JPS60248166A - スクリ−ニング用プレ−ト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は微生物の種属を同定するためのスクリーニング
用プレートに関する。

（従来技術） 微生物の種属の同定は、土壌などから菌を単離し、これ
を純粋培養してその形態学的観察および生理学的観察を
行うことによりなされる。このような操作は煩雑なうえ
に高度の専門的知識と長期にわたる反復実験を必要とす
る。

最近では微生物の種属を同定、特に感染症における病原
菌を同定するためにキット化された試薬が発売されてい
る。これは動物の赤血球などの不活性担体に微生物に特
異的な抗体を吸着させた試薬である。被検出菌が存在す
ると抗原抗体反応により凝集反応が起こる。ブドウ状球
菌を担体とし。

これに微生物に特冗的な抗体を吸着さゼで、同様に、凝
集反応により被検出菌を確認する方法も知られている。

しかし、このような抗原抗体反応を利用した試薬を用い
ても、操作が格別簡便になるわけではない。検体の微生
物のコロニーを形成させ、それを１つずつ取り出し試薬
に加えなければならないからである。また、この操作は
衛生上過大な注意力や設備を必要とする。

（発明の目的） 本発明の目的は、簡単な操作で迅速かつ正確に微生物の
種属が同定できるスクリーニング用プレートを提供する
ことにある。本発明の他の目的は。

一度の操作で菌の種属が同定できるスクリーニング用プ
レートを提供することにある。

（発明の構成） 本発明のスクリーニング用プレートは支持板と該支持板
の少なくとも１個所に固定された親水性高分子層とを備
え、該親水性高分子層が微生物特異抗体、もしくは微生
物特異抗体および溶菌酵素を含有し、そのことにより上
記目的が達成される。

本発明のスクリーニング用プレートの親水性高分子層は
微生物特異抗体、溶菌酵素などを保持することが可能で
、かつ寒天などの培地と接触したときそれらを簡単に溶
出させ得る特性を有する。

このような親水性高分子は含水性で、かつゲル層を形成
でき得る化合物である。通常、　９０　ｗ／ｗ％以上の
水を担持てきる化合物が使用される。この親水性高分子
は微生物特異抗体や溶菌酵素などと反応しないことが必
要であり、透明性に優れていることが望ましい。このよ
うな親水性高分子としては、寒天、アルギン酸ソーダ、
に−カラギーナン。

アクリルアミド、親水ウレタン、アクリル酸ソーダ、ポ
リビニルアルコール、スターチ、ゼラチンなどがある。

このような化合物は架橋処理して用いられてもよい。特
に、寒天、アルギン酸ソーダおよびに一カラギーナンが
好んで用いられる。

親水性高分子層に含まれる微生物特異抗体は微生物の菌
体あるいは菌体外生産物をウサギやモルモットなどの動
物に免疫して得られる抗血清を用いる。抗血清を精製し
て免疫グロブリンＧ　（ＩｇＧ　）分画を得、これを用
いてもよい。　微生物特異抗体の含量はその種類や精製
度により異なるが、精製ＩｇＧ分画とした抗体は親水性
高分子層に０．１〜２０．０ｍｇ／ｍ　Ｉｔ　、好まし
くは０．５〜５．０ｍｇ／ｍｊ！の割合で含有される。

同定する微生物細胞壁およびその微生物により生成され
る特有のムコ多糖類や蛋白質が上記抗体の抗原部位とな
る。これらが菌体外に放出されない場合には、親水性高
分子層にリゾチームなどの溶菌酵素を含有させる。リゾ
チームの含有量は親水性高分子層に対して１通常、０．
１〜３０．０ｍｇ／ｍ　／　、好ましくは１．０〜１０
．０ｍｇ／ｍ　ｉｔである。

スクリーニング用プレートの支持板は親水性高分子層を
支持し、その形状を所定のものに保ち得ればどのような
素材であってもよい。支持板の素材としては２例えばポ
リウレタン、ポリアミド。

ポリカーボネート、アクリル樹脂、ポリプロピレン、ポ
リエチレンテレフタレート、ポリビニルクロリドなどが
ある。支持板が透明であればスクリーニング用プレート
を培地上に積層したときに。

支持板をとおして沈降線を観察することができる。

支持板は不透明でもよく、その場合にはコロニー生育培
地の裏側から観察すればよい。支持板の厚さには、特に
制限はないが２通常０．５〜１．０ｕ程度である。支持
板の厚さが薄すぎると支持板としての機能を有し得ない
。極端に厚いと取りあつかいに不便である。

本発明のスクリーニング用プレートを調製するには、ま
ず、上記の親水性高分子溶液に微生物特異抗体、溶菌酵
素などを加えて混合し親水性高分子層を形成する。親水
性高分子層は、その水分含量が５０％以上、好ましくは
７０％以上で９９．５％以下となるように調製される。

親水性高分子層に含有される液体は抗原抗体反応を起こ
しよくするため。

バルビタールバソファーなどを用いるのが好適である。

親水性高分子のゲル状層を形成しておき。

微生物特異抗体などを含む溶液を表面に塗布してもよい
。微生物特異抗体などを含む溶液に親水性高分子のゲル
状層を浸漬してもよい。塗布もしくは浸漬により作製さ
れた親水性高分子層を備えたスクリーニング用プレート
は３表面に微生物特異抗体を有するため、微生物特異抗
体とコロニーとの接触状態が良好である。親水性高分子
層の厚さは抗原抗体反応に必要な量の微生物特異抗体や
溶菌酵素を含有できる厚さであればよく１通常１〜５ｍ
■である。このような方法で複数種の微生物特異抗体を
用いて複数種の親水性高分子層を調製する。スクリーニ
ング用プレート１は２例えば、第　。

１図および第２図に示すように、適当な大きさに切断さ
れた複数種の親水性高分子層２〜５を支持板６表面に等
間隔で配置・固定して得られる。スクリーニング用プレ
ート１の別の調製法としては。

支持板上に親水性高分子のゲル状層をあらかじめ複数個
配置・固定しておき、このゲル状層に微生物特異抗体な
どを含む複数種の溶液をそれぞれ滴下もしくは塗布して
も得られる。

支持板表面に固定される親水性高分子層の大きさ、形状
および数は特に制限されないが通常数鶏の直径の円板状
に切断された親水性高分子層が１〜数個配置・固定され
る。数が多すぎて親水性高分子層の間隔が狭くなると現
れる沈降線が重なり。

どの親水性高分子層による沈降線であるかがわかりにく
くなる。スクリーニング用プレートの大きさ、形状はと
もに特に制限されない。支持板は。

例えば、培地用の直径９Ｃ１１１程度のシャーレの大き
さにあわせて調製される。

使用される親水性高分子層は含水状態であっても乾燥状
態であってもよく、そのため、調製されたスクリーニン
グ用プレートを凍結乾燥しておけば長期間の保存が可能
である。第３図に示すようにプレート１を、単離されて
得られた同一微生物のコロニー７が１０〜５００個生育
した培地８上に親水性高分子層２〜５が接するように積
層し、所定温度にて所定時間培養を行う。培養する温度
や時間はＷＬ年初物特異抗体どの種類によって適宜選択
される。

第４図に示すように２例えば、親水性高分子層２の微生
物特異抗体や溶菌酵素が培地８に溶出しそこに抗体に対
応する菌体が存在すれば、その菌体細胞壁または菌体か
ら放出される特有のムコ多糖類や蛋白質と抗原抗体反応
を起こしコロニー７の周辺に沈降線９を生じる。沈降線
９は通常白色であり、培地に用いられる寒天などは透明
もしくけ半透明であるため、容易にこれを目視観察する
ことができる。培地中にも抗原抗体反応を起こしよいよ
うに、バルビタールバソファーなどを用いればより鮮明
な沈降線が得られる。

支持板６が透明ないし半透明である場合には沈降線が支
持板６を通して目視観察できる。支持板６が不透明であ
る場合には、シャーレの裏側から観察する。このように
きわめて簡単な操作で、培地上に生育した微生物が、沈
降線の観察された親水性高分子層に含有される抗体に対
応する微生物であることが確認される。

親水性高分子層は支持板表面に限られた数しか固定でき
ないため、一種類のスクリーニング用プレートで菌を同
定できない場合も生じる。しかし。

例えば、腸内細菌や病原菌などをあらかじめ大きく分類
しておきこれを本発明のスクリーニング用プレートで同
定すれば、１回の操作で微生物の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）
を正確に同定することが可能である。

なお１本発明のスクリーニング用プレートに代えて、微
生物特異抗体や溶菌酵素を含有する溶液を濾紙などにし
み込ませてコロニーが生育した培地上にこれを置き、沈
降線を観察する方法も考えられる。しかし濾紙を培地上
に置くときにピンセットの先が培地の菌に汚染されるた
め衛生上好ましくない。

（実施例） 以下に本発明を実施例により説明する。

大旌班上 （Ａ）免疫グロブリンＧ分画の調製二肺炎球菌の菌体を
ソニックで粉砕し、これを遠心分離し細胞壁分画を得た
。これをアジュバントと共にウサギの背中に１週問おき
に３回注射し、最終免疫後３週間後に採血を行った。血
清をアフィニティクロマトグラフィにかけて精製を行い
、免疫グロブリンＧ　（ＩｇＧ　）分画を得た。肺炎球
菌の代わりに大腸菌、チフス菌、サルモネラ菌およびブ
ドウ状球菌を用い同様の操作を行いＩｇＧ分画を得た。

（Ｂ）スクリーニング用プレートの調製：　ｐＨ７，０
の０．０１Ｍリン酸緩衝液１０ｓ＋ｊ！ニ寒天粉末０．
３ｇを加えて１００℃の温浴上で溶解させた。これを６
０”Ｃに冷却し、塩化リゾチーム１５■および（Ａ）項
で得られた肺炎球菌の抗血清ＩｇＧ分画１０ｗを加えて
混合した。この寒天溶液をガラス板上に厚さが２龍とな
るように延展し、親水性高分子層を形成させた。　肺炎
球菌の抗血清ＩｇＧ分画の代わりに。

（Ａ）項で得られた各画のそれぞれの抗血清ＩｇＧ分画
を用いて親水性高分子層を形成した。上記５種類の親水
性高分子層をそれぞれ直径５鶴の円形に打ち抜き、得ら
れた５種類の円板状親水性高分子層を直径８５龍、厚さ
２００μ用の円形のナイロンシート上に配置してスクリ
ーニング用プレートを得た。

（Ｃ）菌種の同定：患者から採取した菌を常法にて単離
し、得た単一・菌株のコロニーをシャーレの寒天培地上
に約３０個形成させた。（Ｂ）項で得られたスクリーニ
ング用プレートを親水性高分子層がコロニーと密着する
ように積層し２０℃で一夜放置した。親水性高分子層の
うちサルモネラ菌の抗血清ＩｇＧ分画を含む親水性高分
子層に接するコロニーの周辺に白い沈降線が認められた
。そのため、この菌はサルモネラであることが確認され
た。

実施例２ （Ａ）免疫グロブリンＧ分画の調製：実施例１と同様で
ある。

（Ｂ）スクリーニング用プレートの調製：　ｐｌ＋７．
０の０．１Ｍリン酸緩衝液１０ｍｊ！にに一カラギーナ
ン０．５　ｇおよび塩化ナトリウム０．０８５　ｇを加
えて混合しガラス板上に厚さが１ｍｍとなるように延展
した。形成したゲル層を直径５龍の円形に打ち抜いた。

塩化リゾチームおよび（Ａ）項で得られた肺炎球菌の抗
血清ＩｇＧ分画をｐＨ７，０の０．１Ｍリン酸緩衝液に
溶解させそれぞれ１．５ｍｇ／ｍＩ２および２．０ｍｇ
／ｍ　ｊ＋の濃度となるようにした。これに上記の円板
上ゲルを２時間浸漬し塩化リゾチームおよび抗体である
１ｇＧ分画を吸着させた。肺炎球菌の抗血清１ｇＧ分画
の代わりに（Ａ＞項で得られた害菌の抗血清１ｇＧ分画
を用い１同様の方法で塩化リヅチームおよびＩｇＧ分画
を吸着した５種類の円板状ゲルを得た。このようにして
得られた５種類の円板状の親水性高分子層を、直径３５
ｍｍで厚さ２００μｍの同形のナイロンシート支持板上
に等間隔に配置し、スクリーニング用プレートを得た。

（Ｃ）菌種の同定：実施例１と同様に患者から採取した
菌を常法にて単離し、得た継−菌株のコロニーをシャー
レの寒天培地上に約３０個形成させた。（Ｂ）項で得ら
れたスクリーニング用プレートを用いて実施例１に準じ
て菌種の同定を行った。

この菌は大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）であることが確認され
た。

（発明の効果） 本発明のスクリーニング用プレートを用いるとこのよう
に、倣生物の種属の同定が簡単な操作で衛生的に迅速か
つ正確になされうる。一度の操作で目的とする菌の同定
を確実に行うことが可能である。このようなスクリーニ
ング用プレートを感染症の病原菌の同定に用いると病原
菌が迅速かつ正確に同定されるため早期治療に貢献する
ことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のスクリーニング用プレートの一実施例
の断面図、第２図はその平面図、第３図はコロニーが生
育した培地に上記スクリーニング用プレートを積層した
状態を示す断面図、そして第４閃は抗原抗体反応により
生じたコロニー生育培地上の沈降線の状態の一例を示す
部分拡大平面図である。 １・・・スクリーニング用プレート、２〜５・・・親水
性高分子層、６・・・支持板、７・・・コロニー、８・
・・培地、９・・・沈降線。 第１図 第２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、支持板と該支持板の少なくとも１個所に固定された
   親水性高分子層とを備え、該親水性高分子層が微生物特
   異抗体、もしくは微生物特異抗体および溶菌酵素を含有
   するスクリーニング用プレート。 ２、前記支持板が透明もしくは半透明である特許請求の
   範囲第１項に記載のプレート。