JPS6028840B2 - 腸の固有運動性制御用ペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は胃腸管および他の組織の平滑筋に対して有効
な活性を有する、牛の脳下垂体後葉から単離された化合
物に関する。

さらに詳細には、この発明はある低分子量べプチド類に
関し、そのべプチド類は０甫乳動物に於ける腸の固有運
動性を安定化するが故に、回腸炎、大腸炎、けいれん性
便秘、けいれん性下痢、憩室炎、消化性潰腸およびべリ
スタルチン作用の不規則性を伴なう状態の治療に有効で
ある。この発明の生成物は牛の脳下垂体後葉から単離さ
れうるある低分子量べプチド類でありそしてそのべプチ
ド類の薬学的に容認されうる塩も包含される。

この発明はまた、主要活性成分として上述した化合物を
、薬学的に容認されうる担体と共に含有する生理学的に
有効な組成物に関する。この発明のべプチドのうちのあ
るものは、腸の固有運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）の制御
に対する有用性に加えて、程度の高い血管収縮神経（ｖ
ａｓｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｏｒ）活性をも示す。

従って、その生成物および薬学的に容認されうる塩は衝
撃（ｓｈｏｃｋ）およびその他毛細血管および動脈の収
縮を行なわしめることが必要ないいま望ましい状態の治
療に有効である。便宜上、この発明の方法により単離さ
れる生成物をコへリン（ｃｏｈｅｒｉｎ）Ａ，Ｂおよび
Ｃと指称する。

コへリンＡおよびＢはこの発明の特殊主題である。この
両者は且易の固有運動性の制御に有効である。また、こ
の両者は血管収縮神経活性を示すが、コへリンＡの有す
る活性はむしろ低い。目下のところ、コへリンＣは担体
として作用すると考えられる。これら生成物の単離操作
は次の通りである。

工程一１に於いて、ァセトン乾燥の牛脳下垂体後葉粉末
（５０ｇ）（ミルズ・ラボラトリーズ）を氷溶中にて２
×１２５地の酢酸アンモニウム（（０．２Ｍ，ｐＨ５．
６）に５分間均質化した。

１８０００ｇ，５℃にて４粉ご間遠０分離した後、上燈
液を聡の珪藻類口退助剤（セラスト、ジョーンズ・マン
ビル、アナリテイカル）により口過し、そして０．２Ｍ
酢酸アンモニウムを用いて前もって平衡化したジヱチル
アミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ）（ワットマン、Ｄ
Ｅ２３）カラム（５０×６１０帆）へ移した（工程−２
）。

ＤＥＡＥカラムを０．０９Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ５．
６で溶離し、その溶出液を分離して集め、その分別（ｆ
ｒａｃｔｉｏｎ）を腸収縮の制御およびルー・ェン・ヮ
ィ（Ｒｏ似−ｅｎ−Ｙ）嬢管（ｆｉｓｔｕｌａ）を有す
る大の腸管隣接節（ｓｅｇｍｅｎｔ）の収縮密着性（ｃ
ｏｈｅｒｅｎｃｅ）によって評価される活性度について
試験を行った。主な生物学的活性を１８２５なし、し３
９６５汎‘（全体積２１４０の‘．２Ａ２８０／私＝４
６０８）の間の分別においてＤＥＡＥセルロースから溶
離した。

ＤＥＡＥセルロース・カラムから得られた活性分別を凍
結真空乾燥した。

その固体滋を１０泌の酢酸アンモニウム（０．０２Ｍ．
ｐＨ５．６）に溶解し、交差結合デキストラン ゲル（
ファーマシア・コーポレーション、セフアデックスＧ−
５０極微粉末）のカラム（５０×６１比肋）へ移した。
工程−３では、０．０２Ｍ酢酸アンモニウムＰＨ５．６
を用いて溶鱗を行なった。

活性分別を１４６０および２５８０の【（Ｖｅ／Ｖｏ＝
３．０８）の間に溶離した。セフアデックスＧ−５０か
ら溶離した分別を凍結真空乾燥し、生成物（２．１ｇ）
を０．０２Ｍ酢酸アンモニウム（５の‘）に溶解した。
溶液を交差結合デキストランゲル（ファーマシア・セフ
アデツクスＧ−２ふ極微粉末）のカラム（５０×１０９
仇吻）に上述したように適用し（工程−４）、上述のよ
うに溶離した。活性成分１４６０ないし２５８０机【（
Ｖｅ／Ｖｏ＝２．３３）の間の分別に存在していた。同
様な方法で、セフアデックスＧ−２５から得られた活性
分別を凍結真空乾燥し４叫の酢酸０．１Ｍに溶解し、同
じ溶媒にて前もって平衡化した、高度に交差結合したデ
キストランゲル（セフアデックス Ｇ−１０）のカラム
（１０×１０５仇奴）へ移した（工程−５）。

工程−５で単離したコへリンは静電力またはファン・デ
ル・ワールス力のいずれかによって結合している錯体（
ｃｍｐｌｅｘ）として存在しているように思われる。

その物質は、工程−４の生成物をセフアデツクスＧ−１
０から２４８の【および３６３のと（Ｖｅ／Ｖｏｌ．４
７）の間の分別中で１分当り０．５の‘の速度で溶縦す
れば得られる。結合コへリンの精製は工程−５の生成物
７＆９を１．９の‘の酢酸０．２Ｍ‘こ溶解することに
より行なった。この溶液をブタノールー酢酸−水（４：
１：５）上部相（非水相）で抽出した（３×１０の‘）
。非水相抽出物を合し、白色固体になるまで真空濃縮し
た。その固体を１０の【のエタノール９５％に溶解し、
５℃にて４糊時間放置したとき、微細白色結晶が形成さ
れた。コへリン錆体は酢酸０．１Ｍ中のセフアデックス
Ｇ−１０でリサイクルをくり返した後も結合したままで
ある。

工程−５で単離したコヘリン鍔体を解離せしめ、ＰＨ２
．８および３．５にて連続流動電気泳動（ｃｏｎｔｉｎ
ｕｏｕｓｆｌｏｗｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）に
循環してくり返すとコへリンＡ．Ｂ．Ｃを生ずる。べツ
クマン−スピンコ連続流動電気泳動器、モデルＣＰを用
いて、コヘリン叢体（工程−５）（２Ａ２８０＝１７５
）を酢酸０．２Ｍ，ｐＨ２．７５に溶解してＡ２８０：
４．０であるような濃縮物を得た。この溶液を１時間当
り０．４２の‘（１８Ｖ／ｃの；０．８３ｍＡ／伽）の
速度にて垂直中央線から十７５肋の点で適用する。電解
液は０．２Ｍ酢酸であり、溶解速度は１時間当り、１チ
ューブ当り１．２凧【であった。コへリンＡは適用の点
に９５肋陰極の適下点（ｄｒｉｐｔｉｐ）に相当する分
別１３なし、し１９に存在してし、た。

これらのチューブのプーリングおよび凍結真空乾燥の後
に得られた固体をィソプロパノール（３×３の【）で抽
出し、遠心分離によって集めた。これらの条件下（ｐＨ
２．８）において、コへリンＢを適用の点に１５仇肋陰
極である分別５なし、し９にて単機する。

コへリンＣは分別１７ないし１９（適用の点に６物舷陰
極）に溶離する。コへリンＡ，Ｂ，およびＣをそれぞれ
含有するチューブをプールし、凍結真空乾燥し、別々に
ｐＨ２．８および３．５で連続流動電気泳敷器で電気泳
動的均質性に循環せしめる。

ｐＨ３．５についての電解液は酢酸０．２Ｍ中の酢酸ア
ンモニウム０．０２Ｍであった。

ｐＨ３．５にて循環せしめると、コへリンＡは分別１９
一２１に、Ｂは分別１５−１９に、Ｃは２３−２５に存
在している。べックマンースピンコ．モデルＣＰの分別
番号は不変のままであるから、陽極および陰極に対して
相対的な位置を示している。番号は陰極から陽極へ１か
ら３２までである。コへリンＡ，ＢおよびＣをｐＨ２．
８および３．５にて連続流動電気泳動に循環せしめた後
に単離し、続いてエタノール抽出を行い他のべプチドお
よび遊離アミノ酸のこん跡を除去する。

コへリンＡは少なくともグリシンを含有するべプチドで
あり、コへリンＢは同じくべプチドであるがいく分分子
量の高いものである。

また、コへリンＢはグリシンを含有し、さらには少なく
ともグルタミン酸をも含有している。この両者のべブチ
ドは水に対して溶解性であって、絶対エタノールに対し
てはわずかに溶解性であるが、アセトンおよびエーテル
に対しては不溶性である。生成物の物理的化学的性質を
表１に示す。表１ コヘリン・ベプチドの特性 コヘリン・ベプチトの特性 表１についての備考： ‘ａ）紫外線測定はカーリイ，モデル１１分光光度計を
使用して行った。

溶媒はｐＨＩについては０．１Ｎ塩酸、ｐＨ１１につい
ては０．１Ｎ水酸化ナトリウムであった。

‘ｂ｝ 電気泳動法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
）はワットマン３ＭＭ紙を用いてリサーチ・スベシヤリ
テーズ・カンパニィの機器により行い、電解液緩衝液は
次の通りであった。ｐＨ２ギ酸、酢酸（１４．２Ｖ／伽
・８５ｍＡ／弧）ｐＨ３．５ピリジン、酢酸（１４．６
Ｖ／伽・８５ｍＡ／肌）ＰＨ８．５ゞルビタール緩衝液
．０５ｈ （８，１３Ｖ／肌．１，２５ｍＡ／肌） ｙ＝金等式中，△ＭＳはプ。

ムフヱノ−ルプルーと試料との泳動（ｍｉｇｒａｔｉｏ
ｎ）の差（柵）であり、ＭＢＰ８はプロムフェノールブ
ル一の泳動である。

‘ｃー 等電点は上記｛ｂ｝に記載した電気波動法機器
を使用して原点から零泳動になるｐＨとして取った。

【ｄ｝ クロマトグラフィーはガラス上のシリカゲル（
メルク、シリカゲルＧ）の薄層を用いて行った。

溶媒ｍＮーブタノールーピリジンー酢酸−水（６０：４
０：１２：４８），｛２｝Ｎーブタノール−酢酸−水（
４：１：５）【ｅ｝ 融点は補正されていない。

コフレー・ミクロ融点 ホットステージを用いて決定し
た。‘ｆ｝ 分子量はデキストラン（セフアデツクスＧ
−５０）の薄層にて評価した。

（ｇ｝ 生物検査は上述した全工程で単離した主な分別
について慣用的に行った。

犬はし一・ェン・ワィ嬢管（Ｒｏｕｘ−ｅｎ−Ｙｆｉｓ
ｔｕｌａｅ）を有するように外科的に供され、腸の吸収
が回腸節の管腔中にて圧変換器によって監視されうるよ
うになされた。

コへリン活性は機械的並びに電気的手段によって決定し
た。分別の活性はコへリンの静脈内注射後３鼠砂以内に
腸収縮の顕著な抑制作用によって示される。評価分析用
の分別は１つの通常の生理的食溶液０．１５州−ＮａＣ
Ｉ溶液に慣例的に溶解した。別の単離操作例 コへリンＡ，Ｂ及びＣはまた次の操作により単離するこ
とができる。

この操作の初めの工程は前述した手順の工程１〜３と同
一である。

工程３からの溶出液をまず凍結乾燥させ、ついでィソプ
ロパノールで抽出する。残留物を酢酸にとかし、その酸
で平衡化したセフアデックスＧ−１０カラムに通す。そ
れを０．１Ｍ酢酸で溶離する。溶出液をついで連続流動
電気泳動にかけｐＨ２．８および３．５で８〜１２回通
過させ所望のサブュニツトを単離する。上記の操作に続
いて工程５を同様に行なうことができる。

しかしながら、コへリンＡ，Ｂ及びＣを含有する工程５
からの溶出液をプールし、凍結乾燥し、それぞれ連続流
動電気泳動に循環してくり返してもよい。各々のプール
は十分に大量であってＰＨ２．０，２．８および３．５
の各々において８〜１２回循環させることが可能である
。このような条件の下で、コへリンＡ，Ｂ及びＣはそれ
ぞれ均質性を保持している。しかし、コへリンＡは解離
して二つの分別Ａ，とＡ２を生ずる。個々のサブフラク
ションを単離するための別の方法を次のように用いても
よい。

初めの抽出操作は前述の例の工程１に関して予じめ記載
した操作と同一である。

しかしながら、工程２においては、ＤＥＡＥセルロース
のカラムを水洗し、０．０８Ｍ酢酸アンモニウムで溶離
する。工程３は同じままであるが、工程４‘こおいては
、必要な場合にはィソプロパノール抽出を用いてシロッ
プを粉末に変えてよい。工程５は例１および２と同一で
ある。本線作の主たる新しい試みは工程６にあり、これ
は一般に次のように行なわれる。セフアデツクスＧ−５
０ス−／ぐーフアイン１００ｇを水中で膨潤させ、０．
２Ｍ酢酸５リットルでカラム（６×１００伽）中で洗浄
する。洗浄したゲル２３０のＺをポリアクリル製トレー
（１９×２０．２×２．４伽）に移し深さ６柳の濃厚な
層を形成する。露気泳動装置（リサーチ・スベシャリテ
ィーズ社製）を用いて、水冷した台（ｐｌａけｏｒｍ）
の適切な場所にそのトレーを置く、そしてワットマン３
ＭＭ炉紙（１８．５×２７肌）のウィック（ｗｉｃｋ）
を各端部でゲルに挿入する。ゥィックの自由端を陽極お
よび陰極の容器にそれぞれ挿入する。０．１Ｍ酢酸１．
０の上中の試流（Ａ２８０＝２１）をゲルの真中の線に
沿ってマイクロピペットで５０山〆づつ適用する。

プロモフエノールフル−（０．１ＭＨＡｃ中の１０−４
Ｍ）のｌｏｗそをその真中の線に参照のために適用する
。蒸発を遅延させるために、ガラス板（２０×２０肌）
でトレーをカバーする。１〆，３小／伽，０．５６ｍＡ
／弧で６時間電気泳動を続ける。

べプチド成分を突き止めるために、ワットマン乳けＭ炉
紙（１×２０弧）の試験片を電流の通過方向に平行にゲ
ル中へ挿入し、すばや〈取除き、乾燥させ、フルオレス
カミンで処理する。ゲルスラブを帯状に５個に切りとり
、ガラス製のクロマトグラフカラム（２×３０肌）に移
し、０．１Ｍ酢酸（１分別当り１５０の‘）で溶鱗する
。綾出液を凍結乾燥させる。分別を生物学的活性につい
ての評価によって同定する。それら分別の均質性につい
て炉紙電気隊動によって、さらには上述した操作を用い
るセフアデックスＧ−５０とシリカゲルの薄層でのクロ
マトグラフィーによって試験することができる。その操
作は分別の均質性を改善するために異なったｐＨ、例え
ば３．５で繰返すことができる。コへリンベプチドの顕
著な特性を分折するため次のような操作を行なった。

その結果は表３に示す。雷気泳敷はリサーチ・スベシャ
リティーズ社製の装置により、ワットマン３ＭＭ 炉紙
及び次の緩衡液を用いて行なった。

緩衝液：ｐＨ２で、ギ酸、酢酸（１４．か／伽，．８５
Ａ／仇）；ｐＨ３．５でピリジン、酢酸（１４．５ｖ／
伽，．８５ｍＡ／肌）または酢酸アンモニウム０．０５
モル濃度またはトリェチル酢酸アンモニウム０．０５モ
ル濃度：ｐＨ８．５で、バルビタール緩衝液、０．０９
Ｍ（８．１ぶ／肌、１．２５ｍＡ／肌）、またはジエチ
ルアミノエタノール０．０５モル濃度 曲１１．０で
Ｎａ２Ｃ０３０．０９Ｍ（８．１桝／弧、１，２靴Ａ／
狐）。地 Ｖ＝腕； 式中、Ｍｓはブロムフェ／ール・フル−と試料との泳動
の差（帆）であり、ＮＺＰＢはブロムフェノール・フル
ーの泳動である。

等亀点は、上に述べた電気泳動を用いて、原点からの泳
動が零であるときのｐＨとする。

クロマトグラフィーは、ガラス上のシリカゲル（メルク
社、シリカゲルＧ）とイーストマンクロマトグラムシー
ト上のそのシリカゲルの薄層で行なった。

各々の場合の溶媒としては｛１’ｎ−ブタノールーピリ
ジン−酢酸−水（６０：４０：１２：４８）とｎーブタ
ノールー酢酸−水（４：１：１）であった。べプチドの
泳動速度をバシトラシンＡのそれと比較した。

ＲＢ＾ｃはバシトラシンＡの泳動距離で割った、謙料べ
プチドの泳動距離（ｎｍ×１００）に等しい。分子量は
アミノ酸分折と共にデモストランゲル（セファデックス
Ｇ−５０）の薄層上での移動比に基いて評価した、その
結果を表２に示す。

べブチドの各々の生物学的活性を試験して腸の固有運動
性の制御のレベルを決定した。

陽の収縮を回腸の分節で圧変換器によって監視できるよ
うなレー・ェン・ワィ嬢を有する犬を用意した。コへＩ
Ｊンの活性を機械的並びに電気的手段で測定した。分別
の活性はコへリンベプチドの静脈注射の後３の砂以内に
陽の収縮に対して著しく抑制することによって示された
。検定用の分別は慣例の通り標準の食塩溶液に溶解した
。生物検定の結果は表３に示す。表２ ★最も近い整数で表わしたモル比 表３ コヘリンベブチドの特性 表１及び表３の（ｇ）に関しさらに説明する。

コへリンＡ，の試料を０．１５４Ｎ−ＮａＣＩ溶液に溶
解する。その濃度を＾２８印ｍでの紫外線吸収度によっ
てＡ２８０，０．１００となるように調節する。この溶
液０．２３地をレー・ェン・ワィ嬢管を有する２３ｋｇ
の犬に静脈内在射する。このことは１．０一ｇ／ｋ９の
投与量を表わす。注射した後３硯砂以内に、小腸内の４
部位での腸管内圧力の抑制を示す電子式記録計上で陽一
性反応が観察される。生物活性は標準投与豊から生ずる
抑制時間（分）によって表わされる。次に毒性試験デー
タを示す。

マウスの場合、コへリンＡの用量を１．０ムｇ／ｋ９か
ら１８００山ｇ／ｋ９まで徐々に増加して８匹のマウス
に皮下投与したところ死んだものはなかった。

モルモットの場合、コへリンＡの用量を１．０山ｇ／ｋ
９から１２７０仏ｇ／ｋ９まで徐々に増加して５匹のモ
ルモットに皮下投与したところ、最大用量のとき一匹が
死んだ。

大の場合、６〜５０ケ月の長期に亘つて静脈内注射を７
匹の犬へ行った。

用量は０．２５０仏ｇ／ｋ９〜５仏ｇ／ｋ９であった。
平均用量は１ムｇ／ｋｇであった。結果を次の表へ示す
。※注射１回当りの用量 ０．２５０ムｇ／ｋｇ〜５仏
ｇ／ｋ９，０．００２〜０．００４％溶液各大の平均用
量 ｌＡｇ／ｋｇ ラツトに対してコへリンＡを静脈内投与して急性毒性試
験を行った。

最大投与量は靴ｇ／ｋ９であった。それ以上の投与量は
ヒトに対して推定される皮下投与量（２ムｇノｋ９／日
）の約２５０併鞠こもなるので用いていない。結果は次
の通りである。死亡については静脈注射後７〜３０分以
内に発生した。この発明の化合物は両性であるので、薬
学的に容認されうる金属塩および酸付加塩の両方共に製
造することができ、そして効果的である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、プロリン
   、グリシン、アラニンおよびロイコシンを等モルで含有
   する別個の分別Ａ＿１と、セリン、グリシンおよびチロ
   シンを等モル比で含有する別個の分別Ａ＿２を有し、そ
   して水に溶解性、絶対エタノールにわずかに溶解性、そ
   してアセトンに不溶性であり、３００ないし６００の分
   子量を有し、スペクトルの紫外線領域に於いてｐＨ１で
   ２７４ｎｍ、ｐＨ１１で２４０ｎｍおよび２９０ｎｍの
   λ最大値と、それぞれこれらに相当する２４８ｎｍ，２
   ３３ｎｍおよび２７２ｎｍで最小値を有することを特徴
   とするペプチド・コヘリンＡおよび薬学的に容認される
   その塩。 ２ アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、プロリン
   、グリシン、アラニンおよびロイコシンを等モル比で含
   有する別個の分別Ａ＿１と、セリン、グリシンおよびチ
   ロシンを等モル比で含有する別個の分別Ａ＿２を有し、
   そして水に溶解性、絶対エタノールにわずかに溶解性、
   そしてアセトンに不溶性であり、３００ないし６００の
   分子量を有し、スペクトルの紫外線領域に於いてｐＨ１
   で２７４ｎｍ、ｐＨ１１で２４０ｎｍおよび２９０ｎｍ
   のλ最大値と、それぞれこれらに相当する２４８ｎｍ，
   ２３３ｎｍおよび２７２ｎｍで最小値を有するペプチド
   ・コヘリンＡまたは薬学的に容認されるその塩を有効成
   分として含有することを特徴とする腸の固有運動性制御
   用組成物。 ３ 特許請求の範囲第２項において、担体が存在するこ
   とを特徴とする腸の固有運動性制御用組成物。