JPS60221080A - 植物および細菌における転写 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、遺伝子工学と植物培養との分野に関し、特に
、植物と細菌の双方における転写の促進と選択マーカー
に対する手段を供給する。

（従来の技術） 本発明に密接に関係する技術的背景の情報を開示する出
版物を下記に示す。これらの出版物はこの従来技術の項
で詳細に論議されている。門、−１Ｂｅｖａｎ　ｅｔ　
ａｌ、　（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０４　：　１
８４−１８７．　Ｒ。

Ｔ、　Ｆｒａｌｅｙ　ｅｔ　ａｔ、　（１９８３）　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０　：　４８０３−４８０７およ
びり、　Ｈｅｒｒｅｒａ−ε５ｔｒｅｌｌａ　ｅｔ　ａ
ｌ、　（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０３　：　２０
９−２１３゜は細菌抗生物質耐性構造遺伝子の植物での
発現をもたらすような」匹プロモーターの使用を開示し
た（Ｔ　Ｉ　Ｐプラスミドの操作を参照）。Ｒ，Ｆ。

Ｂａｒｋｅｒ　ｅＬ　ａｌ、　（１９８３）　Ｐｌａｎ
ｔ　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　２　：３３５−３５０
およびＲ，Ｆ、　Ｂａｒｋｅｒ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｄ、　
Ｋｅｍｐ＋Ｕ、Ｓ　Ｐａｔｅｎｔ　ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ　ｓｅｒ、　ｎｏ、５５３，７８６はオクトピン型
プラスミドｐＴｉ１５９５５由来のＴ−ＤＮＡの完全な
配列を開示する；他のＴｉプラスミド遺伝子の相同性の
ある公にされた配列はそこに引用されている（Ｔ　Ｉ　
Ｐプラスミド上の遺伝子）。Ｎ。

Ｍｕｒａｉ　ａｎｄ　Ｊ、Ｄ、Ｋｅｍｐ　（１９８２）
　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　１０　：　１
６７９−１６８９は１６００塩基の大きさを持ち。

その配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）２
４をコードしているとして、そこで同定された１４５０
塩基転写物（１４５０ｂＴｘ）の存在とおよその位置を
開示した。　Ｓ、　Ｂ、　Ｇｅ１ｖｉｎ　ｅｔ　ａｔ、
　（１９８１）　’Ｐｌａｓｍｉｄ　６　：　１７−２
９はＴ、がアグロバクテリウム細胞と植物細胞中で転写
されると開示した（ＴＩＰプラスミド上の遺伝子）　。

Ｓ、　Ｊ、にａｒｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８４）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、は
、　１４５０ｂＴｘの位置を決定した。２元目的機能の
特徴は、ここで開示され、教えられるので、前述の参考
文献には報告されなかった。　Ｌ、　Ｈｅｒｒｅｒａ−
Ｅｓｔｒｅｌｌａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　ｆ！
ＭＢＯＪ、　２　：　９８７−９９５はカナマイシンと
メトトレキセートに対する耐性をコードする構造遺伝子
が、」丑プロモーターの後に置かれると、細菌および植
物細胞の両方で発現したと、報告した。

シャトルヘク　− Ｇ、　Ｂ、　Ｒｕｖｋｕｎ　ａｎｄ　Ｆ、　Ｍ、　Ａｕ
５ｕｂｅｌ　（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ２９８　：　
８５−８８によって発明されたシャトルベクターは、外
来遺伝物質を巨大プラスミド、ウィルスあるいはゲノム
中の適切な位置へ挿入する方法を提供する。巨大プラス
ミドあるいはゲノムを扱う際に出会う２つの主な問題が
ある。初めに、巨大プラスミドはそれぞれの制限酵素に
対する多くの部位を持つであろう。独特な部位特異性開
裂反応は再現できず、複数の部位開裂反応、それに続（
結合は変わって欲しくない順序や方向の多くの断片の奪
い合いによる非常な困難さを導く。第２は。

巨大ＤＮＡプラスミドでの形質転換効率が大変低いこと
である。シャトルベクターは外来遺伝物質のしばしばイ
ンビトロでの小さいプラスミドへの挿入を促進し１次い
で通常インビボの技術による巨大プラスミドへの転移に
よりこれらの困難さを克服することを可能にする。

シャトルベクターは、最終宿主細菌へ導入されることが
可能で、そこで独立に維持されることができるレプリコ
ンを持つＤＮＡ分子２通常、プラスミドから成る。また
、シャトルベクターは、外来遺伝物質が挿入されること
ができる宿主ゲノムの断片のコピーと、やはり宿主ゲノ
ム断片へ挿入される選択できる特徴をコードするＤＮＡ
小片を含む。選択できる特徴（マーカー）はインビボで
トランスポゾン突然変異によるか、あるいは制限酵素と
りガーゼのインビボでの使用によじて、都合のよいこと
に挿入される。

当核シャトルベクターは最終宿主細胞へ特に（アグロバ
クテリウム属を含む）リゾビアソシー科の細菌へ９次の
ような方法で導入されることが可能である。三組交雑法
（Ｒｕｖｋｉｎ　ａｎｄ　Ａｕ５ｕｂｅｌ、前出）、二
組交雑における自律移動可能なヘクターの直接転移、ア
グロバクテリウム細胞による外来ＤＮＡの直接取込み（
″形質転換”、　Ｍ、　Ｈｏ１ｓｔｅｒｓｅｔ　ａｌ、
　（１９７８）　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ
、　１６３　：　１８１−１８７の条件を用いて）もう
ひとつの細菌細胞とのアグロバクテリウムのスフェロプ
ラスト融合リポゾームで包括されたＤＮＡの取込ｄ、あ
るいはインビトロでパッケージされ得るウィルスに基づ
いたシャトルベクターでの感染。リゾビアッシー科の中
で見つけられた巨大プラスミドの操作であり、当業者に
良く知られている技術である三組交雑は当該シャトルベ
クターを保持する株と、プラスミド起動と接合伝達に対
する遺伝子を含む移動可能なプラスミドを保持する株と
の交雑を含む。もし。

当該シャトルベクターがプラスミド遺伝子によって起動
することが可能なら、当該シャトルベクターは巨大ゲノ
ム、例えば、アグロバクテリウム株のＴｉあるいはＲｉ
プラスミドを保持する宿主細胞へ転移される。

当該シャトルベクターが宿主細胞へ導入された後、可能
な事象は、マーカーのどちらかの側でひとつの組み換え
事象を伴う２重交差を含む。このホモ部分二倍体化事象
は、挿入を欠いた相同小片の置き換えで、マーカーを含
むＤＮＡ小片の宿主ゲノムへの転移という結果を招く。

元のシャトルベクターを失った細胞の選択をするため、
当該シャトルベクターは、最終宿主細胞中での複製不可
能か、あるいは宿主細胞中で元より存在している独立に
選択可能なプラスミドと不和合性でなければならない。

このことを整えるひとつの一般的手段は、第３の宿主に
当該シャトルベクターと不和合性で違った薬剤耐性マー
カーを保持するもうひとつのプラスミドを供給すること
である。したがって２両方の薬剤に対する耐性を選択す
ると、生き残った細胞のみがその中で、当該シャトルベ
クター上のマーカーが宿主ゲノムと組み換えたものであ
る。もし当該シャトルベクターが特別なマーカーを保持
していると、それで、当８亥シャトルベクターと宿主プ
ラスミドとの間での一重交差事象の結果に由来するプラ
スミドを含む細胞を排除でき、無傷の当該シャトルベク
ターが宿主プラスミドと統合されるような結果となる。

もし外来遺伝物質が選択されるべきマーカーへ挿入され
るか。

あるいは隣接すると、また同様の２重組み換えの結果と
して宿主プラスミドへ統合されるであろう。

また、マーカー内や隣接した位置以外で相同性断片へ挿
入されると、いっしょに保持され、しかし。

外来遺伝物質をマーカーから分離している距離が大きく
なるにつれて、外来遺伝物質とマーカーの間に組み換え
事象が起こりやすくなり、外来遺伝物質の転移を妨げる
。

もし、当該シャトルベクターが２表現型的に優性な特１
″＆（例えば、新しく発現可能な殺虫剤構造遺伝子だが
、不活性化された腫瘍性Ｔ−ＤＮＡ遺伝子ではない）を
誘導するために使われると、二重相同組み換えに頼る必
要がな（なる。共同組み込みプラスミドをもたらす一重
組み換え事象により得られる細胞は、植物細胞へ望む特
徴を転移することができる（Ａ、　Ｃａｐｌａｎ　ｅｔ
　ａｌ、　（１９８３）　５ｃｉｅｎｃｅ２２２　：　
８１５−８２Ｌ　Ｒ，Ｂ、　１ｌｏｒｓｃｈ　ｅｔ　ａ
ｌ、　（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２３　：　４９
６−４９８）。単一の連続したＴ−ＤＮＡの配列を持つ
色々なシャトルベクターを用いることさえ可能かもしれ
ない。しかし、その結果として得られたＴ−ＤＮＡは、
今や、繰り返し遺伝子重複を含むであろうから、アグロ
バクテリウムか植物細胞のどちらかで２つの相同配列間
で起こる一重相同組み換え事象による当該シャトルベク
ターのまれに起こる欠失に気をつけて注目しなければな
らない。

シャトルベクターはアグロバクテリうムプラスミドの操
作において効力を与えた。Ｄ、’　Ｊ、　Ｇａｒｆｉｎ
ｋｅｌｅｔ　ａｌ、　（１９８１）　Ｃｅ１ｌ　２７　
：　１４３−１５３．　Ａ、　Ｊ、　Ｍ。

Ｍａｔｚｋｅ　ａｎｄ　Ｍ、−Ｄ、　Ｃｈｉｌｔｏｎ　
（１９８１）　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ。

Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　１　：　３９−４！ＩＬ　
ａｎｄ　Ｊ、　Ｌｅｅｍａｎｓ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８１）　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅ
ｎｅｔ、　１　：　１４９−１６４を参照せよ。彼らは
、シャトルベクターを仲介ベクターあるいは“ｉＶ”と
いう言葉で称した。

巨大ＤＮＡ分子への変化の挿入に対するシャトルベクタ
ー系の最近明らかにされた変形は“自殺ベクター”であ
る。この系ではＳｉｍｏｎ　ｅｔ　ａｌ、細菌−植物相
互作用の分子遺伝学ｐｐ、９８−１０６（ｅｄ、＾。

Ｐｕｈｌｅｒ、　（１９８３））の“グラム陰性細菌の
インビボおよびインビトロ操作のためのベクタープラス
ミド”とＲ，Ｓｉｍｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）
　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　１　ニア８４−７９１によ
って述べられたように、シャトルへクターレブリコンは
宿主細胞内では独立に維持され得ない。この特性は、一
般に三組交雑中になされるようなシャトルベクターを排
除するために。

宿主細胞へ不和合性のプラスミドを導入する必要を削除
している。すでに存在するＤＮＡへ統合されないすべて
のヘクター配列は複製されないことによって効率良く自
殺する。シャトルベクターの伝統的な型で成され得るよ
うに、２つの相同領域の間にない抗生物質耐性遺伝子を
スクリーニングすることによって、二重と一重相同性の
間の区別ができるかもしれない。ＤＮＡ配列をＴｉプラ
スミドへ転移するための自殺ベクターの使用はＥ、Ｖａ
ｎｌｌａｕｔｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　ＥＭＢ
ＯＪ、２　：　４１１−４１７．　Ｌ。

Ｃｏｍａｉ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｐｌａｎｔ
、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　１　：２９１−３００
．　Ｌ、　Ｃｏｍａｉ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　
Ｐｌａｓｍｉｄ　１０　：２１−３０．　Ｐ、　Ｚａｍ
ｂｒｙｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　ＩＥＭＢ
ＯＪ、　２　：２１４３−２１５０．およびＡ、　Ｃａ
ｐｌａｎ　ｅｔ　ａｌ、、前出、によって報告もされて
いる。　Ｃ，ｔｌ、　Ｓｈａｗ　ｅｔ　ａｌ、　（１９
８３）　Ｇｅｎｅ　２８　：　３１５−３３０．は、外
来ＤＮＡを一重相同性組み換えの選択の手段によって選
択可能なマーカーの導入もせずにＴｉプラスミドへ導入
し。

次いで二重相同組み換えに対する選択することによる自
殺ベクターの使用を報告している。

Ｔ−ＤＮＡへの新しいＤＮＡ配列の導入に対する相同性
組み換えの使用に代わるものに細菌トランスポゾンがあ
る。ＴＩＰプラスミド上のアグロバクテリウム遺伝子の
項で述べられるように、トランスポゾンはＴＩＰプラス
ミドのＴ−ＤＮＡへ飛び込むことができる。（例えば、
　Ｄ、Ｊ、Ｇａｒｆｉｎｋｅｌｅｔ　ａｌ、　（１９８
１）　Ｃｅ１ｌ　２７　：　１４−１５３を参照）。当
該トランスポゾンは新しい配列の挿入によってインビト
ロで修飾されるので、その新しいＤＮＡは。

当該トランスポゾンによってＴＩＰプラスミドのＴ−Ｄ
ＮＡへ転移され得る。ＴＩＰは、それが安定に組み込ま
れると、植物細胞へ新しいＤＮＡ／トランスポゾン／Ｔ
−ＤＮＡの組合せを転移することができる。

アグロバクテリウムの外 グラム陰性菌のりゾビアソシー科（リゾビウム属も含む
）に含まれるアグロバクテリウム属には。

アグロバクテリウム・チューメファシエンスとアグロバ
クテリウム・リゾゲネスがある。これらの種はそれぞれ
、植物のクラウンゴール症と毛状根症の原因である。ク
ラウンゴールは脱分化組織のゴールの成長によって性格
づけされる。毛状根は感染された組織において、根の不
適当な誘導によって性格づけされる奇形である。どちら
の病症においても、不適当に成長する植物組織が、正常
には植物によって生産されず、感染している細菌によっ
て代謝される。オピンとして知られる。ひとつあるいは
それ以上のアミノ酸ＫＡ体を通常生産する。既知のオピ
ンは、オクトピン、ツバリンおよびアグロピンという３
つの主なグループに分けられている。不適当に増殖する
組織の細胞は培養することで増殖させることができ、適
当な条件下で、ある形質転換された表現型を維持する完
全な植物へ再生することができる。

アグロバクテリウムの病原性株は、アグロバクテリウム
・チューメファシェンスではＴｉ　（腫瘍誘導）プラス
ミド、アグロバクテリウム・リゾゲネスではＲｉ　（根
誘導）プラスミドとして知られる巨大プラスミドを保持
する。これらのプラスミドを株から脱落させると、疾病
性が失われる。Ｔｉプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡ　（転移
ＤＮＡ）と呼ばれる領域を含み、そのＴ−ＤＮＡは腫瘍
中で宿主植物のゲノムへ取り込まれていることがわかっ
ている。当該Ｔ−ＤＮＡは、いくつかの転写物をコード
している。突然変異の研究は、これらのいくつかは腫瘍
成長の誘導に含まれている。ことを示した。ｔｍｌ　、
　ｔｍｒおよび展に対する遺伝子における突然変異体は
それぞれ（タバコでの）巨大腫瘍、根を産する性質、茎
葉誘導の傾向という結果をもたらす。当該Ｔ−ＤＮＡは
少なくともひとつのオピン合成酵素の遺伝子もコードし
ており、当該Ｔｉプラスミドはそれらによって合成を引
き起こされるオピンによってしばしば分けられる。それ
ぞれのＴ−ＤＮＡ遺伝子はＴ−ＤＮＡプロモーターの調
節下にある。Ｔ−ＤＮＡプロモーターは構造上真核生物
プロモーターと似ており、それらは形質転換された植物
細胞中でのみ機能するようである。当該Ｔｉプラスミド
はＴ−ＤＮＡ以外の遺転子も保持する。これらの遺伝子
はオビン代謝。

腫瘍性、アゲロジン怒受性、複製、および細菌細胞への
自律転移を含む機能に含まれる。ＲｉプラスミドはＴｉ
プラスミドと同様の構造に組織されている。植物細胞の
形質転換に対応する遺伝子とＤＮＡ配列の組は、以後、
集中的に形質転換誘導原理（ＴＩＰ）として呼ぶ。した
がって、ＴＩＰという名称は、制限されないが、Ｔｉと
Ｒｉプラスミドの両方を含む。ＴＩＰの組み込まれた小
片は、　Ｔｉプラスミドに由来するかＲｉプラスミドに
由来するかにかかわらず、ここではＴ−ＤＮＡ　（転移
ＤＮＡ）と呼ばれる。

Ｍ、−Ｄ、　Ｃｈｉｌｔｏｎ　（Ｊｕｎｅ　１９８３）
　Ｓｃｉ、　Ａｍｅｒ、　２４８（６）　：　５０−５
９は最近ベクターとしてのＴｉプラスミドの利用におけ
る紹介記事を示した。アグロバクテリウムが原因となる
疾病の最近の一般的総説にり、　Ｊ、　Ｍｅｒｌｏ　（
１９８２）、　Ａｄｖ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌ、
　１　：１３９−１７８　；　Ｌ、　Ｗ、　Ｒｅａｍ　
ａｎｄ　Ｍ、　Ｐ、　Ｇｏｒｄｏｎ　（１９８２）。

５ｃｉｅｎｃｅ　２１８　：　８５４−８５９　＋　ａ
ｎｄ　Ｍ、　Ｈ，Ｂｅｖａｎ　ａｎｄＭ、−Ｄ、Ｃｈｉ
ｌｔｏｎ　（１９８２）　、八ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅ
ｔ、１６　：３５７−３８４　；　Ｇ、Ｋａｈｌ　ａｎ
ｄ　Ｊ、５ｃｈｅｌｌ　（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒＢｉｏｌｏ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｔｕｍｏｒ＋　Ｋ
、＾、Ｂａｒｔｏｎ　ａｎｄ　Ｍ、−Ｄ。

Ｃｈｉｌｔｏｎ　（１９８３）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ、１０１　：　５２７−５３９゜および八、　Ｃ
ａｐｌａｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　５ｃｉｅｎ
ｃｅ　２２２　：８１５−８２１によるものがある。

超重ｌ１１礪艮束 植物細胞は、当業者に知られる多くの方法で。

アグロバクテリウムによって形質転換されることができ
、その方法とは、アグロバクテリウムと共に植物細胞を
培養すること、アグロバクテリウムスフェロプラストと
の植物プロトプラストの融合。

植物細胞プロトプラストでの遊離Ｔ−ＤＮＡの取込みに
よる直接形質転換、完全な細菌での部分的に再生された
細胞壁を持つプロトプラストの形質転換、　Ｔ−ＤＮｐ
、を含むリボゾームによるプロトプラストの形質転換、
Ｔ−ＤＮＡを持つウィルスの使用、マイクロインジェク
ション、等々、を含むが、限定されない。どの方法も遺
伝子が有−系分裂と減数分裂を通して安定に伝達される
限り充分である。

アグロバクテリウムによる植物細胞の感染は当業者に良
く知られた簡単な技術である（例えば。

Ｄ、　Ｎ、　Ｂｕｔｃｈｅｒ　ｅＬ　ａｌ、　（１９８
０）　ｉｎ　Ｔｉ５ｓｕｅ　ＣｕｌｔｕｒｅＭｅｔｈｏ
ｄｓ　ｆｏｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ
、　ｅｄｓ、　：　Ｄ、　Ｓ。

Ｉｎｇｒａｍ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｐ、　ｔｌｅｌｇｅｓｏ
ｎ、　ｐｐ、２０３−２０８を参照せよ）。典型的には
、植物は多くのいかなる方法によっても傷つけられるが
、その方法とは、刃物で切ること、針で刺すこと、ある
いは研磨剤でこすることを含む。次いで、その傷に腫瘍
誘導細菌を含む溶液を植菌する。完全な植物の感染に代
わるものはポテト茎ディスク（Ｄ、　Ｋ、八ｎａｎｄ　
ａｎｄ　Ｇ。

Ｔ、　Ｈｅｂｅｒｌｅｉｎ　（１９７７）Δｍｅｒ、　
Ｊ、　Ｂｏｔ、　６４　：　１５３−１５８）あるいは
、クハコの茎の逆位の小片（Ｋ、　Ａ。

Ｂａｒｔｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　Ｃｅ１
ｌ　３２　：　１０３３−１０４３）のような組織片の
植菌がある。感染後、腫瘍は植物ホルモンを欠いた培地
での組織培養中に置かれる。

ホルモンに依存しない増殖は形質転換された組織の典型
で、そのような組織培養の増殖の通常の条件と非常に対
照的である。（Ａ、　Ｃ，Ｂｒａｕｎ　（１９５６）Ｃ
ａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、１６　：　５３−５６）　。

アグロバクテリウムは２分離された細胞や、培養で増殖
した細胞（Ｌ、　Ｍａｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９７
９）Ｎａｔｕｒｅ　２７７　：　１２９−１３１）およ
び２分離されたタバコ葉肉プロトプラストにも感染する
能力を持つ。

後者の技術では、新しい細胞壁の部分再生をさせる時間
の後、アグロバクテリウム細胞がしばらくの間培養に加
えられ、そして抗生物質の添加によって殺された。Ｔｉ
プラスミドを保持するアグロバクテリウム・チューメフ
ァシエンス細胞にさらされた。これらの細胞のみが、ホ
ルモンを欠いた培地上においた際、カルスを形成する能
力を持った。

たいていのカルスはオビン同化に関与する酵素活性を含
むことがわかった。他の研究者ら（Ｒ，Ｂ。

Ｈｏｒｓｃｈ　ａｎｄ　Ｒ，Ｔ、　Ｆｒａｌｅｙ　（１
８Ｊａｎｕａｒｙ　１９８３）　１５ＬｂＭｉａｍｉ　
Ｗｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）は、ホルモンに依
存しない増殖を示すカルスを高い比率で（１０％以上）
導き、それらのカルスの９５％がオピンをつくる。

共存培養による形質転換を報告した。Ｍ、　Ｒ，Ｄａｖ
ｅｙｅｔ　ａｌ、　（１９８０）　ｉｎ　Ｉｎｇｒａｍ
　ａｎｄ　Ｈｅｌｇｅｓｏｎ、前出。

ｐｐ、２０９−２１９．　は、プロトプラストから再生
された古い細胞の感染を述べている。

植物プロトプラストはＴＩＰプラスミドの直接取込みに
よって形質転換され得る。Ｍ、　Ｒ，Ｄａｖｅｙｅｔ　
ａｌ、　（１９８０）　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、　Ｌｅｔ
ｔ、　１Ｂ　：　３０７−３１３およびＭ、　Ｒ，Ｄａ
ｖｅｙ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８０）　ｉｎ　Ｉｎｇｒ
ａｍａｎｄ　Ｈｅ１ｇｅｓｏｎ＋前出、は、ペチュニア
・プロトプラストをポリーＬ−α−オルニチンの存在下
にＴｉプラスミドで、オビン合成の表現型および培養で
のホルモンに依存しない増殖という状態に形質転換でき
た。ポリエチレングリコールがＴｉプラスミドの取込み
を刺激すること、およびＴ−ＤＮＡ配列がゲノムへ取り
込まれることが、後に示された。

（Ｊ、　Ｄｒａｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　
Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌＰｈｙｓｉｏ１．２３　
：　４５１−４５８．　Ｍ、　Ｒ，Ｄａｖｅｙ　ｅｔ　
ａｌ、　（１９８２）ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ
　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　１９８２＋　ｅｄ　：　Ａ、　Ｆｕ
ｊｉｗａｒａ＋ｐｐ、５１５−５１６）　、Ｆ、八、Ｋ
ｒｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｎａｔｕｒｅ２
９６　：　７２−７４は、彼らのデータは１組み込まれ
たＴ−ＤＮＡが隣接するＴｉプラスミド配列を含むこと
を示唆するが、カルシウムショックを伴うポリエチレン
グリコールを用いる同様の結果を報告した。

ＤＮＡ取込みを得る他の方法はりポゾームの使用を含む
。ＤＮＡを含むリボゾームの調製は当業者に良く知られ
ている。リボゾームを介するＴｉ　−ＤＮＡの導入に対
する調製が報告されている（Ｔ。

Ｎａｇａｔａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　ｉｎ　Ｆ
ｕｊｉｗａｒａ＋　前出、　ｐｐ。

５０９−５１０．およびＴ、　Ｎａｇａｔａ　（１９８
１）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、　１８４　：　１６１−１６５）　、類似
した系に細胞壁除去後の植物と細菌細胞の融合がある。

この技術の実施例はＳ、　Ｈａｓｅｚａｗａ　ｅｔ　ａ
ｌ、　（１９８１）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、　ｔ８２　：　２０６−２１０によって報
告されたアグロバクテリウムスフェロプラストによるビ
ンカ・プロトプラストの形質転換である。植物プロトプ
ラストは、細胞壁が境界を定めているアグロノ＼クテリ
ウム細胞を取り込むことができる（Ｓ、　Ｈａｓｅｚａ
ｗａｅｔ　ａｌ、　（１９Ｂ２）　ｉｎ　Ｆｕｊｉｗａ
ｒａ、前出ｐｐ、５１７−５１８）。

Ｔ−ＤＮＡは二つのプロトプラストの融合から再生され
る組織に伝達されうる。これら二つのプロトプラストの
うちの一方のみがすでに形質転換されていた（Ｇ、　Ｊ
、　Ｗｕｌｌｅｍｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８０）　Ｔ
ｈｅｏｒ。

Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　５６　：　２０３−２０８
）。植物の再生の項で詳述するように、Ｔ−ＤＮＡは減
数分裂を経、そして単純なメンデル形質として子孫に伝
達されうる。

刊１Ｆ月隼生 正常な形態での脱分化植物組織は、クラウンゴール腫瘍
から得られる。＾、　Ｃ，Ｂｒａｕｎ　ａｎｄ　Ｈ，Ｎ
。

Ｗｏｏｄ　（１９７６）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ−７＝３−：４９６−５００．は正
常植物上へタバコ奇形を移植して。

花を着は得る正常に現れる葉茎を得ることができた。こ
の葉茎は培養されると、オピンを作る能力と植物ホルモ
ンに依存せず増殖する能力を得た。

スクリーニングされた植物では、これらの腫瘍表現型は
減数分裂の間に失われたらしく子孫への伝達は観察され
なかった。（Ｒ，Ｔｕｒｇｅｏｎ　ｅｔ　ａｌ。

（１９７６）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ
、　ＵＳＡ　ヱ３　：　３５６２−３５６４　）。自然
に腫瘍特性を失ったかあるいは奇形種から由来した植物
が、最初はそれらのＴ−ＤＮＡをすべて失ったと示され
た。（Ｆ、−Ｍ、　Ｙａｎｇ　ｅｔａｌ、　（１９８０
）　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　１６　：　８７−９２．　Ｆ、
　Ｙａｎｇ　ｅｔａｌ、　（１９８０）　Ｍｏ１ｅｃ、
　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１７７　：　７０７−７１
４゜Ｍ、　Ｌｅｍｍｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８０
）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１４４　：３５３−
３７６）。しかし、ホルモン処理（１■／ｌカイネチン
）後、復帰突然変異となった植物での後の研究は形質転
換された表現型に対するＴ−ＤＮＡ遺伝子を失っている
が、減数分裂を経験した植物がＴ−ＤＮＡの両端に相同
性のある配列を保持することができたことを示した（Ｆ
、　Ｙａｎｇ　ａｎｄ　Ｒ，Ｂ。

Ｓｉｍｐｓｏｎ　（１９８１）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７８：４１５１−４１５５
）。Ｇ、　Ｊ、　Ｗｕｌｌｅｍｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１
９８１）　Ｃｅ１１２４　：　７１９−７２４．はさら
にオビン同化系に含まれる遺伝子が当該植物が雄性不意
であるが減数分裂を経験する能力を持ち１表面上不変の
Ｔ−ＤＮＡがメンデル則で遺伝され得ることを示した（
Ｇ、Ｗｕｌｌｅｍｓｅｔ　ａｌ、　＜１９８２）　ｉｎ
　Ｆｕｊｉｗａｒａ、前出）　ＯＬ、０ｔｔｅｎ　ｅｔ
ａｌ、　（１９８１）　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅ
ｎｅｔ、１８３　：２０９−２１３゜は茎葉を増殖さす
腫瘍を形成する展（茎葉誘導）部位でＴｎ７　）ランス
ボゾンで作成したＴｉブラスミドの変異体を用いた。こ
れらの葉茎が植物へ再生すると、自家受粉孔を形成する
ことがわかった。

その結果、得られた種は出芽してＴ−ＤＮＡを含みオピ
ンを作る植物へとなった。さらに行われた実験で、■０
口ｅＧｒｅｖｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）Ｎａｔｕ
ｒｅ　３００　ニア５２−７５５．は、オクトピン合成
が、−電価性メンデルの遺伝子として遺伝され得ること
を見つけた。

しかし、当該Ｔ−ＤＮＡは、カルスからの再生を行って
いる間竺以外の機能の広範な欠失を受けた。ハＬ（根誘
導）変異体での同様の実験は、完全な長さのＴ−ＤＮＡ
が減数分裂を通して子孫へ伝達され得たことを示し、そ
の子孫では、ツバリン遺伝子が様々なレベルだが発現し
、ともに形質転換された酵母アルコールデヒドロゲナー
ゼＩ遺伝子は発現されないことを示した（Ｋ、　Ａ、　
Ｂａｒｔｏｎｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　Ｃｅ１ｌ　
’３２　：　１０３３−１０４３）　、他の実験は、ツ
バリンＴ−ＤＮＡが再生の間維持され。

雄性不念性花はメンデル則でＴ−ＤＮＡ上を伝えるとい
うことを示した（Ｊ、　Ｍｅｍｅｌｉｎｋ　ｅｔ　ａｌ
、　（１９８３）Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　
１９０　：　５１６−５２２）　、機能する外来遺伝子
も、優性メンデル則で遺伝される（Ｒ，Ｂ。

Ｈｏｒｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）　５ｃｉｅ
ｎｃｅ　２２３：　４９６−４９８）。

今や、Ｔ−ＤＮＡ配列を欠いた再生組織は、腫瘍に“混
在している”非形質転換細胞由来であり（Ｇ、　Ｏｏｍ
ｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９Ｂ２）　Ｃｅ１ｌ　３０　：
　５８９−５９７）。初めに形質転換された植物細胞の
後成説的な状態が。

再生の可能性に影響する（Ｇ、　Ｍ、　Ｓ、　ｖａｎｓ
ｌｏｇｔｅｒｅｎｅｔ　ａｔ、　（１９８３）　Ｐｌａ
ｎｔ　Ｈｏｔ、　Ｂｉｏｌ、２　：　３２１−３３３）
ことが明らかである。Ａ、　Ｎ、　Ｂ１ｎｎ５　（１９
８３）　Ｐｌａｎｔａ１５８　：　２７２−２７９によ
る最近の研究は、腫瘍性遺伝子、この場合ｔｍｒ　、　
は再生の間“止める”ことができ、再生組織を培養に置
くことによって、“再び開始する”ことができると示し
ている。

アグロバクテリウム・リゾゲネスからの形質転換の結果
として得た根は栽培植物へ直接再生することが比較的簡
単なことを証明した（Ｍ、−Ｄ、　Ｃｈｉｌｔｏｎｅｔ
　ａｌ、　（１９Ｂ２）　Ｎａｔｕｒｅ　２９５　：　
４３２−４３４）　、そして簡単にクローン化された。

再生能力はＴ−ＤＮＡのコピー数に依存するようである
（Ｃ，Ｄａｖｉｄ　ｅｔａｌ、　（１９８４）　Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ、　２　：　７３−７６）。

ＴＩＰブースミ′に′しる゛　− ＡＴＣＣ１５９５５で見つげられたオクトピン型プラス
ミドのｐＴｉ１５９５５のＴ−ＤＮＡの完全な配列が報
告されており、真核生物の転写制御配列に隣接している
１４のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）が含
まれている（Ｒ，Ｆ、　Ｂａｒｋｅｒ　ａｎｄ　Ｊ、　
Ｄ。

Ｉ（ｅｍｐ、　Ｕ、Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎ　ｓｅｒ、　ｎｏ、５５３，７８６゜これは
参考文献、　ＲｏＦ、　Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　
（１９８３）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　
２　：　３３５−３５０に編入されている）。

多（の遺伝子がＴＩＰプラスミドのＴ−ＤＮＡ内に同定
されている。オクトピンプラスミドニーＤＮＡ転写物の
多くの地図が作られており（Ｓ。

Ｂ、　Ｇｅ１ｖｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９　：　７６−８０＋　Ｌ、　Ｗ
ｉｌｌｍｉｔｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ。

（１９Ｂ２）　ＥＭＢＯＪ、　１　：　１３９−１４６
．　Ｎ、　Ｍｕｒａｉ　ａｎｄ　Ｊ。

Ｄ、Ｈｅｍｐ　（１９８２）　Ｎｕｃｌｅｉ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅｓ、１廖Ｄ　：　１６７９−１６８９、　Ｓ、
　Ｊ、　Ｋａｒｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）
　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、　）、いくつかの機能が認められている（
Ｊ。

しｅｅｍａｎｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　ＥＭＢＯ
Ｊ、１　：　１４７−１５２）。

これらの領域のうちのいくつか、特にｔｍｒや匠をコー
ドしているものも原核細胞で転写される（Ｇ、　５ｃｈ
ｒｏｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　ＥＭＢＯＪ
、２　：　４０３−４０９）。

トランスポゾンを用いた変異により充分明らかになって
いるオクトピン型プラスミドの遺伝子は。

ｔｍｓ　、　ｔｍｒ　、　ｔｍｌ　、そして虱を含んで
いる（Ｄ。

Ｊ、　Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ　ｅｔ　ａｔ、　（１９８１
）　Ｃｅ１ｌ　２７　：　１４３−１５３）。

これらの遺伝子にそれぞれ変異を持つＴｉプラスミドは
、シュートを生じ、根を発育させ、そして正常よりも大
きいニコチナタバカムの腫瘍カルスを刺激する。他の宿
主では、これらの遺伝子の突然変異体は異なる表現型を
誘導することができる（Ｍ、Ｗ、Ｂｅｖａｎ　ａｎｄ　
Ｍ、−Ｄ、Ｃｈｉｌｔｏｎ　（１９８２）　八ｎｎ、Ｒ
ｅｖ。

Ｇｅｎｅｔ、　１６　：　３５７−３８４）。ｔｍｒと
五の表現型は。

腫瘍に存在する植物ホルモンレベルの違いに相関する。

サイトカイニン：オーキシン比の違いは。

形質転換されてないカルス組織の朽あるいは根の形成を
培地で誘導できるそれに似ている（Ｄ、　Ｅ。

Ａｋｉｙｏｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ｔｌｓＡ　８０　：　４０７−４１１．　Ａ、　Ｎ、　
Ｂ１ｎｎ５　（１９８３）　Ｐｌａｎｔａ１５８　：　
２７２−２７９．　＾、　Ｃａｐｌａｎ　ｅｔ　ａｌ、
（１９８３）　５ｃｉｅｎｃｅ２２２　：　８１５−８
２１．　Ｒ，Ｍ、Ａｍａｓｉｎｏ　ａｎｄ　Ｃ，Ｏ，Ｍ
ｉｌｌｅｒ（１９８２）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ
、　６９　：　３８９−３９２）　、機能を有するｔｍ
ｌ　だけではなく、展かｔｍｒのどちらかの機能を有す
る遺伝子を含むＴ−ＤＮＡは重要な腫瘍の成長を促進す
ることができる。シュートや根の促進はそれぞれ機能を
有するｔｍｌにより刺激されたり、阻害されたりする（
Ｌ、　Ｗ、　Ｒｅａｍ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８３）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ
、ＬＩＳＡ　旦０　：　１６６０−１６６４）。Ｔ−Ｄ
ＮＡ遺伝子の変異は、Ｔ−ＤＮＡの植物ゲノムへの挿入
に影響を及ぼしたりしないようである（Ｌｅｅｍａｎｓ
　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）前出、　Ｒｅａｍｅｔ　
ａｌ、　（１９８３）前出）。Ｔ−ＤＮＡ！！伝子はホ
転子ンに非依存性の成長を促進させるために、境界の配
列（Ｔ　Ｉ　ＰプラスミドＤＮＡを参照）の間に位置す
る必要がない（）１．　Ｊｏｏｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１
９８３）ＩＥＭＢＯＪ、２：２１５１−２１６０）。

オクトピンＴｉプラスミドは、オクトピンシンターセ　
（リゾピンデヒドロゲナーゼ）をコードする真核生物の
遺伝子にふつうに見られる介在配列で。

ｍＲＮＡの成熟時にメンセンジャー前駆体から転写後に
切り出される）を含まない。それは、真核生物の転写信
号（“ＴＡＴＡ”ボックス）やポリＡ付加部位に似てい
る配列を持っている。竺遺転子の発現に必要なすべての
信号は、虱転写開始部位の２９５ｂｐ内に見出される（
Ｃ，Ｋｏｎｃｚ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８３）　ＥＭＢＯＪ、　２　：　１５９７−１６
０３）　、　Ｐ、　Ｄｈａｅｓｅ　ｅｔａｌ、　（１９
８３）　ＥＭＢＯＪ、　２　：　４１９−４２６は、“
転写物７”（Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、の０ＲＦ３．
前出）とｏｃｓによる様々なポリＡ付加部位の利用につ
いて報告した。

組織内の酵素オクトピンシンターゼが存在することによ
り、様々なアミノ酸類似物の毒性効果からその組織を保
護することができる（Ｇ、　Ａ、　Ｄａｈｌａｎｄ　Ｊ
、　Ｔｅｍｐｅ　（１９８３）　Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐ
ｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　６６　：２３３−２３９．　Ｇ、
Ａ、Ｄａｈｌ　ｅｔ　ａｌ、、ＵＳ　Ｐａｔ、ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓｅｒ、　ｎｏ、５３２，２８０．ここ
で参考文献に編入している）。

ツバリンＴｉプラスミドはツバリンシンターゼ（虱）を
コードしており、その配列はＡ、　Ｄｅｐｉｃｋｅｒｅ
ｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ
、　Ｇｅｎｅｔ、　１　：　５６Ｌ５７３により決めら
れている。ｏｃｓ遺伝子で見られたように、虱はイント
ロンで中断されていない。

それは、２つのポリＡ付加部位と重要なＴＡＴＡ”ボッ
クス転写開始信号を持つ。虱と比べて。

ｎｏｓは“ＣＡ　Ｔ　”ボックスとしで知られている転
写開始信号であるかもしれない配列が前にある。

虱潰転子の発現に必要な信号のすべてが二転写開始部位
の２６１ｂｐ内に見られる（Ｃ，Ｋｏｎｃｚ　ｅｔａｌ
、、前出）。　アグロシノピンシンターゼの遺伝子や、
虱と展に等価な遺伝子がツバリン型プラスミド上で同定
されており　（Ｈ，Ｊｏｏｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８
３）　Ｃｅ１ｌ　３２　：　１０５７−１０６７）、多
くの転写物が地図上で決められている（Ｌ、　Ｗｉｌｌ
ｍｉｔｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　Ｃｅ１ｌ
　３２．：１０４５−１０５６）。Ｊ、　Ｃ，ＭｃＰｈ
ｅｒｓｓｏｎｅｔ　ａｌ、　（１９８０）　Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７７　：２６６
６−２６７０は、クラウンゴール腫瘍からＴ−ＤＮＡに
コードされているｍＲＮＡのインビトロでの転写を報告
した。

根毛のＴ−ＤＮＡの転写が検出されている（Ｌ。

Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　
Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ。

１８６　：　１６−２２）。機能上、根毛症候群は、社
内に突然変異のあるＴｉプラスミドとＲｉプラスミドは
互いに相補できる（Ｇ、　Ｍ、　Ｓ、　ｖａｎ　Ｓｌｏ
ｇｔｅｒｅｎ　（１９８３）Ｐｈ、Ｄ、　ｔｈｅｓｉｓ
、　Ｒｉｊｋｓｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ　ｔｅ　Ｌｅ
ｉｄｅｎ。

Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）ように、　ｔｍｒ内に突然変
異のあるＴｉプラスミド　（Ｆ、　Ｆ、　Ｗｈｉｔｅ　
ａｎｄ　Ｅ、　Ｗ、　Ｎｅ５ｔｅｒ（１９８０）　Ｊ、
　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１４４　：　７１０−７２０
）により刺激されたクラウンゴール腫瘍と等価のようで
ある。

真核生物では、ＤＮＡのメチル化（とりわけシトシン残
基）は転写の不活性化と相関関係があるが、比較的メチ
ル化の少ない遺伝子はｍＲＮ、Ａに転写される。Ｓ、　
Ｂ、　Ｇｅ１ｖｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　Ｎ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１１　：　１５９
−１７４は、クラウンゴール腫瘍におけるＴ−ＤＮＡは
いつも少なくともメチル化されてない１コピー内に存在
しているということを見出した。同じゲノムがメチル化
されているＴ−ＤＮＡの多くの他のコピーを含むかもし
れないということから、１個より多いＴ−ＤＮＡのコピ
ーは生物学的に不活性であるかもしれないということを
示唆している。（Ｇ、Ｏｏｍｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８
２）Ｃｅ１ｌ　３０　：　５８９−５９７も参照）５−
アザシチジンで腫瘍系列を処理すると転写の増大に並行
しているＴ−ＤＮＡ遺伝子の脱メチル化をもたらす（＾
、Ｇ。

１１ｅｐｂｕｒｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　Ｊ、
　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、、　２　：３１
５−３２９　）。５−アザシチジン処理あるいは細胞移
植は、休眠オピン遺伝子を活性化することが示されてい
る（Ｇ、　Ｍ、　Ｓ、　ｖａｎ　Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ（
１９８３）　Ｐｈ。

Ｄ、　ｔｈｅｓｉｓ＋　Ｒｉｊｋｓｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｅｉｔ　ｔｅ　Ｌｅｉｄｅｎ。

Ｎｅ　ｔｈｅｒ　１ａｎｄｓ）。

Ｔｉプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡ領域の外側にある他の遺
伝子をコードしており、感染過程に必要である。　（ツ
バリンプラスミドについては２Ｍ。

１１ｏ１ｓｔｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８０）　Ｐ
ｌａｓｍｉｄ　３　：　２１２−２３０＋オクトピンプ
ラスミドについては、　Ｉｆ、　ＤｅＧｒｅｖｅｅｔ　
ａｌ、　（１９８１）　Ｐｌａｓｍｉｄ　６　：　２３
５−２４８．０．　Ｊ。

ＧａｒｆｉｎｋｅｌとＥ、　Ｗ、　Ｎｅ５ｔｅｒ　（１
９８０）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１４４　：　７３２−７４３とＧ、　Ｏｏｍｓ　（１９
８０）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１４動８２−９１を参照）最も重要なのは憇（遺伝子で
あって、変異を起こすと腫瘍形成不能なＴｉプラスミド
を生じる。（ヴイルレンスに対して５　これらの場所は
ｖｉｒとして知られる。）いくつかの虱潰転子は正確に
位置づけられており、様々なＴｉプラスミド間で保存さ
れた領域内にあることが見出されている（Ｉｔ、　Ｊ、
　Ｋｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　Ｊ、　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ。

１５３　：　８７Ｂ−８８３，Ｖ、　Ｎ、　Ｉｙｅｒ　
ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｍｏｌ。

Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１８し：　４１８−４２４）
。ｏｎｃ遺伝子は、異なるプラスミド型のＴ−ＤＮＡを
持つ植物細胞を形質転換し、しかも物理的に別のプラス
ミドにあるという、トランスに機能する（Ｊ、　）ｌｉ
ｌｌｅ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８２）　Ｐｌａｓｍｉｄ、　７　：　１０７−１
１８．　Ｉｆ、　Ｊ、　Ｋｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８２）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５０　
：　３２７−３３Ｌ　Ａ、　Ｊ。

ｄｅ　Ｆｒａｍｏｎｄ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１　：　２６２−２６９）。ツ
バリンＴｉＤＮＡは、Ｔｉプラスミドから切除したりあ
るいは宿主ゲノムへの組み込みのどちらかに関与してい
るであろうＴ−ＤＮＡの左右の境界にすぐ隣接している
約２５ベースペアーの同方向反復配列を持ち（Ｎ、　Ｓ
、　Ｙａｄａｖ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９
　：　６３２２−６３２６）。

類似配列がオクトピンＴ−ＤＮＡの境界に隣接して認め
られている（Ｒ，Ｂ、　Ｓｉｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、
　（１９８２）Ｃｅｌｌ　２９　：　１００５−１０１
４）。オピン分解は、オクトピン型プラスミドやツバリ
ン型プラスミドの０ＣＣ−遺伝子や虱潰転子のそれぞれ
に特異づけられている。Ｔｉプラスミドも複製の開始点
を含む自身の再生産に必要な機能をコードしている。

（以下余白） Ｔｉプラスミドの転写物はＳ、　Ｂ、　Ｇｅ１ｖｉｎ　
ｅｔ　ａｌ、　（１９８１）　Ｐｌａｓｍｉｄ　６　：
　１７−２９により、アグロバクテリウム・チューメフ
ァシエンス内で検出され、彼はＴ−ＤＮＡｉｌ域が非Ｔ
−ＤＮＡ配列より微弱ながら転写されることを見出した
。Ｔｉプラスミドに指定されている特徴がＭａｒｌＯ＋
上記（特にＴａｂｌｅ　ＩＩ参照）と、　ＲｅａｍとＧ
ｏｒｄｏｎ　＋上記により概説されている。

ＴＩＰプラスミドＤＮＡ Ｄ　Ｎ　Ａ　ハイブリダイゼーション（Ｔ、　Ｃ，Ｃｕ
ｒｒｉｅｒａｎｄ　Ｅ、　ＩＡ、　Ｎｅ５ｔｅｒ　（１
９７６）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１２６　：１
５７−１６５　）あるいは制限酵素分析（Ｄ、５ｃｉａ
ｋｙ　ｅｔａｌ、（１９７Ｂ　）　Ｐｌａｓｍｉｄ　１
　：　２３Ｂ−２５３）により調べると、異なるオクト
ピン型Ｔｉプラスミドが殆ど１００％互いに類似してい
る。ツバリン型Ｔｉプラスミドは互いにはたかだか６７
％の類似しか持っていない（Ｃｕｒｒｉｅｒ　ａｎｄ　
Ｎｅ５ｔｅｒ、前出）。概観すると異なるＲｉプラスミ
ドは互いに非常に類似しているということが明らかにな
った（Ｐ、　Ｃｏ５ｔａｎｔｉｎｏ　ｅｔａｌ、（１９
８１）　Ｐｌａｓｍｉｄ　５　：　１７０−１８２　）
　、　Ｎ、　Ｉｔ。

ＤｒｕｍｍｏｎｄとＭ、　−Ｄ、　Ｃｈｉｌｔｏｎ　（
１９７８）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１３６　：　１１７Ｂ−１１８３はオクトピン型やツバ
リン型Ｔｉプラスミドの比較的小さな部分が互いに類似
しているということを示した。こういった類似性は。

Ｇ、　Ｅｎｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８１）　Ｊ
、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１５２　肝１８３−２０８
により詳細に地図上に位置づけられている。彼らは四つ
の類似領域のうちの三つが、三つ（部分的にＴ−ＤＮＡ
を重複している）、四つくいくつかの」圧迫転子を含む
）、および九つく」圧迫転子を持つ）の類似配列に細分
化されることを見出した。連続した類似性は少なくとも
一つのｔｒａ遺伝子（Ｔｉプラスミドを他の細菌の細胞
への接合伝達のため）と、複製と不和合性に関する遺伝
子を含む。この連続した領域は、リゾビウム科の異なる
遺伝子であるリゾビウム属のある種由来の」Ｈプラスミ
ド（共生窒素固定に関係する）と類イ以性がある（Ｒ，
に、Ｐｒａｋａｓｈ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｐ
ｌａｓｍｉｄ７　：　２７１−２８０　）。四つの領域
の順序は保存されていないが、それらはすべて同方向に
並んでいる。

Ｔ−ＤＮＡ配列のある部分はツバリンプラスミドとオク
トピンプラスミド間で非常によく保存されている（Ｍ、
　−Ｄ、　Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９７８）
　Ｎａｔｕｒｅ２７５　：　１４７４４９．　Ａ、　Ｄ
ｅｐｉｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９７８）Ｎａｔｕｒ
ｅ２７５　：　１５０−１５３　）　、　Ｒｉプラスミ
ドは自身の間で、オクトピンＴｉプラスミド（Ｆ、Ｆ、
　Ｗｈｉｔｅａｎｄ　Ｅ、　Ｈ，Ｎｅ５ｔｅｒ　（１９
８０）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１４４　ニア１０−
７２０　）やツバリンＴｉプラスミド（Ｇ、　Ｒ１５ｕ
ｌｅ。

ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｐｌａｓｍｉｄ　７　：
　４５−５１　）の両方に対して、主としてｏｎｃ遺伝
子をコードしている領域について、広い類似性を有して
いることが示されている。ＲｉＴ−ＤＮＡはＴｉプラス
ミドの両型からＴ−ＤＮＡへ広いけれども５弱い類似性
を有している（Ｌ、　Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ　ｅｔ　ａ
ｌ、　（１９８２）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、１８６　：　１６−２２）、未感染のニコ
チアナ・グラウカ由来の植物ＤＮＡは、ｃＴ−ＤＮＡ（
細胞性Ｔ−ＤＮＡ）と呼ばれるが、ＲｉＴ−ＤＮＡの部
分に類似性を示している（Ｆ、　Ｆ、　Ｗｈｉｔｅ　ｅ
ｔ　ａｌ。

（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０１　：　３４８−３
５０．　Ｌ、　５ｐａｎｏ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８２）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃ、、Ｂｉｏｌ、
１　：　２９１−３００　）　、Ｇ、八。

Ｈｕｆｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、＋　はクロスハイブリダイゼーショ
ンの領域を地図上に位置づけ、　ＲｉプラスミドｐＲ４
八４ｂはｐＴｉＴ３７よりもｐＴｉ八６へ（オクトピン
型）によく似ていることおよびこのＲｉプラスミドは−
ｔｍｒでなく町に類似している領域を有するように見え
ることを示している。彼らの結果もＲｉＴ−ＤＮＡは不
連続でオクトピン］゛−ＤＮＡの場合に似ているという
ことを示唆している。

Ｔｉプラスミド（Ｍ、−Ｄ、　Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅｔ　
ａｌ、　（１９７７）Ｃｅｌｌ　１１　：　２６３−２
７１　）あるいはＲｉプラスミド（Ｍ。

−Ｄ、　Ｃｂｉｌｔｏｎ　（１９Ｂ２）　Ｎａｔｕｒｅ
　２９５　：　４３２−４３４．　Ｆ、　Ｆ。

Ｗｈｉｔｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｅｔ。

ＵＳＡ　７９　：　３１９３−　３１９７．　Ｌ、Ｗｉ
ｌｌｍｉｔｚｅｒ　（１９８２）　Ｍｏｌ。

Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１８６　：　１６−２２　）
の一部は腫瘍植物細胞のＤＮＡ内に見出されるというこ
とが示された。

転送されたＤＮＡはＴ−ＤＮＡとして知られている。Ｔ
−ＤＮＡは、核内の（Ｍ、　Ｐ、　Ｎｏｔｉ　ｅｔ　ａ
ｌ。

（１９８０）　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、Ｌｅｔむ、−１８
：１−６．　Ｌ。

Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９８０）　Ｎ
ａｔｕｒｅ　２８７　：　３５９−３６Ｌ　Ｍ、−Ｄ、
Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８０）　Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７　：　４０６０−
４０６４）　、多くの部位で（Ｄ、　Ｕｒｓｉｃ　ｅｔ
　ａｌ、　（１９８３）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎ
ｅｔ。

１９０　：　４９４−５０３．　Ｊ、　Ｍｅｍｅｌｉｎ
ｋ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）　Ｍｏｌ。

Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、１９０　：　５１６−５２２　
）　、宿主ＤＮＡに組み込まれている（Ｍ、　Ｆ、　Ｔ
ｂｏｍａｓｈｏｗ　ｅｔ’ａ１．　（１９８０）Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７７　：　６
４４８−６４５２．Ｎ。

Ｓ、　Ｙａｄａｖ　ｅｔ　ａｌ、（１９８０）　Ｎａｔ
ｕｒｅ２８７　：　４５８−４６１　）多くの非Ｔ−Ｄ
　Ｎ　Ａ　ＴｉプラスミドＤＮＡが、Ｔ−ＤＮＡの組み
込み前に植物細胞に転送されるようである（Ｈ，Ｊｏｏ
ｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　ＥＭＢＯＪ、　２　
：２１５１−２１６０　）。

Ｍ、　Ｆ、　Ｔｈｏｍａｓｈｏｉｙ　ｅｔ　ａｌ、　（
１９８０）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌ５Ａ７７　：　６４４Ｂ−６
４５２およびＭ、　Ｆ。

Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８０）　Ｃ
ｅ１ｌ　１９　：　７２９−７３９は。

オクトピン型Ｔｉプラスミド由来のＴ−ＤＮＡが。

二つの異なる部分のＴＬ−ＤＮＡとＴ、−ＤＮＡ。

それぞれ左側Ｔ−ＤＮＡと右側Ｔ−ＤＮＡであるが、に
組み込まれていることを見出した。ＴＲとＴＬのコピー
数は異なる腫瘍系列で変化し得る（Ｄ、　Ｊ、　Ｍｅｒ
ｌｏ　ｅｔ　ａｌ、　＜１９８０）　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｇ
ｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ。

１７７　：６３７−６４３　）　、　Ｔ−ＤＮＡ（７）
芯はツバリンＴ−ＤＮＡに非常に類似しており（Ｃｈｉ
ｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ。

（１９７８）前出、　Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、
（１９７８）前出）。

腫瘍維持に必要であり、ＴＬＯ中にあり、一般に細胞あ
たり１コピー存在しており、そして展。

ｔｍｒ　＋　およびｔｍｌの遺伝子をコードしている。

他方では、ＴＲは全体として省くことができるが（Ｍ、
　Ｄｅ、Ｂｅｕｃｋｅｌｅｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９８
１）　Ｍｏ１ｅｃ、’Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、１８３　：２８３−２８８．　Ｇ、　Ｏｏ
ｍｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）Ｃｅｌ１３０　：　５
８９−５９７　）　、ふつう高いコピー数で見られる（
Ｍｅｒｌｏ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８０）前出）　。Ｇ
、　Ｏｏｍｓｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｐｌａｓｍ
ｉｄ　７　：　１５−２９は、彼らはＴＲがＴｉプラス
ミドから欠失すると、アグロバクテリウム・チューメフ
ァシエンス　あるヴイルレンスを持つことを認めている
がＩ　’ｒ＋ｔはＴ−ＤＮＡの組み込みに関係している
という仮説を立てた。Ｇ。

Ｏｏｍｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９Ｂ２）　Ｃｅ１ｌ　３
０　：　５８９−５９７は植物ゲノムに組み込まれた後
Ｔ−ＤＮＡはしばしばＴｉプラスミドにより欠失するが
、一般に安定であるということ、およびＴ−ＤＮＡ形成
の点において異なる細胞の混合液を含む腫瘍は、多様な
形質転換が生じた結果であることを示した。」遺伝子は
ＴＬ内で見出されているが、腫瘍成長に似た表現型を失
うことなく植物ゲノムより欠失され得る。

ＴＬの左側と右側の境界およびＴＲの左側と右側の境界
は、ここではＴＬ　ＬＢ（Ａ）、　ＴＬＲＢ（Ｂ）、　
ＴＲＬＢ（Ｃ７゜ＴＩ　ＲＢ（Ｄ）とそれぞれ表すが、
配列が決定されており　（Ｒ，Ｆ、　Ｂａｒｋｅｒ　ｅ
ｔ　ａｌ、（１９８３）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、２　：　３３５−３５０．およびＲｌＦ、　
Ｂａｒｋｅｒ　ａｎｄ　Ｊ。

Ｄ、　Ｋｅｍｐ、　Ｕ、Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎ　ｓｅｒ、　ｎｏ。

５３２．２８０　）　、各々が２４ベースペアの不完全
な同方向反復配列であり、そしてツバリンＴ−ＤＮＡの
どちらかの末端で見られる同方向反復配列に類似してい
る。組み込まれたＴＬＬＢ（Ａ）の周辺にある植物ＤＮ
Ａが、同方向あるいは逆方向のどちらかであるＴ−ＤＮ
Ａ配列の繰り返しから成っていると観察されている（Ｒ
，Ｂ、　Ｓｉｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）Ｃ
ｅｌｌ　２９　：　１００５−　１０１４）　、　Ｍ、
　Ｈｏ１ｓｔｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８３）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、１９
０　：３５−４１はｌ　’ｒｔが、植物とＴ−ＤＮＡ配
列の両方から生じる約４００ｂｐの“リンカ−”により
隔てられた一列に並ぶコピーに組み込まれていることを
見出した。

オクトピン型腫瘍内の状況と比べて、ツバリンＴ−ＤＮ
Ａはある連続した断片内の宿主ゲノムに３■み込まれて
いる（Ｍ、　Ｌｅｍｍｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８０
）Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１４４　：　３５３−
３７６、　Ｐ、　Ｚａｍｂｒｙｓｋｉｅｔ　ａｌ、　（
１９８０）　５ｃｉｅｎｃｅ　２０９　：　１３８５−
１３９１　）　、回向縦列繰り返しが観察された。奇形
種から再生した植物のＴ−ＤＮＡは挿入されたＤＮＡの
境界の断片に小数の修飾を持っていた（Ｌｅｍｍｅｒｓ
　ｅｔ　ａｌ、＋前出）。右と左の境界の間の接点の配
列分析により多くの同方向繰り返しと一つの逆方向繰り
返しが明らかとなった（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ　ｅｔ　ａ
ｌ、　（１９８０）前出）。左側の接点は少なくとも７
０ｂρにまでわたり多様であることが示されているが、
右側の接点は単一のヌクレオチド以外の変化はない（Ｐ
、　Ｚａｍｂｒｙｓｋｉｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　
Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、１　：　３
６１−３７０　）。

縦列した中の接点の左側と右側の境界は１３０ｂｐを越
えるであろう間隙により隔てられている。間隙は未知の
起源のものであり、いくつかのＴ−ＤＮＡ配列を含んで
いた。Ｔ−ＤＮＡは１反復しており、低分子数の宿主の
配列に組み込まれていることが見出された。Ｈ，Ｊｏｏ
ｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　Ｃｅ１１３２　：　
１０５７−１０６７によると１　ヴイルレンスは通常の
ツバリンＴ−ＤＮＡ境界配列のどちらかの一つの欠失後
に引き起こされるものではないことが示されている。

Ｓｉｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）前出やＺ
ａｍｂｒｙｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８０）前出では、境界領域の同方向反復は植物Ｄ
ＮＡへのＴ−ＤＮＡの組み込みに関係していると示唆さ
れている。二つの異なるＴｉプラスミド由来のＴ−ＤＮ
Ａの持つ境界は類似した境界はど特異的に組み込まれな
いということは、この示唆を支持している（Ｇ、　Ｏｏ
ｍｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９Ｂ２）　ＰｌａｎｔＭｏｌ
ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、１　：２６５−２７６　）。

Ｎ、Ｓ、Ｙａｄａｖ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａ１１．　八ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７４し６３２２−６３２６は、バクテ
リオ・ファージλ内で１０キロベースも離れた周囲のＤ
ＮＡにおける普遍的組み換えを増加させる薊辷部位がＴ
−ＤＮＡの左側末端のちょうど外側のツバリンＴｉプラ
スミドにあることを見つけた。ＲｏＢ、Ｓｉｍｐｓｏｎ
ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｃｅ１１２９　：　１０
０５−１０１４によれば、オクトピンＴｉプラスミド内
の同様の位置にｃｈｉ配列が見つけられなかった。Ｔｉ
プラスミド内のｃｈｉの重要性は知られていない。

ＴＩＰプラスミドの搭 シャトルベクターに関する節の中で詳述したように、改
造したＤＮＡ配列をＴＩＰプラスミド上の所望の場所に
導入するための技術が開発された。

この技術を用いればトランスポゾンを容易に挿入するこ
とができる（Ｄ、　Ｊ、　Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ　ｅｔ　
ａｌ、　（１９８１）　Ｃｅ１１２７　：　１４３−１
５３　）　、　Ｊ、−Ｐ、　Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｅ
ｔ　ａｌ、　（１９８０）　Ｎａｔｕｒｅ　２８７　：
　６５４−６５６はＴｉプラスミド中のＴ−ＤＮＡに挿
入されたＤＮＡ配列（ここでは細菌のトランスポゾン）
が受容植物のゲノム中に転移そして組み込まれることを
示した。ｎ。

１１ｏ１ｓｔｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｍｏ
１．　Ｇｅｎ、’　Ｇｅｎｅｔ、ユ亜：２８３−２８９
は、Ｔ−ＤＮＡに挿入された細菌のトランスポゾン（Ｔ
ｉ７　）が植物ゲノム中に組み込まれた後も、完全に機
能的で外観上は不変な形で再分離され得ることを示した
。異なる起原からのいくつかの遺伝子を用いて外来ＤＮ
Ａの挿入が行われたが、現在までは、外来遺伝子は植物
細胞中において通常はそれ自身のプロモーター制御下で
発現されていない。これらの遺伝子の起原は、ウサギβ
−グロビン（Ｃ，Ｈ，Ｓｈａｗ　ｅｔ　ａｌ、（１９８
３）　Ｇｅｎｅ％＋　：　３１５−３３０　）　、酵母
アルコールデヒドロゲナーゼ（＾ｄｈ　）　（Ｋ、　Ａ
、　Ｂａｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　Ｃｅ
１１３２　：　１０３３−１０４３　）　、）ウモロコ
シＡｄｈｌ　（Ｊ、　Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ。

未発表）およびゼイン、＠乳動物インターフェロンおよ
びグロビン、および咄乳動物ウィルス５Ｖ４０（Ｊ、　
５ｃｈｅｌｌ、未発表）が含まれる。しかし、ツバリン
シンターゼ遺伝子をオクトピンＴ−ＤＮＡに挿入し植物
組織を形質転換した場合は、それは完全に機能的である
ことが分かった（Ｃ，Ｌ、　Ｆｉｎｋ　（１９Ｂ２）　
Ｍ、　Ｓ、　ｔｈｅｓｉｓ、ウィスコンシンーマディソ
ン大学）。豆ファゼオラス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏ
ｌｕζｖｕ１ｇａｒｉｓ　Ｌ、　）の種子中に見られる
貯蔵蛋白であるファセオリンをコードする遺伝子は、ヒ
マワリの腫瘍へ導入され、そこ、で発現した。転写は正
しい位置で開始および終結され、そしてイントロンは転
写後に正しくプロセッシングを受けた（　Ｎ。

Ｍｕｒａｉ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　５ｃｉｅｎ
ｃｅ　２２２　：　４７６−４８２．およびＴ、　Ｃ，
Ｈａｌｌ　ｅｔ　ａｌ、　ＵＳ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎ　ｓｅｒ、　ｎｏ。

４８５．６１３　、これはここで文献に編入されている
）。

八、　Ｃａｐｌａｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）　５ｃ
ｉｅｎｃｅ　２２２　：　８１５−８２１は、エントウ
　リブロース−１，５−ビスホスフェート　カルボキシ
ラーゼの小さいサブユニット遺伝子の５゛側上流領域由
来のＤＮＡ９００ｂｐの断片により、タバコの光誘導性
発現が細菌クロラムフェニコール　アセチルトランスフ
ェラーゼ構造遺伝子に授与されるのに充分であることを
主張している。

ＴＩＰプラスミドにおいていくつかの方法により欠失を
引き起こすことができる。標準的な組み換えＤＮＡ技術
により造り出された欠失を導入するのにシャトルベクタ
ーを用いることができる。すでに決定されている一つの
末端をもつ欠失は、トランスポゾンの不適当な切り出し
により作成することができる（Ｂ、　Ｐ、　Ｋｏｅｋｍ
ａｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９７９）Ｐｌａｓｍｉｄ　２
　：　３４７−３５７．およびＧ、　Ｏｏｍｓ　ｅｔ　
ａｔ、　（１９８２）　Ｐｌａｍｉｄ　７　：　１５−
２９　）　、　Ｊ、　ｌ１ｉｌｌｅおよびＲ９５ｃｈｉ
ｌｐｅｒｏｏｔ　（１９８１）　Ｐｌａｓｍｉｄ　６　
：　１５１−１５４は。

前もって決められた位置に両端をもつ欠失は二つのトラ
ンスポゾンの使用により引き起こすことができることを
証明した。この技術はまた。“組み換えＤＮＡ″分子を
インビボで構築するのに用いることができる。Ｐ、　Ｚ
ａｍｂｒｙｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）ＥＭＢＯ
Ｊ、　２　：　２１４３−２１５０は、タバコにおいて
非常に小さなカルスの形成を促進し、普通の形態をもつ
植物の再生に導くような、虱および転写上以外のツバリ
ンＴ−ＤＮＡ遺伝子のすべてを欠失したベクターの使用
を報告している。

ツバリンシンターゼ遺伝子は、形質転換された植物細胞
の選別に用いることができる薬剤耐性をコードするＤＮ
Ａ小片の挿入のために用いられている。植物細胞では、
　Ｔｉ５からのバクテリアカナマイシン耐性遺伝子はそ
れ自身のプロモーター制御下では転写されない（Ｊ、　
Ｄ、　Ｋｅｍｐ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）　ｉｎ　Ｇ
ｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　ｉｎｅｅｒｉｎｇ　：　Ａｐ　１
ｉｃａｔｉｏｎｓｔｏ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ＋　＜
Ｂｅ１ｔｓｖｆｌｌｅ　Ｓｙｍｐ、　Ａｇｒｉｃ。

Ｒｅｓ、　７）　、ｅｄ、　：　Ｌ、　Ｄ、　Ｏｗｅｎ
ｓ、Ｐｐ、２１５−２２８　；およびＣ，Ｌ、　Ｆｉｎ
ｋ　（１９８２）前出）　。Ｍ、　Ｗ、　Ｂｅｖａｎ　
ｅｔ　ａｌ。

（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０４　：　１８４−１
８７．　Ｒ，Ｔ、　Ｆｒａｌｅｙ　ｅｔａｌ、（１９８
３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　ＵＳＡ　８（し：４８０３−４８０７．およびり、　
１ｌｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８３）　ＥＭＢＯＪ、　２　：　９８７−９９５
．　は、　Ｔｎ５由来のカナマイシン耐性遺伝子（ネオ
マイシン　フォスフオドランスフェラーゼ■）をツバリ
ンシンターゼのプロモーターの後に挿入した。その構築
物は植物細胞の形質転換に用いられ、その植物細胞は培
養下においてカナマイシンおよびＧ４１８のようなその
アナログに対する耐性を示した。Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓ
ｔｒｅｌｌａ　ｅｔ　ａｌ、前出、はＴｎ７由来のメト
トレキセート耐性遺伝子（ジヒドロ葉酸リダクターゼ）
がツバリンシンターゼ　プロモーターの後ろに置かれた
ような、類似の構造を報告した。形質転換細胞は９葉酸
の拮抗アナログであるメトトレキセートに耐性であった
。同様に、　Ｌ、Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａｅ
ｔ　ａｌ、　（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０３　：
　２０９−２１３は、オクトピンシンターゼおよびクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（細菌に
おいてクロラムフェニコール耐性を賦与する）の酵素活
性の発現を、これらの二つの酵素の構造遺伝子を虱プロ
モーターの制御下に置くことにより、植物細胞において
獲得した。

Ｎ、　Ｍｕｒａｉ　ｅｔ　ａｔ、（１９８３）　５ｃｉ
ｅｎｃｅ　２２２　：　４７６−４８２ＩおよびＴ、　
Ｃ，Ｈａｌｌ　ｅｔ　ａｌ、　ＩＪＳ　ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓｅｒ、　ｎｏ、４８５，６１４　、ここでは
文献に編入される。

はユ亜プロモーターおよびオクトピンシンクーゼ構造遺
伝子の５”末端のマメ種子蛋白のファセオリンの構造遺
伝子への融合を報告している。オクトピンシンターゼの
アミノ末端を保持し、ファセオリンのアミノ末端を欠失
する融合蛋白が、　Ｔ−ＤＮＡプロモーター制御下にお
いて生産された。ファセオリン配列により与えられたイ
ントロンは。

転写後に正しくプロセッシングを受けた。

八、Ｊ、ｄｅ　Ｆｒａｍｏｎｄ　ｅｔ　ａｌ、　（１９
８３）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。

１　：２６２−２６９は“ミニ−Ｔｉプラスミド”の構
築に関してそのことを報告している。ツバリンＴ−ＤＮ
Ａにおいて、制限酵素Ｋｐｎ　Ｉにより切断される部位
は通常ただ一つのみ存在する。その部位を欠失する突然
変異を作成し、全ツバリンＴ−ＤＮＡを含むＫＰＬＩ断
片が分離された。この断片はカナマイシン耐性遺伝子と
共にｐＲＫ２９０中に挿入され。

その結果、アグロバクテリウム・チューメフプシエンス
（人、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）中で保持可能で、非
Ｔ−ＤＮＡのＴｉ配列のほとんどすべてを欠失するプラ
スミドとなった。単独では、このプラスミドは植物細胞
を形質転換することができなかった。

しかし、オクトピンＴｉプラスミドを保持するアグロバ
クテリウム・チューメファシエンス中に置かれると、腫
瘍は誘導されてオクトピンおよびツバリンの両方を合成
した。ミニＴｉプラスミドもまた。

それ自身のＴ−ＤＮＡを欠失するＴｉプラスミドで相補
された場合に植物細胞に専大されている。これらの結果
は、非Ｔ−ＤＮＡの機能がＴ−ＤＮＡとトランスに働く
こと、欠失ツバリンＴｉプラスミドの機能がオクトピン
Ｔｉプラスミドにより相補されること、およびツバリン
“ミニ−Ｔｉプラスミド”が植物細胞の形質転換におい
て機能することを示した。各々オクトピンＴ−ＤＮＡも
しくは−ｏｎｃ遺伝子を有し、相補性のあるこれに似た
対が八。

Ｈｐｅｋｅｍａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　Ｎａｔ
ｕｒｅ　３０３　：　１７９−１８０により構築されて
いる。

Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅＬ　ａｌ、　（１８Ｊａｎｕａｒｙ
　１９８３　）　１５ｔｈＭｉａｍｉ　Ｗｉｎｔｅｒ　
Ｓｙｍｐ、は、ツバリンシンターゼ遺伝子および左右の
境界以外の実質的にすべての′Ｆ−ＤＮＡを欠失させる
ために、　Ｓｍａ　Ｉを用いたパミニ−Ｔｉ”の再区分
により作成した“ミクロ−Ｔピの構築について報告した
。ミクロ−Ｔｉは、）はり部位を欠失する修飾ｐＲＫ２
９０プラスミドに挿入され。

ミニ−Ｔｉプラスミドに類似した方法で用いられ。

同等の結果が得られた。Ｇ、八、　Ｄａｈｌ　ｅｔ　ａ
ｌ、　ＵＳａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｓｅｒ、　ｎｏ、
　５３２＋２８０は、オクトピン型プラスミドｐＴｉ１
５９５５のＴＬ領領域ら構築された虱潰転子を所持する
ミクロ−Ｔｉプラスミドを発表している。

（以下余白） 体重」ｂ旧Ｗ斐 本発明の遺伝的に細胞を修飾する方法は、（ａ）二元目
的プロモーター領域／外来構造遺伝子結合体を有するＤ
ＮＡ分子で原核生物細胞を形質転換し。

結果として生じた原核生物株でのこの結合体の発現を検
知する工程；および（ｂｌ二元目的プロモーター領域／
外来構造遺伝子結合体を有するＤＮＡ分子で植物細胞を
形質転換し、結果として生じた植物組織でのこの結合体
の発現を検知する工程、を包含する。本発明の植物は、
（ａ）二元目的プロモーター領域／外来構造遺伝子結合
体を有するＤＮＡ分子で原核生物細胞を形質転換し、結
果として生じた原核生物株でのこの結合体の発現を検知
する工程；および（ｂ）二元目的プロモーター領域／外
来構造遺伝子結合体を有するＤＮＡ分子で植物細胞を形
質転換し、結果として生じた植物組織でのこの結合体の
発現を検知する工程、を包含する遺伝的に細胞を修飾す
る方法により遺伝的に修飾される。本発明のＤＮＡベク
ターは、同定し得る表現型を与え得る１つまたはそれ以
上の二元目的プロモーター領域／外来構造遺伝子結合体
を有するＤＮＡベクターであって、該結合体が該ベクタ
ーにより形質転換された細菌株に同定し得る表現型を与
える該ベクターに対し唯一の手段である。本発明の植物
組織は、同定し得る表現型を与え得る１つまたはそれ以
上の二元目的プロモーター領域／外来構造遺伝子結合体
を有するＤＮＡベクターであって、該結合体が該ベクタ
ーにより形質転換された細菌株に同定し得る表現型を与
える該ベクターに対し唯一の手段である。ＤＮＡベクタ
ーに由来するＤＮＡを含む。本発明の植物は、また、同
定し得る表現型を与え得る１つまたはそれ以上の二元目
的プロモーター領域／外来構造遺伝子結合体を有するＤ
ＮＡベクターであって、該結合体が該ベクターにより形
質転換された細菌株に同定し得る表現型を与える該ベク
ターに対し唯一の手段である。ＤＮＡベクターに由来す
るＤＮＡを含む植物組織に由来する。さらに１本発明の
細菌株は。

同定し得る表現型を与え得る１つまたはそれ以上の二元
目的プロモーター領域／外来構造遺伝子結合体を有する
ＤＮＡベクターを含む細菌株であって、該結合体は該株
に該同定し得る表現型を与える唯一の手段である。ＤＮ
Ａベクターを含む。

本発明の目的の一つは、その遺伝子がその細胞に対して
外来であり他の方法では発現されないという場合の、植
物および細菌の両方の細胞中での構造遺伝子の発現を促
進させるための方法を供することである。この目的の遂
行において、二元目的プロモーター領域／外来構造遺伝
子結合体が供される。それは、その結合体によって形質
転換される細胞に対して同定可能な表現型を授与する外
来構造遺伝子に結合した。植物および細菌の細胞中での
構造遺伝子の転写の制限可能なりＮＡ配列である。もう
一つの目的は、外来構造遺伝子にコードされたタンパク
、そしてもしそれが酵素である場合には、その遺伝子が
挿入された細胞中に。

挿入されていない時には見られない、または見られる代
謝産物もしくは化合物をそれぞれ保持する。

もしくは欠失する。特殊な植物組織および植物を供する
ことである。他の目的には、真核生物で発現するために
設計された構造の、原核生物中における予備実験の、そ
してまた他には選択の、方法を供すること、そしてそれ
によって、真核と原核の両方の形質転換細胞を同定し得
るような方法を供することである。それ以外の目的およ
び利点は。

以下の記述から明らかとなるであろう。

本発明は、導入され２発現される外来構造遺伝子を保持
する。遺伝学的に修飾された植物細胞から成る植物を供
する。そしてその外来構造遺伝子は３分り易く言えば、
Ｔ−ＤＮＡの１４５０ｂＴｘ由来の植物で発現可能な転
写制御配列の制御下で発現される。さらに本発明は、Ｔ
−ＤＮＡ由来の植物で発現可能な転写制御配列に関して
、それらの配列の制御下において植物細胞内で発現可能
なような方向および間隔で挿入された。外来構造遺伝子
を含むゲノムを有する植物細胞から成る植物組織を供す
る。また、Ｔ−ＤＮＡを保持し、そして複製する細菌の
新しい株が供される。そしてそのＴ−ＤＮＡは、Ｔ−Ｄ
ＮＡ由来の植物および細菌で発現可能２．（プロモータ
ー領域に関して、植物または細菌の細胞内で上記プロモ
ーター領域の制御下で発現可能であるような方向および
間隔で挿入された外来構造遺伝子を保持するように修飾
されている。それに加えて２本発明は細菌内での複製能
力を保持し、Ｔ−ＤＮＡを含むように、植物を形質転換
するという努力において便利な新しいベクターを供する
。さらにそのベクターは、Ｔ−ＤＮＡ由来のプロモータ
ー領域の制御下における植物細胞または細菌内で発現可
能であるように、ベクターに含まれるＴ−ＤＮＡ中に挿
入された外来構造遺伝子を含む。さらにまた、上記ベク
ターを保持する細菌の株を開示する。

ここで紹介する実験作業は、真核および原核生物の両方
において構造遺伝子の単一コピーの転写を生じるプロモ
ーター活性を有するＤＮＡ分子を記述する。二元目的プ
ロモーター領域／外来構造遺伝子結合体の有効性は、植
物の形質転換の当業者が外来構造遺伝子を発現させるの
を、そしてＤＮＡ配列の他の操作を行うのを容易にする
。真核生物への形質転換前に、原核生物中で外来構造遺
伝子を発現できることは、その構造が正しく組み立てら
れているかどうかを確認するために１組み換えＤＮＡ構
造を機能的に調べることを可能にする。遺伝的マーカー
の発現を制御するのに用いられた場合、このプロモータ
ー領域のさらに他の効用が明らかとなる。マーカーが植
物と細菌の両方に毒性を持つ選択薬剤１例えば抗生物質
、に対しテ抵抗性もしくは耐性を与える場合、プロー［
−−ター領域および外来構造遺伝子を含む単−ＤＮＡ配
列は形質転換細胞が細菌がまたは植物由来かを同定また
は選択するのに用いることができる。二元目的プロモー
ター領域／構造遺伝子結合体は、その結合体が、その構
造遺伝子により授与される同定可能な表現型の細胞内で
の発現にとって唯一の方法である場合に、特に有用であ
る。２つの目的。

すなわち植物における選別（または選択）および細菌に
おける選別（または選択）、のために単−ＤＮＡ配列を
用いることは、そのようなマーカーを所持するＤＮＡ分
子の大きさを小さくすることを可能とし、それによって
組み換えＤＮＡ操作および細胞形質転換手順を容易にす
る。

本発明は、二元目的プロモーター領域の制御下における
外来構造遺伝子およびポリアデニル化部位から成り、上
記プロモーター／遺伝子／ポリアデニル化部位の結合は
、当業者には知られたどんな方法によってでも細胞に挿
入される。　もっと明確に３分り易（言えば、ここで発
表される本発明はＴ−ＤＮＡを介した導入の後に、すな
わち外来構造遺伝子をＴ−ＤＮＡの１４５０ｂＴｘＰＲ
の制御下およびポリアデニル化部位の前に挿入し、既知
の方法を用いて挿入物を含むＴ−ＤＮＡを植物細胞に導
入することにより、あるＴ−ＤＮＡ由来の植物内で発現
可能な転写制御配列、すなわち１４５０ｂＴｘＰＲの制
御下での外来構造遺伝子の植物および細菌内での発現を
さらに含む。ひとたび、二元目的プロモーター領域の制
御下で外来構造遺伝子を発現する植物細胞が得られれば
、当業者にはよく知られた方法および技術を用いて、そ
こから植物組織および植物全体を再生することができる
。再生した植物はその後、普通の方法により増殖させら
れ。

導入された遺伝子は、普通の植物育種技術により他の株
および栽培種へ移すことができる。本発明は原則として
、外来ＤＮＡ　（分り易く言えばＴ−ＤＮＡ）をどのよ
うにかして導入でき、上記ＤＮＡが安定に複製されて存
在し得るようなどんな植物への、外来構造遺伝子のあら
ゆる導入に対して適用される。一般的に、これらの分類
には現在。

これだけに限定されないが、ヒマワリ　（コンポジタ工
科）、タバコ（ソラナサ工科）、ムラサキウマゴヤシ、
ダイス、そして他のマメ科植物（レグミノッセ科）、綿
（マルバソセー科）、およびほとんどの植物を含む。

本発明は、他の種、生物２株からの有用な構造遺伝子を
挿入することにより、細菌、植物細胞。

植物組織、および植物全体を遺伝学的に修飾するのに有
益である。そのような有用構造遺伝子には。

これらに限定されるわけではないが２次のような同定可
能な表現型を伝達する遺伝子が含まれる二極端な署さま
たは寒さに対する改良された耐性；嫌気的条件（例えば
浸水）、早魅、または浸透圧に対する改良された耐性；
昆虫（例えばバチルス・チューリンゲンシスの結晶性タ
ンパクのような殺虫性毒素）、＜も、線虫、または寄生
害虫、およびカビ、細菌、またはウィルス性の病気に対
する改良された抵抗性または耐性；通常は上記組織また
は植物に存在しない酵素もしくは二次代謝産物の生産；
改良された栄養性（例えばレクチン。

またはゼインもしくはファセオリンのような貯蔵タンパ
ク）、香味（例えばクウマチンのような甘味タンパク）
、または繊維もしくは人や動物の食糧に用いられる場合
の加工処理における特性；変化した形態学上の特徴もし
くは生育における様式（例えば昆虫から植物を保護する
集毛、美的にとって喜ばしい変色、変化した植物の生育
習性、矯性植物、成熟するまでにかかる短縮された時間
。

組織中での遺伝子の発現もしくは９通常は発現されない
時期における発現、など；雄性不稔；改良された光合成
能（低下した光呼吸を含む）；改良した窒素固定能；改
良された栄養物の摂取；植物に対する有害物に対する改
良された耐性（例えばグリフォセートまたはトリアジン
）；増加した穀物の収率；他の植物に対する改良された
競争力；遺伝学的に修飾された細胞に対゛して新しい遺
伝マーカー；など。遺伝マーカーは、１つもしくはそれ
以上の特徴的な核酸配列、タンパク、遺伝子産物、もし
くはどうにかして同定された表現型、の存在による生殖
細胞の同定を改良するのに用いることができる。遺伝マ
ーカーは、遺伝学的に連鎖の、もしくは同時形質転換さ
れた９人工的導入ＤＮＡ配列、もしくは他の（例えば性
的の）方法による。他の遺伝型への表現型の移動を促進
するように、もしくは、特許または植物系統保護証明書
により保護された植物の同定を促進するように。

は修飾されていない植物、植物細胞、または細菌から９
本発明における遺伝学的に修飾された植物。

植物細胞、または細菌細胞を区別することができる。細
胞もしくは組織の培養における選択薬剤に対する抵抗性
（または耐性）（すなわち選択可能マーカー）、および
選択中に容易に認識できるマーカー（例えば明確な細胞
表面抗原もしくは酵素のような、もしくは視覚的に容易
に認識できるβ−ガラクトシダゼのような選択マーカー
）もまた。

有用な遺伝マーカーである。Ｔｎ５由来のネオマイシン
フォスフオドランスフェラーゼｎ　（ＮＰ”Ｉ’ｌｌ）
をコードし、カナマイシンおよびそのアナログ化合物の
効果に対して耐性である表現型を授与する構造遺伝子（
ｋａｎ遺伝子）を、自然には１４５０ｂＴｘの発現を制
御するプロモーター領域の制御下に置くことにより１本
発明は例証される。プロモーター／ｋａｎ結合体は、こ
の結合体により形質転換された細胞の検出および選択に
用いることができる。

当業者には理解されるように、真核および原核生物にお
いて、この結合体に連鎖したＤＮＡ配列は何でも選択さ
れ、連鎖したＤＮＡ配列により形質転換された細胞はそ
れゆえ同定されるであろう。

レクチンの構造遺伝子を１４５０ｂＴｘプロモーター領
域の制御下に置くことにより２本発明はさらに例証され
る。レクチンは、栄養上重要な、ファセオラス・ブルガ
リス（マメ）の種子の子葉タンパクである。レクチン構
造遺伝子の導入および発現は。

タンパク含有量を増加し、いろいろな穀物の栄養価を変
化させるのに用いることができる。本発明の他の利用、
いろいろな植物種に導入された他の構造遺伝子の特性を
開発すること、は当業者には容易に明らかとなるだろう
。

本発明は、さらに１４５０ｂＴｘプロモーター支配下に
転写される外来構造遺伝子を有するサブ−Ｔｉプラスミ
ドを含んでいる。

Ｔ−ＤＮＡの植物ゲノムへの取込みに関与する直接反復
配列と１つ以上のオピン合成遺伝子を有するサブ−Ｔｉ
プラスミドの利用は、以下の利点を有している：１．虱
遺伝子が欠失しているため。

形質転換した組織培養物やプロトプラストから再生植物
体が得やすいこと。２．オピン合成遺伝子が、Ｔ−ＤＮ
Ａが組み込まれた植物細胞や組織を同定するために用い
ることができる（したがってさらに組み込まれている他
の連接したあるいは共同形質転換されている遺伝子も）
。３．植物細胞は、Ｔｔ　ＤＮＡのみでも、ＴＲ−ＤＮ
Ａのみでも、またＴＬ、ＴＲ−ＤＮＡ両方でも形質転換
される。形質転換植物細胞中では、’ｒＲ−ＤＮＡが多
コピー見られ、活発に転写されているので、ＴＬ−ＤＮ
Ａの全体または一部の欠失は３種々のｏｎｃ遺伝子が存
在せず、外来遺伝子を効率的に発現させる。４．サブ−
Ｔｉプラスミドは、小さいので。

形質転換の際に要求される多くの操作が簡略化できる。

第１図は、　Ｓ、　Ｊ、　Ｋａｒｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ
、　（１９８４）　Ｍｏｌ。

Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、よりとったオクトピン型Ｔｉプ
ラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の制限酵素地図である。

Ｂａｍ１１１断片３０′　は、」憇旧断片８と３０の間
に位置する。制限酵素地図の下にひかれている線は。

Ｅ９タバコ腫瘍細胞系列の中に含まれているＤＮＡ領域
を示している。

第２図は、　Ｋａｒｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、前出の論文
よりとったＴＲＤＮＡの制限酵素地図であり、５つのＴ
Ｒ転写産物の地図上の位置と極性を示している。示され
ている制限酵素は、」憇ＩＮ、ＥｃｏＲＩ、肛匹■。

展Ｉ、鎖ｔｌ、只虹Ｉ、財１】、ハｔｌ、およびＳａｌ
　Ｉである。上の酵素によるＴＲ内のすべての切断部位
が本地図中に含まれているわけではない。

第３図は、実施例２．２から３．４までに用いたＤＮＡ
実験操作の概略図であり、大きさは正確ではない。制限
酵素によって切断される部位は、酵素名を示した。制限
酵素によってもはや切断されなくなった部位は、制限酵
素名の前後にカッコをおくことにより示した。プロモー
ターまたは構造遺伝子の大きさと極性は、矢印によって
示した。プラスミドの名前は、プラスミドを環状に表記
する時その内に記した。“Ｅｘ”は、実施例を意味し。

特殊な操作について記している。これらの用法は。

第５図においても用いた。

第４図は、１４５０ｂＴｘプロモーター領域とＮＰＴ■
構造遺伝子の結合体を有している細菌細胞の増殖特性を
示すグラフである。このプロモーター領域は、アグロバ
クテリウム・チューメファシエンス中で活性があり、こ
の構造遺伝子との組合ゼは。

カナマイシン耐性を賦与している。

第５図は、実施例ら、１に記されているＤ’ＮＡ実験操
作の概略図である。

（以下余白） 日の−　な記゛ポ 以下の用語の定義は本願特許明細書および特許請求の範
囲中のこれら用語の趣旨および意味の範囲のあいまいさ
を除去するためのものである。

プロモーター；本譜は、構造遺伝子の５′末端に位置す
る転写開始に関与する配列を意味する。本発明は、２つ
のプロモーター活性（真核プロモーター活性と原核プロ
モーター活性）が、Ｔ−ＤＮＡ配列のプロモーター領域
に存在することから成っている。その結果として、目的
の外来構造遺伝子ＤＮＡ配列の転写が、真核生物と原核
生物において、すなわちある特定の植物とグラム陰性細
菌において可能となった。自然には、ここに例示してい
るＴ−ＤＮＡプロモーター領域配列は、　１４５０ｂＴ
ｘのクラウンゴール中の転写を引きおこす。プロモータ
ー支配下の発現は、直接発現かまたは融合蛋白発現の型
をとるであろう。前者の型では、正常にプロモーター支
配をうけている構造遺伝子を一部または全部除去し、外
来構造遺伝子の挿入によって置換する。そして開始コド
ンは、Ｔ−ＤＮＡ構造遺伝子の残っている部分のもの、
または、挿入された構造遺伝子のものが用いられる。後
者の型では、既在のＴ−ＤＮＡ構造遺伝子内にリーディ
ングフレームが合うように構造遺伝子の全体または一部
が挿入される。この時、翻訳産物は、融合蛋白になって
いる。真核プロモーター配列は。

ｍＲＮＡの５”末端（キャンプ部位）の約１０〜３０ベ
ースベアー（ｂｐ）　５’側にある５′・・・ＴＡＴＡ
八・・・３゛という基本配列と相同性のあるＤＮＡ配列
の存在によって共通的に認識される。ＴＡＴＡＡ配列の
約３ｏｂｐ５”側には、基本配列５゛・・・ＣＣＡＡＴ
・・・３＋　の別のプロモーター配列が見られる。翻訳
開始は、一般的にキャップ部位の３゛側にある最初のＡ
ＵＧからが最も効率的である。

ポリアデニル化部位；本語は、真核生物において。

伝達ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）のポリアデニル化を誘起し得
る核酸の配列を意味する。すなわち、転写終了後、ポリ
アデニル酸“末尾”が、ｍＲＮＡ前駆体の３”末端に付
加される。ポリアデニル化部位のＤＮＡ配列は、天然ま
たは人工、原核または真核の遺伝子ＤＮＡまたはｍＲＮ
Ａ由来ｃ由来Ａ等の多くの情報から導かれる配列の混合
物である。

ポリアデニル化部位は、基本型５゛・・・ＡＡＴＡＡＡ
・・・３゛に相同性のあるＤＮＡ配列の存在によって認
識される。ところが、転写産物の５′から３゛末端まで
の距離のばらつき部分的“読み越し”と基本配列の縦列
重複は珍しくない。“ポリアデニル化部位”の基本型は
、ポリアデニル化それ自体の位置ではな（で、ｍＲＮＡ
の３°末端の位置を決定していると考えられるべきであ
る（Ｎ、　Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ　（１９８４）　Ｎａｔ
ｕｒｅ　３０７　：４１２−４１３）。

転写調節配列；本譜は、構造遺伝子に隣接して存在する
プロモーター／ポリアデニル化部位の組合せを意味する
。特定の外来構造遺伝子に隣接しているプロモーターと
ポリアデニル化ＤＮＡ配列は。

同一起源の遺伝子（例えば、２つのＴ−ＤＮＡ転写産物
の一組）または同−分類上の起源の遺伝子（例えば、Ｔ
−ＤＮＡ由来の配列と植物、動物。

カビ、酵母、真核性ウィルス、細菌と合成配列等のよう
な非Ｔ−ＤＮＡ由来のＤＮＡ配列の一組）由来である必
要はない。

外米構造遺伝子；本譜はここでの用法は、外来ＲＮＡ、
蛋白質、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む遺
伝子の一部または、翻訳開始コドンを含む遺伝子の一部
を意味する。外来構造遺伝子は、その遺伝子が導入され
た細胞では普通見出せない遺伝子産物をコードしている
場合もある。さらに本譜は、天然にその細胞内に存在す
る遺伝子の場合でも３人為的に導入された構造遺伝子の
コピーをも意味する。外来遺伝子は、原核ＤＮＡ。

真核ＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、プ
ラスチイツトＤＮＡ、遺伝子ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、　ウィ
ルスＤＮＡ、　ウィルスｃＤＮＡ、化学合成りＮＡ等か
ら一部または全体が由来している。

外来構造遺伝子は、コーディング部位または非翻訳部位
に一つ以上の修飾を有するものも考慮している。この修
飾は１発現産物の生物活性や化学構造９発現の速度や発
現調節の様式に影響を及ぼすだろうと考えられる。この
修飾は、一つまたはそれ以上の核酸の変異、挿入、欠失
、置換、および発現産物の化学構造は変えずに１発現産
物の細胞間局在化、転送２分泌または安定性に影響をお
よぼす“サイレント”修飾を含むが、これに限らない。

構造遺伝子は、コーディング部のみから成っているかも
しれないし、また化学合成したものであれ天然のもので
あれ、１つ以上のイントロンを含んでいるかもしれない
。本イントロンは、適正な機能スプライス部を両端に有
している。構造遺伝子は、化学合成したものであれ天然
のものであれ、構成蛋白質をコードする部位からなって
いる。

この構成蛋白質は１本遺伝子が導入され１発現している
細胞にとって外来性であるかまたは、一部が外来蛋白質
由来のものである。外来構造遺伝子は、融合蛋白質、特
に転写調節配列が由来している構造遺伝子の一部または
全部と融合しているもの、でもよい。

ニー　〇・ブロモ−−ｈＪ！′告゛　云　±人止；本譜
は、複数のプロモーター活性１例えば。

真核プロモーター活性および原核プロモーター活性、に
より調節されている外来構造遺伝子を意味する。このプ
ロモーター活性部位は１重複する必要はない、すなわち
、真核および原核プロモーター活性は、物理的に同一の
ところになくてもよいし、あってもよい。例えば、真核
プロモーター活性および原核プロモーター活性が、異な
ったＤＮＡ配列上にあってもよい。両プロモーター活性
間の距離は１本発明においては、原核プロモーター活性
と構造遺伝子間に原核性の転写終止点が存在しない限り
、またキャップ部位とコーディング配列との間に真核性
のｍ　ＲＮ　Ａ転写終止シグナルが存在しない限りにお
いては２重要ではない。

植物組織；本譜は、植物の分化、未分化組織を含む。こ
れは、根、茎葉、花粉１種子、クラウンゴールのような
腫瘍組織のみならず、胚およびカルスのような植物培養
細胞の種々の集合体をも意味する。植物組織は、植物体
中、または器官１組織中または培養細胞中のものをいう
。

鼠隻且凶；本譜は、植物体中の植物細胞、植物培養物中
の植物細胞およびプロトプラストを意味する。

Ｍ皿狙胞；ここでの使用は生物学的に純粋な培養および
環境中に分散したものを含み、かつこれに限定されない
培養中の細胞を含む。

ＤＮＡ断片の定義は第１図、第２図で規定されている。

二元目的のプロモニター領域／外来遺伝子結合体を発現
する遺伝的に修飾された細胞の生成は。

ここに開示される特殊な知識と当該分野の種々の技術お
よび手段を組み合わせたものである。大部分の例におい
て、全体のプロセスの各段階に他の手段が存在する。手
段の選択は二元目的の結合体の導入と安定な維持のため
の基本的なベクター系の選択、修飾される植物種および
望まれる再往手段、そして用いられる特別の外来構造遺
伝子またはプロモーター活性などの変数に依存し、それ
らすべてに当業者が望む結果を得るために選択し。

用いることができる別のプロセス段階がある。例えば、
二元目的のプロモーター領域を得るための出発点は１本
応用においてはｐＴｉＡ５から単離されたＴ−ＤＮＡに
例証されているが、他の相同性ＴｉプラスミドのＤＮＡ
配列で、適切な修飾がプロモーター領域の単離および操
作手順に施される限り。

置き換えても良い。（しばしば、ｐＴｉ１５９５５が修
飾なしに用いられる。）ここで示された１４５０ｂＴｘ
遺伝子由来以外の二元目的プロモーター領域が発見また
は構築されるであろう。相同性遺伝子は当業者により、
適切な厳密さの条件下で相同性核酸の交差ハイブリダイ
ズ能により、または当該分野で熟知の核酸または蛋白質
の配列により同定されるだろう。本適用で利用されるま
たは開示される遺伝子配列内でのわずかな配列の変動が
あることは理解されるだろう。これらの変動は当業者が
操作し得る標準技術により決定され、そのような相同性
遺伝子のプロモーター領域を利用できるであろう。外来
遺伝子の植物細胞への安定な挿入に対する新しい手段が
開発されれば、当業者は望みの結果を達成するために、
これら他のプロセス段階の中で選択できるであろう。本
発明の基本面は二元目的プロモーター領域の性質と外来
構造遺伝子の単一コピーの原核および真核再生物内での
発現をもたらすためのその利用である。他の面として。

外来構造遺伝子の性質と構造、および細菌および植物ゲ
ノムへの挿入と発現のための手段がある。

遺伝的に修飾された植物を得るために望まれる具体化の
残された段階として、Ｔ−ＤＮＡへの１４５０ｂＴｘＰ
Ｒ／構造遺伝子結合体の挿入、細菌での発現の監視、修
飾Ｔ−ＤＮＡが植物細胞ゲノムの一部として安定に取り
込まれる植物細胞への修飾Ｔ−ＤＮＡの移送、形質転換
植物細胞の選抜と検出の段階。

および最初に形質転換された株から実用的な栽培物への
導入遺伝子と他の共存した。または同時に転移したＤＮ
Ａ配列の移送の段階を含むインビトロ培養と完全植物体
への再生の技術、および形質転換植物での発現の監視が
ある。

本発明のその望まれる具体化での基本面は挿入外来構造
遺伝子が１４５０ｂＴｘＰＲの支配下にある。すなわち
二元目的プロモーター領域とポリアデニル化部位の間に
ある。Ｔ−ＤＮＡ誘導体の構築であり、これらの用語は
上で定義した。構造遺伝子はプロモーター領域に関して
正しい位置と方向に挿入されねばならない。位置には２
つの観点がある。

第１はプロモーターのどちら側に構造遺伝子が挿入され
るかに関するものである。大多数のプロモーターは転写
と翻訳の開始をＤＮＡに沿って唯一の方向に支配するこ
とが知られている。プロモーター支配下にあるＤ　Ｎ　
Ａ　８Ｍ域はプロモーターの“下流に”、または他の表
現として“後に”または“３゛側に”あると言われる。

したがって、プロモーターに支配されるためには外来構
造遺伝子の正しい挿入の位置はプロモーターの“下流に
”なげればならない。位置についての第２の観点はプロ
モーターの既知機能要素９例えば転写開始部位。

と構造遺伝子の翻訳開始部位間の塩基対での距離に関す
るものである。プロモーターによりこの距離に関して実
質上の変動が存在するらしい。したがって、これに関す
る構造上の要求は機能的という言葉により最もよく表現
される。第一次近似として、理にかなった作用能はプロ
モーターと挿入外来構造遺伝子間の距離が、正常に支配
しているプロモーターと遺伝子間の距離に近い場合に得
られる。向きとは構造遺伝子の方向性に関するものであ
る。最終的には外来蛋白質のアミノ末端をコードする構
造遺伝子の部分を構造遺伝子の５°末端と呼び、一方、
蛋白質のカルボキシル末端付近のアミノ酸をコードする
端を構造遺伝子の３°末端と呼ぶ。外来構造遺伝子の正
しい向きは、その５′末端をプロモーターの近くに有す
る。融合蛋白質発現をもたらす構築の場合にさらに要求
されることは、２つの構造遺伝子の融合は、２つの遺伝
子のコード配列が同じリーディングフレームフェーズに
なければならないことであり、この構造上の要求性は当
該分野に熟知されている。このフェーズの要求性の例外
はイントロンが２つの構造遺伝子由来のコード配列を分
断している場合に存在する。その場合９両構造遺伝子は
適合するスプライス部位を保有しなければならず、そし
てイントロンスプライス部位は正しいリーディングフレ
ームが、イントロンが転写後のプロセッシングにより除
去された後、同じフェーズに保存されるような位置にな
ければならない。発現速度または発達の制御の差は別の
外来構造遺伝子が１４５０ｂＴｘＰＲ８Ｍ　４体または
他の二元目的プロモーター領域の支配下に挿入されると
きに観察されるであろう。発現速度はまた生じるｍＲＮ
Ａの２次構造、特にステム−ループ構造の細部により大
きく影響される。

当該分野で熟知の如く、原核細胞における翻訳速度はＡ
ＵＧ翻訳開始部位の５′側のりボゾームＲＮＡ結合配列
（Ｊ、　５ｈｉｎｅ　ａｎｄ　Ｌ、　Ｄａｌｇａｒｎｏ
　（１９７４）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　ＩＪＳＡ　７１　：　１３４２−１３４６）の
存在により影響されるであろうし、また真核細胞内での
翻訳速度はＡＵＧ近傍の特別のヌクレオチド（Ｍ、　Ｋ
ｏｚａｋ（１９８１）　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
、　９　：　５２３３−５２５２）により影響されるで
あろう。発現蛋白質自身の安定性、細胞間または細胞内
局在性または分泌、溶解性、標的特異性、および他の機
能上の性質を含み、またそれに限定されない性質の差は
融合蛋白質の場合に、挿入部位、融合蛋白質に含まれる
外来蛋白質の部分の長さと性質、およびその折りたたみ
構造の効果に依存することが観察されるであろう、そし
てそれらのすべてに、植物細胞。

植物組織および完全植物体で要求される生理的性質に依
存して、外来蛋白質産物の機能上の性質を操作する。お
よび制御する多数の機会が存在する。

プロモーター領域にイ以て、ポリアデニル化部位もコー
ド配列の３゛末端に関して正しい位置と方向に位置しな
ければならない。外来構造遺伝子蛋白質の３゛末端とポ
リアデニル化部位の起源を提供するＤＮＡにコードされ
るポリペプチド間の融合蛋白質もまた可能である。

当業者には理解されるであろうが、他の部位が。

連結部の配列が翻訳と転写の機能に適合性を保持するよ
うにより具体的に用いられるＣｊａ　Ｉプロモーター／
構造遺伝子構造に置き換えられる。構造遺伝子を荷なう
断片の５゛および３°末端の制限部位は同じであるかも
知れないし、異なるかも知れない。遺伝子断片の両末端
で特異性の異なる粘着末端を有する部位の利用は、自動
的に構造遺伝子を１４５０ｂＴｘＰＲの後に正しい方向
で位置させることになる。制限部位が適合性のない末端
を有する場合、当該分野で熟知の方法により、それらを
平滑末端に変換し、平滑末端は共に結合される。適当な
リンカ−、アダプターあるいはカップラーの使用もまた
。　１４５０ｂＴｘＰＲと構造遺伝子間の連結部の形成
に、ある場合には有効であり、これは当業者には証明さ
れており、ここでも示される。

植物形質転換を実際に行っている人々は構造遺伝子が細
菌宿主内で、植物細胞内と同様有利に発現するというい
くつもの状況に気づくだろう。しかし、形質転換細胞の
同定および／または選択のための遺伝マーカーとして機
能する遺伝子の発現をもたらすための１４５０ｂＴ’ｘ
ＰＲの使用は特に有効であり、そしてここで例証される
（実施例４）。原核、真核生物に拘らず、細胞の形質転
換はマーカーおよび連接したＤＮＡ配列を保持する特別
の組み換えＤＮＡ分子により形質転換された細胞を容易
に同定する方法をもつ場合に、最も簡単に達成される。

　単一マーカーの効果的な発現のための１４５０ｂＴｘ
ＰＲの使用は当業者に形質転換ベクターへの第２のマー
カーを導入する手間を省かせる。さらに、第２のマーカ
ーが不要なことは形質転換ベクターを作成するのに小型
化ができ、それによりＤＮＡ操作の容易性、形質転換効
率の上昇などをもたらす。しかし、特別のマーカーを１
４５０ｂＴｘＰＲの後に置く場合、当該分野で既知の如
く、遺伝子の再配置をもたらすプラスミド内の他の部分
との相同配列に気をつけねばならない。例えば、ＴＬ二
遺伝子とＴ＋ｔの１４５０ｂＴｘＰＲ／展組合せを欠失
したホモ部分２倍体を選択するのに用いるｋａｎ遺伝子
は組み換えを起こし、介在Ｔ−ＤＮＡ配列の欠失あるい
は逆転を生ずる。　１コピ一以上の１４５０ｂＴｘＰＲ
を似たような数の種々の外来構造遺伝子の発現をもたら
すために用いる場合に注意を払わねばならないことは同
様である。

当業者には明らかなように、二元目的プロモーター領域
／外来構造遺伝子結合体は、それが乗っているプラスミ
ドからその組合せを除去するのに都合の良い何らかの制
限部位と、植物形質転換付または選んだシャトルベクタ
ーへの挿入に都合の良い制限部位の間に置かれるだろう
。Ｔ−ＤＮＡ内の二元目的組合せの挿入部位の位置は、
近接するＴ−ＤＮＡ境界の配列の転移機能が損なわれな
い限り、厳密なものではない。何故なら、以前の研究に
おいて、これらの領域は修飾Ｔ−ＤＮＡの植物ゲノムへ
の挿入に本質的なもののようである。

望ましい挿入部位は最も活発に転写されている領域、特
にＴＲ９および１４５０ｂＴｘを含む領域にあるもので
ある。二元目的組合せが挿入されるＴ−ＤＮＡは何らか
のＴＩＰプラスミドから得られ、そしてこの結合体は当
業者に熟知の標準技術により挿入される。内在Ｔ−ＤＮ
Ａまたはベクター遺伝子の転写、翻訳の方向に関する挿
入植物遺伝子の向きは厳密ではなく、２つの可能な方向
のどちらも機能的である。植物での発現速度の差は、あ
る遺伝子がＴ−ＤＮＡ内の異なった位置に挿入される場
合に生ずるだろうし、それはＤＮＡメチル化およびクロ
マチン構造などの因子によるものである。

二元目的結合体と何らかの望まれる連接したＤＮＡをＴ
−ＤＮＡに挿入する簡便な方法に、背景の項で述べたよ
うに、エセリシア・コリー内で複製できるプラスミドに
取り込まれたＴ−ＤＮＡの小片（これらの小片間に挿入
が望まれる）を有するシャトルベクターの利用がある。

このＴ−ＤＮＡ小片は１つの制限部位、できればシャト
ルベクター内で特別な部位、を含む。二元目的結合体は
Ｔ−ＤＮＡ配列の特別の部位に挿入されることができ、
そしてこのシャトルベクターは適当なアグロバクテリウ
ム株、できればそのＴ−ＤＮＡがシャトルベクターのＴ
−ＤＮＡ小片と相同性を有する。の細胞へ移される。形
質転換アグロバクテリウム株は、Ｔｉプラスミドの既存
の小片をシャトルベクターのＴ−ＤＮＡ小片で置換させ
るような二重相同組み換え（ホモ部分二倍体化）現象の
選択を許す条件下でできれば増殖させる。しかし２本発
明は二元目的結合体のＴ−ＤＮＡへの導入が二重相同組
み換え機構に限定されないことに注意すべきである；シ
ャトルベクター（恐ら＜Ｔ−ＤＮＡと相同性の唯一の連
続した領域を有する）と単一部位での単−相同組み換え
（共同組み込み）。

あるいはプロモーター領域／構造遺転子保有細菌トラン
スポゾンの挿入もまたこの結合体のＴ−ＤＮＡへの挿入
に有効な手段である。

ちょうどここで述べた方針に従い、修飾Ｔ−ＤＮＡを当
該分野の何らかの技術により植物細胞へ移すことができ
る。例えばこの転移はＴ−ＤＮＡ内に組み込まれた外来
構造遺伝子を有する新規アグロバクテリウム株での植物
の直接感染、あるいは植物細胞とこのアグロバクテリウ
ム株との共存培養のどちらかにより、最も容易に達成さ
れる。

前者の技術、直接感染、は感染部位に腫瘍体またはクラ
ウンゴールの出現をもたらす。クラウンゴール細胞は次
いで培養で増殖させることができ。

そして当業者に既知の適切な環境下で挿入Ｔ−ＤＮＡ小
片を含む完全植物体へ再生できる。共存培養の技術によ
り、植物細胞のある部分は形質転換される。すなわち転
移したＴ−ＤＮＡを有し、植物細胞ゲノムに挿入される
。どちらの場合も、形質転換細胞は非形質転換細胞と選
別、または区別されねばならない。選別はＴｘＣ８／外
来構造遺伝子に加えてＴ−ＤＮＡに取り込まれた選択マ
ーカーを用意することにより最も容易に達成される。

公表されたマーカーの例として、メトトレキセート−耐
性ジハイドロフォレートリダクターゼまたはツバリンシ
ンターゼのプロモーターの支配下で発現するネオマイシ
ンフォスフオドランスフェラーゼＵ　（ＮＰＴＩＩ）が
ある。これらのマーカーはそれぞれメトトレキセートま
たはカナマイシンあるいはそのアナログ含有培地での増
殖により選別される。重金属イオンの毒性効果はメタロ
チオネインの存在により軽減され得る。事実１本発明は
形質転換植物組織の選択に適した選択マーカー。

１４５０ｂＴｘＰＲ／　Ｎ　Ｐ　Ｔ　Ｉ［構造遺伝子結
合体、の作成について例を示した。さらにＴ−ＤＮＡは
、培養でＴｉ−誘導腫瘍のホルモン非依存増殖を制御す
る遺伝子、　Ｒｉ−誘導腫瘍根の異常な形態を制御する
遺伝子、およびアミノ酸アナログのような有毒物質に対
する耐性を制御する遺伝子、そのような耐性はオピン合
成酵素（例えば匹し）により与えられるが、のような内
在マーカーを保有する。当業者に熟知の選択法にはオビ
ン生産の分析、特徴的な核酸配列に対する特異的ハイブ
リダイゼーション、あるいはＥＬＩＳＡ（″エンザイム
リンクドイムノソーバン１〜　アッセイ”の略）、ラジ
オイムノアッセイ、および“ウェスタン”プロットなど
を含む特異蛋白質の免疫的分析などがあるが。

これに限らない。さらに発現外来遺伝子の表現型も形質
転換組織の同定に用いることができる（例えば抗生物質
耐性またはバチルス・チューリンゲンシス結晶蛋白質の
殺虫能）。

（以下余白） シャトルベクター戦術の別法に二元目的結合体が挿入さ
れるＴ−ＤＮＡまたは修飾Ｔ−ＤＮＡを含み、アグロバ
クテリウム株で独立に複製できるプラスミドの利用があ
る。背景で述べた最近の証拠は、アグロバクテリウム株
はＴ−ＤＮＡの植物細胞への転移を促進する機能がある
。あるトランスに作用する遺伝子を含み、そのようなプ
ラスミドをアグロバクテリウム株から植物細胞へ移し得
ることを示した。Ｔ−ＤＮＡを含み、アグロバクテリウ
ム株の中で独立に複製できるプラスミドを。

ここで“サブ−ＴＩＰ″またはサブ−Ｔｉプラスミドと
呼ぶ。サブーＴＩＰプラスミドはそれが含有するＴ−Ｄ
ＮＡの量に差があるという変動は存在する。この変動の
一方の極端はＴＩＰプラスミドからのＴ−ＤＮＡのすべ
てを残しているもので。

時々“ミニ−Ｔ■Ｐ”またはミニ−Ｔｉプラスミドと呼
ばれる。もう一方の極端は、Ｔ−ＤＮＡ境界付近のＤＮ
ＡＮ思量のすべてが欠失し、残存部分はサブーＴＩＰプ
ラスミドが宿主細胞へ移り、取り込まれるのに必要最小
である。ものである。このようなプラスミドを“ミクロ
−ＴＩＰ″またはミクロ−Ｔｉと呼ぶ。サブーＴＩＰプ
ラスミドはそれが小さく直接操作が比較的容易であり、
相同組み換えによりシャトルベクターからＴ−ＤＮＡへ
遺伝子と移す必要性がないという利点がある。望みの構
造遺伝子を挿入した後、Ｔ−ＤＮＡの転移を促進するト
ランスに作用するｖｉｒ遺伝子を含む植物細胞へ容易に
直接導入ができる。アグロバクテリウム株への導入は、
当業者に熟知の技術、すなわちアグロバクテリウム株の
形質転換または供与細菌細胞からの接合伝達のいずれか
により容易に達成される。新規ＤＮＡ配列の植物ゲノム
への導入の目的のために、ＴＩＰプラスミドおよびサブ
−Ｔ、Ｉ　Ｐプラスミドは機能的に等価であると見なさ
れるべきである。実施例６は一般にＴＲに基づく、サブ
ーＴＩＰプラスミドを開示し、そしてさらに詳細な考察
を行う。

本発明の望ましい具体化は二元目的プロモーター領域／
外来構造遺伝子結合体を、形質転換されるべき植物のゲ
ノムへの導入のためのＴ−ＤＮＡに基づくアグロバクテ
リウム仲介系にあるが、この結合体の転移と組み込みの
ための他の手段もまた本発明の展望に含まれる。二元目
的結合体の植物ゲノムへの安定な組み込みのための別の
手段には、さらに、ウィルスゲノム、ミニクロモシーム
。

トランスポゾンおよび植物染色体への相同あるいは非相
同組み換えに基づくベクターの利用があるが、これに限
らない。植物細胞へのこれらベクターの導入の別の方式
に、ベクター含有リポゾームあるいは細菌スフェロプラ
ストとの融合、顕微注射、ウィルスコート蛋白質への封
入とそれに続く感染に慎た過程、および電気パルス、レ
ーザー。

あるいは化学剤による原形質膜透過性の誘導後のＤＮＡ
の直接取込みがあり、またこれに限らない。

移行取込みおよび／または発現の手段もまた本発明の展
望に含まれる。アグロバクテリウム細胞およびＴＩＰに
基づく系は細菌から植物細胞へのＤＮＡの転移により双
子葉植物を形質転換するのに用い得る；他のベクターに
基づく系、あるいはベクター伝達手段が単子葉および双
子葉植物を含むすべての裸子植物およびすべての被子植
物の形質転換に使用し得る。

形質転換細胞および組織の再生は既知技術により達成さ
れる。再生段階の目的は正常に、しかし組み込まれたＴ
−ＤＮＡを保持して２発育、増殖する完全植物体を得る
ことである。再生の技術は当該分野の原理に従い、Ｔ−
ＤＮＡの起源、修飾の性質および形質転換された植物種
によりある程度変わる。Ｒｉ型Ｔ−ＤＮＡにより形質転
換された植物細胞は当業者に熟知の技術により、余分の
実験なしに容易に再生され得る。Ｔｉ型Ｔ−ＤＮＡによ
り形質転換された植物細胞は、ある場合には。

培養のホルモン準位を適当に操作することにより再生さ
れ得る。しかし、望ましくは、　Ｔｉ−形質転換組織は
、もしＴ−ＤＮＡがｔｍｒおよび展遺転子の一方または
両方に変異を受けていれば、最も容易に再生される。こ
れら遺伝子の不活化は形質転換組織のホルモンバランス
を正常に向け、培養での組織のホルモン準位を極めて容
易に操作できるようにするため、その、より正常なホル
モン生理のゆえに容易に再生する植物となる。もしｔｍ
ｒおよび展での変異がシャトルベクターを用いた二重相
同組み換えによりＴ−ＤＮＡに導入されるならば、その
変異の導入は二元目的プロモーター領域／構造遺伝子結
合体の導入とは別の様式で選択されねばならないことに
注意するのは重要である。例えば、前者の例においては
ｔｍｒおよび展不活化をクロラムフェニコール耐性によ
り選択するが、一方プロモーター領域／外来遺伝子選択
はカナマイシン耐性で行われる。展およびｔｍｒ部位の
不活化は、これら遺伝子のコード領域あるいはプロモー
ター内の１つまたはそれ以上の塩基の挿入、欠失、また
は置換、すなわちプロモーターの不活性化あるいは蛋白
質の構造の破壊を計る変異、により達成されるだろう。

（適当な変異の作成はＴ、　Ｃ，Ｈａｌｌ　ｅｔ　ａｔ
、、　ＩＩｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｓｅｒ。

ｎｏｓ、　４８５，６１３　ａｎｄ　４８５，６１４お
よび背景で挙げた文献に例が述べられている。）ある例
では、腫瘍細胞は組み込まれたＴ−ＤＮＡを有し、ツバ
リンシンターゼのようなＴ−ＤＮＡ遺伝子を発現する。

そしてそれはさらに挿入された植物構造遺伝子を発現す
る。シュートを再生することができる。このシュートは
根を有する植物に継ぎ木することにより栄養細胞で維持
でき、そして稔性花を生ずることができる。このシュー
トはこのようにしてＴ−ＤＮＡを有し、そこに挿入され
た外来構造遺伝子を発現する正常な子孫植物のための親
植物材料を提供する。

形質転換される植物組織の遺伝子型は、その細胞がイン
ビトロ培養で発育再生でき、用いる選択剤に感受性であ
るように、容易にするためにしばしば選ばれる。農業的
に興味のある栽培物はこの操作には不適であり、もっと
やりやすい変種が最初に形質転換される。再生後、新し
く導入された二元目的プロモーター領域／外来構造遺伝
子結合体および何らかの連接したおよび／あるいは共同
転移したＤＮＡは容易に望まれる農業栽培物へ。

植物育種および植物遺伝学の当業者に熟知の技術により
、移される。農業栽培物と形質転換植物の有性交配によ
り最初の雑種ができる。これら雑種は次いで望ましい遺
伝的背景をもつ植物と戻し交配される。子孫は常に、挿
入外来ＤＮＡの連続した存在、あるいは挿入外来ＤＮＡ
によりもたらされる遺伝子の発現の結果としての新しい
表現型について９選択および／または選別を行われる。

このようにして、多数回の戻し交配と選別の後に。

農業的に望ましい親と本質的に同じ遺伝子型を持ち、挿
入外来ＤＮＡ配列を併せ持った植物がつくり出され得る
。

大血斑 次に述べる実施例は、ＴＩＰとアグロバクテリウムの分
子生物学および操作に習熟した当業者にとって、よ（知
られた。そして行い易い技術の多くを利用している；こ
れらの方法は、ここで詳述されていない場合は、引用さ
れた参考資料の１つまたはそれ以上のものに詳述されて
いる。酵素は市販品を購入し、販売者の勧める方法また
は当該分野の他の変法により用いられる。試薬、緩衝液
および培養条件も、当業者に知られている。そのような
標準的技術を含む参考資料には１次に述べるものが含ま
れる：　Ｒ，Ｗｕ、　ｍ　（１９７９）　Ｍｅｔｈ。

Ｕｎｚｙｍｏｌ、　６Ｂ　、　Ｒ，Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ、
編（１９８３）　Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１００および１０１．　Ｌ、　Ｇｒ
ｏｓｓｍａｎおよびＫ。

Ｍｏ１ｄａｖｅ、編（１９８０）　ＭｅｔＪ＋、　Ｆｉ
ｎｚｙｍｏｌ−６５，Ｊ、　Ｈ。

Ｍｉｌｌｅｒ（１９７２）　Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔｓ　
ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＋Ｒ，Ｄ
ａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８０）＾ｄｖａｎｃｅｄ
　ＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ＋　Ｒ，Ｆ、　
５ｃｈｌｅｉｆおよびＰ、　Ｃ，Ｗｅｎｓｉｎｋ（１９
８２）　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ　＋およびＴ、　Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９Ｂ２）　Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣＩｏｎｉｎｇ　ｏそれに加えて、　Ｒ，Ｆ
、　Ｌａｔｈｅ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８３）　Ｇｅｎｅｔ、Ｅｎｇｉｎ、４　：　１−
５６＋はＤＮＡ操作についての有用な説明をしている。

単離されている制限エンドヌクレアーゼという名称につ
いての本文での使用１例えば“Ｂｃｌｌ”。

は１図表中におけるその酵素の作用を受けやすい配列部
位１例えば制限部位、を表す場合以外は。

酵素反応におけるその酵素の使用を表す。本文では、制
限部位は“部位”という用語２例えばＢｃｌ　１部位”
という用語の付加的な使用により表示される。“断片”
という言葉の付加的な使用１例えば“Ｂｃｌ　Ｉ断片”
、はその命名酵素の作用により生成した末端を保持する
直線二本鎖ＤＮＡ分子を表す（例えば制限断片）。“Ｂ
ｃｌｌ／Ｓｎｉ虹Ｉ断片”のような語句は、２つの異な
る酵素、ここではＢｃｌ　ＩおよびＳｍａｌ、の作用に
より、制限断片が生成したことを示し、それは、２つの
異なった酵素の作用の結果生成した２つの末端を有する
。その末端は、“粘着性で”あること（すなわち、相補
的な一本積オリゴヌクレオチドと対合することのできる
。一本積の突起を持つこと）もしくは“平滑で”あるこ
との特徴を有すること、および粘着性末端の特異性は、
それを生成する酵素の特異性により決定されること、に
留意しておく。

プラスミド、および唯一プラスミドのみが２例えばｐＴ
ｉ１５９５５またはｐＵｃ１３のように“ｐ”の頭文字
が付けられ１株の名称は９例えばアグロバクテリウム・
チューメファシエンス（ｐＴｉ１５９５５　）またはエ
セリシア・コリーＪＭ８３　（ｐＵｃ１３）のように、
括弧を付けてプラスミドがそれに保持されていることを
示す。

次に示す株は寄託されている： エセリシア・コリーに１２　ＲＲＩ　（ｐＲＫ２９０Ｋ
ａｎ−１）ＮＲＲＬ　Ｂ−１５７３６ エセリシア・コリーＣ６００（ｐＫＳ４）ＮＲＲＬ　Ｂ
−１５３９４ エセリシア・コリーＩＩＢＩＯＩ　（ｐＰＶＬ１３４）
ＡＴＣＣ３９１８１ 他のプラスミドおよび株は当業者に広く利用でき、そし
て入手し易い。

（以下余白） 去１Ｉ１１ この実施例は、　１４５０塩基転写物（１４５０ｂＴｘ
’　）の位置を決定する転写マツピング実験の結果を発
表。

討論し、そしてまた前記の結果を得るため用いられた方
法を教示する。これらの実験結果は１本質的にはＳ、　
Ｊ、　Ｋａｒｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）　
Ｍｏ１ｅｃ、　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、　、から抜粋され、そしてここでは本発明
を理解するのに必要な背景として含まれる。

１．１椿果 第１図は、植物ＤＮＡ　（Ｔ−ＤＮＡ）中に安定して組
み込まれるＴｉプラスミドの領域を示すｐＴｉＡ６の部
分の制限エンドヌクレアーゼ地図を示す。

ハＬ旧断片２の副断片（第２図の地図を参照）はプラス
ミドｐＢＲ３２５，ｐＭＫ２００４．もしくはｐＵｃ１
３中にクローン化され、Ｔ−ＤＮＡのＴＲ領域にコード
されていて、植物腫瘍中で転写されるＲＮＡの局在化の
ためのハイブリダイゼーション試料として用いられた。

Ｅ９懸濁腫瘍細胞系列、すなわち当業者によく知られた
アグロバクテリウム・チューメファシエンス（ｐＴｉＢ
ＪＯ６）（Ｍ、　Ｆ、　Ｔｈｏｍａｓｈｏｉｙ　ｅｔ　
ａｌ。

（１９８０）　Ｃｅ１ｌ　１９　：　７２９−７３９　
）により刺激されたニコチアナ・タバカム系列、より分
離された全細胞ＲＮＡもしくはポリＡ″ＲＮＡのノーザ
ンブロソト分析により、試料す、ｃおよびｄｌにハイブ
リダイズする。約１４５０塩基の大きさのＲＮＡが発見
された。このＲＮＡは試料ｂ４及びｂ３にも低い程度に
ハイブリダイズしているようである（第２図）。

１４５０ｂＴｘの境界および方向性をより正確に決定す
るために８１ヌクレアーゼマツピング実験が行われた。

Ｓ１ヌクレアーゼ保護実験の試料として用いられた断片
は、−重鎖バクテリオファージＭ１３由来のハククー中
に両方向でクローン化された。

（実施例１．３ｂを参照）このようなＭ１３由来の一本
鎖ＤＮＡを使用することは＋ＳＩ　ヌクレアーゼ分析の
試料としては、二本鎖ＤＮＡを使用するよりも有効であ
った。ＤＮＡとＲＮＡのハイブリダイゼーションは、６
５℃で、水溶液中において、比較的短時間で実施可能で
あった。それに加えて。

Ｍ２ＳでのクローニングではＤＮＡの側鎖は分離される
ので＋Ｓｌヌクレアーゼ分解からのＲＮＡによる保護に
ついて、各々の鎖は別々に試験することが可能であった
。どちらのクローン化ＤＮＡ鎖が保護されているのかと
いうこと、およびＭ２Ｓの多様性クローニング部位中に
クローン化した挿入物の方向性を決定することにより、
ＲＮＡの転写の方向性を推論することが可能であった。

与えられた領域の側鎖が保護されたので１両方向での転
写が示された。

Ｅ９全細胞ＲＮＡを用いたこのような分析の結果が第２
図に示される。ｄ、＋ｄ２を３１ヌクレアーゼ保護試料
として用いることにより、１４５０ｂＴｘがＣおよびｄ
ｌの間のＢｉｎ　ｄ　ｍの右側の約２４０ｂｐより始ま
ることが決定された。Ｃおよびす、の両断片は、この転
写物によりＳＩヌクレアーゼ分解から完全に保護されて
いた。ｂ５がＳＩヌクレアーゼ保護試料として用いられ
た場合に、約２８０　ｂｐの断片が回収された。ｂ４＋
ｂ５が用いられた場合には、約２０ｂｐ以上の断片が８
１ヌクレア一ゼ分解から保護された。このデータから、
　１４５０ｂＴｘは。

ｂ４とす、の間のＣ１ａ　Ｉ部位のちょうど左側のｂ４
で終結することが示された。

１．２考察・ ノーザンブロソティングおよびＳ１ヌクレア一ゼ分析を
用いることにより、オクトピン型クラウンゴール腫瘍由
来のＴ−ＤＮＡのＴＲ領域によりコードされた五つの転
写物が局在化された。ポリアデニル化されたＲＮＡは宿
主植物プロモーターからではなく、Ｔ−ＤＮＡ内部のプ
ロモーターより転写された。ノーザンプロット分析によ
り、−Ｅ９腫瘍系列においては、　１４５０ｂＴｘを含
むＴ、にコードされた最も多量の転写物は、ＴＬにより
コードされた転写物よりも相当多かった。それゆえＴＲ
は植物遺伝子工学実験での利用において興味が持たれる
。というのは、それは強力なプロモーターを含み、それ
でいて直接には腫瘍化に含まれていないからである。

これらのＲＮＡの転写方向の決定、および５゛および３
”末端の局在化を、プロッティング実験よりももっと正
確に行えるように＋ＳＩ　ヌクレアーゼマツピング操作
が用いられた。Ｓ１ヌクレアーゼ保護データから、　１
４５０塩基ＲＮＡをコードする遺伝子は検出可能の介在
配列を一つも含まないことが示された。ノーザンブロッ
ティング分析により決定された転写の大きさは＋Ｓｌ　
ヌクレアーゼ分析により示された大きさよりも大きかっ
た。大きさにおけるこの違いは、転写後のポリ　（Ａ）
配列の付加により容易に説明される。

ノーザンブロソトおよびＳ、ヌクレアーゼ保護のデータ
は、他の人たちにより推論されたこの領域のＤＮＡ配列
のデータ（Ｒ，Ｆ、　Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８３）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、
　２　：　３３５−３５０．　Ｒ，Ｆ。

Ｂａｒｋｅｒ　およびＪ、Ｄ、［ｅｍｐ、ＬＩＳ　Ｐａ
ｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｅｒ、　ｎｏ、５
５３．７８６　）とよく一致した。上記の転写マツピン
グ実験により予想された方向性および長さを持つオープ
ンリーディングフレーム（その中に０ＲＦ２４が存在）
が一つ存在した。それに加えて１４５０ｂＴｘＰＲ中に
、真核生物の転写の促進に関係しているＴ　Ａ　Ｔ　Ａ
　Ａもしくはゴールドバーグーホグネス　ボックス（Ｇ
ｏｌｄｂｅｒｇ−Ｈｏｇｎｅｓｓ　ｂｏｘ）　（Ｊ、　
Ｅ。

Ｄａｒｎｅｌｌ　（１９８２）　Ｎａｔｕｒｅ　２９７
　：　３６５−３７１　）に類似した配列が存在した。

ＴＡＴＡＡボックスは正確なインビトロ転写に必要であ
ることが示されてし）る（Ｂ、　Ｗａｓｙｌｙｋ　ｅｔ
　ａｌ、　（１９８０）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃ
ａｄ。

Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ７７　：　７０２４−７０２８　）
が、ＴＡＴＡＡの上流の配列はインビボでの有効な転写
に必要であることが知られている。ＣＣＡＡＴという配
列はＴＡ’ＦＡ　Ａ　ホソ’）　ス（Ｄ上流によ（見ら
れ（Ｃ，Ｂｅｎｏｉｓｔｅｔ　ａｌ、（１９８０）　Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、８　：　１２７−
１４２゜八、Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ　ｅｔ　ａｌ、
（１９８０）　Ｃｅ１１２１　：　６５３−６６８゜Ｔ
、　５ｈｅｎｋ　（１９８１）　Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐｉ
ｃｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

９３　：　２５−４６　）　、　１４５０ｂＴｘＰＩｌ
中に類似配列が存在した。転写物の３°末端付近には、
多くのｍＲＮＡの３゛末端の適当な決定に必要な配列信
号である（Ｎ。

Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ　（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３
０７　：　４１２−４１３　）　、　ＡΔＴＡＡＡとい
うヘキサヌクレオチドに三つの類似した配列が存在する
。

クラウンゴール腫瘍系列は、１．０％ファイトアガー（
Ｍ、　Ｆ、　Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ　ｅｔ　ａｌ、　（１
９８０）　Ｃｅ１ｌ　１９　ニア２９−７３９　）を加
えない（）諒濁培養用）または加えた（カルス培養用）
　ＭＳ３培地上で、光の連続照射下で２５℃で培養され
た。対照として用いられた非腫瘍性タバコ系列であるＸ
ＳＲは、１．０■／ｐのナフタレン酢酸および０．１■
／ｌのヘンシルアミノプリンを補足したＭＳ３培地で培
養した。

組み換えプラスミドを保持するエセリシア・コリー株は
０．２％のカザミノ酸を補足したし液体培地で培養され
た。用いられた抗生物質濃度は、エセリシア・コリーに
対しては：アンビシリン、５０−１００８ｇ　／　ｍβ
；テトラサイクリン、１０　μｇ／ｍｚ；カナマイシン
、２０μｇ／ｍ＃；およびアグロバクテリウム°チュー
メファシエンスに対しては：カルペニシリン、１００μ
ｇ／ｎｕ；テトラサイクリン５、ｕｇ／ｎｕ；カナマイ
シン、１００μｇ　／　ｍ（１；リファンピシン、１０
μｇ／ｎｕ；ゲンタマイシン。

１００　ｐｇ　／　ｍＣであった。

１．３ｂ　組み換えＤＮＡプラスミドおよびＭ１３の構
乗 Ｂａｍ旧断片２（第１図）は９通常の当業者に知られた
標準的操作によりアグロバクテリウム・チューメファシ
エンス　プラスミドｐＴｉＢ、８０６　（Ａ２７７株中
で培養）からｐＢＲ３２２中へクローン化された。

ハｍ１ｌｌ断片２の副断片は、　ｐＢＲ３２５，ｐＨに
２００４．もしくはｐＵｃ１３　（各々Ｆ、　Ｂｏｌｉ
ｖａｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９７７）　Ｇｅｎｅ２　：　
９５−１１３．　Ｍ、　Ｋａｈｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１
９７９）　Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、６８　：　２６８−２８０．およびＪ
、　Ｍｅｓｓｉｎｇ　（１９８３）Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ、　１０１　：　２０−７８　）にクローン化
された。制限エンドヌクレアーゼ反応のすべては、供給
元（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ　（ＢＲＬ　）　＋Ｐ、Ｌ、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ＋　もしくはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ　）の示唆の通りに実施された。Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼはＢＲＬより購入した。組み換えプラスミ
ドは、クリアート・ライゼート操作（Ｄ、Ｇ、　Ｂｌａ
ｉｒｅｔ　ａｌ、　（１９７２）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪｓＡ　６９　：２５
１Ｂ−２５２２）もしくはアルカリ溶菌操作（Ｎ、　Ｃ
。

ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＪ、　Ｄｏｌｙ　（１９７９）
　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ１ンｅｓ、λ：　１５１
３−１５２３）を用いてエセリシア・コリーから分離さ
れた。

Ｓ１ヌクレア一ゼ保護反応に用いられたＢａｍ　ＨＩ断
片２の領域は、当業者によく知られている技術により、
複製可能な型のＤＮＡであるＭ１３ｍｐ８およびＭ１３
ｍｐ９　（Ｎ、　Ｊｏｎｅｓ博士から入手）、もしくは
Ｍ１３ｍｐｌＯおよびＭ１３ｍｐＨ（Ｐ、　Ｌ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓにより供給）中へ両方向において
クローン化された。

腫瘍ＲＮＡは、フェノール抽出後に１．５倍量の冷蔵し
た１００％エタノールを加え、１５分氷上で定温に保つ
ことにより多糖類を沈澱させたこと以外は、以前に記述
された（Ｓ、　Ｂ、　Ｇｅ１ｖｉｎ　ｅｔ　ａｌ、（１
９８１）　Ｐｌａｓｍｉｄβ−：　１７−２９　）通り
に分離された。

１０．０００Ｘｇ　、　１０分間の遠心分離の後、ＲＮ
Ａを沈澱させるために上澄みに２倍量の１００％エタノ
ールを加えた。

変性ホルムアルデヒドゲルによるアガロースゲル電気泳
動、ニトロセルロース上でのプロッティング、およびハ
イブリダイゼーションは記述された通りであり（Ｇｅｌ
ｖｉｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８１）前出）。

変更された所は次の通りであったニゲルは２％アガロー
ス含有、洗浄液はＩ　Ｘ５ＳＣ（０，１５Ｍ塩化ナトリ
ウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）　、０．１％
ＳＤＳ。

および１０ｍＭＮａｚ　ＥＤＴＡ含有であった。二・ツ
ク・トランスレーションは＋　Ａｍｅｒｓｈａｍのニッ
ク・トランスレーション・キットを用いて実施された。

１．３ｄ　Ｅ９腫しＲＮＡのヌクレアーゼ　云、８組み
換えＡ１３−重鎖ＤＮＡおよびＥ９懸濁ＲＮＡの間のハ
イブリダイゼーションは５　ｘＳＳＣ２Ｏ−３０ｐ　Ｉ
ｔ　、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，４）中で
６５°Ｃにおいて実施された。典型的に、　５００ｎＨ
の組み換えファージＤＮＡが、　Ｈｇ懸濁培養液から分
離された全ＲＮＡ２０１１ｇとハイブリダイズした。５
時間後に冷蔵Ｓ１ヌクレア一ゼ分解用緩衝液（２８０ｍ
Ｍ塩化ナトリウム、　５０ｍＭ酢酸ナトリウム、　４．
５ｍＭ硫酸亜鉛。

２０ｐｇ／１１１７！変性子牛胸腺ＤＮＡ、　ｐＨ４，
６）で全、、、７ｆｆｉを１５０μｌにし、１００単位
のＳ＋　ヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ　）を加えた。この
試料は３７℃で４５分間保温された。５０μβの冷蔵Ｓ
１終結混合液（２，５Ｍ酢酸ナトリウム、５０ｍＭＮａ
ｚ　ＥＤＴＡ）を加え、保護された断片は２０ｐｇの酵
母ｔＲＮＡおよび２．５倍量の１００％エタノールの添
加により沈澱させた。

−２０℃の保温の後、沈澱を集め、２０μｌのアルカリ
緩衝液（３０ｍＭ水酸化ナトリウム、’　２ｍＭＮａｚ
　ＥＤＴＡ）に溶解し、そして断片を１．２％もしくは
２．０％のアルカリアガロースゲルの電気泳動（Ｍ、Ｗ
、　ＭｃＤｏｎｎｅｌｌｅｔ　ａｌ、　（１９７７）　
Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、旦０　：　１１９−１４６
　’）にかげた。ＤＮＡのニトロセルロースへの移動。

プロットのハイブリダイゼーションおよび洗浄は。

試料の濃度は通常５０ｎｇ／　ｍｉｌ以下で、プロット
は慣例的に０．３　Ｘ５ＳＣで５時間洗うだけであった
以外は、以前に記述された通り（Ｍ、　Ｆ、　Ｔｈｏｍ
ａｓｈｏｗｅｔ　ａｌ、（１９８０）前出）であった。

大旌炭ｌ この実施例は、　ｐＴｉＡ６およびｐＴｉ１５９５５の
ようなオクトピン型プラスミドのＴ＋ｔへのホモ部分二
倍体化に適した１４５０ｂＴｘＰＲプロモーターの媒介
物の構築を教示する。

２．１　ＴＲのクローニング ｐＢＲ３２２のハＬ旧部位中のｐＴｉＡ６のＴ−ＤＮＡ
のＢａｍ旧断片２の組み換えＤＮＡクローンを、　Ｅｃ
ｏ　ＲＩにより完全分解した（ＡＴＣＣ１５９５５より
分離されたｐＴｉ１５９５５と高い相同性のあるｐＴｉ
Ａ６はアグロバクテリウム・チューメファシェンスＡ６
ＮＣより分離される）。５．４キロベースペア（Ｋｂｐ
　）のＤＮＡ断片、　Ｅｃｏ　Ｒ１１３を含む分解混合
物を、　Ｅｃｏ　Ｒ１により直線化されたｐＲＫ２９０
ＤＮＡ　（Ｇ、　Ｄｉｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、（１９８０
）　Ｐｒｏｃ、’Ｎａｔ１．　八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩ
Ｓ＾　７７　ニア３４７−７３５７）と混合および連結
し、そしてその混合物をエセリシア・コリーに１２ＰＲ
１中へ形質転換した。プラスミドＤＮＡをテトラサイク
リン耐性の形質転換体より分離し、　ｐＲＫ２９０Ｅｃ
ｏ１３と名付けた。　Ｅｃｏ　Ｒ１１３Ｔ　−Ｄ　Ｎ　
Ａ断片を含むプラスミドを保持するコロニーを制限酵素
分析により同定した。

２．２　１４５０ｂＴｘ　ｌ造遺転子の欠ｐＲＫ２９０
Ｅｃｏ１３　Ｄ　Ｎ　Ａを、　Ｃ１ａ　Ｉにより完全分
離し、再結合し、そしてＰＨ１中へ形質転換した。テト
ラサイクリン耐性形質転換体から分離されたプラスミド
Ｉ）ＮＡを制限分析により特徴づけ、そしてｐＲＫ２９
０Ｅｃｏ１３ΔＣ１ａと名付けられたプラスミドを保持
するコロニーが同定され、それは第２図のｂｓ、ｃおよ
びｄ、断片を包含する旦ａｌ断片を欠失していた。外来
構造遺伝子は、　１４５０ｂＴｘプロモーター領域の後
方にある。　ｐＲＫ２９０Ｅｃｏ１３ΔＣ１ａの唯一の
Ｃ１ａ　１部位に容易に挿入することができる（第３図
）。Ｃ１ａ　Ｉ断片の欠失により、　１４５０ｂＴｘの
３゛側の最初のポリアデニル化部位が取り除かれた；し
かじ、他の二つのポリアデニル化部位の配列は、残って
い条唯−のＣ１ａ　１部位の下流に保有されている。

（以下余白） ２．３　Ｃ１ａ　１都立の他の制限自立による（月次に
示すことは、　ｐＲＫ２９０Ｅｃｏ１３ΔＣ１ａの唯一
のＣ１ａ　１部位のｌ１ｉｎｄ　Ｉ１１部位による代用
を記述している。ｐＲＫ２９０［１ｃｏＬ３ΔＣ］ａＤ
ＮＡを分離し、そしテＣ１ａｌにより完全分解する。そ
の結果生じる以堕−１の粘着性末端を、　Ｅ、　Ｃｏ１
１　ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を加えて保温
することにより埋め、そして 」圏ｄｕｌ＋ ５’　ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧ３’ ３’　ＧＧＴＴＣＧＡＡＣＣ５’ という構造を持つ二本鎖リンカ−を、すでに平滑末端化
された旦ａ１部位中に、平滑末端間結合する。その結果
生じた混合物をｌ１ｉｎｄ’　ｍで完全分解し、再結合
し、そしてＰＨ１中へ形質転換する。テトラサイクリン
耐性形質転換体から分離されたプラスミドＤＮＡを、欠
失した１４５０ｂＴｘ構造遺伝子の場所におけるＣ１ａ
　１部位の欠如およびＨｉｎｄ　Ｉ１１部位の存在によ
る制限分析によって選択し、そのようなプラスミドをｐ
ＲＫ２９０Ｅｃｏ１３ΔＣ１ａ旧ｎｄと名付ける。

当業者には明らかになるだろうが、　Ｃ１ａ　１部位を
Ｈｉｎｄ　ｍ以外の制限酵素の所望の特異的配列に変え
ることにより、上記のリンカ−を他のリンカ−で代用す
ることができる。例えば。

則り一■ ５’　ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ３” ３’　ＧＧＣＣＴＡＧＧＣＣ５’ という配列を持つＢａｍ旧リンカ−（ＢＲＬがら入手）
でＨｉｎｄ　Ｉ［［リンカ−を代用し、他は本質的に上
記通りの実験手順中に組み込まれた。ここではｐＲＫ２
９０Ｅｃｏ１３ΔＣ１ａＢａｍと名付けられた。欠失し
た１４５０ｂＴｘ構造遺伝子の場所に展旧部位を持つプ
ラスミドを保持するＢＲＬ株が同定された。

大族廻主 この実施例は、第３図に示されているように。

抗生物質であるカナマイシンおよびそのアナログ物質２
例えばネオマイシンおよびＧ４１８に対する。

植物と細菌の両方で耐性を賦与する選択可能マーカーの
構築を教示する。

３．１　ｋａｎ　゛　云　のし′１ ネオマイシン　フォスフオドランスフェラーゼ■いう酵
素をコードする細菌のトランスポゾンＴ。

由来のカナマイシン耐性（ｋａｎ　）遺伝子は、そのＤ
ＮＡ配列はＥ、　Ｂｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２
）　Ｇｅｎｅ　１９　：３２７−３３６により報告され
たが、プラスミドｐＫＳ４上に存在し、それはエセリシ
ア・コリー（ｐＫＳ４）ＮＩン［ＩＬ　Ｂ−１５３９４
より分離される。ｐＫＳ４　Ｄ　Ｎ　Ａを１１工■およ
びＳｍａ　Ｉにより完全分解し、その結果生しる１キロ
ベースペアの、ＮＰＴＩＩ含有の断片を、すでにＳｍａ
　ＩとＢａｍ　ＩＩＩにより分解されたｐＵｃ１３と混
合および結合した。Ｂａｍ　ＩＩＩおよび監し■の粘着
性末端は同じ特異的配列（５’ＧＡＴＣ，、、３’）を
持ち、そして両方を容易に結合できるが、しかしその結
果生じるＢａｍ旧／Ｂｇｌ　ＩＩの縫合部位、すなわち
５’、、、ＧＧＡＴＣＴ、、、３’ ３’、、、ＣＣＴＡＧＡ、、、５’ はどちらの酵素の作用も受けない。結合混合物をエセリ
シア・コリーに１２　ＪＭ８３に形質転換しくＪ。

Ｍｅｓｓｉｎｇ　（１９７９）　Ｒｅｃｏｍｂ、　ＤＮ
Ａ　Ｔｅｃｈ、　Ｂｕｌｌ。

２　（２１：　４３−４８．ＮＩ）Ｉ　Ｐｕｂｌ、　Ｎ
ｏ、　７９−９９　）　、そして白色を呈するコロニー
を選別した。プラスミドＤＮＡを１選別された形質転換
体から分離し、そして制限部位マツピングによる特徴づ
けを行った。

ｐＵｃ１３ＫａｎＢｇｌ　／　Ｓｍａと名付けられたプ
ラスミドを含むコロニーが同定された。

ｐＵｃ１３ＫａｎＢｇｌ　／　Ｓｍａのｋａｎ遺伝子含
有断片は。

■Ｌ構造遺伝子に対して、ハＬ旧／Ｂｇｌ　ＩＩ縫合部
位のすぐ上流のｐＨｃ１３のポリリンカー（ポリリンカ
ーとは、いくつかの制限酵素の作用を受ける部位を含む
、短い配列のことである）中にＡｃｃユ■部位を持って
いる。ｋａｎ遺伝子は、　Ｓｍａ　’ＩおよびＡｃｃ　
ＩによるＩＫｂｐＤ　Ｎ　Ａ断片における分解により。

ｐＵｃ１３ＫａｎＢｇｌ　／　Ｓｍａより取り除かれる
。特にこのＡｃｃ　Ｉ切断部位は、５”ＣＧ、、、　３
°という粘着性末端を持ち、これは酵素Ｃ１ａ　Ｉによ
り生成した末端と容易に結合しうる。

３．２　１４５０ｂＴｘ　ＰＲプロモーターの後ろへの
ｋａｎの挿入 ｐＵｃ１３ＫａｎＢｇｌ　／　ＳｍａおよびｐＲＫ２９
０Ｅｃｏ１３ΔＣ１ａを、各々Ａｃｃ　ＩおよびＣ１ａ
　Ｉを用いた完全分解により直線状にし、互いに混合、
結合し、そしてＥ、Ｃｏ１１　ＲＲＩへ形質転換した。

アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性（各々ｐＵｃ
１３およびｐＲＫ２９０の配列を選別する）の形質転換
体から分離されたプラスミドＤＮＡは制限酵素分析によ
り特徴づけがなされた。ｐＲＫ２９０Ｋａｎ−１と名付
けられた。プラスミドを含むコロニーが同定され、その
プラスミドは、　１４５０ｂＴｘプロモーターの後ろに
、以前そこにあった１４５０ｂＴｘのコード配列と同じ
方向性および位置に挿入されたｋａｎ　１ｆｆｌ伝子を
保持していた。

ｐＲＫ２９０Ｋａｎ−１のｋａｎ遺伝子が転写される場
合には。

ＲＮＡポリメラーゼ■は、敗退転子の３゛側にある最初
のＴ−ＤＮＡのポリアデニル化部位に到達する前に＋　
Ｔｎ５の全ておよびｐＵｃ１３配列のすべてを転写しな
ければならない。しかし、　ｋａｎ　／ｐＵｃ１３縫合
部位の３°側に、ポリアデニル化部位として働く他の配
列が存在する。

３．３　ｐＲＫ２９０のｐｌ’１Ｘ２９０Ｋａｎ−１か
らり入末ｐＲＫ２９０が基礎になっているプラスミドは
がなり太きく　（２０Ｋｂｐ以上）、それゆえ組み換え
ＤＮＡ操作を行うとき、扱うのが離しいことが多い。

ｐｌＩＣ１３のレプリコンにより複製される二つのプラ
スミドの構築がこの後に記述され、そして第３図に概略
的に図解されている。

ＰＲＫ２９０Ｋａｎ−Ｉ　Ｄ　Ｎ　ＡをＥｃｏ　ＲＶで
完全分解し、それ自身を連結し、　ＪＭ８３中に形質転
換した。アンピシリン耐性およびテトラサイクリン感受
性形質転換体からプラスミドが分離され、制限分析によ
って特徴づけられ、そしてｐＶｉｃｌと名付けられたプ
ラスミドを含むコロニーが同定され、そのプラスミドは
、　ｐＵｃ１３　、粒重、および匡［ＲＶ　Ｔ−ＤＮＡ
断片を保持し、　１４５０ｂＴｘプロモーター（第２図
にあるように断片ｄ２の一部）および１４５０ｂＴｘに
関連したポリアデニル化部位（ｂ４およびｂ３の一部）
を所持する１４５０ｂＴｘ構造遺伝子を欠失していた。

１４５０ｂＴｘ構造遺伝子の両側のＴ−ＤＮＡと相同性
のあるｐＶｉｃｌは、アグロバクテリウム・チューメフ
ァシエンス細胞の直接形質転換およびカルベニシリン耐
性による選別の後の、二重相同性組み換えによるオクト
ピン型Ｔｉプラスミド中への組み込みに適している。ホ
モ部分二倍体化の後。

Ｔ−ＤＮＡは機能的な１４５０ｂＴｘ遺伝子を保持せず
。

そして形質転換された植物細胞に、オピンであるマンノ
ピンもしくはアグロビンを生成することはない。共存取
り込み後、この構造物は細菌にカルへニジリン耐性を賦
与し、植物細胞中ではアグロビンおよびマンノピンの合
成を行わせる。

ｐＲＫ２９０Ｋａｎ−Ｉ　Ｄ　Ｎ　ＡをＳｓｔ　Ｉ　、
　Ｅｃｏ　Ｒ１および１１ｉｎｄｌＩ［テ分解した。ｐ
ＵＩＪ３ＤＮＡをＳｓｔ　Ｉおよびに虹Ｒ１で分解した
。分解されたｐＲＫ２９０Ｋａｎ−１およびｐＵｃ１３
　ＤＮＡを混合、および互いに結合させた後、結合混合
物をＪＭ８３中へ形質転換した。プラスミドＤＮＡを白
色の、アンピシリン耐性コロニーから分離し、制限酵素
分析により特徴づけを行い、そしてｐＵＣ１３Ｋａｎ−
１と名付られたプラスミドを含むコロニーが同定され、
そのプラスミドはｐＵに１３゜１（ａｎ　＋および１４
５０ｂＴｘを所持するＴ−ＤＮＡ断片ｄｚ　（第２図に
あるように）の配列を保持していた。１４５０ｂＴｘ構
造遺伝子の片側についてＴ−ＤＮＡと相同性のあるｐＵ
ｃ１３Ｋａｎ〜１は、アグロバクテリウム・チューメフ
ァシエンス細胞の直接形質転換およびカルベニシリン耐
性による選別の後に、単−相同性組み換えによる。オク
トピン型Ｔｉプラスミド中への組み込みに適している。

共存取り込みの後、Ｔ−ＤＮＡは断片ｄ２の複製物を含
み、カルベニシリンの選別下で維持される必要があり。

機能的１４５０ｂＴｘ遺伝子を保有し、形質転換された
植物細胞に対し、オピンであるマンノピンおよび／もし
くはアグロピンを生成させる。

３．４　起動性ベクターの構“ ｐｔｌｃ系列のプラ）スミド（例えばｐｔｌｃ１３を基
礎とするプラスミド）はｐＲＫ２０１３によるエセリシ
ア・コリーからアグロバクテリウム・チューメファシエ
ンスへの接合伝達に対し起動性とは成り得す。

よって宿主アグロバクテリウム細胞中へ直接形質転換さ
れなければならない。しかし、　ｐＢＲ３２２を基礎と
するプラスミドはｐＲＫ２０１３により起動性と成り得
るが、アグロバクテリウム中では複製されないので、こ
のようなプラスミドは、　１４５０ｂＴｘＰＲ／庖り店
択可能マーカーの、オクトピン型Ｔｉプラスミドへの伝
達において有用な自殺ベクターである。

各々ｌ１ｉｎｄ　ＩｆｆおよびＥｃ６　Ｒ１により分解
されたｐＶｉｃｌおよびｐＢ１１３２２　Ｄ　Ｎ　Ａを
、混合し、互いに結合し、　ＰＨ１中へ形質転換し、ア
ンピシリン耐性形質転換体より分離されたプラスミドＤ
ＮＡは、制限マツピングにより特徴づけが行われ＋　１
）Ｖｉｃ２と名付けられたプラスミドを保持するコロニ
ーが同定され、そのプラスミドはｐＶｉｃｌのｐＵｃ１
３配列の代用としてｐＢＲ３２２のコピーを保持してい
た。ｐＶｉｃ２は、共存取り込みまたはＴＲへのホモ部
分二倍体化が可能な起動性自殺ベクターである。

各々１ｌｉｎｄ　ｍおよびＥｃｏ　Ｒ１て分解されたｐ
Ｕｃ１３Ｋａｎ−Ｉ　Ｄ　Ｎ　ＡおよびｐＢＲ３２２Ｄ
　Ｎ　Ａを、混合し、互いに結合し、そしてＲＲＩ中へ
形質転換した。アンピシリン耐性形質転換体より分離さ
れたプラスミドＤＮＡは制限マツピングにより特徴づけ
が行われ、　ｐＢＲ３２２Ｋａｎ−１と名付けられたプ
ラスミドを保持するコロニーが同定され、そのプラスミ
ドはｐＬＩｃ１３ｋａｎ−１のｐＬＩｃ１３配列の代用
としてｐＢＲ３２２のコピーを保持している。Ｉ］ＢＲ
３２２Ｋａｎ−１はＴＲ中への共存取り込み可能な起動
性自殺ベクターである。

尖施災土 この実施例は、　１４５０ｂＴｘプロモーター領域の後
に置くとカナマイシン耐性の細菌の構造遺伝子は真核細
胞、特に植物細胞、と原核細胞、特にアグロバクテリウ
ムとエセリシア・コリー細胞の両方で発現されたという
予期しなかった結果を明らかにしており、それゆえに二
元目的プロモーター領域と外来構造遺伝子の結合体の一
部として１４５０ｂＴｘＰＲが使えるかも知れないとい
う、以前に明らかにしていなかった事実を説明している
。

４．１　原！生物内でのカナマイシン耐性当該分野で以
前に知られているアグロバクテリウム・チューメファシ
エンスＡ３４８は、オクトピン型プラスミドｐＴｉへ６
をツバリン型株Ｃ５８の熱により脱落した無毒性の誘導
体Ａ１１４　（ＮＴＩ　）のりファンピシン耐性誘導体
Ａ１３６に導入することにより産み出した。ｐＲＫ２９
０Ｋａｎ−１を形質転換することにより八３４８に導入
したが、その際にはｐＴｉＡ６にはホモ部分二倍体化し
なかった。結果として生じた株であるＡ３４Ｂ−１）Ｒ
Ｋ２９０−Ｋａｎ−１はカナマイシン１００　ｐｇ／＋
ｎｊ！を含む培地に置くと成育することが観察された。

液体培地（ＹＥＰ培地、３０℃）でこの株の増殖曲線は
一般に試したすべてのカナマイシン濃度で同等の増殖を
示したが、最高濃度の２００μｇ／ｍｎでは曲線は低薬
剤濃度で観察されるより早く頭打ちした（第４図）。

４．２真核生物でのカナマイシン耐性 Ａ３４Ｂ−ｐＲＫ２９０−Ｋａｎ−１はｐＴｉＡ６にホ
モ部分二倍体化し、植物細胞を形質転換するのに用いた
。逆位のヒマワリの胚軸部の切片の上面の端（Ｋ、＾。

Ｂａｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　Ｃｅ１ｌ
　３２　：　１０３３−１０４３を参照）に接種し、２
−４週間後生じたカルスをホルモンを欠く固体ＭＳ３培
地に置いた（実施例１．３ａ）。

アグロバタテリウム細胞は＋１ｍｇ／ｍＡのカルベニシ
リンおよび２００μｇ　／　ｍｌ！バンコマイシンで死
滅し、カルスは直径約２．５ＣＩＩｌになるまで成長し
た。カルスの小断片をホルモンを欠く固体ＭＳ３培地に
移しカルへニジリン、バンコマイシン、そして２５μｇ
　／　ｍｚのＧ４１８カナマイシンのアナログを付加し
た。断片の多くは緑色のままで成長し続けるが、おそら
くカルスが混入した未形質転換細胞に由来している他の
断片は死滅した。匠構造遺伝子とどちらかの方向で代用
したゼイン配列からなるすべての対照物はＧ４１８で死
滅した。このことから１４５０ｂＴｘ　ＰＲ／■Ｌ構造
遺伝子結合物で形質転換した植物細胞はカナマイシン作
用に耐性であり得ることを示した。

大胤桝】 この実施例は、　１４５０ｂＴｘプロモーター領域の後
に置いた真核生物の構造遺伝子は真核および原核細胞の
両方で発現するという予期しない結果を教示する。

レクチンは栄養的にも重要な種子蛋白質であり。

豆科植物とりゾビウム共生を確立する間で重要であると
考えられている。エセリシア・コリー１１８ＩＯＩ（ｐ
ｐｔ、ν１３４　）　、　ＡＴＣＣ３９１８１より得ら
れるｐＰＶＬ１３４は、フォゼオラス　ブルガリスＬ、
の種子のレクチンのｃＤＮＡ構造遺伝子を含む（Ｌ、　
Ｍ、　Ｈｏｆｆｍａｎｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｎｕ
ｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、二１０　：　７８１９−
７８２８　）。

ｃＤＮＡをコードしている配列はイントロンにより分断
されない遺伝子と同じく、遺伝子自身のそれと同じであ
る。

（以下余白） ５．１　ベタ　−の エセリシア・コリーＨＢＩＯＩはＤＮＡをメチル化する
ので、ＤＮＡは酵素Ｂｃｌ　Ｉでは切断されないが、エ
セリシア・コリーＧＭ３３と当業者に知られている他の
株はメチル化によりＢｃｌ　１部位は保護されない。Ｈ
ＢＩＯＩ　（ｐＰＶＬ１３４　）より単離したｐＰＶＬ
１３４ＤＮＡはＧＭ３３を形質転換し、テトラサイクリ
ン耐性形質転換体が同定される。ＧＭ３３　（ｐＰＶＬ
１３４　）より単離したｐＰＶＬ１３４　Ｄ　Ｎ　Ａは
Ｂｃｌ　Ｉで完全分解により線状化し、　ＢＡＰ処理を
行い、　Ｂａｍ　ＨＩ分解したｐＲＫ２９０Ｅｃｏ１３
ΔＣ１ａＢａｍと混合し連結し、ＲＲｌへ形質転換する
。テトラサイクリン耐性形質転換体より単離したプラス
ミドＤＮＡが特徴づけられ、レクチンをコードしている
配列のすぐ上流に１４５０ｂＴｘＰＲがあるような方向
にｐＰＶＬ１３４挿入体を持ち。

ｐＲＫ２９０Ｌｅｃ−１と表されるプラスミドを持つコ
ロニーを選別する。レクチン遺伝子の方向性は、挿入体
の５”末端と３”末端からそれぞれ０．０９ｋｂｐと０
．７８ｋｂｐのＣ１ａ　１部位の存在により決められる
。両末端は、　ｐＲＫ２９０Ｅｃｏ１３ΔＣ１ａＢａｍ
に連結後、ハＬ旧とＢｃｌ　Ｉで分解できない縫合部を
形づくる。

ｐＲＫ２９０Ｌｅｃ−Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａは形質転換あるい
は接合のどちらかによりＡ３４８　（ｐＴｉＡ６　）に
転換され２次いで独立のｐＲＫ２９０レプリコンやテト
ラサイクリン耐性細胞の選別を除外するためにｐｐＨＩ
Ｊ１を導入される。レクチン遺伝子の発現のためにはホ
モ部分二倍体を単離する必要はないが、もし必要なら、
制限酵素分析によりテトラサイクリン耐性共同組込体の
子孫を選抜することにより同定できる。

ｐＲＫ２９０Ｌｅｃ−１とｐＴｉＡ６との共同組込体あ
るいはホモ部分二倍体のどちらかにより生じるＴＩＰプ
ラスミドをここではｐＴｉＡ６Ｌｅｃ４と表す。

５．２原核生　での発現 ＲＲＩ　（ｐＲＫ２９０Ｌｅｃ−１）　とＡ３４８　（
ｐＴｉＡ６Ｌｅｃ−１）を。

電気泳動とハイブリダイゼーション法により選別し、適
当な植物ＲＮＡ配列を含むことが観察される。

５．３真奢生物での完工 Ａ３４８　（ｐＴｉＡ６Ｌｅｃ−１）を逆にしたヒマワ
リの軸に接種し、生じたクラウンゴール腫瘍は、レクチ
ンｍＲＮＡと蛋白質の配列を含んでいることを、当業者
でふつうに知られているハイブリダイゼーション、電気
泳動、免疫的各手法により観察した。

爽施災■ この実施例はすべてのＴ、を含むサブ−Ｔｉプラスミド
の構築を教示する。ＴＲは形質転換細胞のホルモン非依
存性の増殖の表現型を示す遺伝子は一つも持たない。ま
た１匹とがここで論じたプラスミドのいくつかにある選
択可能なマーカーとして機能し得ると２選択可能なマー
カー（例えば。

ｋａｎ　）の発現を促進するために１４５０ｂＴｘＰＲ
を用いる必要が排除されるということを注記しておく。

６、ＩＴＲサブ−Ｔｉプラスミドの構築ｐＲＫ２９０Ｋ
ａｎ−１を形質転換によりＡ３４８　（ｐＴｉ＾６）に
転移させた。１４５０ｂＴｘ構造遺伝子を欠失し、オビ
ン合成欠損表現型となるホモ部分二倍体化後。

カナマイシン耐性アグロバクテリウム細胞より単離した
Ｔｉプラスミドを制限酵素分析で特徴づける。

共同組込よりもホモ部分二倍体化の結果であるＤＮＡ試
料をＢａｍ　ＨＩで分解し、自身で連結させた。

生じた混合物をＪＭ８３へ形質転換する。カナマイシン
および／もしくはアンピシリン耐性形質転換体のプラス
ミドＤＮＡを制限酵素分析により特徴づけ、非伝達性で
、エセリシア・コリーに保持され。

ｐＵｃ１３Ｂａｍ２Ｋａｎ−１と表されるプラスミドを
保持するコロニーを同定する。（第５図） ｐＵｃ１３Ｂａｍ２Ｋａｎ−１とｐＲＫ２９０　Ｄ　Ｎ
　ＡをそれぞれＢａｍ　ＩｌｌＢｇＩ　ｎとで分解し、
それぞれを混ぜ、連結する。

連結した混合液をハｍ　ＨＩζ旺ＩＩＩで分解して非混
成物分子を線条化し、　ＲＲＩを形質転換した。（もし
プラスミドを展旧で部分分解し線状化すると。

ｐＢＲ３２２Ｂａｍ２Ｋａｎ−１はｐＵｃ１３Ｂａｍ２
Ｋａｎ−１と置き換え得る。）アンピシリンおよび／も
しくはカナマイシン、およびテトラサイクリンに耐性形
質転換体より分離したプラスミドＤＮＡは制限分析によ
り特徴づけられる。二つのバイブリソ１１ＬＩ［／Ｂａ
ｍ旧部位でどちらかの方向で縫合された二つの親プラス
ミドのそれぞれの単一コピーを持ち＋　ｐＲＫ２９０Ｂ
ａｍ２Ｋａｎ〜ｌ（第５図）プラスミドを持つコロニー
を同定する。ｐＲＫ２９０Ｂａｍ２Ｋａｎ−１をアグロ
バクテリウム（ｖｉｒ　）株、エセリシア・コリーＲＲ
Ｉ　（ｐＲＫ２９０Ｂａｍ２Ｋａｎ−１）そしてエセリ
シア・コリー（ｐＲＫ２０１３　）の三組交雑によりｖ
ｉｒ遺伝子を含むアグロバクテリウム株に転移させる。

正常な二親交雑過程の変形で、ｐｐＨＩＪ１は、アグロ
バクテリウム（ｖｉｒ　）株内で独立に複製するように
設計されているｐＲＫ２９０レプリコン。

ｐＲＫ２９０Ｂａｍ２Ｋａｎ−１とは不和合性であるの
で、導入されない。

６．２ＴＲサブ−Ｔｉプラスミドの゛用実施例６．１に
述べられたベクターはＢａｍ旧断片２に基づき、したが
ってＴＬの両境界（ＴＲＬＢ（Ｃ）およびＴ、　ＲＢ（
Ｄ）　）に加えてＴＬ右境界（ＴＬＲＢ（Ｂ）　）を含
む。オクトピン型プラスミドｐＴｉ１５９５５のＴ。

を開裂せず、サブ−Ｔｉプラスミドの構築に有効性を示
す他の酵素は、町すエＩとＳｍａ　Ｉ　（ｏｃｓ　と田
しの一部）、肛１．！：並虹■　（虱の一部）および紅
ｎＩ（匹し、田し、　０ＲＦ９）を含む。（括弧で示さ
れたＴＬ構造遺伝子あるいはオープンリーディングフレ
ーム（ＯＲＦｓ）は、前述の酵素によって生成する断片
上に含まれる。）正常にＴＲＤＮＡを切る他の酵素９例
えば、」坏ｄｎｌ（二、田１．０ＲＦ９゜田ｒ　、０Ｒ
Ｆ５’　／ハＬの一部）およびＢＢＬＩ　（虱）は、第
２図の断片す、、ｃ、およびｄｌをおおっているＣ１ａ
　Ｉ断片由来のＴ８誘導体を切らない。

当業者は、■Ｌ配列がＢｇｌ　１部位を含むことと。

ｐＢ１７３２２とｐＵｃｌ系のプラスミドにｌ１ｉｎｄ
　ｕ［部位があることを知るであろう。部分的ガ１」も
しくは１１ｉｎｄ　ｍの制限酵素分解条件の賢明な使用
法は。

当業者によく知られているように、ここで述べられた選
択マーカー構築に基づくサブ−Ｔｉプラスミドの構築の
際に必要とされるであろう。

旦ａｌｌ＆ｃｌａｌのような他の酵素は、　’ｒｔ　Ｒ
Ｂ（Ｂ）を含まないｐＴｉ１５９５５に基づ＜ＴＲサブ
−Ｔｉプラスミドの構築に対して利用されるかも知れな
い。特に、適切にメチル化されている宿主９例えばエセ
リシア・コリーに８０２　（Ｗ、　Ｂ、　Ｗｏｏｄ　（
１９６６）　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　１６　：　１１８　）中での増殖の際、　
ｐＲＫ２９０Ｋａｎ−１゜ｐＶｉｃｌおよびｐνｉｃ２
のホモ部分二倍体化されたＴ−ＤＮＡ誘導体はｌ　ＴＲ
内にメチル化されておらず、開裂できるＣ１ａ　１部位
を持たず、しかしＴ□ＬＢ　（Ｃ１とＴＬＲＢ（Ｂ）間
に開裂できるＣ１ａ　１部位を持つ。

（第５図を参照）　。Ｋ２Ｏ２中で増殖したｐＵｃ１３
Ｂａｍ２Ｋａｎ−１あるいはｐＢＲ３２２Ｂａｍ２Ｋａ
ｎ−Ｉ　Ｄ　Ｎ　ＡはＢａｍ旧および只虹■で制限酵素
分解される。このＤ’ＮＡは適当なリンカ−の使用ある
いはエセリシア・コリーＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ
ー断片での粘着末端の平滑末端化によって連結され、そ
の結果としてＴＬＲＢ（Ｂ）の欠失となる。ヌクレアー
ゼＢａ１３１によるＢａｍ旧で線状化されたｐｔｌｃ１
３Ｂａｍ２Ｋａｎ−１の制御条件下での分解で、　ＴＬ
ｌ？Ｂ（Ｂ）の除去も可能になる。

６゜３ミニＴｉプラスミド ミニＴｉプラスミドは酵素Ｅｃｏ　Ｋ　とＭｓｔユ■と
を用いて同様に構築される。このＥｃｏ　ＫはｐＴｉ１
５９５５Ｔ−ＤＮＡを開裂しない。Ｍｓｔ　Ｉ［はｂ５
　、ｃおよびｄ、断片をおおうＣ１ａ　Ｉ断片の欠失に
よって除去される単−ｐＴｉ１５９５５Ｔ　−Ｄ　Ｎ　
Ａ開裂部位を持つ。

Ｍｓｔ　１粘着末端はＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー
断片での連結の前に平滑化されなければならず。

・Ｅｃｏ　Ｋ末端はクレノー断片とＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼの両方の反応によって平滑化されなければならない
。

ここで論議されたサブ−Ｔｉプラスミドの大きさを小さ
くするため、より小さいベクターがｐＲＫ２９０の代わ
りに代用され得る。従来技術の項でアグロバクテリウム
で維持され得るシャトルベクターに言及したもの以外の
プラスミドは、Ｒ１Ｃ０Ｔａ１ｔ　ｅｔａｌ、（１９８
２）　Ｇｅｎｅ　２０　：　３９−４９．　Ｊ、　Ｌｅ
ｅｍａｎｓ　ｅｔ　ａｌ（１９８２）　Ｇｅｎｅ　１９
　：　３６１−３６４およびＪ、　Ｈｉｌｌｅ　ａｎｄ
Ｒ，５ｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ　（１９８１）　Ｐｌａ
ｓｍｉｄ　６　：３６０−３６２によって述べられたも
のを含む。しかし、これに限定されない。

実施例７ 三組交雑は、下記の手順で行った； 当業者に既知の他の変法も可能である。

Ｅ、　Ｃｏ１１　ＲＲＩ　（ｐＲＫ２９０に基づくシャ
トルベクターを有する）またはＥ、　Ｃｏ１１　Ｋ２Ｏ
２（ｐＲＫ２９０に基づくシャトルベクターを有する）
と、　Ｅ、　Ｃｏ１１　ＲＲＩ　（ｐＲＫ２０１３を有
する）とＡ３４８　（Ｔｉプラスミドを有するリファン
ピシン耐性のアグロバクテリウム・チューメファシエン
スの菌株）とを交雑させる。

ｐＲＫ２０１３は、菌株を有するシャトルベクターへ転
移し、シャトルベクターをアグロバクテリウムへ転移さ
せる。Ｅ、Ｃｏ１１の増殖できない最小培地（つまり、
　ＡＢグルコース）での菌の生育によって。

シャトルベクター配列を有するアグロバクテリウム細胞
が選択される。この培地は、リファンピシンとシャトル
ベクターが耐性である薬剤との両者。

しばしばカナマイシンまたはカルベニシリン（アンピシ
リンアナログ）のいずれかを含む。これらの細胞のＥ、
　Ｃｏ１１　（ｐＰＨＩＪｌ）　２１０４菌株との交雑
は。

ｐｐ旧Ｊ１のアグロバクテリウム細胞への転移を引き起
こす。　ｐＰＨＩＪｌ　（！＝　ｐＲＫ２９０に基づく
シャトルベクターは、同−細胞中に長時間共存できない
。ゲンタマイシンとカナマイシンを含む培地での生育に
より、Ｔｉプラスミドを有する細胞が選別される。

このＴｉプラスミドは、−重または二重相同組み換え（
それぞれ共同取り込みまたは、ホモ部分二倍体化）をシ
ャトルベクターとの間に起こし、そして所望の構造を有
している。選別に用し〜る抗生物質の濃度は、実施例１
．３ａに記したとおりである。

ＩＥ、　Ｃｏ１１の菌株は、平常０．２％カザアミノ酸
を補足するし一培地で、３７℃生育させ、また、アグロ
バクテリウム・チューメファシエンスは、　ＹＥＰ培地
で３０°Ｃで生育させている。ｐＲＫ２９０とｐＲＫ２
０１３は。

Ｇ、　Ｄｉｔｔａ　ｅｔ　ａｔ、（１９８０）　Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　７７　：　７３４７−７３５７に、またｐｐＨ
ＩＪ１はＰ、　Ｒ，旧ｒｓ（１９７８）　Ｔｈｅｓｉｓ
、　Ｌｌｎｉｖ、　Ｅ、　Ａｎｇｌｉａに開示されてい
る。

（以下余白） 溌３Ｒ戸【ピ オクトピン型クラウンゴール腫瘍中で１４５０ベースの
ＴＲ転写物の発現をもたらすプロモーター領域はまた細
菌内で外来構造遺伝子の発現をも促進することができる
ことを開示した。植物、細菌双方で外来構造遺伝子の１
コピーの発現をもたらすためのこの二元目的プロモータ
ー領域の利用が教示される。真核および原核生物で機能
する選択マーカーの構築が植物を形質転換する試みに有
効なベクターとして例証される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、オクトピン型ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領
域の制限酵素地図、第２図は、ＴＲＤＮＡの制限酵素地
図、第３図は、実施例２．２から３．４までに用いたＤ
ＮＡ実験操作の概略図、第４図は。 １４５０ｂＴｘプロモーター領域とＮＰＴＩＩ構造遺伝
子の結合体を有している細菌細胞の増殖特性を示すグラ
フ、第５図は、実施例６．１に記されているＤＮＡ実験
操作の概略図である。 以上 代理人　弁理士　山本秀策 ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、　４ ＠　本Ａ３４８−ｐＲＫ２９０−ＫａｎＩＦＩＧ、５ 手続補正書（自発） 昭和６０年４月２４日 特許庁長官殿 ２、発明の名称 植物および細菌における転写 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国　コロラド８０３０１ボールダー
、ミソチェル　シー２３３フ５名称　アグリジェネティ
クス　リサーチアソシエイツ　リミテッド 代表者　ゾール　ジェイ、ハンセン 国籍　アメリカ合衆国 ４、代理人 住所　〒５３０大阪府大阪市北区西天満５、補正の対象 図面 ６、補正の内容 トレーシングペーパーに製果で描いた 正式図面（内容に変更なし）を別紙の とおり差し出します。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）二元目的プロモーター領域／外来構造遺伝子
   結合体を有するＤＮＡ分子で原核生物細胞を形質転換し
   、結果として生じた原核生物株でのこの結合体の発現を
   検知する工程；および（ｂ）二元目的プロモーター領域
   ／外来構造遺伝子結合体を有するＤＮＡ分子で植物細胞
   を形質転換し、結果として生じた植物組織でのこの結合
   体の発現を検知する工程。 を包含する遺伝的に細胞を修飾する方法。 ２、　前記７’ｔｌモータ＠ｆｊ域カＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａ
   　１４５０ｂＴｘ遺伝子とハイブリダイズし得る何らが
   のＴＩＰ遺伝子に由来する特許請求の範囲第１項に記載
   の方法。 ３、前記ＴＩＰ遺伝子がｐＴｉＡ６またはｐＴｉ１５９
   ５５に由来する特許請求の範囲第２項に記載の方法。 ４゜前記構造遺伝子が該構造遺伝子を含むように形質転
   換された植物内で同定しうる表現型を与える特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。 ５、前記同定し得る表現型がカナマイシン、ネオマイシ
   ン、　Ｇ４１８　、またはそのアナログｉ４性である特
   許請求の範囲第４項に記載の方法。 ６、前記構造遺伝子がＴｎ５のネオマイシンフメスフォ
   トランスフェラーゼ■を特徴とする特許請求の範囲第５
   項に記載の方法。 ７、前記二元目的結合体がリゾビアッシー科の細菌内で
   独立に維持され得ないレプリコンに連接している特許請
   求の範囲第１項に記載の方法。 ８、前記二元目的結合体がリゾビアソシー科の細菌内で
   独立に維持され得るレプリコンに連接している特許請求
   の範囲第１項に記載の方法。 ９、前記プロモーター領域／構造遺伝子結合体が繰り返
   し配列ＴＬ　ＬＢ（Ａ）、ＴＬ　ＲＢ（Ｂ）、ＴＲＬＢ
   （Ｃ）。 またはＴ、　ＲＢ（Ｄ）の１つまたはそれ以上と連接し
   ている特許請求の範囲第１項に記載の方法。 １０、前記構造遺伝子が断片ｄ２の左端に連結されてい
   る特許請求の範囲第１項に記載の方法。 １１、前記構造遺伝子が断片す、の右端に連結されてい
   る特許請求の範囲第１０項に記載の方法。 １２　、　（ａ）二元目的プロモーター領域／外来構造
   遺伝子結合体を有するＤＮＡ分子で原核生物細胞を形質
   転換し、結果として生じた原核生物株でのこの結合体の
   発現を検知する工程；および（ｂ）二元目的プロモータ
   ー領域／外来構造遺伝子結合体を有するＤＮＡ分子で植
   物細胞を形質転換し、結果として生じた植物組織でのこ
   の結合体の発現を検知する工程。 を包含する遺伝的に細胞を修飾する方法により遺伝的に
   修飾された植物。 １３、同定し得る表現型を与え得る１つまたはそれ以上
   の二元目的プロモーター領域／外来構造遺伝子結合体を
   有するＤＮＡベクターであって。 該結合体が該ベクターにより形質転換された細菌株に同
   定し得る表現型を与える該ベクターに対し唯一の手段で
   ある。ＤＮＡベクター。 １４、前記プロモーター領域がＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａ　１４
   ５０ｂＴｘ遺伝子とハイブリダイズし得る何らかのＴＩ
   Ｐ遺伝子に由来する特許請求の範囲第１３項に記載のベ
   クター。 １５、前記ＴＩＰ遺伝子がｐＴｉ八６へた番！、ｐＴｉ
   １５９５５に由来する特許請求の範囲第１４項に記載の
   ベクタ０ １６、前記構造遺伝子が該構造遺伝子を含むように形質
   転換された植物細胞で同定し得る表現型を与える特許請
   求の範囲第１３項に記載のベクター。 １７、前記同定し得る表現型がカナマイシン。 ネオマイシン、　０４１８　、またはそのアナログに耐
   性である特許請求の範囲第１６項に記載のベクター。 １８、前記構造遺伝子がＴｎ５のネオマイシンフォスフ
   オドランスフェラーゼ■を特徴とする特許請求の範囲第
   １７項に記載のベクター。 １９、前記ベクターがｐＲＫ２９０Ｋａｎ−１であるか
   もしくはｐＲＫ２９０Ｋａｎ−１から構築された特許請
   求の範囲第１８項に記載のベクター。 ２、特許請求の範囲第１９項に記載のベクターを含む細
   菌株。 ２１、リゾビアソシー科め細面内で独立に維持され得な
   いレプリコンをさらに含む特許請求の範囲第１３項に記
   載のベクター。 ２２、リゾビアソシー科の細菌内で独立に維持し得るレ
   プリコンをさらに含む特許請求の範囲第１３項に記載の
   ベクター。 ２３、繰り返し配列ＴＬＬＢ（八）、ＴＬ　ＲＢ（Ｂ）
   、Ｔｌ１ＬＢ　（Ｃ）　、またはＴｌｌ　ＲＢ（Ｄ）の
   １つまたはそれ以上をさらに含む特許請求の範囲第１３
   項に記載のベクタＯ ２４、前記構造遺伝子が断片ｄ２の左端に連結されてい
   る特許請求の範囲第１３項に記載のベクタＯ ２５、前記構造遺伝子が断片ｂ４の右端に連結されてい
   る特許請求の範囲第２４項に記載のベクタ０ ２６、同定し得る表現型を与え得る１つまたはそれ以上
   の二元目的プロモーター領域／外来構造遺伝子結合体を
   有するＤＮＡベクターであって。 該結合体が該ベクターにより形質転換された細菌株に同
   定し得る表現型を与える該ベクターに対し唯一の手段で
   ある。ＤＮＡベクターに由来するＤＮＡを含む植物組織
   。 ２７、同定し得る表現型を与え得る１つまたはそれ以上
   の二元目的プロモーター領域／外来構造遺伝子結合体を
   有するＤＮＡベクターであって。 該結合体が該ベクターにより形質転換された細菌株に同
   定し得る表現型を与える該ベクターに対し唯一の手段で
   ある。ＤＮＡベクターに由来するＤＮＡを含む植物組織
   に由来する植物。 ２、特許請求の範囲第１３項に記載のベクターを含む細
   菌株。 ２９、同定し得る表現型を与え得る１つまたはそれ以上
   の二元目的プロモーター領域／外来構造遺伝子結合体を
   有するＤＮＡベクターを含む細菌株であって、該結合体
   は該株に該同定し得る表現型を与える唯一の手段である
   。ＤＮＡベクターを含む細菌株。 （以下余白）