JPS60237990A - 液体培養から動物細胞を分離する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は動物細胞の液体培養から動物細胞および／また
は動物細胞砕片を分離する方法に閏する。

本方法は液体培右からハイブリドーマ細胞を分離する方
法として好内である。

最近の分子生物学の発展につれて粕汁な発酵方法および
発酵冒番に対する需聾か増大している。

特に種々の技術によって修飾された動物細胞が、ぞれか
らポリペブブトやクン白質を抽出するために広く培養さ
れている。その方法の一工程は培養液から動物細胞およ
び／または動物細胞砕片を分頗りることであり、これは
培養液から細胞産生物を中成するために必要な最初の段
階である。

従来この分離は動物細胞の液体培養の遠心分因によって
行われていた。この方法は完全な分離を確実に行うため
にはかなりの加速を比較的に長時間にわたって行わねば
ならないため能率か恕い。

また遠心分離にかわって、液体培養を濾過しでもよいが
、フィルターは動物細胞と砕片とで簡単に目詰りを起こ
す。またどちらの方法によっても有用な細胞産生物が動
物細胞とともに除去廃東されることがあり、また培養上
消からの細胞砕片の分離が不完全になることがある。

本発明の目的は、液体培養碌地からの動物細胞の分離能
率を改良させることにある。

培養からの微生物細胞の分離を助けるために微生物液体
培養を凝結さぜる（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｅ）ことは公知
である。このにうな方法の一例として濁ったビールに清
澄剤を添加することが挙げられる。この場合清澄剤酵母
菌および酵母菌砕片の微小粒子を凝結さけ、次いで醸造
容器の底に沈降させる。

動物細胞物質は通常の条件の下では実効電荷が負である
外表面を右する。凝結は反対の極性の粒子の静電引力に
よる結合によって起るものであるから、プラスに荀電し
た物質が動物細胞や動物細胞砕片を凝結させるものと予
想されるであろう。

しかし驚くべきことに、われわれは、あく負に荷電した
可溶性ポリマーが動物細胞と動物細胞砕片の凝結を生じ
させる上で著効があることを介児した。

これは細胞上の電荷のプラスに荷電した部分に合致する
当該ポリマーの電荷分荀に帰因りるものではないかと推
測される。

本発明によれば、液体培養にポリガラクツロン酸（ｐｏ
ｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）を混合づるこ
とによって動物細胞および／または動物細胞砕片を凝結
さる工程ど、凝結した動物細胞および／または動物細胞
砕片を液体培養から分離する工程とを含む、動物細胞の
液体培養から動物細胞および／または動物細胞砕片を分
離する方法が提供される。

ポリカラクツロン酸なこのように凝結剤として利用りる
ことは多くの利益をもたらす。動物細胞および／または
動物細胞砕片を物理的に分離する前に凝結させることは
潜在的な産生物の収率と培養の純度を劇的に増大させ、
分離工程を全体どしてスピードアップする。本発明の方
法は動物細胞を凝結させる点で有効であるばかりでなく
、サイズが小さいために除去し勤い動物細胞砕片を凝結
させる点でも有効である。さらに、本発明の方法によれ
ば培養上清から取去られる動物細胞産生物の門は非常に
少ない。ポリガラクツロン酎自体は無毒ひあり、容易に
入手可能であり、かつ安価である。それはペクチンを脱
アシル化りることにより得ることができる。

本発明に使用するポリガラクツロン酸はポリガラクツロ
ン酸自身でもよいし、動物細胞または動物細胞砕片の凝
結を生じさせうる可溶性のポリガラクツロン酸誘導体で
もよい。動物細胞の液体培養の条件下で、使用されるポ
リガラクツロン酸が実質的に可溶である限り、その分子
量は広範囲のものを使用することができる。同様に広範
囲の澗庶にわたるポリガラクツロン酸が使用可能である
。

右効淵疫が細胞密麻に依存するため、正確に定義するこ
とはできないが有効な上限はポリガラクツロン酸が培養
をゲル化させる淵亀によって規制きれる。これは明らか
に望ましくないことである。

一方下限は動物細胞または細胞砕片の実質的な凝結が生
じる濃度によって規制される。典型的な培養については
、少くとも０．００４％（重量／容枯）のポリガラクツ
ロン酸濶度を使用りることが望ましい。特に、約０．０
３％（重量／容積）の濃度を使用りることが望ましい。

凝結した動物細胞および／または動物細胞砕片し重力に
より沈降させた後、濾過または遠心分離を選択的に行う
ことにより液体から分離ざせる。

ぞの結果生成した上清は清澄であり、動物細胞によって
産性されるポリペプチドまたはタン白質を得るために容
易に精製りることがてきる。本発明の方法はたどえば音
波処理により細胞の破壊を行った後の動物細胞の液体培
養にも適用りることができる。

動物細胞は試験管内増殖が可能な自然の動物細胞でもよ
いが、遺伝的に修飾されこ動物細胞が好ましい。動物細
胞どしてはたとえばマウスまたはラットに由来する肩種
細胞等のハイブリドーマ細胞が好ましい。また動物細胞
はヒトのリンパ芽球様細胞でもよい。動物細胞が抗体（
ＩａＭまたはＩｑＧ）を産生りる混合は、動物細胞およ
び／または動物細胞砕片の凝結時に培養の液相から除去
される抗体は非常に少く、抗体の収率を高水準に維持す
ることができる。

液体培養は少くとも凝結時において酸ｐＨ（ａｃｉｄｐ
Ｈ）に調整されることが望ましい。酸ｐＨは細胞表面上
のアミノ基とヒスチジンのプロトン化を確実にし易く、
したがって細胞上の陽電荷領域の電荷を増大させる。ポ
リガラクツロン醋はｐＨ３よりも小さいｐＨでイオン化
されたまゝでいる。ｐＨはｐＨ４とｐＨ７の間に調整さ
れることが好ましく、ｐＨ５とｐＨ６の間に調整される
ことが特に好ましい。

液体培養はたとえばジュルベツコ、モディファイド、イ
ーグル、ミジアム（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　Ｍｏｄｉｆｉｅ
ｄＥａｇｌｅ　Ｈｅｄｉａｍ（ＤＭＥＭ）またはＬ−ブ
ロス（Ｌ−Ｂｒｏｔｈ）等適当な培養であればよい。

本発明を例として挙げる以下の実施例について発明りる
。

実施例１ ＩｇＭを培養中に産生するハイブリドーマ細胞の培養上
における負じ荷電した各種可溶性ポリンーの凝決能力を
試験するために実験を行った。実験の結果はこの点にｄ
月ノるポリガラクツ１］ンＰ４すの不思議な特性を浮き
ほりにさせるしのであった。

ＩｇＭを産生りるハイブリドーン細胞ＮＢ１−マウスハ
イブリドーン）をジュルベッコ、モディファイド、イー
クル、ミディアム（ＤＭＥＭ）および５％ウシ胎児血澗
を含む培地内で標準ローラー培養法を使用して増殖させ
た。この培養は、細胞の密度および細胞砕片の聞が最大
どなる対数増殖期の終点で使用された。下記の負に荷電
した各ポリマーの水溶液を調整した。すなわち、ポリガ
ラクツロン酸（４％Ｗ／ｖ）、硫酸デキストラン分子量
８０００（１０％Ｗ／ｖ）、硫酸デキストラン分子石５
００，０００（８％Ｗ／ｖ）、アルギン酸、カラギーナ
ン、ＤＦＡＦ−デキストラン、ポリグルタミン酸、硫酸
ポリビニルの各水溶液である。

複数の培養（５０ｍｌ）を１ＭＨＣｌまたは固定トリス
−ＨＣｌ塩基を用いてｐＨ５．０、７．０および９．０
にそれぞれ調整した。１５ｍｌ画線試験管内の各ｐＨ調
整済み試料１０ｍｌに被試験凝結剤を添加し各試料を反
転することにより混合した。各試験管を静置し、２時間
後および１８時間後に観察した。ｐＨ５．０のポリガラ
クツロン酸を含む試験管のシリーズを遠心分離によって
清澄化した。清澄化した上清をリンプルし、ＥＬＩＳＡ
検定法を使用してＩｇＭ濃度を測定した。

試験の結果を下表１に示す。

アルギン酸、カラギープン、ＤＥＡＥ−デキストラン、
ポリグルタミン酸および硫酸ポリビニルは濃度１％（Ｗ
／ｖ）で凝結を牛しなかった。また０．０４％（Ｗ／ｖ
）〜０．０００４％（Ｗ／ｖ）のポリガラクツロン酸で
凝結ざせた培養から生じる上量中にはＩｇＭの損失は検
知されなかった。

実施例２ 実施例１の実験はポリガラクツロン醸が液体培養中のバ
イブリドーマ細胞を凝結さける効宋を実証した。次にこ
の実験をパイロットプラントのレベルまで拡大した。

３０ｌの培養を以下に述べる方法で培養し収穫した。培
仏光酊槽中にＣＯ２を吹き込むことによって培養のｐＨ
を５．０と６．０の間に調整した。ポリガラクツロン酸
をハイブリトーマ細胞および細胞砕片の密度に応じて濃
度０．０４％〜０．１％（Ｗ／Ｖ）で添加した。添加凝
結剤の品は約５０ｍｌであった。

発酵槽中で混合しだ後ＣＯ２ガスの供給を停止し、凝結
を進行させた。凝結した細胞と砕片は１時間かけで沈降
ざせた。次いで凝結しこ細胞と砕片を巻回ポリプロピレ
ン・デプス・フィルクー・カートリッジ（ｗｏｕｎｄ　
ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ　ｄｅｐｔｈ　ｆｉｌｔｃ
ｒ　ｃ−ａｒｔｒｉｄｇｃ）（公称孔径０．１μ）を使
用して濾過りるかまたはウェストフアリアＳＡ−１（Ｗ
ｃｓｔｒａｌ−ｉａＳＡ−１）分離器を使用して連続遠
心分離りることにより除去した。どちらの場合もその結
果牛じた上清は従来の分離技術を使用する場合に比べて
より清登てあつた。このスケールアップした実験を１０
０ｌ培養および１０００ｌ培益についてもくり返し、そ
の結果は成功であった。また上記実験の結果、５ＭＨ２
ＳＯ４を使用することによりｐＨを減少さびうろこと、
およびポリガラクツロン酸は添加前に水に溶かして製電
２０％（Ｗ／Ｖ）の水溶液にしておくど取扱いが容易で
あることが判った。

実施例３ マウスハイブリドーマ細胞系統およびヒへリンパ芽球様
細胞系統（ＥＢ転換したリンパ球）を使用した１００ｌ
培養中で実施例２の実験を打つた。

どららの場合し動物細胞と動物細胞砕片の凝結と分離ご
成功した。

なお、上記実隔例はあまでも例示的なものであって、本
光明の領域ど精神の範囲内において細部の改変は種々用
能であることは理解されよう。

出願人　セルテック、リミテッド 代理人　坂本徹 　（ほか１名）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）液体培養にボリガラクツロン酸（ｐｏｌｙｏａｌ
   ａｃｔ−ｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）を混合することによつ
   て動物細胞および／または動物細胞砕片を凝結させる工
   程と、凝結した動物細胞および／または動物細胞砕片を
   液体培養から分離する工程とを含む、動物細胞の液体培
   養から動物細胞および／または動物細胞砕片を分離する
   方法。
2. （２）該凝結した動物細胞および／または動物細胞砕片
   を濾過または遠心分離によって該液体培養から分離する
   特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）動物細胞は遺伝的に修飾された動物細胞である特
   許請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
4. （４）動物細胞はハイブリドーマ細胞である特許請求の
   範囲第３項記載の方法。
5. （５）動物細胞はリンパ芽球様細胞である特許請求の範
   囲第３拍記載の方法。
6. （６）液体培養のｐＨは少くとも凝結時において酌ｐＨ
   に調整されている特許請求の範囲第１瑣ないし第５項の
   いずれかに記載の方法。