JPS60248186A - 酵母菌の形質転換のための選択可能な遺伝標識 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、外因性の（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）ＤＮＡを酵
母菌菌株、とくにサツカロミセス・セレビシ７工（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に導
入するために有用な、プラスミド含有遺伝標識（ｐｌａ
ｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｒｋｅｒ
）および関連する方法に関する。

組み換えＤＮＡ技術による有機体の遺伝的相補性の選択
的修飾は、価値あるタンパク質の効率的生産、受容体の
有機体への新しい能力の導入、および有機体の現存する
特性の最適化を可能とした。今日まで、これらの技術は
主としてバクテリア、とくにエシャリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）へ適用されてきた。し
かしながら、真核有機体、ことにサツカロミセス拳セレ
ビシアｚ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）のような酵母菌も組み換えＤＮＡ分子の受容
体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）として使用することができる
。サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ）のあ
る種の菌株、とくに醸造および／ヘン焼き産業において
使用するための増殖されるものは商業的にかなり重要で
ある０組み換え技術による工業用酵母菌の最適化または
修飾は、それらの価値を有意に増加することができる。

典型的なりローニング実験において、選択されたＤＮＡ
セグメントをベクター（ｖｅｃｔｏｒ）として知られる
自発的に複製するＤＮＡ中に組み込む。形質転換と呼ば
れる方法において、受容体細胞集団をベクター分子の調
製物と、受容体細胞によりベクター分子の組み込みを可
能とする条件下で接触させる。ベクター分子が受容体に
よる表現が可能である「遺伝標識」遺伝子を含有する場
合、実際にベクター分子を組み込んだ細胞は同定される
ことができる０例えば、あるベクターが特定の抗生物質
に対する抵抗性を付与する遺伝子を含有する場合、形質
転換された細胞は前記抗生物質の存在下に生長しか２増
殖するそれらの能力により同定されるであろう。あるい
は、ベクターは特定の栄養素を合成する受容体の菌株の
能力を排除した突然変異（栄養要求変異型として知られ
ている状態）を補足する遺伝子からなることが知られて
いる。この場合において、ベクター含有栄養遺伝標識遺
伝子を組み込みかつ表現した細胞のみは栄養に欠ける培
地中で生育しかつ増殖するであろう。

野生型または工業用酵母菌菌株の形質転換を含む実験は
、形質転換体を検出するために適当な遺伝標識が入手不
可能であることにより妨げられてきた。−［業酵母菌菌
株は、形質転換された細胞を選択する手段を提供するで
あろう栄養要求変異型に・般に欠ける。その上、抵抗表
現型が入手可能である適当な抗生物質または他の生育影
響化合物は現在知られているのはほんのわずかである。

いくつかの遺伝標識を下に要約する。

バクテリア起源のある種の遺伝子は、酵母菌中の選択的
遺伝標識として有効に使用されてきている。Ｒｅ１ｐｅ
ｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
　６：１８９（１９８２）は、ペーターラクタマーゼを
符合化する遺伝子、すなわち、Ｅ、ｃｏ　ｌ　ｉから誘
導された抗生物質不活性化酵素、をサツカロミセス・セ
レビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉ且」）を含む形質転換実験における選択的遺伝標
識として使用−することを開示している。しかしながら
、この遺伝子は、他の酵母菌オペロンから１誘導された
プロモーター配列の制御下に表現されたときにのみ有効
であった。Ｒｏｓｅ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７８：２４６０（１９８
１）は、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからの無傷のＵＲＡ
３遺伝子およびＥ、ｃｏｌｉからのベーターガラ・クト
シダーゼ遺伝子を交雑プラスミドクローニングベヒクル
１−で融合することを開示している。交雑プラスミドで
形質転換した酵母菌は、ベーターガラクトシダーゼ活性
を表現した。ＪｉｍｉｎｅＺ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕ
ｒｅ　２８７：８６９　（１９８０）は、転置要素（ｔ
　ｒａｎｓｐｏｓａｂ　１ｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ）を有す
るバクテリアコリジン誘導体および酵母菌ベクターでＳ
、ｃｅｒｅｖｉ　ｓ　ｉ　ａｅｌ同時形質転換して、２
−デオキシストレプタミン、すなわち、タンパク質合成
の比較的効力のある阻害剤、に対する抵抗性を付与する
実験を記載している。Ｃｏｈｅｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｔ、ＵΣＡ　７７：１０
７８（１９８０）は、影ユ輩±ユクロランフェニコール
抵抗決定因子を有するキメラのプラスミドでＳ、ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅをクロランフェニコール抵抗性に形質転
換することを記載している。Ｇｒｉｔｚ、ｅｔ　ａｌ、
。

広１且」　ヱ５　：　１７９　（１’Ｊ８３）は、１２
匹ｌ↓」遺伝子を含有する交雑プラスミドで酵母菌を形
質転換して抗生物質ハイグロマシン−Ｇに対する選択可
能な抵抗性を付与することを開示している。

酵母菌およびバクテリアＤＮＡからなる交雑プラスミド
が研究の調節に使用されてきたが、バクテリアＤＮＡの
特定の酵母菌菌株中への導入の回避が望ましい環境を予
測することができる（例えば、血液処理のための新しい
菌株の生産）。このような場合において、酵母菌起源の
ベクター含有ｉγ択可能な遺伝標識は好ましいであろう
。次の参考文献は酵母菌起源の優生な選択可能な遺伝標
識を有するプラスミドを開示している。

Ｆｒ１ｅｄ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ　、ＵＳＡ　７８　：　２３８（１９８１
）は、抵抗性酵母菌菌株から誘導されたＤＮＡ断片のラ
イブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）を含有するプラスミド集
団で感受性宿主菌株を形質転換することにより、タンパ
ク質合成阻害剤のトリコデルミンに対して抵抗性のＳ、
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを生産する実験を記載している。

抗生物質または阻害剤抵抗性酵母菌表現型を構成する他
のアプローチは遺伝子の増幅を含み、ここで所定の阻害
剤により標的にされる酵素を符合化する遺伝子の多数の
コピー（ｃｏｐｙ）を宿主細胞へ導入する。達成される
酵素活性の増加は選択可能な抵抗性表現型を生じうる。

例えば、Ｒｉｎｅ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、
Ａｃａｄ−３ｃｉ、ＵＳＡ　８０：２４６０　（１９８
３）は、生育阻害剤のツニカマイシンおよびコンパクチ
ンに対して抵抗性のＳ、ｃｅｒｅｖｉｓユ旦形質転換体
に導く遺伝子形質転換実験を記載している。Ｆｏｇｅｌ
、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒ。

ｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　７９：５３４
２　（１９８２）は、適当なベクター中に挿入された不
規則の酵母菌ゲノムＤＮＡ断片のライブラリーで形質転
換された受容体菌株から銅毒性抵抗性Ｓ、ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅを選択することを記載している。制限エンドヌ
クレアーゼの開裂（ｃ　ｌ　ｅ　ａｖａｇｅ）および電
気泳動の実験は、抵抗性の形質転換体が銅毒性に対して
自然変異型アレル媒介抵抗性の多数のコピーからなるプ
ラスミドを含有することを示した。いくつかの場合にお
いて、抵抗性遺伝子は酵母菌染色体ＤＮＡ中へ組み込ま
れた。

この領域における発展の加速する速度は示すようし５酵
母菌ＤＮＡから誘導された新しい選択的遺伝標識、この
ような遺伝標識を有するベクター、およびこのようなベ
クターを使用する方法は酵母菌の遺伝子操作の有用な道
具として重大な興味がもたれている。

本発明は、選択的濃度のスルホメツロンメチル（ｓｕｌ
ｆｏｍｅｔｕｒｏｎ　ｍｅｔｈｙｌ）すなわち、スルホ
ニル尿素除草剤、に対する抵抗性により特徴づけられる
表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）に感受性細胞を形質転換
することができる第１ＤＮＡセグメントからなることを
特徴とするサツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅ
ｓ）属の宿主菌株の形質転換に適合するプラスミド、ベ
クターに関する。本発明は、また、これらのベクターを
使用する方法、サツカロミセス−セレビシアｚ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＩＬ
Ｖ２位置の突然変異体アレルからなるＤＮＡセグメント
、およびサツカロミセス（Σエエエ上１」ヱＬｌ工」」
）属の酵母菌中の外因性ＤＮＡの表現に適合するプラス
ミドベクター／宿主系を提供する。

バクテリアおよび植物におけるある種のスルホニル尿素
除草剤類の作用の機構の研究は、これらの化合物がアセ
トラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）、すなわち、イソロ
イシンおよびバリンの生合成において第１の共通の工程
を触媒する酵素、の活性を阻害することを示した。ある
種のスルホニル尿素除草剤類は、また、酵母菌、例えば
、サツカロミセス拳セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の生長阻害剤である
。スルホニル尿素除草剤のスルホメツロンメチルは、３
ｐＬｇ／ｍｌのａａ濃ｉにおいてヲｔｉ１１害する。ス
ルホメツロンメチルは次の構造式： ％式％ 突然変異体すなわち野生型アレル（ａｌｌｅｌｅ）を有
する、プラスミドベクター分子を構成し、そして野生型
または工業用酵母菌菌株の感受性宿主を形質転換するた
めに使用する・ことができることが今回発見された。得
られる表現型は、未形質転換の細胞の生育および増殖を
完全に阻害するスルホメツロンメチルの濃度に対して選
択回部に抵抗性であることにより特徴づけられる。

一定１− この明細書を通じて使用するとき、次の定義が適用され
る：　「プラスミドベクター」、「プラスミド」および
「プラスミドベヒクル（ｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｈｉｃｌ
ｅ）Ｊは、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅ
ｓ）属の宿主細胞中で自発的に複製することができる二
本鎖ＤＮＡ分子を各々ざ及し、前記分子は追加のＤＮＡ
を挿入することができる少なくとも１つの制限エンドヌ
クレアーゼ開裂部位を含有する。本発明において有用な
プラスミドＤＮＡは、酵母菌またはバクテリア起源であ
ることができる。研究のため、酵母菌／／スクテリア交
雑を表わすプラスミドは、それを使用しである種のバク
テリア菌株中で増幅させかつそれら抽出することが容易
であるために好ま「７い。「宿主細胞」はプラスミドベ
クターＤＮＡの受容体として使用するのに適しあるいは
適合される細胞を意味する。ｒＤＮＡセグメント」は、
任意の源から誘導することができる二本鎖デオキシリポ
核酸の直線の断片を意味する。「遺伝子産生物」は、タ
ンパク質合成の間に選択したＤＮＡセグメントの転写お
よび翻訳により得られるポリペプチドを意味する。未発
明の分脈において、「遺伝子産生物」は通常酵素または
酵素前駆体をｆｆ、味する。「アレル（ａ　ｌ　Ｉ　ｅ
　ｌ　ｅ）　Ｊは、特定の遺伝子産生物の変異型を符合
化（ｅｎｃｏｄｅ）Ｌかつ特定の遺伝子座（ｇｅｎｅｔ
ｉｃ　１ｏｃｕｓ）に位置する遺伝子の群の１つを意味
する。分離されかつプラスミドベクター上に存在する酵
母菌遺伝子のアレルは、組み換えにより酵母菌ゲノムの
特定の遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）中に組み込まれることが
できる。

「選択的濃度」は、野生型酵母菌またはバクテリア菌株
の生育または増殖を阻害することができる生育阻害性ま
たは抗生物化合物の濃度を意味する。このような菌株、
またはその構成員の細胞は「感受性」菌株または細胞と
して知られている。

「抵抗性」は、選択的濃度の阻害剤の存在下に生υおよ
び増殖する菌株または細胞の能力を意味する。

スルホニルーーーー　寛 本発明のプラスミドベクターで形質転換された細胞は、
広いスペクトルの発芽前および発芽後の除草剤として有
効である。ある種の構造的に関係するスルホンアミド化
合物に対して選択可能な交差抵抗性を示す、一般的意味
においてここで使用するとき、「スルホニル尿素除草剤
」は広いスペクトルの除草活性および低い哺乳動物の毒
性を示すＮ−（ヘテロサイクリックアミノカルボニル）
アリールスルホンアミド化合物を意味する。

本発明の目的に対して、「スルホニル尿素除草剤」は、
除草剤スルホメツロンメチルによる生長阻害に感受性で
ある酵母菌菌株の生育を阻害することができる任意のＮ
−（ヘテロサイクリックアミノカルボニル）アリールス
ルホンアミド化合物として便利に定義することができ、
前記化合物はスルホメツロンメチルに対して特異的に抵
抗性である酵母菌菌株の生育を同時に阻害しない。

ベクター、ａ１支ｍ菌並一 本発明の範囲内の酵母菌ベクターは、２つの群に分類す
ることができる。第１に、好ましい群は、Ｓ、ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ遺伝子に対してアレリック（ａｌｌｅｌｆ
ｃ）であるデオキシリボヌクレオチド配列からなる第１
ＤＮＡからなるプラスミドを包含し、前記配列は選択的
濃度のスルホメツロンメチルに対する抵抗性を付与する
ことができる遺伝子を符合化する。この群は１例えば、
Ｉ　ＬＶ２の突然変異体アレルからなるプラスミド、Ａ
ＬＳの表現の遺伝情報を指定する（ＣＯｄｅ　ｆｏｒ）
Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｉｆｉ伝子座を含む。適当な
感受性宿主菌株の形質転換後、この突然変異体アレルは
表現され、スルホメツロンメチルによる阻害に対して抵
抗性の変更されたＡＬＳｇ素の生産を生ずる。とくに好
ましいベクターの群は、適当な宿主菌株における表現の
ために選択された、常態で酵母菌に対して外因性である
、ＤＮＡ断片からなる第２ＤＮＡセグメントからなるも
のを包含する。

本発明の範囲内のベクターの第２群は、野生型ＩＬＶ２
遺伝子の１または２以上のコピーからなる第１ＤＮＡセ
グメントからなる大きいコピ一番号（ｃｏｐｙ　ｎｕｍ
ｂｅｒ）のプラスミドを含む。適当な宿主菌株を第２群
のベクターで形質転換した後、野生型ＡＬＳ酵素は野生
型遺伝子の多数のコピーが存在する結果過度に生産され
る。得られる形質転換体は、約１〜３ＪＬｇ／ｍｌの範
囲のスルホメツロンメチルの培地濃度に対して表現型的
に抵抗性である。

一般に、本発明のベクター中にｌみ込まれたＤＮＡはバ
クテリアまたは酵母菌の起源であることができる。好ま
しくは、本発明に従って構成されるベクターはバクテリ
アおよび酵母菌の両者の起源の複製を組み込み、そのベ
クターを酵母菌（例えば、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
およびバクテリア（Ｅ、ｃｏｌｉ）の両者中で［シャト
ルベクター（ｓｈｕｔｔ　ｌｅ　ｖｅｃｔｏｒ）Ｊとし
て使用できるようにする。前述のように、ある種の用途
は酵母菌ＤＮＡのみからなるベクターの使用を必要とす
る。この場合において、所定のベクターのバクテリア区
画は既知の技術により切除（ｅｘｃｉｓｅ）することが
できる。酵母菌起源の複製の存在は、酵母菌宿主細胞中
の内因性プラスミドの複製を可能とし、プラスミドＤＮ
Ａの多数のコピーを生ずる。この目的に対して、有用な
ベクターはｒ２ｇｍの環（ｃｉｒｃｌｅ）ＪまたはΣ旦
」ｌとして知られている内因性（ｅｎｄ。

ｇ　ｅ　ｎ　ｏ　ｕ　ｓ）酵母菌プラスミドから誘導さ
れた複製の起源を含有するものである。ＢｒｏａｃＩｎ
ｈｅｒｉｔａｎｃｅ　５ｔｒａｔｈｅｒｎｅｔ　ａｍ、
編、（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ、ＮｅｗＹｏ　ｒｋ、１９８１）参照。

さらに、酵母菌染色体遺伝子に対してアレリックである
ＤＮＡ断片の存在は、相同組み換え（ｈｏｍｏ　ｌ　ｏ
ｇｏｕ　ｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ　１ｏｎ）による酵母
菌酵母菌染色体ＤＮＡ中へのプラスミドＤＮＡの安定な
組み込みの基準を提供する。この可能性の開発は、永久
の遺伝される特性を工業用酵母菌変異型へ導入するため
に有用であろう。

好ましいベクターは、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、ｅｔａｌ、、
Ｇｅｎｅ　８：１７（１９７９）に記載された、大きい
コピ一番号のベクターＹＥＰ２４から誘導されたプラス
ミドである。本発明のとくに好ましいベクターは、第２
図に示すプラスミドｐＣＰ２−４−１０である。第２図
に示すように、このプラスミドはＥ、ｃｏｌｔプラスミ
ドｐＢＲ３２２から誘導されたＤＮＡセグメントを含有
し、アンピシリン抵抗性を付与する遺伝子（ＡＲ）およ
びバクテリア起源の複製からなる。さらに、このベクタ
ーは２ｇｍの環から誘導された酵母菌起源の複製、酵母
菌ＵＲＡ３遺伝子、およびＤＮＡ断片ＣＰ２−４−１０
を含有し、スルホニル尿素除草剤スルホメツロンメチル
に対する選択的抵抗性を付与する突然変異体ＴＬＶ２遺
伝子からなる。

本発明の種々の実施態様における使用に適当な酵母菌系
列は、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）
属の範囲内に分類されるもの、例Ｓ、５ａｋｅ、および
Ｓ、ｔａｖａｒｕｍを包含する。これらのうちで、Ｓ、
ｃｅｒｅｖｉＳｉａＡか好ましい。Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅの範囲内で、ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ４９２１
を有する菌株（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｖａｒ。

ｃｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ、フランス国ワイン酵母菌）
はとくに好ましい工業用酵母菌菌株を代表する。

本発明は、また、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺仏子に対
してアレリックであるデオキシリボヌクレオチド配列か
らなるＤＮＡセグメントに関し、前記配列は選択的濃度
のスルホニル尿素生長阻害剤の選択的濃度に対して抵抗
性の遺伝子産生物を符合化し、例えば、Ｓ、ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅＩＬＶ２の突然変異体アレルからなるＤＮＡ
断片である。１つのこのような断片は、長さがほぼ５．
６キロ塩基（ｋｉｌｏｂａｓｅ）であり、大きいコピ一
番号のプラスミドＹＥｐ２４中に挿入された。この断片
、ＣＦ２−４−１０と表示する、は第１図中に示されて
いる。対応するプラスミド、ｐＣＰ２−４−１０、は前
述したとおりであり、第２図中に概略的に示されている
。旦ユ匹ｌ↓１宿主菌株ＨＢＩＯＩ中に挿入された、こ
のベクターは、アメリカンψタイプ拳カルチャー・コレ
クション（ＡＴＣＣ）（ｔ　ｈｅ　Ａｍｅｒ　１ｃａｎ
　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ　ｉｏｎ
、Ｒｏｃｋｖｉｌ　ｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）
に受託され、そして受託番号３９６０６で表示される。

この菌株の試料は、特許出願人の許可を得れば・般に入
手可能である。本発明の種々の実施態様を代表する他の
ベクターおよび受容体菌株は、イー・アイ・デュポン者
の中央研究開発部（ｔｈｅ　Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｄｅｐａ
ｒｔｍｅｎｔ、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＤｉｖＬ　Ｓ　ｉ　
Ｏｎ　、　Ｅ　、　Ｉ　−ｄ　ｕ　Ｐ　Ｏｎ　ｔ　ｄ　
ｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ　（Ｉ　
ｎｃ、）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　５ｔａｔｉｏｎ
、Ｄｅｌａｗａｒｅ、ＵＳＡ）が維持している受託収集
物に保仔されており、試料の要求はそこにされたい。

ベクターの　゛よび１ ＤＮＡの操作、酵母菌形質転換、生育培地の調製、およ
び酵母菌菌株の生育の方法は、この分野においてよく知
られている。したがって、このような方法は、次の実施
例に記載されている本発明の特定の実施態様を参照する
以外、ここで詳しく述べない。

酵母菌の遺伝学および組み換えＤＮＡの関連する面を包
含する有用な背景参考文献には次のものが包含される：
Ｓｈｅｒｍａｎ、ｅｔ　ａｌ、。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７４）＋Ｄａｖｉ
ｓ、ｅｔ　ａｌ、、ＡｄｖａＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎ　（
Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８０）；およびＭａ
ｎｉａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
。

ｒ　Ｌａｂｏｒａ’ｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

１９８２）。前記参考文献の結合した開示をここに引用
によって加える。

以下の実施例において、特記しないη′−σす、す＼て
の部および百分率は重量により、そしてすべての度はセ
氏である。

一災差夕二 一爪ボー 培地に使用した処方（非選択的生長のためのＹＥＰＤ：
選択的生育のための適当な供給物を有するＳＤおよび栄
養遺伝標識の記録）は、Ｓｈｅ　ｒｒ　１　ｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａ　ｂ　Ｏｒ　ａｔ　Ｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙ
ｏｒｋ、１９７４）に開示されているものである。胞子
形成培地は、２％の酢酸カリウム：０，１％のグルコー
ス、０．２５％の栄養エキス、例えば、バク）（Ｂａｃ
ｔｏ）−酵母菌エキス（Ｄｉｆｃｏ）および１．５％の
寒天、例えば、バクト（Ｂａｃｔｏ）−寒天（Ｄ　ｉ　
ｆ　ｃＯ）を含有した。固体培地に加えて、スルホメツ
ロンメチル（分子量３６４）をアセトン中に２ｍ　ｇ　
／　ｍ　１で溶解し、そして培養血中へ注ぐ直前に培地
−５所望濃度で添加した。

一旦ＮＡμ】】− Ｒａｍｂａｃｈ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａ
ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　７４：５０４１（１，９７７
）に記載されている方法に類似する急速方法により：あ
るいはＤａｖｉｓ、ｅｔ　ａｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、
１９８０）に開示されているものに実質的に類似する塩
化カルシウム害度勾配法により、プラスミドＤＮＡをＥ
、ｃｏ（ｉから調製する。、Ｆａｌｃｏ、ｅｔａｌ、、
Ｃｅ１１　２９：５７３（１９８２）に開示ｙれている
方法に実質的に類似する方法により、酵母菌ＤＮＡを分
離した。

一酔旦勇９１１ｔ（二 Ｈｉｎｎｅｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃ
ａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　７５：１９２９（１９７８）に
開示される方法に類似するが、次のように変更した方法
により、酵母菌の選択した宿主菌株を形質転換した。１
％のメルカプトエタノールおよび０．１モルのクエン酸
ナトリウムを含有する１モルのンルビトール、ＰＨ５，
８、中で、受容体細胞をグルスラーゼとともに３０℃に
おいて３時間インキュベーションしてスフェロプラスト
を形成した。

アセトラクテートのシンターゼの　〜 Ｍａｇｅｅ、ｅｔ　ａｌ、、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、３：５０２　（１９６８）中に実質的に記載されて
いるようにして、この検定を実施した。各反応混合物は
、０．１モルのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨａ−ｏ、５
０ミリモルのピルビン酸ナトリウム、５ミリモルのＭｇ
ＳＯ４，２５ｐＬｇ／ｍｌのピロリン酸チアミン、およ
びトルエン透過性とされた細胞を、０．５ｍｌの容量で
、含有した。

栄養物を補充されたＳＤ培地中で生育させた指数的生育
相（１〜２Ｘ　ＩＯ７細胞／　ｍ　ｌ　）中の培養から
、透過性とされた細胞を調製した。細胞を遠心により収
穫し、０．１モルのリン酸緩衝液、ｐＨ８，０、中で１
回洗浄し、小体積（もとの培養体積の１／１２）の０．
１モルのリン酸カリウム、ＰＨ８，０、？５％ｖ／ｖの
グリセロールおよび１ミリモルのＥＤＴＡ中に再懸濁さ
せた。試薬級のトルエンを１０　ｖ　／　ｖ％の濃度に
添加し、そして得られた懸濁液を激しく３０秒間攪拌し
、次いで水浴中で３０℃において２分間インキュベーシ
ョンした。次いで細胞を必要とするまで氷」二に保持し
た。合計のタンパク質を標準の方法で測定した。合計１
０〜３０．ｇのタンパク質を含有する透過性とされた細
胞の５０ｐＬｌを１回の反応に使用した。スルホメツロ
ンメチルを０．１モルのリン酸カリウム、ｐＨ８，０、
中に１００ｇ　ｇ　／　ｍ　ｌまたはアセトン中に２　
ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌで溶解し、そして反応混合物に所望
濃度で添加した。

検定混合物を含有する管を３０℃の温度に平衡化し、次
いで透過性とされた細胞を添加して各反応を開始した。

Ｏ，１ｍｌの６ＮのＨ２Ｓ０ｓまたばＯ，１ｍｌの２．
５ＮのＮａｏ）ｉの添加により反応を停止１−させた。

管を５５°Ｃに１５分間加熱し、次いで０．４ｍｌの０
．５％のクレアチンを添加し１次い−ｃ２．５ＮのＮａ
ＯＨ中ノ０．４ｍ１の４％のα−ナフトールを添加し、
各添加後金しく攪拌した。管を再び５５℃に５分間加熱
し、遠心して沈殿を除去した。次いで５３０ｎｍにおけ
る光学濃度を決定した。この検定はアセトインを測定す
る。酵素反応により形成したアセトラクテートは、Ｈ２
ＳＯ４で停止された反応における酸性化によりアセトイ
ンに転化される。

こうして、酸停止反応および塩基停止反応の（”０５３
０の読みの差は、バックグラウンドのアセトインの形成
の速度である。

−」ｊ１性↓− スルホメツロンメチルに対する抵抗性を付与スル酵母菌
ゲノムＤＮＡセグメ）・トの分離および　性づけ 酵母菌ＩＬＶ２を含有するプラスミドを構成するため、
３種の酵母菌ゲノムＤＮＡライブラリーをＣａｒｌｓｏ
ｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　２８　：　１４５　（１
９８２）に記載される方法により大きいコピ一番号のプ
ラスミドＹＥｐ２４中で構成した。このベクターは、ｕ
ｒａ３受容体菌株から形質転換体を選択するため野生型
酵母菌遺伝子ＵＲＡ３、そして／くクチリア宿主中のア
ンピシリン抵抗性を置択するためβ−ラグタマーゼ遺伝
子を含有する。制限エンドヌクレアーゼΣａｕ　３Ａ１
で部分的に消化して得られる酵母菌ＤＮＡの断片を、Ｂ
ｏｔｓｔｅｉｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　８　：１７
　（１９７９）に実質的に記載されているようにして、
プラスミドＹＥｐ２４の旦」ｉＨ１部位へ挿入した。前
述のように、ＹＥｐ２４は多数のコピー中に酵母菌細胞
中に存在することが知られている。

Ｓ　、　Ｃｅ　ｒ　ｅ　Ｖ　ｔ　Ｓ　ｌ　ａ　ｅ菌株Ｆ
Ｙ１３８（ａａａｓ３　ｈｉｓ４　Ｕｒａ３−５０）お
よびＦＹ１３９　（Ｑ　ａａｓ３　ｈｉｓ４　１Ｊ！［
ヱｕｒａ３−５０）は、前述のライブラリーでウラシル
のプロトトロフィー（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ）に形質
転換された。はぼ１０，０ＯＯＵｒａ＋形質転換体を選
択し、プールし、そしてウラシルに欠けかつｌｐｇ／ｍ
ｔの最小阻害濃度でスルホメツロンメチルを含む培地上
でほぼ１×１０６細胞／ベトリ冊の濃度で広げた。

スルホメツロンメチルに対して抵抗性のコロニーは、は
ぼＩＸ５／１０’形質転換体の頻度（ｆ　ｒ　ｅ　ｑ　
ｕｅ　ｎｃｙ）において現われる。各原子のバックグラ
ウンド中の１２コロニー、各ライブラリーから２つ、を
選択し、そしてさらに特徴づけた。

スルホメツロンメチル抵抗性の決定因子がプラスミドを
石するかどうかを決定するために、プラスミドの固有の
不安定性を利用した。プラスミドの損失のためにＵｒａ
−であるセグレガン）（Ｓｅｇｒｅｇａｎｔ）を、非選
択性培地上の生長後に、各クローンから分離した。この
ように分析した１２クローンのうちｌＯの場合において
、すべてのＵｒａ−セグレガントはスルホメツロンメチ
ルの選択的濃度に対して同様に感受性であり、前記抵抗
性決定因子がプラスミドを有することを示した。この観
察を確証し、かつクローニングしたプラスミドを分離す
るために、ＤＮＡを前記１０の酵母菌形質転換体から調
製し、モしてＥ、ｃ。

上１菌株ＨＢＩＯＩをアンピシリン抵抗性に形質転換す
るために使用した。プラスミドＤＮＡをｌＯの酵母菌Ｉ
）ＮＡ調製物から誘導してバクテリアの形質転換体から
調製した。形質転換により酵母菌中に戻した後、１０の
プラスミドのうち８つはすべてＵｒａ”の形質転換体を
生じ、それらは同様にスルホメツロンメチルに対して抵
抗性であつた。８つの調製物バクテリアの調製物の制限
酵素の地図作成（ｍａｐｐｉｎｇ）は４つの異るプラス
ミドを明らかにした；１つのＰＧＦ２−４が１回分離さ
れ：２つのＰＧＦ２−２およびがＰＧＦ２−１が２回分
離され；そして１つのｐＣＰｌ−１が３回分離された。

プラスミドｐＣＰ２−２、ＰＧＦ３−１およびｐＣＰｌ
−１中に挿入された酵母菌ゲノムＤＮＡが関係づけられ
、ある数の共通の制限断片を有する；　ＰＧＦ２−４に
より支持される酵母菌ゲノムＤＮＡ断片は他の３つに関
係づけられない。

次いで、プラスミドを有する菌株のトルエン透過性化細
胞試料を、ＡＬＳについて検定してこの酵素が過度に生
産されるかどうかを決定した。ＡＬＳ特異的活性の４〜
５倍の増加が、プラスミドｐｃＰ２−４を支持する菌株
ＦＹ１３８において見られた。この結果は、ＰＧＦ２−
４がＡＬＳ、ＩＬＶ２を符合化する無傷の構造遺伝子を
支持することを示唆した。ＡＬＳ活性のほんのわずかの
増加が、残留するプラスミドを含む菌株の抽出液中に観
察された。

プラスミドＰＣＰ２−４が無傷の酵母菌ＩＬＶＺ遺伝子
を支持することを立証するために、変更された（ａ　ｌ
　ｔ　ｅ　ｒｅｄ）ＡＬＳ酵素活性の生産を生ずるであ
ろう突然変異を探究した。ＰＧＦ２−４を支持する菌株
ＦＹ１３８の突然変異体を、ウラシルに欠けかつ高い選
択的濃度（３０ｕｇ／ｍｌ）でスルホメツロンメチルを
含む培地上で選択した。（ＦＹ１３８中のＰＧＦ２−４
の存在は３μｇ　／　ｍ　ｌの濃度に対してだけのスル
ホメツロンメチル抵抗性を付与する付与する）。６つの
独立に分離された自発的な、高いレベルの抵抗性突然変
異体が得られ、そしてこれらを特徴づけた。

前記の突然変異体がプラスミドを有することを確立する
ために、Ｕｒａ−セグレガントを前述のように分離した
。各突然変異体について、すべてのＵｒａ−セグレガン
ト（プラスミドの損失を示す）はスルホメツロンメチル
に感受性であった。

次いで、これらの突然変異体クローンから分離されたＤ
ＮＡを使用して、Ｅ、ｃｏ　ｌ　ｉ菌株ＨＢＩＯ１をア
ンピシリン抵抗性に形質転換した０次いで、プラスミド
ＤＮＡを得られる形質転換体のバクテリア培養物から調
製した。酵母菌菌株ＦＹＩ３８中へ再導入したとき、こ
れらのプラスミドは３０ｇｇ／ｍｌのスルホメツロンメ
チルに対して抵抗性である形質転換体を生じ、このこと
により高いレベルの抵抗性決定因子はプラスミドを有す
ることが立証された。

これらの突然変異体プラスミドの各々を支持する菌株Ｆ
Ｙ１３８受容体のＡＬＳ活性を、０．８色モルのスルホ
メツロンメチルの存在下および不存在下に検定した。下
表１のデータが示すように、各プラスミドの突然変異は
スルホメツロンメチルによる阻害に対して抵抗性のＡＬ
Ｓ活性の大きい程度の増加に導く、これらの結果は、ｐ
ｃＰ２−４が無傷（ｉ　ｎｔ　ａｃｔ）　のＩＬＶ２遺
伝子を支持するという結論を裏付ける。

−去ユー プラスミドを有する突然変異によるスルホメツロンメチ
ル　ＳＭ　ＡＬＳ Ｏ８８ＩＬモルのＳＭに対す プラスミド　る　のＡＬＳ　Ｏ なし　７ ＹＥｐ２４　９ ｐｃＰ２−４　４ ｐｃＰ２−４−５　７２ ｐｃＰ２−４−８　７０ ｐＣＰ２−４−１ｏ　１００ ｐｃＰ２−４−１１　７．７ ｐｃＰ２−４−１３　８５ ｐｃＰ２−４−１５　８３ 前述のようにして分離したプラスミドｐＣＰ２−４−１
０を使用して、工業用Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ閑秩Ａ
ＴＣＣ７７５４およびＡＴＣＣ４９２１をスルホメツロ
ンメチルに対して抵抗性の表現型に形質転換した。形質
転換のプロトコール（ｐｒｏｔ　ｏｃｏ　ｌ）は前述の
ものに実質的に類似し、モして３７ｚｇ／ｍｌのスルホ
メツロンメチルに対して抵抗性の形質転換体を選択した
。形質転換しない野生型菌株の生長はこの濃度において
完全に阻害された。スフェロプラストを生産するための
グルスラーゼとのインキュベーションの最適期間は、は
ぼ３時間であると決定された。

形質転換から生ずるスルホメツロンメチル抵抗性の損失
は、非選択的培地上でほぼ２５世代生長させた細胞のう
ちの２０〜８０％において起こり、この事実により抵抗
性を付与する遺伝子はプラスミドを有する（ｐｌａｓｍ
ｉｄ−ｂｏｒｎｅ）ことが示された。

？ｌＩられるＴ業用形質転換体は、スルホメツロンメチ
ルに加えて、他の構造的に関連するスルホニル尿素生長
阻害剤に対して抵抗性であった。これらの阻害剤の例は
、Ｎ−［（４−メトキシ−６−メ千ルーピリミジン−２
−イル）アミ７カルポニル］−２−二トロベンゼンスル
ホンアミド；　Ｎ−［（４、６−ジメトキシ−ピリミジ
ンー２−イル）アミノカルボニル］−２−メチルチオベ
ンゼンスルホンアミド；および２−［［（４−クロロ−
６−メドキシピリミジンー２−イル）アミノカルボニル
１アミ、ノスルホニル］安息香酸、エチルエステルであ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、サツカロミセス・セレビシアエ（５ａｃｃｈ
ａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ旦）のＩ　ＬＶ
２遺伝子座に対してアレリンクである、ＤＮＡセグメン
トＣＰ２−４−１０の部分的制限地図である。このセグ
メントは、適当なプラスミドベヒクル中に挿入されたと
き、酵母菌の形質転換のための優生の選択可能な遺伝標
識を提供する。 第２図は、無傷の酵母菌のＵＲＡ３遺伝子およびアンピ
シリン抵抗性を付与するＥ、ｃｏｌｉｉ伝子に加えて、
Ｄ−ＮＡセグメントＣＰＩ−４−１０を含有する、プラ
スミドｐＣＰ２−４−１０の略図である。 特許出願人　イー−アイ・デュポン・デ・ニモアド　Ｉ
Ｗ Ｉ−１賞 起源 ＦＩＧ、２ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和６０年特許願第３２９７９号 ２、発明の名称 酵母圏の形質転換のための選択可能な遺伝標識３、補正
をする者 事件との関係　特許出願人 ４代　理　人〒１０７ 電　話　５８５−２２５６　Ｌはが１名）（１）明細書
１１頁１−２行に「Ｒｅ１ｐｅｎ　−・−・（１９８２
）ｊとあるを「ライペン等（Ｒａｉｐａｎ＋ａｔａ１．
）、カレント・ジエネテイツクス（Ｃｓｂｒｒｇｎｔ　
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　）　６　：　１８９　（１９８２）
」と訂正する。 （２）同１４頁５−８行行に「Ｒｏｓｇ　＝”（１９８
１）Ｊとあるを以下の通り訂正する。 「ローズ等（Ｒｏｓｅ、ａｔ　ａＬ、）、プロシーテイ
ンダス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サ
イエンス・オフ拳ザ・ニー、ニス、ニー（ｐｒｏｃ、　
Ｗｒｉｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ、ｉ、　ＵＳＡ）　７８
　：　２４６［１（１９ｓ１）Ｊｌ （３）同１１頁１９行−１２頁２行に［Ｊｉｍイｎｅｔ
・・・・・・（１９８０）Ｊとあるを１ジミネツツ等（
Ｊｉｍｉｎｅｚ、ａｔ　ａｔ、）、ネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｇ）２８７：８６９　（１９８０）Ｊと訂正する。 （４）同１２頁８−１０行に［ｅｏｈｔｎ＝（１９８０
）Ｊとおるを以下の通シ訂正する。 １コーヘン等（Ｃｏｈｇｎ、　ｅｔ　ａｌ、）、プロシ
ーデインダス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
フ・サイエンス・オフ・ザ・ニー、ニス。 ｘ−（ｐｒｏｃ、、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃ＝、ＵＳＡ
）７７　：１０７Ｂ　（１９８０）Ｊ （５）同１２頁１４−１５行に「Ｇｒ　ｉ　ｔ　ｚ　−
−−−・・（１９８３）Ｊとあるを「グリッツ等（Ｇｒ
ｉｔｚ。 ｅｔａｌ、）、ジーン（Ｇａｎｇ）２５二１７９（１９
８３）」と訂正する。 （６）同１３頁１０−１２行に「ｐｒｉｅｄ　＝（１９
８１）ｊとあるを以下の通り訂正する。 「フリート等（Ｆｒｉｅｄ、ａｔ　ａｔ、）、プロシー
デインダス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ
・サイエンス・オフ・ザ・ニー、ニス、工（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｓ、　ＵＳＡ）　７８　：　
２３８　（１９８１）Ｊ （ハ　同１４頁５−８行に「Ｒｉｎｅ　−＝−（１９８
３）」とあるを以下の通り訂正する。 ｒライネ等（Ｒｉｎｔｔ、　ａｔ　ａｔ、）　、プロシ
ーデインダス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
フ・サイエンス・オフ・ザ・ニー、ニス、エーロ０　（
１９８３）　、ｆｉ （８）同１４頁１１−１５行に［Ｆｏｇｇｌ・−−−−
−（１９８２）Ｊとあるを以下の通シ訂正する。 Ｆフォー？’ル等（Ｆｏｇｅｌ、ａｔ　ａｌ、）、プロ
シーデインダス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
オフ・サイエンス・オフ・ザ・ニー、ニス。 ５５４２　（１９８２）　Ｊ （９）同２５頁１２−１９行に「Ｂｒｏａｃｈ　・＝−
・１９８１）参照。」とおるを以下の通り訂正する。 「ストラセルン等編「酵母サツカロミセスの分子生物学
：う・ｆフサイクル及び遺伝」　（コールド・スプリン
グ・ハーバ−・ラボ７）！Ｊ％ニューヨーク、１９８１
）における提唱（Ｂｒｏａｏん、１ｆＬｅｄｓ、、（Ｃ
ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８１）　）参照。」 （１０）同２４頁８−９行に「ＢｏｔＢｔｅｉｎ−−−
（１９７９）Ｊとあるを「ポットスティン等（Ｂｏｔｓ
ｔｅｉｎ、ａｔ　ａｌ、）、ジー：／　（Ｇｅｎｅ）８
：１７　（１９７９）　」と訂正する。 （１１）同２７頁４−１１行に［イー、アイ、デュポン
・・・・・・ＵＳＡ）」とあるを以下の通シ訂正する。 「イー・アイ・デュポン・デ・ニモアス・アンド・カン
・ぞニー（インコーホレイテッド）、実験研究所、中央
研究開発部、研究味、アメリカ合衆国プラウエア用Ｃｔ
ｈｇ　Ｃｔｎｔｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈａｎｄ　Ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｌｔｎｔ　Ｄｔｒｐａｒｔｍｅｎｔ。 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｅ、１．ｄｕ　
ｐｏｎｔｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐｃｔ
ｎｙ　（Ｉｎｃ、）。 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　５ｔａｔｉｏｎ、Ｄｇｔａ
ｗａｒｅ。 ＵＳＡ）　」 （１２）同２８貞４−１８行に「Ｓ　ｈ　ｅ　ｒｍａ　
ｎ　−・−・−１９８２）Ｊとあるを以下の通シ訂正す
る。 ｆシャー−ｑン等（Ｓｈｅｒｒｎａｎ、　ｅｔ　ａｌ、
）　。 ［酵母遺伝学における方法Ｊ　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、（：７−ルド・スプ
リング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク、１９
７４）　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７４）：　
ディビス等（Ｄａｖｉｓ、　ｇｔ　ａｌ、）、アト／？
　ンスド・バクチリアル・ジエネテイツクス３（Ａｄｖ
ａｎｃｔｔｄ・フォー・ジエネテイツク・エンジニアリ
ングｉｎｇ）、Ｃコールド・スプリング・ノル−パー・
ラボラトリ−、ニューヨーク、１９８０　ＣＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ
ｅｗ］’ｏｒ＆、１９８０）　〕ｉおよびマニアテイス
等（Ｍａｎｉａｔｉａ、ａｔ　Ｃｌ）、モレキュラー・
りＣｌ）　（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリ−・ニューヨーク、１９８２　（ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮｅｗＹ
ｏｒｋ、　１９８２）　］　Ｊ （１６）同２９頁８−１２行に「Ｓｈｅｒｍａｎ＝１９
７４）Ｊとあるを以下の通シ訂正する。 「ジャーマン等、「酵母遺伝学における方法」（コール
ド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨー
ク、１９７４）　（５ｈｅｒｔｎａｎ。 ｔｉｅｓ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７４
））Ｊ（１４）同３０頁４−６行に「Ｒａｍｂ　ａ　ｃ
　ｈ　−・・−１９７７）ｊとあるを以下の通り訂正す
る。 ｒラムバッハ等（Ｒａｍｂａｃｈ、ｅｔ　ａｌ、）、７
”Ｃｌシーデインダス・オフ・ザ・ナショナル・アカデ
ミ−・オフ・サイエンス・オフ・ザ・ニー、ニス。 ５０４１　（１９７７）、Ｒ （１５）同３０頁７−１２行に［Ｄａｖ　ｉ　ｓ　・−
・−・−１９８０）Ｊとあるを以下の通シ訂正する。 １″デイビス等、アドバンスト・バクチリアル・ジエネ
テインクス：ア・マニュアル・フォー・ジエネテイツク
・エンジニアリング（コールド・スプリング・ハーバ−
・ラボラトリ−、ニューヨーク、１９８０）（Ｄａｖｉ
ｓ、ａｔ　ａｌ、、ＡｄｖａｎｃｅｓＳｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ、
　１９８０）　］　Ｊ （１６）同３０頁１５−１６行に［Ｆａ　ｌ　ｃ’ｏ　
＝（１９８２）Ｊとあるをｒファルコ等（ｐａｌｅｏ。 ａｔ　ａｌ、）、セｋ　（Ｃｅｌｌ）２９　：　５７３
　（１９８２）」と訂正する。 （１７）同３１頁１−３行に［Ｈｉｎｎｅｎ＝・・・・
（１９７８）Ｊとあるを以下の通り訂正する。 「ヒンネン等（Ｈ４ｎｎｅｎ、ｅｔ　ａｌ、）、　プロ
シーデインダス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
オフ・サイエンス・オフ・ザ・ニー、ニス、工９２９　
（１９７８）Ｊ （１８）Ｕ３１典１２−１３行に「Ｍａｇｇｇ−・−（
１９６８）Ｊとあるを以下の通り訂正する。 「マジエー等（Ｍａｙｍｓ、ａｔ　ａｌ、）、ＥＴ−ａ
ビアン・ジャーナル・第１・バイオケミストリー（Ｅｖ
、ｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈａｔｎ、）　３　：　５０２　（
１９６８）Ｊ（１９）同３４頁７−８行に［Ｃａｒｌｓ
ｏｎ・曲・（１９８２）ｊとあるを「カールソン等（Ｃ
ａｒｌｓｏｎ。 ｅｔ　ａｌ、）、セル（Ｃｅｌｌ）２８：１４５　（１
９８２）」と訂正する。 （２０）同３４頁１６−１７行に「Ｂｏｔｓｔｅｉｎ・
・・・・・（１９７９）Ｊとあるをｒ戸ットスティン等
（Ｂｏｔｓｔａｉｎ、ｅｔ　ａｌ、）、ジー：ｙ　（Ｇ
ｇｓｇ）８：１７　（１９７９）Ｊと訂正する。 （２１）同１１頁４行及び１５行；１２頁１０行及び１
５行；２２頁１８行；２４頁１４行；２６頁１３−１４
行ｉ　３０ｊ１５行；３６頁１２−１３行；６９貞す行
；並びに４３頁２行に「Ｅ。 ｃｏｌｉ」とあるをそれぞれ「エシェリヒア・コリ（Ｅ
、ｃｏｌｉ）Ｊと訂正する。 （２２）同１１買１３−１４行；１２頁４−５行及び１
２行；１３頁１６−１７行；１４頁９−１０行及び１６
行；１６頁１９行；１７頁４行；２１頁４行及び１２行
；２２頁１７行；２５頁１２−１５行及び１９行；３５
頁３行；並びに４０頁１９行−４１頁１行に［Ｓ、　ｃ
ｅｒｅｖｉａｉａｌ　Ｊとあるをそれぞれ「サツカロミ
セス・セレビシアエ（Ｓ、ｃｅｒｔｔｖｉｓｉａｌ）Ｊ
と訂正する。 （２３）同２５頁９−１１行に１５．　ｃｅｒｅｖｉ−
ｓｉａｅ、、５．ｂａｉｌｉｉ、Ｓ、ｂａｙａｎｖ、ｓ
、Ｓ、ｒｏｗｚ−ｉｉ、Ｓ、５ａｋｅ、およびＳ、ｔａ
ｖａｒｕｍＪとあるを１サツカロミセス・セレビシアエ
（５，ｃｇτ６−υｉ８ｉαｅ）、サツカロミセス・′
パイリー（Ｓ。 ｂａｉＬｉｉ）　、サツカロミセス・パヤヌス（Ｓ。 ｂａｙａｎｕａ）　、サツカロミセス・ルキシー（ｓ。 ｒｕｘｉｉ）　、ｆツカａミー１ｚス・サケ（，５，ｓ
ａ４ｇ）、およびサツカロミセス・タパルム（Ｓ、ｔ、
ａｖατｕｒｒＬ）Ｊと訂正する。 （２４）同２５頁１５−１６行に［Ｓ、ｃｇｒｅ−ｖｉ
ｓｉａｋ　ｖａｒ、ｇｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓＪとおる
を１サツカロミセス・セレビシアエ・バリアント・エリ
プソイデス　（Ｓ、ｃｅｒｅｖｓｓｉａｅ　ｖａｒ。 ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ）、Ｉｔと訂正する。 （２５）同２６頁５−６行に「、５．ｃｇｒｅｖｉｓｉ
ａｇｔＬＶｚ　Ｊ　ト’）るをｒサツカロミセス・セレ
ビシアエ１ＬＶ２　（Ｓ、ｃｅｒｔｔｖｉｓｉａｅ　Ｉ
ＬＶ２）Ｊと訂正する。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■、選択的Ｃ度のスルホメツロンメチルに対する抵抗性
   により特徴づけられる表現型に感受、性細１りを形質転
   換することができる第１ＤＮＡセグメントからなること
   を特徴とするサツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃ
   ｅｓ）属の宿主菌株の形質転換に適合するプラスミドベ
   クター。 ２、宿主菌株がサツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃ
   ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｆ　ｓ上ａ６）であ
   る特許請求の範囲第１項記載のプラスミド４弓弓翻か手
   ベクター。 ３、前記ベクターがマルチコピープラスミドである特許
   請求の範囲第２項記載のプラスミドベクター。 ４、第１ＤＮＡセグメントが野生型サッカロミセス−セ
   レビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　Ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ
   ｉｓｉａｅ）ＩＬＶ２遺伝子に相当する少なくとも１種
   のデオキシリボヌクレオチド配列からなる特許請求の範
   囲第３項記載のプラスミドベクター。 ５、前記第１ＤＮＡセグメントがサツカロミセス・セレ
   ビシアｘ　（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅ　５ｃｅｒｅｖ
   ｉｓｉａｅ）遺伝子に対してアレリックであるデオキシ
   リボヌクレオチド配列からなり、前記配列は選択的濃度
   のスルホメツロンメチルに対する抵抗性を付与すること
   ができる遺伝子産生物を特徴とする特許請求の範囲第２
   項記載のプラスミドベクター。 ６、＋ｉｆｆ記配列がＩＬＶ２、アセトラクテートシン
   ターゼを符合化するＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ・構造遺
   伝子、の突然変異体アレルである特許請求の範囲第５項
   記載のプラスミドベクター。 ７、前記突然変異体アレルが野生型Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓ
   ｉａｅ遺伝子に関して優性である特許請求のＱ、間第６
   項記載のプラスミドベクター。 ８、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから誘導されたプラスミ
   ドＤＮＡをさらに含む特許請求の範囲第７項記載のプラ
   スミドベクター。 ９、酵母菌起源の複製をさらに含む特許請求の範囲第８
   項記載のプラスミドベクター。 １０、バクテリア起源の複製をさらに含む特許請求の範
   囲第９項記載のプラスミドベクター。 １１、酵母菌起源の複製が内因性酵母菌プラスミドから
   誘導される特許請求の範囲第９項記載のプラスミドベク
   ター。 ミドベクター。 １３、常態でＳ、ｃｅｒｅｖｆｓｉａｅに対して外因性
   であるデオキシリボヌクレオチド配列からなる第２ＤＮ
   Ａセグメントをさらに含む特許請求の範囲第８項記載の
   プラスミドベクター。 １４、選択的濃度が３＃１．ｇ／ｍｌである特許請求の
   範囲第５項記載のプラスミドベクター。 １５、選択的濃度が３０ルｇ　／　ｍ　ｌである特許請
   求の範囲第１４項記載のプラスミドベクター。 １６、前記プラスミドベクターがプラスミドＹＥｐ２４
   から誘導される特許請求の範囲第１２項記載のプラスミ
   ドベクター。 １７、プラスミドｐＣＰ２−４−１０である特許請求の
   範囲第１６項記載のプラスミドベクター。 １８、宿主菌株がＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡＴＣＣ７
   ７５４である特許請求の範囲第１７ｓｎ記載のプラスミ
   ドベクター。 １９、サツカロミセス争セレビシアエ（ΣａＣｃｈａｒ
   ｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｆｓｉａｅ）ｔｒ【仏子に対
   してアレリックであるデオキシリボヌクレオチド配列か
   らなり、前記配列が選択的濃度のスルホメツロンメチル
   に対して抵抗性の遺伝子産生物を符合化することを特徴
   とするＤＮＡセグメント。 ２０、前記配列がＩＬＶ２、アセトラクテートシンター
   ゼを符合化するＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａ！構造遺伝子、
   の突然変異体アレルである特許請求の範囲第１９項記載
   のプラスミドベクター。 ２１、前記配列が断片ＣＰ２−４−１０である特許請求
   の範囲第２０項記載のプラスミドベクター。 ２２、適当なＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主菌株とす・
   ンカロミセス會セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃ
   ｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子に対してアレリッ
   クであるデオキシリボヌクレオチド配列からなるプラス
   ミドベクターとからなり、前記配列が選択的濃度のスル
   ホメツロンメチルに対して抵抗性を付与することができ
   る遺伝子産生物を符合化することを特徴とするＳ、ｃｅ
   ｒｅｖｔｓｉａｅに対して常態で外因性であるＤＮＡの
   発現のためのプラスミドベクター／宿主菌株系。 ２３、宿下菌株がＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡＴＣＣ７
   ７５４であり、そしてプラスミドベクターがｐＣＰ２−
   ４−１０である特許請求の範囲第２２項記載のプラスミ
   ドベクター／宿主菌株系。 ２、特許請求の範囲第１項記載のプラスミドからなるこ
   とを特徴とする形質転換体Ｓ、　ｃｅ　ｒｅｖｉｓｉａ
   ｅ細胞。 ２、特許請求の範囲第５項記載のプラスミドからなるこ
   とを特徴とする形質転換体Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細
   胞。 ２６、プラスミドｐｃＰ２−４−１０からなることを特
   徴とする形質転換体Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓ−り生」細胞。 ２７、（ａ）適当な宿主菌株集団を、感受性細胞を形質
   転換することができる第１ＤＮＡセグメントからなるプ
   ラスミドベクターで、選択的濃度のスルホメツロンメチ
   ルに対する抵抗性により特徴づけられる表現型に形質転
   換し、 （ｂ）前記集団を選択的濃度のスルホメツロンメチルま
   たは他のスルホニル尿素の除草剤に暴露し、そして （ｃ）前記選択的濃度の前記除草剤の存在下に生育する
   ことができる形質転換体を選択する。 からなることを特徴とするＳ、ｃｅｒｅｖｉ　ｓ　ｉ主
   副に対して常態で外因性のＤＮＡをＳ、　ｃｅ　ｒｅｖ
   ｉｓｉａｅ宿主細胞へ導入する方法。 ２８、前記プラスミドベクターが特許請求の範囲第５項
   において定義したとおりである特許請求の範囲第２７項
   記載の方法。 ２９、スルホニル尿素の生育阻害剤がスルホメツロンメ
   チルでありかつ選択的濃度が３０．ｇ／ｍｌである特許
   請求の範囲第２８項記載の方法。 ３０、プラスミドベクターがプラスミドｐＣＰ２−４−
   １０である特許請求の範囲第２９項記載の方法。