみられたタンパク質のハンドがなくなる。この処理方法を少し変えればホルマリンはヒトに用いるワクチンの公式化に有効な成分として使えるであろう。

表−ＦＳＤＳゲル電気泳動による分子量（ダルトン）試料　７．５％ゲル　１０％ゲルＩｎｄｏｃｈｉｎａ種（濃縮）　８３，０００及び４６．０００Ｈｏｎｄｕｒａｓ種（未濃縮）　４９．０００Ｉｎｄｏｃｈｉｎａ種（未濃縮）　４９，０００サル／ヒト（未濃縮）　４９，０００Ｉｎｄｏｃｈｉｎａ種（ヒト細胞）　５４．００１１１及び４２，０００（濃縮）Ｃ，ポリアクリルアミド電気泳動による分析抗原調製試料をＳＤＳを使わないポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いても分析した。この方法だとタンパクはもとの構造を保ってい゛る。

濃縮した上ずみ調製試料を凍結乾燥して２倍の蒸留水に溶解する。これをトリス −グリシン試料緩衝液で透析する。１００μｐの緩衝液に対して、５μｌの０．２５％ブロモフェノールを加える。７μβのサンプルを電気泳動用のトラックにのせて、５０ミリアンペアで半時間予備泳動する。サンプルの濃縮には２０ミリアンペアで１０分間、電気を流す必要がある。その後、４０ミリアンペアで４時間半電気泳動する。電気泳動終了後、タンパクハンドをクラシブルーで染色する。

ＳＯ５なしのポリアクリルアミドゲル電気泳動で、感染細胞培養上ずみ液は２木のハントを示した（非感染細胞培養上ずみ液ではこのハンドはみられない）。１木目のハントは非常にはっきりしており、濃縮されたラインである。これはトラックの近くにあり、マーカーハンド（正常ヒト血清）の下に位置している。２木目のハンドはトラックから少し離れたところにあり、マーカーハントの上に位置している。これは少し拡散しており、正常な細胞培養上ずみ液にかすかにみられるハンドがその少し下にある。

洗浄液抗原と低張洗浄液抗原調製物質も同様にポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。上ずみ液抗原と洗浄液抗原の調製物質を比較すると、洗浄抗原の方がタンパクが少なく、上述のトラック近くの低い最初のハントがない。一方、低張洗浄液抗原はこのハントはあるが２木目の高い方のハンドがない。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動では正確な分子量がわからないので、５Ｏ５− ポリアクリルアミドゲル電気泳動で示されたほどには２つの抗原の分子量の違いはわからない。

可溶性の上ずみ液抗原をＤＥＡＥ　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ−５０（ＰｈａｒａｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）を用いたイオン交換クロマトクラフィーで分析した。カラムにはＰＨ７，６のトリス−塩酸緩衝液をいれた。

Ｉｎｄｏｃｈｉｎａ　１種（ヒト細胞）の培養上すみ液を１０倍にｌ溶縮してこの方法による分画に用いた。ガンマグロブリンとアルブミンのタンパクピークが最初に出て来る。アルブミンピークの近くにタンパク質のピークが識別できる。

このピークのクンバクは、酵素結合免疫吸着剤検出法によってマラリア原虫由来のものであることが確認された。このピークは非感染細胞の培養上すみ液では検出されなかった。５ＤＳ−ポリアクリルアミドケル電気泳動法でもこのフラクションが、上ずみ液から得たものと一致することを確Ｓ忍した。

別のクコマドグラフィー的な方法に、陰イオン交換体としてＤＥＡＥ　（ジエチル７ミノエチｌし）セルロース５２　（ＷｈａＬｍａｎ　）を用いたものがある。Ｔｎｄｏｃｈｉｎａ種（ヒト細胞）の感染培養上ずみ液を分画して、コントロールの正常細胞培養上ずみ液と比較した。両方とも６０ｍ＋２の未濃縮の培養上ずみ液をカラムに流し、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＣラスターティングバッファー中ａＣ１９ｉ度を０．ＯＩＭ　、　０゜０５門、０．１町０．２Ｍ、０．３Ｍ、　０．５Ｍにして溶出した。各フラクションの２８０ｎｍの吸光度を調べた。感染及び非感染の細胞培養」二すみ液の溶出ピークを比較すると、感染細胞培養土ずみ液特有のピークがたくさんあることがわかる。（図７八と図７Ｂの比較）。

マウスを使った免疫原性のテスＩ・の予備実験とし２て、でてきたピークもしくはまだ分画されていない培養上ずみ液が、間接螢光抗体法によるスクリーニングでとらえうる抗体をもっているかどうかをワクチン接種実験を行って確かめた。

非感染および感染細胞の分画されていない上すみ液を４匹のＢａ１ｂ　Ｃマウスグループにワクチン注射し１こ。また各々のフラクションを集めて３匹のマウスグループにワクチン注射した。感染および非感染の−Ｌずみ液を１０倍にした濃縮したもの０．２５ｍ　Ａを投与したがその際、実施例５（以下）で用いた水酸化アルミニウムアジュバントを０．０５ｍβ−緒に使用した。１回目と２回目のワクチン投与は２１日間の間をおき、間接螢光抗体力価テストに用いる血ン夜は、１回目の接種から８．２０日後と、２回目の接種から２０日後に採取した。表２、表３にその結果を示すが、感染細胞培養上ずみ液の５つの分画部分と、未分画の部分から陽性の抗体反応（”　Ｐｏｓ　”　）が検出された。未感染細胞培養上すみ液の分画および非分画部分からは抗体反応は検出されなかった（　”　Ｎｅｇ）。

表↓ 正常細胞培養上ｔ々イ佼フラクション隘　タンパク濃度　フラクション　１ｌ１２ｂ　３０２２　０．０５Ｍ　− ３ａ　３２０２　０．１０Ｍ　− 未分画部分　４７００−−−−一本ＮａＣ１表１２　１８２　０、ＯＩＭ　→− ３ａ　２３５　０．０５４　− ３ｂ　８９２　０．０５Ｍ　＋４ａ　８７　０．１０Ｍ　− ４ｂ　１７７２’　０．１０Ｍ　− ４ｃ　４７７　０．１０Ｍ　− ５６２２０，２０Ｍ　＋６　２００　０．３０門　十７　１７７　０．５０Ｍ　’＋未分画部分　４９５０　−　＋この５つの分画部分は比較的　精製されたもの　であり（たとえば、正常血清や赤血球細胞成分は含まれない）、分子量は３５　、０００から８５，０００ダルトンである。感染細胞培養上ずみ液の特異活性をもつ分画部分の分子量は、フラクション２　：８３，１７６７２、４４４．５６．２３’４　フラクション３　ｂ：８５．１１４．６７．６０８　、５２゜４８１、、４７，８６３、フラクション５　：５１．２８６、　フラクション６・７９．４３３．４５，７０９．３１，６２３、　フラクション７　：　７９．４３３である。

Ｄ、逼Ｊ１亀受−性λ」羊弄」唸受法ポリアクリルアミドケル電気泳動によって得たＬずみ抗原調製物質の温度感受性と酵素感受性を調へた。３７°Ｃと５６°Ｃで１時間半熱処理しても、感染細胞培養上ずみ液に特異的な２本のＰＡＧＥ　（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）タンパクハンドは消失せず、その位置もハンドの濃さもかわらなかった。しかし１００°Ｃで５分間熱処理すると、このハンドは消失した。また２つの異なった非特異的タンパク分解酵素、２種の異なる起源由来のα−アミラーゼ、２種の異なる起源由来の膵臓のリパーゼ、パパイン、混合グリコシターゼ（ＣＩＯ結合を切る酵素）を作用させた。酵素はＰＨ７，２のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ　）で０．１■／ｍβに調製した。感染細胞培養上ずみ液（Ｉｎｄｏｃｈｉｎａ　（ヒト細胞）、］とコントロールの非感染細胞培養上ずみ液を２倍に濃縮したもの１００μｌに、０．０１ｍ　ｌの酵素をおのおの加え、３７℃で１６時間インキユヘーヒトて酵素反応をさせた後、ＰＡＧＥ分析を行った。

その結果、２種の非特異的タンパク分解酵素を作用させるとＰＡＧＥのクンバクハンドはすべて消失したが、リパーゼ、混合グリコシダーゼ、パパインでは２本の抗原に特異的なハンドは残っていた。アミラーゼを作用させると１つのアミラーゼでは、トラックから一番遠いハンドの濃さがうずくなり、もう１つのアミラーゼでは一番上のハンドが拡散した。

この発明の可溶性タンパク質抗原の少なくとも１つは、糖タンパクであるということの予備的な証明として、抗体反応陽性（もしくは陰性〒ない）上ずみ液に特異的なハンドの過ヨウ素酸・シッフ反応が陽性であることがあげられる。

尖旌勇Ｍこの例では、本発明によるワクチン組成について述べる。

タンパク質性免疫源を濃縮したワクチン（実施例■の方法で調製する）は抗原とアジュバントを等量に混合して調製するが、その際、アジュバントにはサポニン（ＰＢＳと１：１５の割合にしたもの）（Ｑｕｉｌ−Ａ、５ｕｐｅｒｆｏｓ　Ｅｘｐｏｒｔ　Ｃｏ、、　Ｖｅｄｂａｃｋ、　Ｓｗｅｄｅｎ）を使用する。

抗原濃縮物と水酸化アルミニウムアジュバントは１ｍβあたり２．０　ｍｇ　Ａｌ（ＯＨ）３　（Ａｓｈｙ　ｄｒｏｇｅｌ、５ｕｐｅｒｆｏｓ、　Ｅｘｐｏｒｔ　Ｃｏｒｐ、）　と６．９■マージオレート（もしくは他の防腐剤を同量）を含む水？容１生アジュバントをイ吏って８周製する。このアジュハントン容ン夜を様々な比で、抗原濃縮物と混合する。

実施例■ この例は、５ｑｕｉｒｒｅｌ　ｍｏｎｋｅｙを用いてワクラン佳射を行った実験について述べる。ここではサポニンアジュバントと、実施例■で述べたサル細胞培養から得た上ずみ液抗原と洗浄液抗原の混合したものの濃縮物をワクチンとして接種した。

Ａ、実験動物ポリビア起源の雄の５ｑｕｉｒｒｅｌ　ｍｏｎｋｅｙを５ｏｕｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｐｒｉｍａｔｅｓ、　Ｉｎｃ、、　ｏｆ　Ｍｉａｍａ、　Ｆｌｏｒｉｄａから購入した。動物はそれぞれステンレス製のおりにいれて、高タンパクのサル用飼料（Ｒａｌｓｔｏｎ　Ｐｕｒｉｎａ　Ｃｏｍｐａｎｙ）と飲み水を自由に与えた。またサルには毎日、果物を３つと１週間に２回、２０μρのビタミン補給剤（Ｖｉｓｏｒｂｉｎ、　Ｎｏｒｄｅｎ／Ｓｍ１ｔｈ　Ｋ１１ｎｅ、　Ｌｉｎｃｏｌｎ＋　Ｎｅｂｒａｓｋａ　）を与えた。

サルは実験に使う前最低３週間は、休息させて新風上に慣らした。この間にサルが健康であるかどうかチェ、りした。このチェックにマイコバクテリア感染テストも含まれる。０．１ｍｌのツベルクリン（Ｊｅｎｓｅｎ　５ａｌｓｂｕｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｋａｎｓｕｓ　Ｃ１ｔｙ＋Ｍｉｓｓｏｕｒｉ　）を、下まぶたの皮肉に注射する。陽性の遅延型過敏症反応があるので、このテストは２４．４８．７２時間後に反応をみた。またギムザ染色をして、顕微鏡で動物が寄生虫感染をしていないかどうか調べた。腸管に寄生虫がいるかどうかは、糞を調べて確かめた。血清に抗プラスモジウム抗体をもつがどうａｓｉｌｉａｎｕｍもしくはＰ、ｓｉｍｉｕｍに感染した５ｑｕｉｒｒｅｌ　ｍｏｎｋｅｙはＩＦＡテストでＰ、ｆａ旦印肛憇と交差反応する抗体をもっている。

旦−分析方迭１、寄生虫感染率の決定培養細胞中の寄生虫感染率は、血液をギムザ染色して顕微鏡で調べて出す。

実験動物の血液中の１ｍ’あたりの寄生虫の数は、ギムザ染色したムハ旦」肛憇の数を数えて決定した。感染血液５μｐを実験動物の足のふくらはぎから採取する。ます、９５％エタノールで採血部分を清潔にして、滅菌ランセットを線刺し、マイクロサンプリングピペット　（Ｃｏｒｎｉｎｇ、　Ａｒｔｈｕｒ　Ｉｌ、　Ｔｈｏｍａｓ　Ｃｏ、、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｏｈｉａ、　Ｉ’ｅｎｎ、）の目盛りが５μｆｆのところまで血液採取する。この血液をすばやくスライドグラスに移し、決められた長さと巾に均一にひきのばす。未固定のギムザ染色塗抹標木を用意して、ハワードグリ・ソドで寄生虫の数を数える。各塗抹標本には横に５木の線がひいであるので、このグリッド全体の数を数える。このようにして数えた寄生虫の数を血液１ｍ＋＋’あたりの数に換算した。

れ以上の５ｑｕｉｒｒｅｌ　ｍｏｎｋｅｙの大腿の静脈から血液を得た。パンヘパリンもしくはアクチノマイシンＤを抗血液凝固剤として用いた。採取した血液を遠心し、血漿を取り除き、赤血球をリン酸緩衝食塩水で２回洗浄した。赤血球の沈さを４０％、ＰＢＳ　（ＰＨ７，２）に１．７５％にとかした牛のアルブミン（フラクションＶ、　Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　）を６０％の割合のものをつくる。この希釈した感染赤血球を１滴、９５％エタノールで洗浄１乾いたスライドグラスの上にのせて、もう一枚のスライドグラスを重ねてスライドグラス全体に血液が広がるようにする。このスライドをドライヤーですばやく風乾して、ティッシュペーパーにそれぞれ包んでプラスチックの容器に入れ一７０°Ｃで保存する。

このとき、シリカパウダーを１箱いれておくと、水分の蓄積が防げる。

テストに使う時は、スライドをすばやくデンケーターにうつして、１晩乾燥させる。２４時間後、アセトンで１０分間固定して風乾する。塗抹標本の長さによって、マルテクスインクで各々のスライドに１０〜１４のサークルをかく。血餅から抽出する血清は、未感染の免疫した、もしくは感染５ｑｕｉｒｒｅｌ　ｍｏｎｋｅｙの大腿もしくは伏在静脈から、適当な間隔をおいて得る。マイクロプレート（コースタ−１９６穴細胞培養用クラスクー、平底、ケンブリッジ、マザチューモノツ）の穴の中で、血清２０μでとリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７，２）　１８０μｌを混合する。１番目の穴に、２倍に希釈した１：１０の血清希釈液をいれて、各々の穴に２０μρのサンプルをいれて、以下の間接螢光抗体テス）　（ＩＦＡ　）を行う。

１番目の穴には、ネガティブコントロールの正常Ｓａｉｍｉｒｉ　血清の１：１０希釈溶液がはいっている。２番目の穴には、ポジイティブコントロールのＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＩｎｄｏｃｈｉｎａ　１種に感染した動物から得た血清の１：１０の希釈溶液がはいっている。このポジイティブコントロールとネガティブコントロールはすべてのスライドに塗っておく。

血清希釈液を塗ったスライドを３７°Ｃで３０分間、恒温インキュベーターでインキュベートする。余分の血清はスライドを傾けておとし、回転子を使ってゆるやかに、ＰＢＳで２回、蒸留水で１回スライドを洗浄する。スライドを完全に乾かしてから、それぞれのサークルに、ヤギの抗サル血清（Ｃａｐｐｅｌ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅＳ）の螢光を結合したＩｇＧフラクションを１＝３０の比でＰＢＳに希釈した溶液２０μβを加える。非特異的な螢光を取り除くため、使用直前に螢光を結合した血清（希釈した）を遠心しておく必要がある。スライドを３７゛Ｃで３０分間、恒温インキュヘーター内で再びインキュベートして、上述の方法で洗浄し、乾燥後マウンティング培養液を用いてカバーグラスをする。その後、各サークルに細胞および寄生虫に関係ある螢光が存在するかどうかを調べる。

３、■」汀ば■１蔑Ｕけソ上試験管内での生物学的検定は、ｆｉ；の生育阻害と促進に対する免疫化したサルの血清力価を用いて調べた。これは、試験管内生育阻害と名づけられるが、ワクチン注射によって生しる臨床的防御゛と関係がある。この方法ではＰ　、　ｆ　ａ　ｌ　ｃ　ｉ　ｐ五斐１　ｎｄｏｃｈｉｎａ　Ｉ種の培養上ずみに接触感染させたヒトへ陽性赤血球を、正常ヒ）Ａ陽性血清、もしくは正常Ｓａｉｍｉｒｉ血清もしくは感染赤血球をもつ動物もしくはアジュバントと共にＰ、ｆａｌｃ’＋ｐａｒ叩の可溶性抗原をワクチン注射した動物の血清存在下で培養した。この免疫血清はずべてｒＦＡテスト陽性である。

免疫Ｓａｉｍｉｒｉ血清を正常Ｓａｉｍｉｒｉ　ｍｌントロール血清で１＝２に希釈する。１０％ヒト血清もしくは１０％正常Ｓａｉｍｉｒｉ血清もしくは１０％の各免疫血？ｉ＃（１：　２０）を含む完全培地ＲＰＭＩ　１６４０を用意する。感染赤血球１０％懸濁液を用意して、各完全培地に０゜５ｍｎのこの懸濁液を加えたものを各培養穴に２個もしくは３個に入れる。

赤血球が沈んだら、感染赤血球のワクチンパーセントを調べるため、すべての穴から塗抹標本をつくる。細胞を培養しているプレートをろうろくびんシステムを用いて３７°Ｃで培養し、感染赤血球のパーセンテージを調べるために、２４時間ごと９６時間まで、各穴からサンプルをとって塗抹標本をつくる。

Ｃ−ユ又天ヱ扱盪方法ワクチン接種実験には合計４匹のサルを用いた〔ネガティブコントロールのサル、２が月前にマラリアから回復したＰ、ｆａｌｃ」肛憇保持の予備免疫したサル、２匹のワクチン注射をしたザル（ワクチン接種１　と　ワクチン接種２　と名付けた）の合計４匹である〕。ワクチンは２日目、２３日目の２回投与した。

各ワクチン接種期間中は、接種物を２つに等分して、各ワクチンを皮下に注射した。この方法では１回目のワクチンはサルの胸の上横部分に、２回目のワクチンは腸の下横部分に投与した。

ワクチン接種１　に投与したタンパク質性免疫源は、まず実施例■で述べた培養液の上ずみと洗浄液から得た抗原を混合して、遠心、濾過、透析したものを１０倍に濃縮して用意した。

ワクチン接種２　には、１５倍の濃縮抗原を投与した。ネガティブコントロール動物及び予備免疫した動物には、同様に正常細胞培養上ずみとアジュバントを投与した。

接種前に、濃縮抗原とＰＢＳで１：１５に希釈したサポニン（Ｑｕｉｌ−Ａ）を等量に混合する。１回目及び２回目のワクチン接種時には　ワクチン接種１″には１．２ｍ７！、−ワクチン接種２には２゜０１のワクチンを投与した。ネガティブコントロール動物及び予備免疫した動物には、１回目及び２回目の接種時に、１．２ｍ６のワクチン混合物を接種した。

１回目の接種から５３日後に、４匹の動物に、急性マラリア感染サルから得たＰ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ惑染赤血球を均衡塩感染液に２．０×１０７コ懸濁したものを静脈内投与（伏在静脈を通しての）する。

ワクチン投与数日前と、ワクチン投与後及び抗原投与後に、サルの直腸温度を測定したり、毎日健康診断をしたりする。また、１週問おきにヘマトクリット比とＩＦＡ検定を行う。また末梢血管試料中の寄生虫の数をギムザ染色して顕微鏡で数える。

臨床的防御に加えて、ワクチン注射した動物の防御免疫性は、メチレンブルー染色した血液塗抹標本による網赤血球増多症の確認、ヘマトクリット比が一定していること、抗原投与に伴うＩＰＡ反応のパターン、赤血球内及び赤血球外にある異常寄生虫の存在などによって示される。

実験動物の体液性免疫応答を図１に示した。ＩＦＡテストの結果から、ワクチン注射したサルは、体液性免疫応答が促進されていることがわかる。２匹のサルの抗原投与前の最大力価は、１回目のワクチン注射の約３０日、４０日後で、それぞれ１：Ｉ６３゜８４０．１　：　１０，０００，０００であった。抗原投与（１回目のワクチン注射の５３日後）の後、ワクチンを注射したサルと両方ともＩＰ八へ価が増した。この力価は増加してつづけて、抗原投与後９０日目で最大にてた。わずかな差はあるが、マラリア原虫保持動物（ポジティブコントロール）の力価も、アジュバントの免疫変パターンをもつ。ネガティブコントロールのサルの場合、抗原投与後２週間目に力価が最大になり（１：　２０，４８０）　、死に至るまで２つの血清希釈液を注射したものよりは低い力価を示した。

１：１０から１　：　２０，０００に希釈した血ｆｆＪ下では、細胞全体、特に感染細胞の細胞質が強い螢光を示す。Ｅベーンの図９をみると、あとで観察したものは細胞質に可溶性の抗原をもっことがわかる。高濃度の血清希釈液では、寄生虫の生活環のうちの胞子体時期が最も螢光を発する。

実験動物のへマドクリット比を図２に示した。一般的に、２匹のワクチン接種したサルとポジティブコントロールのサルのへマトクリソト比は、抗原投与後は正常範囲内のままである。

抗原投与前にも３回のへマドクリット実験を行った。これらのうち２つは２回目のワクチン接種後に行った。ワクチン投与した動物のうち一匹は、２回目のワクチン投与後に、ヘマトクリット比がワクチン投与前の４０％から３０％に減少しｆこ。これはおそらく、サポニンアジュバントの投与量によるのであろう。抗原投与時には、このサルのへマトクリソト比はワクチン投与前の４０％にもどった。ネガティブコントロールのサルは、抗原投与後１７日目からヘマトクリット比が減少しはしめ、抗原投与後２５日目には２０％になり死んだ、すなわち、抗原投与によってヘマトクリット比がコントロールに対して約５０％減少した。

血液塗抹標本をもとにして計算した寄生虫感染率は、血液１鶴３あたりの全寄生虫数として示される（図３参照）。図３に示されたスケールでは最大寄生虫数（血液１酊３あたり４５．１５５）を１００％としている。ネガティブコントロール動物では抗原投与後１７日目と２４日目に血液１龍３あたりの寄生虫数がそれぞれ４５、１５５と４１，０００になり２つのピークが示される。抗原投与後、は、ネガティブコントロールの寄生虫感染率の約５０％である一時期を除くと、ネガティブコントロールの約２５％である。ポジティブコントロールのサルの寄生虫感染率は無視できるほど低かった。

ワクチン投与したサルと、コントロールのサルの寄生虫感染率の差は別として、コントロールのサルに急性の病気の徴候が示された後、塗抹標本に検出されうる寄生虫の遅延型聞出期間が、ワクチン投与したサルにみられる。

ワクチン投与したサルの原虫をギムザ染色して顕微鏡でみると、５０％以上の寄生虫が構造に異常を示し、その多くは細胞外にあることがわかる。図４にワクチン投与したサルと予備免疫したコントロールのサルの異常寄生虫の形態と、網赤血球増多症の証拠を、抗原投与後の他の適当なパラメーターと共に示した。異常寄生虫はワクチン投与したサルにのみみられる。たとえば、図９の免疫化したサルの血液をギムザ染色したちのプレートＡ、Ｂ、Ｃとワクチン投与していない牌切除術をしたサルの血液をギムザ染色したものプレートＤを比べてみるとこのことがよくわかる。

２匹のワクチン投与したサルもしくは予備免疫したサルには、マラリア病の臨床徴候はみられなかった。それらのサルの食物摂取、敏捷さ、反射作用には異常はみられず、直腸温度も正常であった。しかし、ネガティブコントロールのサルはＰ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの典型的な感染徴候を示した。感染中の危険状態でのこのサルの体温は１０５．４°Ｆになり肉眼的にも貧血がわかり、関節炎の徴候も示していた。死ぬ少し前このサルは酸素欠乏症になり、ショック状態になり止息死した。

実施例　■ この実施例は独身の感染し易いＳａｉｍｉｒｉ　ｍｏｎｋｅｙを使って行ったワクチン注射について記述している。この実施例におけるワクチンは、実施例■において示した様に、アジュバントとしてサポニンよりはむしろ水酸化アルミニウムを加えたｌ０Ｘ（１０倍濃度）も抗原からなっている。動物に上述した方法で、ワクチン２服を皮下に０日（１９８２年５月）と２１日（１９８２年６月）に投与した。最初のワクチン量は、０．５ｍ　ｌの抗原と０．０５ｍＡのアジュバントから成っており、２回目の量は、０．４ｍｆｆの抗原とｏ、１５ｍ１のアジュバントを混合して調製した。この動物の最大の抗繁殖体力価１：１０，４８０を越えており、抗−胞子体力価は更に大きい。高い抗プラスモジウム抗体力価は３力月間は維持された１９８２年の１２月までに力価は１：１０まで落ちた。この動物は実施例■の手順に記述した最初のワクチン注射の約９カ月後に抗原投与された。

実施例　■ この実施例は全部で８匹のサルに関した第２のワクチン注射について記述している。

Ａ、動物、分析の手順とワクチン注射の手順サルは全部実施例■において示した様に取り扱った。これらの８匹のサルのうち、３匹は以前に感染し、マラリア保有者ということがわかっていた。これらはマラリア感染という最も高い危険に曝された集団の中に共通な、前もって感染した患者を使って発明されたワクチンの効果を評価するのに用いられた。

残りの動物はプラスモジウム（マラリア原虫）を持っていない感染しやすい被実験者である。個々の動物と、受けた治療は以下に記述した。

Ｎｏ、１（第一の保有者）は、サルの細胞培養液から調製した上澄みと洗浄液とを混合した抗原で免疫した。Ｎｏ、２（第二の保有者）は、ヒトの細胞培養液から調製し上澄みと洗浄液とを混合した抗原で免疫にした。Ｎｏ、３（第三の保有者）は、ヒトの細胞培養液から調製した上澄みと洗浄液を混合し、ホルマリン処理した抗原で免疫した。Ｎｏ、４（第一の非保有者）は、実施例■の手順で、約６カ月前に免疫した。Ｎｏ、５（第二の非保有者）は、サルの細胞培養液から調製した上澄みと洗浄液とを混合した抗原で免疫にした。Ｎｏ、６（第三の非保有者）は、サルの細胞培養液から調製した上澄みと洗浄液とを混合し、ホルマリン処理した抗原で免疫した。Ｎｏ、７（第四の非保有者）は、ヒトの細胞培養液から調製した上澄みと洗浄液を混合した抗原で免疫にした。

そしてＮｏ、８（第五の非保有者）椿ま、免疫しない対照とし、感染していないサルの細胞から調製した上澄みと洗浄液を混合した抗原を接種した。

使用前に、抗原は全て１３から１４倍濃縮した。抗原のホルマリン処理は、子ルマリンの０．５χ溶液で室温で２４時間掻き混ぜて行った。その後、抗原、ホルマリン混合物は、ホルマリンを除くために、ＰＢＳを用いて４℃、ｐＨ７，２で透析し、使用するまで一８０℃で保存した。最初のワクチン注射は、０．５ｍ７！の抗原（約２５ｍｇのタンパクを含む）と実施例■で記述した５０μｌの水酸化アルミニウムアジュハン）　（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）溶液を組合わせた組成から成っている。Ｎｏ、４以外の動物は全部１９８２年１２月２０日（研究の０日）に−回目の接種をし、１９８３年の１月１７日に二回目の接種をした。１９８３年の２月１６日（５８日目）に動物は全部、約１×１０６のｈハ旦昆肛岬（Ｉｎｄｏｃｈｉｎａ　Ｉ）に感染したサルの赤血球を含む均衡塩溶液を静脈投与して抗原投与した。抗原投与の前後の分析手順と臨床的な情報の測定は、実施例 ■に示した様に行った。

旦−じ壷りし４往μｍ」１（社）在米免疫応答（ＩＦＡ力価、“Ｓ”は繁殖体に対する力価、“Ｒ”は胞子小隊小体に対する力価）と、このワクチン注射の研究における試験動物の血球容積のレヘルは、表・４から１１に示した。

麦−□（動物　Ｎｏ：ｌ（第一の保有者）免疫の手順、サルの細胞培養液から調製した洗浄液と上清の抗原捷−ノ−３１Ｆ　ＡノＥ（ｉ　＊Ｌｉｇ１ｍＯ（ワクチンｌ王射１）ト９１：１６０４５．０＋１８　１・６４０　４７．１＋　２５　１　：　１６０　５０．０ト２８　（ワクチン注射２）＋　３５　１　：　６４０５　４８．４＋４２　１・６４０　４５．９１−４９　１　：　１２８０　’４４．６＋　５６　１　：　３２０　４６゜４ト５８　（抗原段Ｌｉ、　）＋　６８　１　＋　６４０　３９．０＋　７２　１　：　６４０　４４．６＋７９　１・１０，２４０　４４．４＋８６　１・２．５６０　５０．０＋９３　］　：　１０，２４０　４４．４＋　１００　１．　：　１．．２８０　４６．１＋１０７　１：１．２８０　５０．０＋１２＋　１：１，２８０＋　１２８　１　：　１６０清田−晃動物　Ｎｏ・２　（第二の保有者）免疫の手順二人の細胞培養液から調製した洗浄液と上清の抗原 →−９１：　５，１．２０　５０゜０＋　１８　１　：５．１２０　４６．５＋２５　１：５，１２Ｏ３１・６５５．３２ＯＲ４５，０＋２８　（ワクチン注射２）＋３５　１：６４０ｓ１　：　２０．４８ＯＲ４７，１＋　４２　１　：　１，２８ＯＳ　４７．０１　：　１０，２４ＯＲ＋４９　１・１０．２４０　４３．２＋　５６　１　：　６５５，３２０　４７．５＋５８　（抗原投与）＋５５　１　：　２，５６０　４３．０＋　７２　１　：　５，１．２０　４７．５＋　７９　１　：　１０，２４０　４８．０＋　３５　１　：　１０，２４０　４８．１＋９３　１：５．１２０　４７．０＋　１００　１　：　２．５６０　４６．５＋１０７　１ｊ、５６０　４６．０＋　１　２　＋　１：２，５６０＋　ｌ　２　８　１：１．２８０表五動物　Ｎｏ：３（第三の保有者）免疫の手順３人の細胞培養液から調製したポルマリン処理した洗浄液と上清の抗原０　（ワクチンｌ王射ｌ） ■・Ｌ２８０　Ｒ４８，３ →−２８（ワクチン注射２）４５８（抗原投写）＋Ｉ２８　］：１．２８０Ｖ動物　Ｎｏ：４（第一の非保有者）免疫の手順：サルの細胞培養液から調製した上清の抗原（実施例■を見よ）実験の日　ＩＦＡ力価　血球容積〔ワクチン注射１と２６ケ月前〕＋５８（抗原投与）＋　６；　５１：　４０　４１．０＋　７２　１　：　２．５６０　４２．９＋７９１：５，１２０４０．０＋　８６　１　：　２０，４８０　３８．０＋９３　１　：　１０，２４０　４０゜０＋　１００　１：２，５６０　４３．８＋　ｌ　Ｏ７１：５，１２０　４５．０＋１２１　１　：　３２０ ±１２８　１　：　３２０表■ 動物　Ｎｏ・５　（第二の非保有者）免疫の手順：サルの細胞培養液から調製した洗浄液と上清の抗原０　（ワクチン注射１）　・＋２８　（ワクチン注射２）＋５８　（抗原投与）＋　８６　１　：２．５６０　４４．０＋　１２８　１　：　３２０表立動物　Ｎｏ：６（第三の非保有者）免疫の手順：サルの細胞培養液から調製したホルマリン処理した洗浄液と上清の抗原＋２８　（ワクチン注射２）＋　１２８　１　：　６４０溝泗− 動物　Ｎｏニア（第四の非保有者）免疫の手順二人の細胞培養液から調製した洗浄液と上清の抗原＋２８　（ワクチン注射２）＋　３５　］　：　１６０　Ｓ＋　１　２　８　１　：　３２０茅（ｌｊ動物　Ｎｏ：８（第五の３ト保有者）免疫の手順・感染していない勺ルの細胞の一ヒ清と細胞洗浄液０　（ワクチン注射１）＋２８　（ワクチン注射身１２）− ト５８　（抗原投与）Ｎｅｇ、（陰性）　、ＤＩＥＡＤ　（死）前述の表の免疫学的データのいくつかの点に、注目すべきである。つまりワクチンを投与した動物は、抗原投与する前にばかなりのＩＡＦ力価を持つが、最初の抗原投与後、７口開には力価の減少を示した。

一方、抗原投与前にかなり低い抗体力価を示す動物（たとえばＮｏ４とＮｏ５）は、抗原投与後７日間に抗体力価は自然な上昇を示した。抗体力価の存在する動物においては、生物を侵ずことによって最初の抗体の除去があり、それにひきつづいて力価の増加が起こると仮定される。南８　（対照）とワクチン注射した動物とを比較すると、抗原投与後の反応に明らかな差異があることがわかった。陽８で示された最大のＩＦＡ抗体力価は１・３２０であったのに対してワクチン注射した動物の力価は低くて１．　：　２５６０、高くてｌ　：　２０，４８０の範囲であった。平均的な抗体を基礎として計算すると、ワクチン圧射した動物は１　：　１０．４８０の力価をもっている。動物はすべてワクチン注射後と抗原投与前は、血球容積のレヘルは安定であった。抗原投与後２１日目に１回だけ顕著に血球容積が減少しく２０％）、次の試験期間に早い回復（３１，６％）を示した漸６を例外としては、他のワクチン注射した動物は全部、抗原投与後の期間を通して立派な血ｆ７ト容積レベルを推持した。ＮＯ４とＮＯ５の血球容積の表示は、３匹の保有動物（ＮＯＩ、２．３）の表示とほぼ匹敵する。対照的に、歯８　（陰性対照）では、死の前の１週間の間に３６８％から１３２％に制球容積が突然減少した。図８は、８匹の実験動物の抗原投与、後の寄生虫血症の程度に関する情報を示している。希薄あるいは、濃厚血ｆｉ、塗抹標木法によって、きめられるように抗原投与後経過する時間と互いに関係がある寄生虫血症に関係するテークが下の表に示されている。保存動物（ＮＯＩ、２と３）の希￥ｉｔ塗抹標木には、たった１匹の寄生虫がときおり見られたので寄生虫血症は“０”であると考えられた。

表１２抗原投与後の日数このデータは血球容積とＩＦＡ力価のデータと一致し、ワクチン注射した非保有動物か陰性対照動物より先に寄生虫血症のピークに達することを示している。

１回目と２回目のワクチン注射の後、非保有動物も保有動物も即時型過敏症、あるいは遅延型過敏症のとちらの徴候も全く示さ４ｆかっｆコ。また接種の部位での臨床的に検出可能な組織の１員傷の徴候もなかった。抗原投与後Ｎｏ　８は軌のスパイクを含むＰ、　ｔａｌｃｉｐａｒｕｍ　マラリアの典型的な徴候を示す唯一の動物であった。これらの徴候は、死の前の４．５日の開展もはっきりしていた。動物は死ぬ直前のた３［」間、９４°Ｆから９８°Ｆの間の正常以下の体温を示した。この期間の大部分の間、動物は、かこのとまり木あるいは床の上にしつとして動かず、手を触れたり、検査の間、はとんどあるいは全く反応しなかった。この動物は、死の２日前抗原投与２９日目に、食べたり飲んだりしなくなった。

死後の動物を検査すると、強いマラリア感染の多数の典型的な病理上の徴候があられれていた。

Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　（マラリア原虫）感染動物の以前の観察から、２つの異なったショック症候群が通常体験されることが明らかにされたことに注意するのは重要なことである。第一は平衡感覚を失い、腹部の収縮、呼吸困難、またときには意識の喪失を伴い、このまま死んでしまうこともある。この症候群は、通常病気のとうげの間、あるいはその直後に起こり、Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに感染したＳａｉｍｉｒｉ　ｍｏｎｋｅｙにおいてはくり返し観察される。そのような動物は、血球容積レヘルが低く明らかに症候群を起こしやすい。第２の症候群は、普通は病気のとうげを越えてから起こるが、致命的ではなく、てんかん性の発作に特徴がある。上記の研究においては、Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍを抗原投与されてもワクチン注射したＳａｉｍｉｒｉ　ｍｏｎｋｅｙはどちらのショック症候群も示さなこの例は、以前の実施例■と■における試験動物から得られた免疫したＳａｉｍｉｒ血清によってＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのｉｎ　ｖｉｔｒｏ □での増殖阻害について記述している。３つの実験の結果は図５に示しである。

寄生虫の再反の最も顕著で速い阻害は、水酸化アルミニウムアジュバントで強化された可溶性の抗原で免疫した実施例■のサルの血清で起こった。抗寄生虫抗体の効果の阻害は、ギムザ染色された薄い血液被幕の顕微鏡検査によって示される様に、異常な形の細胞外の寄生虫の出現によって、十分に説明された。

実施例■で生成された血清抗体が、実施例ＩＶ　（Ａ）で議論された様に人の培養細胞から得られた可溶性の抗原とゲル中の二重拡散法で反応するということに注意すべきである。感染したサルやサポニンや可溶性抗原でワクチン注射した動物から得た血清は、正常の人やサルの血清と比較して同様の程度の再反の阻害を示した。

別の研究が、異種の株の系で増殖阻害効果を調べるために行われた。この場合、血清は北西アフリカのセネガル地方で見つかったＰ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの “Ｇｅｎｅｖｅ”株の培養液に由来する可溶性の上清抗原によるワクチンに応して生産された。図６に示し様に、Ｉｎｄｏｃｈｉｎａ　１株上清抗原と水酸化アルミニウムアジュバント（実施例■）でワクチン注射したサルの抗血清は、正常な人とサルの血清に比較して、Ｉｎｄｏｃｈｉｎａ　１株で以前に感染し、回復した保有者のサルの血清と本質的に同等であるような特異的な増殖阻害の点でＧｅｎｅｖｅ株寄生虫の増殖阻害をかなり示している。

実施例Ｘこの実施例は、Ｉｎｄｏｃｈｉｎａ　ＩとＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＧｅｎｅｖｅ　株の感染した人の赤血球の」　リ」仔−培養液の上清から蛋白を精製する手順について述べている。

培養液上清は、実施例■とＨの手順に従って、Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの　Ｉｎｄｏｃｈｉｎａ　ＩあるいはＧｅｎｅｖｅ　（Ｓｅｎｅｇａ　ｌ）株のどちらかが感染した人の赤血球から得られたものである。　上清抗原”物質は集められて、遠心し、濾過し、圧力をかける透析によって１０倍濃縮された。

２つの濃縮された部分は“抗原Ｅ”分画の単離に用いられたＴｈｅｌｕら（Ｗ）１０　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、６０．ｐｐ、７６１−７６６（１９８２）、）の手順に従ってＱＡＥ　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ５０を使う陰イオン交換タラマドグラフィーにかけられた。

同し濃縮された部分は一晩、０．１門酢酸緩衝液（ｐＨ３，７，）に対して透析し、物質の高い電気陰性度によって、免疫原を収率良く生産するようにされた５Ｐ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌイオン交換樹脂を使う陽イオン交換クロマトグラフィーにかけた。この系で、マラリア蛋白は、０．２から０．３Ｍ　ＮａＣ１で溶出した。一方もっと陽性に荷電しているガンマグロブリンやヘモグロビンの様な蛋白はカラムに残ったままであった。それぞれの分画の抗原活性は、完成あるいは非感染の源に由来する高度に免疫した正常胎盤ＩｇＧを使う間接酵素免疫分析（ＥＩＡ）によって測定した。２つのＥＩＡ陽性分画（＋ＩｇＧ）は、この塩濃度の範囲以内から集められ５Ｐ−１と５ｐ−２と名づけられた。最初に溶出してくる前者の分画は最も高い蛍白濃度を示し、次に溶出してくる後者の分画はすっと低い蛋白濃度を示した。集められた５Ｐ−１と５Ｐ−２分画の交差免疫電気泳動による分析から約１０の人の蛋白が存在することがわかった。

これらは後に大アルブミンなるいはα−グロブリンノ性質を持っていることが決定された。５Ｐ−２分画の一部はさらに、ＴＳＫ　３００ＳＷカラム（ＰＢＳ、　ｐＨ７，２，流速Ｑ、５ｍｌ／ｍ１ｎ）を使うゲル濾過のＩＩＰＬｃ分離を行った。高感度ＥＬＩＳＡ分析による蛍白ピークに対応する分画は濃縮されＳＤＳケルによる分析に用いられた。主な分子量部分は、２００ｋｄ　、８０ｋｄ、４０ｋｄ蛋白と同定された。また５０ｋｄのハンドも検出された。２２−３１分間に集められた分画は、ＤＥＡＥ　ＨＰＬＣカラム〔へ〇ＦＳ＝１．ＯＤ＝２１４ｎｍ；流速−１ｍ１／　ｍｉｎ；可動棚Ａ＝１０＋ｎＭＰ０４、ｐＨ７，２；可動棚Ｂ＝１０ｍＭ　ＰＯ４、ｐＨ７，２，０，５Ｍ　Ｎａｃｌ　’Ｊにかけられ、ＥＬＩＳＡによって活性のあることがわかった分画は、５Ｏ５−ＰＡＧＥよって２００．０００ダルトンと４３．０００ダルトンの蛋白を含むことが明らかにされた。

５Ｐ−２抗原に対するウサギの抗血清に対する濃縮した、Ｉｎｄｏｃｈｉｎａ　ｌが感染した人界血球培養液の交差免疫電気泳動によって、アルファー１領域にかなり速い電気泳動移動度を持って１つの主なマラリア蛋白が明らかにされた。

このマラリア抗原に対応する沈降ハンドを７つのゲルから切り出して、５０５− ＰＡＧＥによって分析すると、４３ｋｄ蛋白が検出された。同様の免疫沈降は、ウサギの多クローン抗体を分析するのに用いられている。

実施例■ この例は合計１６匹のサルに関する第３のワクチン注射の研究について記述している。

Ａ、動物、分析手順とワクチン注射の手順サルは全部木質的には実施例■と同様にとり扱った。７匹のサルは全部、Ｇｅｎｅｖｅ　株　Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ−培養液起源の免疫原調製品、つまり２匹は実施例ＸのＥ抗原て、２匹５ｐ＝１陽イオン交換分画で、２匹は５Ｐ−２分画で、１匹は（ＩＯＸ：１Ｍ縮した上清（Ｃ３）と洗浄した抗原物質でワクチン注射した。７匹のサルは同様よＩｎｄｏｃｈｉｎａｌ培養液由来のＥ、５Ｐ−１，５Ｐ−２、ｃｓ免疫原調製品でワクチン注射した。２匹の対照のサルの１匹は未感染の赤血球培養液の上清（ＮＣ５）を１０倍濃縮したものを注射され、もう−匹の対照は全くワクチン注射されなかった（ＮＣ）。クロマトグラフィーによる分画（Ｅ、　５Ｐ−１，５Ｐ−２＞の場合は、最初（０日）も２回目（２８日）の注射も、実施例■と同様に、ＰＢＳ中に２ｍｇ／ｍｌの蛋白と０．１５ｍ１の水酸化アルミニウムアジュバント（八＋ｈｙｄｒｏｇｅｌ）を含む溶液（総量１．１５ｍ１）から成っていた。ＣＳ物質のワクチンの濃度は、０．１５ｍ１水酸化アルミニウムを含む１ｍｌ　の濃縮物から成っていた。１日９５匹の動物全部が、強く感染したサルの約１　ｘ　１０６のＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　Ｉｎｄｏｃｈｉｎａｌが寄生した赤血球を含む均衡塩溶液の静脈内への投与によって抗原投与された。

抗原投与前後の分析手順は実施例■における場合と同様であった。

Ｂ、ワクチン注射の結果表１３と１４はそれぞれＩｎｄｏｃｈｉｎａｌ、ｌ！：Ｇｅｎｅｖｅ株培養液由来の免疫原訊（製品でワクチン注射した場合の対照と比較したＩＦＡ力価か示されている。別Ｇこ示さない限りは、Ｅ、５Ｐ−１，５Ｐ−２分画のワクチン注射によって示された力価は２匹のワクチン注射された動物の値の平均である。ＮＣ５とＮＣ対照動物の力価はそれぞれの表にくり返されていることに注意されたい。表中のＮＥＣ”は力価が認められないことを、ＢＧ”は）＼・ツクグラウンドを示してし）る。挿入した値は非特異的あノ＼ノクグラウンド力価を表わしている。

表置Ｉｎｄｏｃｈｉｎａ　ｌ　分画　外照一旦　旦　５Ｐ−１各均ヱ　μｍ　」μｓ　町ＯＮＥＧ　ＮＥＧ　ＮＥＧ　ＮＥＧ　ＮＥＧ　ＮＥＧ１４　１ニア　ＮＥＧ　１・７　１：１０　ＮＥＧ　ＮＥＧ２７　ｔｉｔ４　１・７　１：２８　ＮＥＧ　ＮＥＧ　ＮＥＧ３５　１　：　２８　１　：　２８　１　：　４０　１　：　２０　±ＢＧ　±１Ｇ４２　１　：　２８　］、　：　１４　１　：　５７　１．　：　８０　±ＢＧ　＋：Ｂｃ。

５６　１　：　８０　１　：　１４　１　：　２０　１　：　４０　±（１：　２０）　±（１：　１０　）７０　１・２０　ＮＥＧ　１　：　２０　１　：　８０　±（１：　２０）　±（１，：　１０　）８４　１　：　１０　１　：　１０　］　：　７　１　：　２０　±（］　：　２０）　±（１：　２０　：１９１　１：１４　ＮＥＧ　１：２０　１・２０　±（１：　２０）　±（１：　４０　）９５（Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ　）８　１・３２０　１　：　１２８０　１　：　１１３　１　：　１．２８０　１　：　３２０　１　・１６０１５　１　：　７２４１　１　：　５１２０　１　：　２’５６０　１　：　’１０２４０　１　：　２５６０　１　：　５１２０２２　１　＋　５１２０　１　：　１２８０　１　：　１８］０　１　：　１０２４０　１　：　３２０　Ｄｉｅｄ　Ｄａｙ　１８２９　１　：　２５６０　１　：　７２４１　１　：　６４０　１　：　１０２４０　１　＋　６４０Ｃｈａ　］　ｌｅｎｇｅ　（抗原投与）　、ＮＥＣ（陰性）、ＢＧ（ハックグラウンド）、Ｄｉｅｄ　Ｄａｙ（死んだ日）表置旦旦　−ミ！」　浜　競　ＮＣ５ＮＣＯＮＥＧ　ＮＥＧ　ＮＥＧ　ＮＥＧ　ＮＥＧ　ＮＥＧ１４ＮＥＧ　１＋７　１：１４　ＮＥＧ　ＮＥＧ　ＮＥＧ２７１・７　１：２０　１：１４　ＮＥＧ　ＮＥＧ　ＮＥＧ３５　１：２０　１：４０　１．：２８１：８０　±ＢＧ　±ＢＧ４２　１、：２８　１．：４０　１：１４　１：］、６０　±ＢＧ　±ＢＧ５６　］：］１３　１：２０　＋、：８０　１：３２０　±（１・２０）　±（１・１０）７０　１：２８　ｔ：４ｏ　１．：１０　］・４０　±（１：２０）　±（１：　１０）８４　］ニア　１：１０　１：２０　１：１０　±（１：２０）　 ±（１，＋２０）９１　ＮＥＧ　１：２０　１．：１４　ＮＥＧ　±（１・２０）　±（１：４０）５（Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）８　１、：６４０”　Ｉ：１２８０　１：２２６　１＋３２０　１＋３２０　１：１６０＋５　１：２５６０　１・５１２０　１；５１２０　１：５１２０　１：２５６０　１＋５１２０２２　１：２５６０　１：］８１０　１：５１２０　１＋２０４８０　１＋３２０　ＤｉｅｄＤａｙ１８２９　１：１２８０　１：３６２０　１：２５６０　１：１０２４０　１＋６４０＊　１匹は１３日冒に死んだＣｈａｌｌｅｎ（Ｈｅ（抗原投与）　、ＮＥＣ（陰性）、ＢＧ（ハックグラウンド）、Ｄｉｅｄ　Ｄａｙ（死んだ］」）表１５と表１６はそれぞれＩｎｄｏｃｈｉｎａ　Ｉ−と銃ｎ　ｅ　ｙ、、、ｅ株培養液由来の免疫原調製品でワクチン注射した場合の、対照と比較した赤血球容積の特性について報告している。別に示さない限りは、各分画でワクチン注射した場合の値は、研究した２匹の動物の平均である。またＮＣ５とＣ３の血球容積の状態は（り返してそれぞれの表に示しである。

実施例■に示したワクチン注射の研究の場合と同様に、ワクチン注射は、発明次第で、Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍによって起こる　病率や死亡率を下げように免疫応答を刺激する。ワクチン注射した動物に対する抗原投与後の抗体力価（ＩＦＡ）は、一様にかなり高く、血球容積、ヘモグロビンは減少する。そして、赤血球数は一様にかなり少なくなる。期待された様に、血球容積を保護するｉ改候か、ある程度の　株特異性”を示して観察された。ことにＥ抗原を使った場合にそれは顕著であった。

抗原投与後、８日と１５日の螢光のパターンはＥ分画のワクチン注射に対しては、全分化段階の寄生虫の螢光を示すのに対して、５Ｐ−１でワクチン注射した動物は繁殖体に特異的と思われる螢光を示した。

拡散した　白血球”の螢光我５Ｐ−２でワクチン圧射した動物細胞で観察さ眉、た。そして高い割合て抗体を希釈すると寄生虫特異な螢光か認められた。ＣＳでワクチン注射すると、繁殖体段階に対する白血球の螢光がことにあさやかに現れた。

病気のとうげ”の状態の寄生虫は、常に、対照よりもワクチンｌ平射された動物の方が低い平均寄生虫血症を示した。

表」輝旦　ジＵ　シタ　ｋジ　覗ジ　覗最大、鍵血球容積■　加、０±１．５　３２．１±１１．４２９．９±５．８　２８．９　４９．７４６．０ヘモグロビン　あ、４±０．２”　３３．４±１６．１　２９．７±６．１　３５．Ｌ　５１．７　４９．７ＲＢＣ３１，６±４．９　２９．５±１５．０　２２．９±６．０　２７．０　４９．０　４９．７Ｘ最大寄生虫血症ω　５．８±２．０　３．０±１．３”　２．８±０．５　５．６　１１．１　２２．７危機”状態の最初の出現：抗原投与後の日数　１２．５±１．５　１１．５±２．５　１４．０±０　１４．０　１１．０　観察されないＸ藻り」町叫定■　４．７±３．０　２．４　± １．３　２．６　±０．４”　１．３　７．７　観察されない＊ＮＣＭ＠と著しく異なる、ｐ　＜ｏ、銘ｍ　ＮＣ３対照と著しく異なる、ｐ　＜ｏ、ｏｓＬ皿最大、論少血球容積■　４３．５”　２９．８±５．０　３１．５＋４．３　３４．６　４９，７　４６．０ヘモグロビン　材、３°　３２．７±６．６　３５．０±３．６　３４，８　５１．７　４９．７ＲＢＣ４１，０”　釘、７±６．１　２８．６±２．９　３１．５　４９．０　４９．７Ｘ最大寄生虫血症（Ｅ　６．２±２．１　４．８±１．３”５．５±１．９　４．５　１１，１　２２．７危機゛状態の最初の出現：抗原投与ｍ日数　９．０＋Ｏ］４．０＋０　１１．５＋２．５　１１，０　１１．Ｑ　１ｔｉｉ察サレないＸ寄４」Ｉ損定■　２．６＋０．７　４．２＋１．９　４．２＋１．６　４．２　７．７　観察サレない零Ｎ幌と著しく異なる、Ｐ〈０．部材　生き残ったサノＨこ対するｆ直前述の例は、マラリア寄生虫の試験管内の繁殖と関係があり、またその繁殖の過程で生産される物質を使って保護ワクチンの開発をする現在の発明の多くの相関した状況を明確に例証していると信じられている。“スクリーニングの手順を述べた実施例Ｉの内容は、寄生虫の感染した多くの赤血球の一貫した開発の一連の発表と組み合わせると、以前の技術の普及した方法の物質的な改良から成る発明の詳細な説明している。最初の連続培養した寄生虫の増殖が感染した赤血球を、血清を含む培地中の感染しやすい、未怒染の赤血球に加えることによってうまく行われる時は常に、赤血球と同し血液グループの抗原と、また異常な抗体と反応する抗原を持つ血液源由来の血清とを組み合わせて使用する新案の実施が必要である。この様に、一般的な抗原と抗体の凝集反応は、初代培養でも、それに引き続く継代培養でも完全に避けられる。これらの手順は、この発明のワクチンに使用された可溶性抗原の生産と単離を非常に容易にするだけではなく、また利用できる多数の後期赤血球段階の寄生虫をつくる。そのような寄生虫は、繁殖体とメロゾイトを含むが、たぶん可溶性の抗原を供給するのに好都合であろう。これ９．３００に記述されている。本発明の改良された方法の実施は、マラリア寄生虫に関係していると思われる不溶性の抗原物質の単離の試みを容易にするであろう。

もう一つの点で、本発明はマラリア寄生虫の試験管内培養が、水に可溶な抗原物質を産生しうるということを最初に証明したものである。この抗原物質は培養上澄みと洗浄液から単離され施例■の動物Ｎｏ、　４は、ワクチン注射と抗原投与の間に７ケ月が経過しているにもかかわらす、また循環するマラリア抗体が保有動物に普通に検出される割合よりも減少するにもかかわらず、致死的な寄生虫の攻撃に対して明らかに保護されていた。

このような長期の既往応答の開発は、この発明の以前のワクチン研究の１０年間においては全く見あたらない。

保護ワクチンの調整において、論証できる効用のある可溶性の培養液由来の免疫原の上述した同定によって、組み替え法或いはアミノ酸の合成ペプチドへの重合を使って、微生物の宿主細胞（ハタテリア、酵母、哺乳類）において大量に生産される培養液由来の免疫原の全体の、或いは部分的な写しから成る免疫原をたやすく産生ずるようになることは、明らかに技術的な熟練を要することであろう。

これらの写は期待されるように、試験管内培養物に対応する一次（アミノ酸配列）、二次或いは三次構造の一部或いは全部を持つポリペプチドからなるであろう。Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ小芽体の王な表面クンバクを暗号化している遺伝子のクローニングの場合と同しように〔例えば、Ｍａｒｘ＋　５ｉｃｉｅｎｃｅ、　２２５＋　ｐｐ、６２８−６２９　；　ＭｃＣｕｔｃａｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　１ｂｉｄ、＋　ｐｐ、６２５−６２８　；　Ｄａｍｅ、　ｅｔ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２４．　ｐｐ、３９７−３９９　＜１９８４）を参照〕上記の免疫原を暗号化しているマラリアＤＮＡの同定、クローニング、塩基配列決定の仕事が現在行われている。この仕事はアミノ酸配列、そして次に合成ペプチド抗原の調整を考慮して行われている。この仕事は、次の（１）と（２）の二つの方法が交互に進められるであろう。（１１Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ＤＮＡの制限酵素（例えば、５ａｌｅ、　Ｍｂｏｌ、丁ａｑＴ、　Ａｃｃｌ、　ＥｃｏＲｉ　Ｈｉｎｄさん或いはｍｕｎｇ抗片の生産をスクリーニングしていくこと。（２）　発現ヘクター系における増幅を挿入の前にクローン化された旦１ａｓｍｏｄｉヨー」■を同定するために用いる多数のＤＮＡハイフリタイセーションプローフの調整を考慮しながら、免疫原のアミノ酸配列に関する特異的な配列の情報を手に入れること。

多くのアジュバントが、本発明によって造られた抗原と組み合わせて用いられることは当業者にとっては明白であろう。その抗原は限定されてはいないが、次に示ずののを含む。表面活、性物質、例えば、ｈｅｘａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ、　ｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ、　１ｙｓｏｌｅｃｉｔｈｉｎ、　ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ、　Ｎ、Ｎ− ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−Ｎ’−Ｎ’−ｈｉｓ　（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ−ｐｒｏｐａｎｅｄｉａｍｉｎｅ　）　、　ｍｅｔｈｏｘｙｈｅｘａｄｅｃｙｌＨＩｙｃｅｒｏｌ、及びｐｌｕｒｏｎｉｃ　ｐｏｌｙｏｌｓ　；　ｐｏｌｙａｎｉｏｎｓ、例えばｐｙｒａｎ、　ｄｅｃｔｒａｎ　５ｕｌｆａｔｅ、　ｐｏｌｙ　＋（、＋　ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ　ａｃｉｄ、　ｃａｒｂｏｐｏｌ　；　ｐｅｐｔｉｄｅｓ、例えば、ｍｕｒａｍｙｌ　ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ、　ｄｉｍｅｔｈｌｇｌｙｃｉｎｅ、　ｔｕｆｔｓｉｎ　；　ｏｉｌ　ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ　；及びａｌｕｍｎ　（ミョウバン）。

然しなから、動物での保護効果はＦ（、Ａ或いはその類似物のようなアジュバント物質の使用にたよらないでも開発されたことは重要である。霊長類では、いままで致死的なマラリアの攻撃に対して保護する免疫応答の発生を助けるために、サポニンや水酸化アルミニウムのような安全なアジュバントを使用した例はない。最後に、ホルマリンのような試薬は抗原活性を失卯ことなく、ワクチンの構成成分を処理するのに用いられることがはっきりした。

例えば、実施例■で用いた上澄みと洗浄液に由来する抗原のタンパクの単位量は、かなり不純な上澄みと洗浄液物質の約２５くとも約０．１ｍｇ　、多くて約］、００ｍｇの培養液由来のタンパク物質からなっている。

異常に説明した実施例の手順は、Ｐ　Ｉ　ａＰμ扛サ−すＩｃ１ｐユ（熱帯熱マラリア原虫）の使用を必要とする。それらは、ヒトへのマラリア感染とヒトの抗マラリアワクチン注射のための試験方法における可能な類似法を確率するために計画された。然しなから、本発明の種々の方法と物質は、他のヒト−特異的なマラリア種に使用するように簡単に応用されるであろう。そのようなマラリア種には、ｈ■胆ｘ、　ｌし倶土匡、匡国巳朋がある。

また、ヒト以外の宿主に対して特異的な種にも適用されるであろう。

それゆえ、当該技術分野に熟達した当業者が前述の例証的な実施例や、好ましい態様によって、本発明の実施に際し多くの改良及び多様性が生しることが期待される。従って、添付した請求の範囲中の現在あるそのような限定は、本発明の一トに置かれるべきである。

鮨１）ｌ嗅敬／ｋＡ１０きｉ　７ノ（ａ）１　゛”“ １（ｂ）Ｉ−０゜８．、ａ傷Ａ−ｔ；贅ｍ　ｉＬ　Ｉｘ、Ｊ％Ｆ＝７＊Ｉｉ＄’ｆ’ｌ−ｕシー９　、ヅ［国際調査報告 ■

Claims

【特許請求の範囲】１　、　Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫によって感染しやすいを椎動物における保護免疫反応を改良するために用いるワクチン成分で、該成分は、（１）一種あるいはそれ以上の可溶性のクンバク免疫原を有する免疫学的に効果を有する量であり、該免疫原は各々分子量が約３５，０００から約８５．０００、及び約１９０，０００から約２１０．０００の範囲であり、感染しやすい宿主赤血球培養液中で、坦μ」回士岬寄生虫の試験管内での培養成長及び、増殖によって造られ、宿主及び寄生虫の細胞や細胞片を含まない培養液、及びそのような培養液中で感染した宿主の細胞を洗浄した液から単離され、或いは前記免疫原の一種或いはそれ以上の全体及び一部の写しが、遺伝学的に形質転換された微生物宿主或いは合成ペプチドの重合によって造られ、且つ（２）免疫学的に認められる保有者或いはアジュバントの免疫学的に有効である量である。２、請求の範囲第１項のワクチン成分で、各々分子量か約４３，０００、約５４　、０００及び／あるいは約２００．０００である可溶性タンパク免疫原の一種或いはそれ以上を含む。３、請求の範囲第１項のワクチン成分で、免疫原が、感染しやすい赤血球細胞培養液中のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ寄生虫の培養成長の過程で単離される。４、請求の範囲第３項のワクチンで、感染しやすい赤血球がヒトの赤血球である。５、請求の範囲第３項のワクチンで、免疫原成分が分子量約４３゜０００で、更に陽イオン交換クロマトグラフィーによって単離されることを特徴とする。６　請求の範囲第１項のワクチンで、免疫学的に認められるアジュバント物質がサポニンである。７、請求の範囲第１項のワクチンで、免疫学的に認められるアジュバント物質が水酸化アルミニウムである。８、　Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫による感染に対して感染しやすいを椎動物を保護する方法で、請求の範囲第１項のワクチン成分を投与することを含む。９　、　Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ−−感染に対してヒトを保護するワクチン成分で、該成分は、（１）一種あるいはそれ以上の可溶性のタンパク免疫原を有する免疫学的に効果を有する量であり、該免疫原は各々分子量が約４３．０００、約５４，０００、及び／或いは約２００，０００によって造られ、宿主及び寄生虫の細胞や細胞片を含まない培養液、及びそのような培養液中で感染した宿下の細胞を洗浄した液から単離され、或いは前記免疫原の一種或いはそれ以上の全体及び一部の写しが、遺伝学的に形質転換された微生物宿主或いは合成ペプチドの重合によって造られ、且つ（２）免疫学的に効果のある量の水酸化ルミニウムはアジュバントの免疫学的に有効である量である。１０、感染した赤血球で開始した培養液中てｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの寄生虫を連続培養し増殖させる方法で、該培養液が感染しやすい未感染の赤血球と血清を含む栄養分のある培地の両方を含み、その培地中で赤血球の抗原が全培養温度範囲で反応せず、血清や血漿中に存在する塩や異常な抗体とは反応するように、赤血球及び血清、或いは血漿を組み合わせて改良する。比請求の範囲１０項の改良で、未感染赤血球と血清はヒトの血液由来である。