JPS60188079A - シグナルペプチドをコ−ドする遺伝子およびその利用 - Google Patents
シグナルペプチドをコ−ドする遺伝子およびその利用Info
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- JPS60188079A JPS60188079A JP59045315A JP4531584A JPS60188079A JP S60188079 A JPS60188079 A JP S60188079A JP 59045315 A JP59045315 A JP 59045315A JP 4531584 A JP4531584 A JP 4531584A JP S60188079 A JPS60188079 A JP S60188079A
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
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- Medicinal Chemistry (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
技術分野
本発明は、所謂シグナルペプチドをコードする遺伝子に
関する。さらに具体的には、本発明は、ス）Ｌ／ブトマ
イセス属細菌を宿主とする宿主−ベクター系において該
ベクターＤＮＡに組込んで使用すべき、シグナルペプチ
ドをコードする遺伝子のＤＮＡフラクシロンに関する。
関する。さらに具体的には、本発明は、ス）Ｌ／ブトマ
イセス属細菌を宿主とする宿主−ベクター系において該
ベクターＤＮＡに組込んで使用すべき、シグナルペプチ
ドをコードする遺伝子のＤＮＡフラクシロンに関する。
近年急速に進歩した生物工学技術によって、これまで高
等生物が産生じていたインシーリン、成長ホルモン等の
ホルモン、８ｍ肝炎ウィルス等のワクチン、インターフ
ェロン、インターロイキン■等のリンホカインその他の
蛋白産物を微生物に産生させることが可能となシ、その
実用化に向けて研究が続けられている。
等生物が産生じていたインシーリン、成長ホルモン等の
ホルモン、８ｍ肝炎ウィルス等のワクチン、インターフ
ェロン、インターロイキン■等のリンホカインその他の
蛋白産物を微生物に産生させることが可能となシ、その
実用化に向けて研究が続けられている。
このような生物工学的技術による微生物による蛋白の産
生は、所望蛋白のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤ
ＮＡを予定微生物への導入具すなわちベクターと結合さ
せること、結合物（通常＆１プラスミド）を該微生物中
に導入して該微生物に該蛋白産生能という形質を与える
こと、ならびにこの微生物を培養して、該形質の発現と
して該蛋白を産生させること、からなる方法によって行
なわれることがふつうである。
生は、所望蛋白のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤ
ＮＡを予定微生物への導入具すなわちベクターと結合さ
せること、結合物（通常＆１プラスミド）を該微生物中
に導入して該微生物に該蛋白産生能という形質を与える
こと、ならびにこの微生物を培養して、該形質の発現と
して該蛋白を産生させること、からなる方法によって行
なわれることがふつうである。
このような方法において効率のよい宿主−ベクター系が
探究されているのであるが、宿主としては大腸菌の外に
放綜菌、枯草菌および酵母が知られている。
探究されているのであるが、宿主としては大腸菌の外に
放綜菌、枯草菌および酵母が知られている。
これらの宿主のうちでは、放線菌（ストンブトマイセス
属細菌）に興味が持たれる。放線菌にはβ−ラクメム型
型土生物質を産生ずるものがあるうえ抗生物質の製造を
通じて安全性を含めてその取扱いに当業者は習熟してい
るといえるからである。
属細菌）に興味が持たれる。放線菌にはβ−ラクメム型
型土生物質を産生ずるものがあるうえ抗生物質の製造を
通じて安全性を含めてその取扱いに当業者は習熟してい
るといえるからである。
放線菌には菌体外α−アミラーゼのように産生ずる蛋白
産物を菌体外に分泌するものがあるが、このような現象
は宿主菌の遺伝子が特定の遺伝情報を持っていて予定蛋
白を所謂シグナルペプチドと呼ばれるペプチド鎖の結合
した前駆体としていったん産生じ、これが細胞膜を通過
して細胞外またはブリペラズムに分泌され、その際にシ
グナルペプチド鎖が切断されて成熟蛋白となるという機
構による屹のとされている。
産物を菌体外に分泌するものがあるが、このような現象
は宿主菌の遺伝子が特定の遺伝情報を持っていて予定蛋
白を所謂シグナルペプチドと呼ばれるペプチド鎖の結合
した前駆体としていったん産生じ、これが細胞膜を通過
して細胞外またはブリペラズムに分泌され、その際にシ
グナルペプチド鎖が切断されて成熟蛋白となるという機
構による屹のとされている。
この所謂シグナル仮説は種々の実験的事実によって現実
のものとなってきているが、宿主力１放紳菌の場合にシ
グナルペプチドがどのようなアミノ酸配列を持つもので
あるかについては未だ明らかではない。
のものとなってきているが、宿主力１放紳菌の場合にシ
グナルペプチドがどのようなアミノ酸配列を持つもので
あるかについては未だ明らかではない。
ところで、前記のように、細菌による有用蛋白の生物工
学的製造はベクターによって宿主菌内に導入された該蛋
白用遺伝子の発現によるのであるから、放線菌内形質発
現用プラスミドをつくる際にシグナルペプチドをコード
する遺伝子をこのプラスミド中に組込めば、この遺伝子
の遺伝情報の発現によ−てシグナルペプチドが目的蛋白
と融合した前駆体が生成し、このシグナルペプチドによ
って目的蛋白が宿主放線菌外に分泌される可能性が与え
られる。
学的製造はベクターによって宿主菌内に導入された該蛋
白用遺伝子の発現によるのであるから、放線菌内形質発
現用プラスミドをつくる際にシグナルペプチドをコード
する遺伝子をこのプラスミド中に組込めば、この遺伝子
の遺伝情報の発現によ−てシグナルペプチドが目的蛋白
と融合した前駆体が生成し、このシグナルペプチドによ
って目的蛋白が宿主放線菌外に分泌される可能性が与え
られる。
発明の概要
要旨
本発明は、上記の立場に立ってストレプトマイセス属宿
主菌に対するシグナルペプチドをコードする遺伝子を提
供しようとするものである。
主菌に対するシグナルペプチドをコードする遺伝子を提
供しようとするものである。
すなわち、本発明によるストンブトマイセス属細菌を宿
主とする宿主−ベクター系において該ベク１−ＤＮＡに
組込んで使用すべき、シグナルペプチドをコードする遺
伝子のＤＮＡｔＪｉは、添付第１図のＸからＹまでのア
ミノ酸配列を有するペプチドをコードする塩基配列を有
するＤＮＡからなるものであること、を特徴とするもの
である。
主とする宿主−ベクター系において該ベク１−ＤＮＡに
組込んで使用すべき、シグナルペプチドをコードする遺
伝子のＤＮＡｔＪｉは、添付第１図のＸからＹまでのア
ミノ酸配列を有するペプチドをコードする塩基配列を有
するＤＮＡからなるものであること、を特徴とするもの
である。
また、本発明によるストンブトマイセス属細菌を形質転
換させるべきベクタープラスミドは、ストンブトマイセ
ス属細菌を宿主とする宿主−ベクター系において使用す
べきベクタープラスミドにストレフトマイセス・バイグ
ロスコピカス５Ｆｉｏｔｖ株またはその変異株由来の菌
体外α−アミラーゼをコードする塩基配列のＤＮＡ頌を
組込みかつ該ＤＮＡ鎖の遺伝情報の発現に必要なりＮＡ
を持たせたものであること、を特徴とするものである。
換させるべきベクタープラスミドは、ストンブトマイセ
ス属細菌を宿主とする宿主−ベクター系において使用す
べきベクタープラスミドにストレフトマイセス・バイグ
ロスコピカス５Ｆｉｏｔｖ株またはその変異株由来の菌
体外α−アミラーゼをコードする塩基配列のＤＮＡ頌を
組込みかつ該ＤＮＡ鎖の遺伝情報の発現に必要なりＮＡ
を持たせたものであること、を特徴とするものである。
効果
産生させるべき蛋白としてストレプトマイセス・バイグ
ロスコピカス８Ｆ１０ｒμ株のα−アミラーセ遺伝子を
そのシグナルペプチドをコードする部分と共に切出して
これを放線菌用ベクターによって放線菌に導入して核間
にα−アミラーゼを産生させたところ、その大部分が菌
体外に分泌されていることが見出された。
ロスコピカス８Ｆ１０ｒμ株のα−アミラーセ遺伝子を
そのシグナルペプチドをコードする部分と共に切出して
これを放線菌用ベクターによって放線菌に導入して核間
にα−アミラーゼを産生させたところ、その大部分が菌
体外に分泌されていることが見出された。
シグナルペプチドをコードする
本発明によるストンブトマイセス属細菌を宿主とする宿
主−ベクター系において該ベクターＤＮＡに組込んで使
用すべきＤＮ入鎖は、シグナルペプチドをコードする塩
基配列を有するものである。
主−ベクター系において該ベクターＤＮＡに組込んで使
用すべきＤＮ入鎖は、シグナルペプチドをコードする塩
基配列を有するものである。
このよりに本発明ＤＮＡ鎖を定義するシグナルペプチド
は、添付第７図のＸからＹまでの３個のアミノ酸配列を
有するものである。すなわち、この塩基配列は、下記の
通りである。
は、添付第７図のＸからＹまでの３個のアミノ酸配列を
有するものである。すなわち、この塩基配列は、下記の
通りである。
Ｍｅｔ −Ｇｌｎ−Ｇｉｎ −Ａｒｇ −Ｓｅｒ −Ａ
ｒｇ −Ｖａｌ −Ｌｅｕ −Ａｌａ −Ａｓｐ −Ｖ
ａｌ −Ａｌａ −Ｇｌｙ −１１ｅ −Ｖａｌ −Ａ
ｌａ Ａｌａ −Ａｒｇ −Ａｌａ −Ｇｌｙ−Ｈｉｓ
−Ｖａｌ −Ａｌａ −Ｐｒｏ −Ｓｅｒ −Ｇｌｙ
Ｓｅｒ −Ｇｌｎこのアミノ酸配列は、ストレプトマイ
セス・バイグロスコピカス５Ｆ１０１’１株の菌体外α
−アミラーゼ遺伝子の解析によって得られたものである
。
ｒｇ −Ｖａｌ −Ｌｅｕ −Ａｌａ −Ａｓｐ −Ｖ
ａｌ −Ａｌａ −Ｇｌｙ −１１ｅ −Ｖａｌ −Ａ
ｌａ Ａｌａ −Ａｒｇ −Ａｌａ −Ｇｌｙ−Ｈｉｓ
−Ｖａｌ −Ａｌａ −Ｐｒｏ −Ｓｅｒ −Ｇｌｙ
Ｓｅｒ −Ｇｌｎこのアミノ酸配列は、ストレプトマイ
セス・バイグロスコピカス５Ｆ１０１’１株の菌体外α
−アミラーゼ遺伝子の解析によって得られたものである
。
本発明ＤＮＡ鎖
本発明によるシグナルペプチドをコードする遺伝子は、
上記アミノ酸配列のペプチドをコードする塩基配列を有
するものである。
上記アミノ酸配列のペプチドをコードする塩基配列を有
するものである。
ペプチドのアミノ酸配列が与えられれば、それをコード
する塩基配列は所謂遺伝子暗号表を参照して容易に定ま
る。
する塩基配列は所謂遺伝子暗号表を参照して容易に定ま
る。
本発明によるシグナルペプチドをコードする遺伝子のＤ
ＮＡ鎖は、その塩基配列が添付第１図の塩基配列のうち
Ｘからｙｔでのものあるいはその縮重異性体である。こ
こで、「縮重異性体」とｂうのは、縮重関係にあるコー
ドンが使用されている点以外は塩基配列が同一で同一の
ペプチドをコードするＤＮＡ鎖を意味するものとする。
ＮＡ鎖は、その塩基配列が添付第１図の塩基配列のうち
Ｘからｙｔでのものあるいはその縮重異性体である。こ
こで、「縮重異性体」とｂうのは、縮重関係にあるコー
ドンが使用されている点以外は塩基配列が同一で同一の
ペプチドをコードするＤＮＡ鎖を意味するものとする。
従って、たとえば １／−側から２番目のコードンであ
るＣＡＧが同一のアミノ酸ＧｉｎをコードするＣＡＡに
代−た以外は同一の塩基配列のＤＮＡ鎖を、第１図に示
した塩基配列のＤＮＡ鎖の縮重異性体を呼ぶ。
るＣＡＧが同一のアミノ酸ＧｉｎをコードするＣＡＡに
代−た以外は同一の塩基配列のＤＮＡ鎖を、第１図に示
した塩基配列のＤＮＡ鎖の縮重異性体を呼ぶ。
このＤＮＡ鎖はシグナルペプチドをコードする遺伝子で
あシ、従ってこれは第１図ｘ−ｙの長さのＤＮＡ鎖とし
て単独に存在するのではなくてそのｊ′−側上流および
（または）３′−側下流に種々の機能のＤ Ｎ Ａ ＠
が結合した状態で存在する訳である。具体的には、たと
えば、その！′−側のわずか上流にリポソーム結合部位
となることが予想される塩基配列（第７図では２と表示
）あるいはプロモーターその他の調節領域を構成するＤ
ＮＡフラクシ四ンが存在するであろうし、また本発明Ｄ
ＮＡ鎖はベクター由来のＤＮＡフラクシ田ンと共にプラ
スミドの形態で存在することもある。従？て、本発明の
ＤＮＡ鎖が特定アミノ酸配列を有するペプチドをコード
する塩基配列を有するＪＤＮＡからなる」ものであると
いうことは、このような種々の存在形態を包含するもの
である（なお、発明の性質からいって、この存在形態に
はストンブトマイセス属細菌に生得的に含まれている状
態は包含されない。本発明ＤＮＡ鎖を「該ベクターＤＮ
Ａに組込んで使用すべき」と定義した所以である）。
あシ、従ってこれは第１図ｘ−ｙの長さのＤＮＡ鎖とし
て単独に存在するのではなくてそのｊ′−側上流および
（または）３′−側下流に種々の機能のＤ Ｎ Ａ ＠
が結合した状態で存在する訳である。具体的には、たと
えば、その！′−側のわずか上流にリポソーム結合部位
となることが予想される塩基配列（第７図では２と表示
）あるいはプロモーターその他の調節領域を構成するＤ
ＮＡフラクシ四ンが存在するであろうし、また本発明Ｄ
ＮＡ鎖はベクター由来のＤＮＡフラクシ田ンと共にプラ
スミドの形態で存在することもある。従？て、本発明の
ＤＮＡ鎖が特定アミノ酸配列を有するペプチドをコード
する塩基配列を有するＪＤＮＡからなる」ものであると
いうことは、このような種々の存在形態を包含するもの
である（なお、発明の性質からいって、この存在形態に
はストンブトマイセス属細菌に生得的に含まれている状
態は包含されない。本発明ＤＮＡ鎖を「該ベクターＤＮ
Ａに組込んで使用すべき」と定義した所以である）。
このような「ＤＮＡからなる」本発明ＤＮＡ鎖の一具体
例は、放線菌の菌体外（すなわち分泌型）α−アミラー
ゼの構造遺伝子、すなわち該α−アミラーゼ自体の構造
遺伝子とその菌体外分泌を支配するシグナルペプチドの
構造遺伝子とを含むもの、の塩基配列を有するものであ
る。このような菌体外α−アミラーゼ遺伝子の一例は、
ス）Ｌ／ブトマイセス畳バイグロスコピカスＢＦ１０１
１／−株またはその変異株由来の菌体外α−アミラーゼ
の遺伝子（またはそれと同一の塩基配列のもの）である
。
例は、放線菌の菌体外（すなわち分泌型）α−アミラー
ゼの構造遺伝子、すなわち該α−アミラーゼ自体の構造
遺伝子とその菌体外分泌を支配するシグナルペプチドの
構造遺伝子とを含むもの、の塩基配列を有するものであ
る。このような菌体外α−アミラーゼ遺伝子の一例は、
ス）Ｌ／ブトマイセス畳バイグロスコピカスＢＦ１０１
１／−株またはその変異株由来の菌体外α−アミラーゼ
の遺伝子（またはそれと同一の塩基配列のもの）である
。
とのよ５なｒＤＮＡからなる」本発明ＤＮＡ＠’の他の
一具体例は、ベクタープラスミドとしてのそれである（
詳細後記）。
一具体例は、ベクタープラスミドとしてのそれである（
詳細後記）。
本発明ＤＮＡ鎖の取得
本発明ＤＮＡ鎖はその塩基配列が定まっているので、全
化学合成または生化学合成によつて製造することができ
る。
化学合成または生化学合成によつて製造することができ
る。
しかし、このＤＮＡ鎖はかなシ鎖長の長いものであるか
ら、放線菌の遺伝子から切出す方法が便利であるといえ
よう。
ら、放線菌の遺伝子から切出す方法が便利であるといえ
よう。
そのような放線菌遺伝子からの切出しによる方法の場合
の一具体例は、ス）Ｌ／ブトマイセス・バイグロスコピ
カス５Ｆ１０ｒ＋を株またはその変異株のα−アミラー
ゼ遺伝子をそのシグナルペプチドをコードする部分と共
に切出し、その後に該部分を切断することからなる。
の一具体例は、ス）Ｌ／ブトマイセス・バイグロスコピ
カス５Ｆ１０ｒ＋を株またはその変異株のα−アミラー
ゼ遺伝子をそのシグナルペプチドをコードする部分と共
に切出し、その後に該部分を切断することからなる。
このような目的遺伝子ＤＮＡ鎖の取得は、生物工学の分
野において既に知られている各種の方法ないし技術によ
って行なうことができる０そのような方法ないし技術は
、具体的な方法については、後記実験例を参照されたー
。
野において既に知られている各種の方法ないし技術によ
って行なうことができる０そのような方法ないし技術は
、具体的な方法については、後記実験例を参照されたー
。
具体的には、たとえば、シグナルペプチドをコードする
ＤＮＡ鎖は、α−アミラーゼのアミノ酸配列の一部に対
応するＤＮＡ配列に関するホモａジーまたはアミラーゼ
活性の遺伝的指標を基に単離分別することができる。
ＤＮＡ鎖は、α−アミラーゼのアミノ酸配列の一部に対
応するＤＮＡ配列に関するホモａジーまたはアミラーゼ
活性の遺伝的指標を基に単離分別することができる。
本発明ＤＮＡ鎖の利用
本発明によるＤＮＡ鎖は放線菌に対するシグナルペプチ
ドをコードするという遺伝子を持つものであるという点
を除けば、これは本質的にはＤＮＡ鎖であることはいう
までもなく、従ってこのＤＮＡ鎖と所望蛋白をコードす
るＤＮＡ鎖とを放紛菌内で複製可能かっ、両遺伝情報発
現可能な状態で含むＤＮＡ鎖、特にプラスミド、の形と
して放線菌の形質転換を行なえば、宿主菌の細胞外に産
生蛋白を得ることができる。
ドをコードするという遺伝子を持つものであるという点
を除けば、これは本質的にはＤＮＡ鎖であることはいう
までもなく、従ってこのＤＮＡ鎖と所望蛋白をコードす
るＤＮＡ鎖とを放紛菌内で複製可能かっ、両遺伝情報発
現可能な状態で含むＤＮＡ鎖、特にプラスミド、の形と
して放線菌の形質転換を行なえば、宿主菌の細胞外に産
生蛋白を得ることができる。
このような方法による場合の宿主菌への遺伝子導入具で
あるベクターとしては、プラスミドおよびファージが各
種知られている（たとえば、「蛋白質・核酸・酵素」第
３巻、第μ号、第！７３〜１２／貢（共立出版■））。
あるベクターとしては、プラスミドおよびファージが各
種知られている（たとえば、「蛋白質・核酸・酵素」第
３巻、第μ号、第！７３〜１２／貢（共立出版■））。
これらのうちではプラスミドが代表的であシ、プラスミ
ドとしてはｐｌＪ７０．２（Ｇｅｎｅｔｌａｓ ｏｆ
Ｉｎｄｕｓｔｒｉｍｌ Ｍｌｃｒｏｏｒｇａｎｉｇｎｉ
ｐ＋７／ 。
ドとしてはｐｌＪ７０．２（Ｇｅｎｅｔｌａｓ ｏｆ
Ｉｎｄｕｓｔｒｉｍｌ Ｍｌｃｒｏｏｒｇａｎｉｇｎｉ
ｐ＋７／ 。
ｌりＬへ講談社）、ｐｓＦ ４１り（機工研条寄／２／
号、特開昭３；”）−１１ｒｌｓ００号公報）およびｐ
ｓＦ７６ｔ（機工研条寄／コ≠号、特開昭５７−ｔｒ♂
１００号公報）を具体例として挙げることができる。な
お、上記した「複製可能かつ両遺伝情報発現可能な状態
で含むＤ Ｎ ａ［Ｊとは、そのベクターが予定宿主（
すなわち、放線菌）内で複製可能なものであると共にパ
ラセンジャー遺伝情報が発現できるようにプロモーター
その他の制御領域その他の必要な領域を有するものであ
ることを意味する。
号、特開昭３；”）−１１ｒｌｓ００号公報）およびｐ
ｓＦ７６ｔ（機工研条寄／コ≠号、特開昭５７−ｔｒ♂
１００号公報）を具体例として挙げることができる。な
お、上記した「複製可能かつ両遺伝情報発現可能な状態
で含むＤ Ｎ ａ［Ｊとは、そのベクターが予定宿主（
すなわち、放線菌）内で複製可能なものであると共にパ
ラセンジャー遺伝情報が発現できるようにプロモーター
その他の制御領域その他の必要な領域を有するものであ
ることを意味する。
前記のように、本発明ＤＮＡ鎖の一具体例は、ベクター
プラスミドとしてのそれである。すなわち本発明ＤＮＡ
鎖は、放線菌を宿主とする宿主−ベクター系において使
用すべきベクタープラスミドにストレプトマイセス・バ
イグロスコピカスＦＳｌｏｒａ株またはその変異株由来
の菌体外α−アミラーゼをコードする塩基配列のＤＮＡ
鎖を組込みかつ該ＤＮＡ鎖の遺伝情報の発現に必要なり
ＮＡ”ｌｋ持たせた、放線菌を形質転換させるべきベク
タープラスミドの形態として利用することができる。
プラスミドとしてのそれである。すなわち本発明ＤＮＡ
鎖は、放線菌を宿主とする宿主−ベクター系において使
用すべきベクタープラスミドにストレプトマイセス・バ
イグロスコピカスＦＳｌｏｒａ株またはその変異株由来
の菌体外α−アミラーゼをコードする塩基配列のＤＮＡ
鎖を組込みかつ該ＤＮＡ鎖の遺伝情報の発現に必要なり
ＮＡ”ｌｋ持たせた、放線菌を形質転換させるべきベク
タープラスミドの形態として利用することができる。
このようなベクターＤＮＡに対する外来ないしパラセン
ジャーＤＮＡの組込みならびに生成組込体によるバチル
ス属細菌の形質転換は、前記した諸文献その他の教示な
らびに後記実験例から当業者にとって容易であろう。
ジャーＤＮＡの組込みならびに生成組込体によるバチル
ス属細菌の形質転換は、前記した諸文献その他の教示な
らびに後記実験例から当業者にとって容易であろう。
実験例
α−アミラーゼ生産菌ストＶブトマイセス・バイグロス
コピカスＳＦ＃ｌ！株をＹＭＳ培地（ｌチイーストエキ
ス、’％マルトエキス、３チ可溶性デンプン、ｏ、ｏｏ
ｓ係トリプトファン、ｐＨ７，０）ｒｏｍｉに接種し、
ｕ’ｃでλ日間振盪培養を行ない、／ ０，０００ Ｘ
、９７１０分間の遠心分離により集菌した。
コピカスＳＦ＃ｌ！株をＹＭＳ培地（ｌチイーストエキ
ス、’％マルトエキス、３チ可溶性デンプン、ｏ、ｏｏ
ｓ係トリプトファン、ｐＨ７，０）ｒｏｍｉに接種し、
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、９７１０分間の遠心分離により集菌した。
この菌体からスミス等の公知の方法（Ｍ、 Ｇ、 Ｓｍ
１ｔｈ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ、 Ｄ：、Ｆｌｊ （／り６７））で全ＤＮＡを抽出
精製し、ＴＥ緩衝液ＣＩＯｍＭＴｒｉｇＨＣＩ 、 ｐ
Ｈ♂、θ、／ｍＭ ＥＤＴＡ ）で透析して供与体ＤＮ
Ａとした。
１ｔｈ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ、 Ｄ：、Ｆｌｊ （／り６７））で全ＤＮＡを抽出
精製し、ＴＥ緩衝液ＣＩＯｍＭＴｒｉｇＨＣＩ 、 ｐ
Ｈ♂、θ、／ｍＭ ＥＤＴＡ ）で透析して供与体ＤＮ
Ａとした。
このようにして得た供与体ＤＮｋ１０μｇ に制限酵素
Ｓａｕ Ｊ Ａを２単位加え、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｈ
ＣＩ 。
Ｓａｕ Ｊ Ａを２単位加え、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｈ
ＣＩ 。
ｐＨ７，，２，１０ｍＭジチオスＶイトール、／’ｊＯ
ｍＭＮａＣ１の組成の緩衝液３ｏμｌ中でＩＯ分間反応
させた。
ｍＭＮａＣ１の組成の緩衝液３ｏμｌ中でＩＯ分間反応
させた。
反応液にＴＥ緩衝液で飽和したフェノールＳＯμｌを加
えて７分間振盪した後、１０，０ＯＯＸＩ／ｊ分間の遠
心分離を行ない、上層をパスツールピペットで取り出し
た。ＤＮＡを含むこの水層をエチルエーテルで２回抽出
し、フェノールを除去してからエタノール／３０μｌを
加え、−１０’ＱＩＣ２時間放置後、１０．０ＯＯｘＩ
／ｊ分間の遠心分離を行なって、ＤＮＡを沈澱物として
回収した。回収したＤＮＡをエタノール、１００μｌで
１回洗滌し、減圧下で乾燥させてから１．２０μｌの加
熱滅菌した純水に溶解して、供与体ＤＮＡとした。
えて７分間振盪した後、１０，０ＯＯＸＩ／ｊ分間の遠
心分離を行ない、上層をパスツールピペットで取り出し
た。ＤＮＡを含むこの水層をエチルエーテルで２回抽出
し、フェノールを除去してからエタノール／３０μｌを
加え、−１０’ＱＩＣ２時間放置後、１０．０ＯＯｘＩ
／ｊ分間の遠心分離を行なって、ＤＮＡを沈澱物として
回収した。回収したＤＮＡをエタノール、１００μｌで
１回洗滌し、減圧下で乾燥させてから１．２０μｌの加
熱滅菌した純水に溶解して、供与体ＤＮＡとした。
一方、コスミッドベクターｐＨｃ？？ （Ｂａｒｂｒａ
Ｈｏｈｎ ａｔ ａｌ ： Ｇｅｎｅ 、／／、 コタ
／ −Ｊりｌｒ （ｌり♂Ｏ）。
Ｈｏｈｎ ａｔ ａｌ ： Ｇｅｎｅ 、／／、 コタ
／ −Ｊりｌｒ （ｌり♂Ｏ）。
市販品）、２μＩを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣＩ 、
ｐＨ７，２，１０ｍＭジチオスＶイトール、１００ ｍ
Ｍ ＮａＣ１の組成の緩衝液２０μ！中で制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ≠単位と、？７℃で２時間反応させた。さらに７
３℃で７０分間加熱した後、市販の大腸菌由来のアルカ
リホスファターゼ７単位を加えて５０℃で７時間反応さ
せ、その後フェノール処理、エタノール沈澱およびエタ
ノール洗滌をしてから、ベクターＤＮＡとして７０μｌ
の滅菌水に溶解した。
ｐＨ７，２，１０ｍＭジチオスＶイトール、１００ ｍ
Ｍ ＮａＣ１の組成の緩衝液２０μ！中で制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ≠単位と、？７℃で２時間反応させた。さらに７
３℃で７０分間加熱した後、市販の大腸菌由来のアルカ
リホスファターゼ７単位を加えて５０℃で７時間反応さ
せ、その後フェノール処理、エタノール沈澱およびエタ
ノール洗滌をしてから、ベクターＤＮＡとして７０μｌ
の滅菌水に溶解した。
前記供与体ＤＮＡ１Ｏμｌと上記ベクターＤＮＡ／（１
）μ！とを混合し、７０℃で１０分間加熱処理し、室温
まで徐冷した後、緩衝液（０，１，Ａ Ｍ Ｔｒｌｓ
ＨＣＩ 、 ｐＨ７，６，６６ｍＭ ＭｇＣｌ２．０．
／Ｍジチオスンイトール、１０ｍＭＡＴＰ ）’Ｉμｌ
とＴｕＤＮＡリガーゼコμｌとを加えてｎ℃で７を時間
反応させて、ｐＨｃ７９とス）Ｌ／ブトマイセス・バイ
グロスコピカスＤＮＡとの組換体ＤＮＡを作成した。
）μ！とを混合し、７０℃で１０分間加熱処理し、室温
まで徐冷した後、緩衝液（０，１，Ａ Ｍ Ｔｒｌｓ
ＨＣＩ 、 ｐＨ７，６，６６ｍＭ ＭｇＣｌ２．０．
／Ｍジチオスンイトール、１０ｍＭＡＴＰ ）’Ｉμｌ
とＴｕＤＮＡリガーゼコμｌとを加えてｎ℃で７を時間
反応させて、ｐＨｃ７９とス）Ｌ／ブトマイセス・バイ
グロスコピカスＤＮＡとの組換体ＤＮＡを作成した。
この組換体ＤＮＡで大腸菌ＬＥ３タコを形質転換する方
法は、ホーン等の公知の方法によ−た。（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ （ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、６１！、 コタタ
ー３０２（ｌり７り））。
法は、ホーン等の公知の方法によ−た。（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ （ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、６１！、 コタタ
ー３０２（ｌり７り））。
すなわち、先に調製したｐＨＣ７９とストＶブトマイセ
スφバイグロスコピカスＤＮＡとの組換体ＤＮＡＪＡμ
ｌにエタノール１００μｌを加え、−１０℃で２時間放
置後、／ Ｏｒ ０００ Ｘ ／ｉ ／ ’分間の遠心
分離を行なつて、組換体ＤＮＡを沈澱物として回収する
。
スφバイグロスコピカスＤＮＡとの組換体ＤＮＡＪＡμ
ｌにエタノール１００μｌを加え、−１０℃で２時間放
置後、／ Ｏｒ ０００ Ｘ ／ｉ ／ ’分間の遠心
分離を行なつて、組換体ＤＮＡを沈澱物として回収する
。
これに加熱滅菌水：１０１ｔｌを加えて溶解し、この溶
液１０１１７Ｉをホーン等の方法によシ調製されて市販
されている試験管内ファージ粒子形成溶液５０μｌに加
えて、？７°Ｃで１時間反応させ、その後７０μｇ／μ
／ ＤＮａｓｅＩ 。
液１０１１７Ｉをホーン等の方法によシ調製されて市販
されている試験管内ファージ粒子形成溶液５０μｌに加
えて、？７°Ｃで１時間反応させ、その後７０μｇ／μ
／ ＤＮａｓｅＩ 。
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣＩ 、ｐＨ７ｊＣ、／（：１
ｍＭ ＭｇＣｌ２．００１ＭＮａＣ１，０，０３４Ｂ
Ｓ Ａの組成の緩衝液１ｓｏＩｔｉを加えて、７７°Ｃ
でｌＯ分間反応させる。次にこの溶液をｔｏ、 ｏｏｏ
ｘ Ｍ ／ ｓ分間の遠心分離に付して上清を取り、
組換体ＤＮＡをラムダファージ粒子内に取シ込ませる。
ｍＭ ＭｇＣｌ２．００１ＭＮａＣ１，０，０３４Ｂ
Ｓ Ａの組成の緩衝液１ｓｏＩｔｉを加えて、７７°Ｃ
でｌＯ分間反応させる。次にこの溶液をｔｏ、 ｏｏｏ
ｘ Ｍ ／ ｓ分間の遠心分離に付して上清を取り、
組換体ＤＮＡをラムダファージ粒子内に取シ込ませる。
大腸菌に一／：ｌＬＦ、３タコへの形質導入は、以下の
様にして行なった。すなわち、ＬＥ３タコを０．／チマ
ルトースを含むＬ培地Ｃ／ｌポリペプトン、０．３係イ
ーストエキス、ｏ、ｓチＮｉＣ１） ２−に接種し、−
晩培養後、先の組換体な導入したファージ粒子液を加え
、その後その０．１−ずつをｔ、１％寒天、ＳＯμ、９
／ｍｌアンピシリンを含むＬ培地を人−些たシャーＶに
塗布し、３７℃で一晩培養してコロニーを形成させ、組
換体ＤＮＡをもつＬＥＪＰＪをコロニーとして出現させ
た。
様にして行なった。すなわち、ＬＥ３タコを０．／チマ
ルトースを含むＬ培地Ｃ／ｌポリペプトン、０．３係イ
ーストエキス、ｏ、ｓチＮｉＣ１） ２−に接種し、−
晩培養後、先の組換体な導入したファージ粒子液を加え
、その後その０．１−ずつをｔ、１％寒天、ＳＯμ、９
／ｍｌアンピシリンを含むＬ培地を人−些たシャーＶに
塗布し、３７℃で一晩培養してコロニーを形成させ、組
換体ＤＮＡをもつＬＥＪＰＪをコロニーとして出現させ
た。
このコロニーからのアミラーゼ遺伝子をもつ組換体の選
択は、公知のコロニー交雑法（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ 。
択は、公知のコロニー交雑法（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ 。
Ｍ、、 Ｈｏｇｎｓｓａ 、 Ｄ、８．、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｅｔ、 Ｕ ＳＡ η、３
７６）−３２６！、（ｌり７ｊ））によシ行なった。そ
の際のプローブとして３２ｐで標識した１本鎖合成オリ
ゴヌクＶオチドを使用したが、このオリゴヌクＶオチド
は、下記の方法によって得たものである。すなわち、こ
れは、アミラーゼ蛋白のアミノ末端側のアミノ酸配列を
エドマン分解法（Ｊｏｈｎ、Ｅ、８ｈｔｖｅｌｙ ：
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＸ７９．
３／−ψｇ（ｌりｒ７））により決定したーＸ（不明）
−プロリン−プロリン−グリシン−グルタミン−リジン
−スレオニン−バリンの配列から適当な５個の連続した
アミノ酸配列よシ推定される／４Ｃ塩基の長さからなる
オリゴヌクＶオチドをＭ、Ｃａｒｕｔｈｅｒａの方法で
合成して得た少なくとも、２種類からなるもの（ミック
ス・プローブ）である。合成したオリゴヌクＶオチドは
ｒ−５２Ｐ−ＡＴＰとＴＩＩポリヌクレオチドキナーゼ
とを用いて５２Ｐで標識し、板金等の条件でノ〜イプリ
ダイゼイシ冒ンを行なつて（Ｎｕｃｌｅｌｃ Ａｃ１ｄ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ９ Ｊ’７ターｒｙｓ ％（ツタ
♂／））、目的とする組換体遺伝子をもつコロニーを選
別した。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｅｔ、 Ｕ ＳＡ η、３
７６）−３２６！、（ｌり７ｊ））によシ行なった。そ
の際のプローブとして３２ｐで標識した１本鎖合成オリ
ゴヌクＶオチドを使用したが、このオリゴヌクＶオチド
は、下記の方法によって得たものである。すなわち、こ
れは、アミラーゼ蛋白のアミノ末端側のアミノ酸配列を
エドマン分解法（Ｊｏｈｎ、Ｅ、８ｈｔｖｅｌｙ ：
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＸ７９．
３／−ψｇ（ｌりｒ７））により決定したーＸ（不明）
−プロリン−プロリン−グリシン−グルタミン−リジン
−スレオニン−バリンの配列から適当な５個の連続した
アミノ酸配列よシ推定される／４Ｃ塩基の長さからなる
オリゴヌクＶオチドをＭ、Ｃａｒｕｔｈｅｒａの方法で
合成して得た少なくとも、２種類からなるもの（ミック
ス・プローブ）である。合成したオリゴヌクＶオチドは
ｒ−５２Ｐ−ＡＴＰとＴＩＩポリヌクレオチドキナーゼ
とを用いて５２Ｐで標識し、板金等の条件でノ〜イプリ
ダイゼイシ冒ンを行なつて（Ｎｕｃｌｅｌｃ Ａｃ１ｄ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ９ Ｊ’７ターｒｙｓ ％（ツタ
♂／））、目的とする組換体遺伝子をもつコロニーを選
別した。
ｐｓＨ／からα−アミラーゼ遺伝子を放線菌ストンブト
マイすス智リビダンス６６へ導入するには、チェーター
等公知の方法（Ｃｕｒｒ、 Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉａｒｏ
ｂｉｏｌ。
マイすス智リビダンス６６へ導入するには、チェーター
等公知の方法（Ｃｕｒｒ、 Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉａｒｏ
ｂｉｏｌ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、、存、６り（１９１ｒｌ））によった
。すなわち、組換体ｐｓＨ／３０μＩと制限酵素５ｅｔ
１２０単位とを１ｏｏｐｉの＃ｌ）ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｈ
ＣＩ 、 ｐＨ７，２，３ｍＭＭｇＣ１２，７Ｊ ｍＭ
ＮａＣ１の組成の緩衝液中で、？７℃で２時間反応さ
せ、これを００ｌｒ％ＬＧＴ（低融点）アガロースゲル
／ ｇＯｍ Ａ ／ ３時間の電気泳動に付し、ゲルか
らα−アミラーゼ遺伝子を含むバｙドを切り出し、６５
″ＣでフェノールによりＤＮＡを抽出し、エタノールで
沈澱させた。α−アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡの同定
は公知の方法であるサザンブロッティング法（５ｏｕｔ
ｈｅｒｎ、 Ｅ、Ｍ、 ： Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、
、〃、！０３ （ツタ７ｊ））に従い、ｊ×５ｓｃｃＯ
，りＭＮａＣｌ 、 ０．０９ Ｍクエン酸ナトリウム
）を用いて３７℃でハイプリダイゼーシ■／を行ない、
Ｐで標識した先の合成オリゴヌクレオチドをプローブ
として使用した。５ｓｔＩで切断され、回収きれたα−
アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片−μｌを制限酵素５
ａｕ３ Ａ ／単位と、７７°Ｃで７５分間反応させて
から、ＤＮＡをフェノール抽出−エタノール沈澱によ−
て回収し、１０μｌの加熱滅菌水に溶解して、供与体Ｄ
ＮＡとした。一方、公知の放線菌プラスミツドベクター
であるｐｌＪ ７０．２（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅ
ｎｅｒａｌＭｌｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 、ヱ２９ 、
＋２７０３−．２７１４ｔ （／り♂３））ｌμｌとＢ
ｇｌｌ、２単位とを、７７℃で１時間反応させた後、大
腸菌由来のアルカリホスファターゼｏ、ｔ１位を加えて
５０℃で１時間反応させた。その後、ＤＮＡをフェノー
ル抽出−エタノール沈澱によって回収し、ｉｏμｌの加
熱滅菌水に溶解して、ベクターＤＮＡとした。
。すなわち、組換体ｐｓＨ／３０μＩと制限酵素５ｅｔ
１２０単位とを１ｏｏｐｉの＃ｌ）ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｈ
ＣＩ 、 ｐＨ７，２，３ｍＭＭｇＣ１２，７Ｊ ｍＭ
ＮａＣ１の組成の緩衝液中で、？７℃で２時間反応さ
せ、これを００ｌｒ％ＬＧＴ（低融点）アガロースゲル
／ ｇＯｍ Ａ ／ ３時間の電気泳動に付し、ゲルか
らα−アミラーゼ遺伝子を含むバｙドを切り出し、６５
″ＣでフェノールによりＤＮＡを抽出し、エタノールで
沈澱させた。α−アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡの同定
は公知の方法であるサザンブロッティング法（５ｏｕｔ
ｈｅｒｎ、 Ｅ、Ｍ、 ： Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、
、〃、！０３ （ツタ７ｊ））に従い、ｊ×５ｓｃｃＯ
，りＭＮａＣｌ 、 ０．０９ Ｍクエン酸ナトリウム
）を用いて３７℃でハイプリダイゼーシ■／を行ない、
Ｐで標識した先の合成オリゴヌクレオチドをプローブ
として使用した。５ｓｔＩで切断され、回収きれたα−
アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片−μｌを制限酵素５
ａｕ３ Ａ ／単位と、７７°Ｃで７５分間反応させて
から、ＤＮＡをフェノール抽出−エタノール沈澱によ−
て回収し、１０μｌの加熱滅菌水に溶解して、供与体Ｄ
ＮＡとした。一方、公知の放線菌プラスミツドベクター
であるｐｌＪ ７０．２（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅ
ｎｅｒａｌＭｌｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 、ヱ２９ 、
＋２７０３−．２７１４ｔ （／り♂３））ｌμｌとＢ
ｇｌｌ、２単位とを、７７℃で１時間反応させた後、大
腸菌由来のアルカリホスファターゼｏ、ｔ１位を加えて
５０℃で１時間反応させた。その後、ＤＮＡをフェノー
ル抽出−エタノール沈澱によって回収し、ｉｏμｌの加
熱滅菌水に溶解して、ベクターＤＮＡとした。
このようにして得た供与体ＤＮＡとベクターＤＮＡとを
混合し、ＴＩＡＤＮＡリガーセコ単位を加えて３℃で２
時間反応させて、ｐＩＪ７０．２とストンブトマイセス
・バイグロスコピカスのアミラーゼ遺伝子との組換体を
作成した。
混合し、ＴＩＡＤＮＡリガーセコ単位を加えて３℃で２
時間反応させて、ｐＩＪ７０．２とストンブトマイセス
・バイグロスコピカスのアミラーゼ遺伝子との組換体を
作成した。
この組換体のストンブトマイセス・リビダンス６６への
形質転換は、以下のように行なった。すなわち１．１．
ＯｍｌのＹＥＭＥ培地（３１１４シ日糖、０．３％イー
ストエキス、０．３％バクトペプトン、０．３％マルト
エキス、ノチグルコース、！ ｍＭ ＭｇＣｌ２．０、
ｊｄＪグリシン、ｐＨ７，７７）にストンブトマイセス
・リビダンス６６を接穏し、３．２℃で３を時間振盪培
養を行ない、／ ０．０００ Ｘ ｇ ７１０分間の遠
心分離で菌糸を集め、７０％シロ糖溶液で１回洗浄した
後、１ｏｍｌのＰ培地（にｌ、ｊＭシ日糖、１．弘ｍＭ
Ｋ２Ｓ０ｕ 。
形質転換は、以下のように行なった。すなわち１．１．
ＯｍｌのＹＥＭＥ培地（３１１４シ日糖、０．３％イー
ストエキス、０．３％バクトペプトン、０．３％マルト
エキス、ノチグルコース、！ ｍＭ ＭｇＣｌ２．０、
ｊｄＪグリシン、ｐＨ７，７７）にストンブトマイセス
・リビダンス６６を接穏し、３．２℃で３を時間振盪培
養を行ない、／ ０．０００ Ｘ ｇ ７１０分間の遠
心分離で菌糸を集め、７０％シロ糖溶液で１回洗浄した
後、１ｏｍｌのＰ培地（にｌ、ｊＭシ日糖、１．弘ｍＭ
Ｋ２Ｓ０ｕ 。
１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、０．ＩＩ ｍＭ ＫＨ２ＰＯ
ｕ 、Ｂ ｍＭ ＣａＣｌ２ ．３ｍＭ Ｔ Ｅ Ｓ緩
衝液ｐＨ７，，２）に懸濁させた。この菌糸液に最終濃
度／ｍ９／７の卵白リゾチームを加え、３２°Ｃで６０
０分間反応せてプロトプラストを形成させ、プロトプラ
スト化しない菌糸は綿沢過で除去した。生成プロトプラ
ストを♂０ＯｘＩ／７分間の遠心分離で集め、更にＰ培
地λｍｌに懸濁させた。プロトプラスト液ｉｏｏμＩｔ
、３／２濃度のＰ−マノイン酸緩衝液（Ｊ、、！１％シ
冒糖、）、 ４’ ｍＭ Ｋ２Ｓ０ｕ 。
ｕ 、Ｂ ｍＭ ＣａＣｌ２ ．３ｍＭ Ｔ Ｅ Ｓ緩
衝液ｐＨ７，，２）に懸濁させた。この菌糸液に最終濃
度／ｍ９／７の卵白リゾチームを加え、３２°Ｃで６０
０分間反応せてプロトプラストを形成させ、プロトプラ
スト化しない菌糸は綿沢過で除去した。生成プロトプラ
ストを♂０ＯｘＩ／７分間の遠心分離で集め、更にＰ培
地λｍｌに懸濁させた。プロトプラスト液ｉｏｏμＩｔ
、３／２濃度のＰ−マノイン酸緩衝液（Ｊ、、！１％シ
冒糖、）、 ４’ ｍＭ Ｋ２Ｓ０ｕ 。
１００ ｍＭ ＣａＣｌ２．５０ｍＭ Ｔｒｉｍ−Ｍａ
ｌｅｉｃ ａｃｉｄ緩衝液、ｐＨ１，０） １００Ｐｌ
！、組換体ＤＮＡ溶液５Ｏ７ｔｌＪおよび３７！μｌの
ポリエチレングリコール溶液（３３％ボリエテＶングリ
コールｆ１０００／Ｐ−マレイン縁緩衝液）を加えて混
合し、Ａθ秒間室温に放置後、Ｐ培地ｊｍｌで稀釈し、
１００ Ｘ ９７１０分間の遠心分離でプロトプラスト
を集めてλｍｌのＰ培地に１′諒濁させた。この菌液を
０．’ｉｍｌずつ２０枚のシャーＶに調製したＲ２ＹＥ
寒天培地（０，３Ｍシ日糖、／４ｍＭＫ２Ｓ０ｕ 、５
０ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、／％グルコース、０，０ｔｑｂ
カザミノ酸、０．４’ ｍＭ ＫＨ２ＰＯｕ 、 ２０
ｍＭ ＣａＣ＋２．０．３％プロリン１．ｔ５ｍＭＴＥ
８緩衝液、ｐＨ７，，２、ｊ ｍＭ ＮａＯＨ、０，タ
チイーストエキス、２．２％寒天）に夫々塗布し、３／
°Ｃで一晩培養した後、０．１％ニー−トリエンドブロ
ス、’％カザミ／ｍ、！００μｇ／ｍｌチロシン１．ｚ
ｏｏμｇ／−チオストＶプトン、ｊ μ９／ ｍｌ Ｃ
ｕ５Ｏｕ ＠ｊＨ２０、０，Ｊ’ ％寒天からなる培地
を重層する。更に３／”Ｃでλ日間培養する。その結果
、ｐＩＪ７０２Ｂｇｌ Ｉ切断部位に新らたなりＮＡ断
片を含む組換体プラスミドを持つコロニーは白色とな、
り 、ｐｌＪ ７０λそのものを持つコロニーは黒色と
なる。この白色コロニー約３００個を夫々ＹＭＳ寒天培
地（／％イーストエキス、１９Ｉ＋マルトエキス、３チ
スターチ、２０μ９／ｒｕｌチオストＶプトン、／、ｉ
ｔ％寒天、ｐＨ７０，２）とＮＡ培地（ｏ、コチ二一一
トリエントプロス、ノチカザミノ酸、！ＱＯμ２／ｍｌ
チロシン、５０μＱ／ｍ、ｌチオストレプトン、！μｇ
／ｍ１ＣｕＳＯｕ ｅ！ Ｈ２Ｏ、）、！チ寒天、ｐＨ
７，２）にレプリカ法で移して３／°Ｃで３日間培養す
る。公知の方法（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｔｏｌ、、μ！、
弘／Ａ −！、２Ｆ （ツタ７グ））を用いてＶＭＳ培
地上に生育した細菌コロニーなｌ２−Ｋｌ溶液で処理し
、コロニーの周辺に白色の輪を生じたものを検出した。
ｌｅｉｃ ａｃｉｄ緩衝液、ｐＨ１，０） １００Ｐｌ
！、組換体ＤＮＡ溶液５Ｏ７ｔｌＪおよび３７！μｌの
ポリエチレングリコール溶液（３３％ボリエテＶングリ
コールｆ１０００／Ｐ−マレイン縁緩衝液）を加えて混
合し、Ａθ秒間室温に放置後、Ｐ培地ｊｍｌで稀釈し、
１００ Ｘ ９７１０分間の遠心分離でプロトプラスト
を集めてλｍｌのＰ培地に１′諒濁させた。この菌液を
０．’ｉｍｌずつ２０枚のシャーＶに調製したＲ２ＹＥ
寒天培地（０，３Ｍシ日糖、／４ｍＭＫ２Ｓ０ｕ 、５
０ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、／％グルコース、０，０ｔｑｂ
カザミノ酸、０．４’ ｍＭ ＫＨ２ＰＯｕ 、 ２０
ｍＭ ＣａＣ＋２．０．３％プロリン１．ｔ５ｍＭＴＥ
８緩衝液、ｐＨ７，，２、ｊ ｍＭ ＮａＯＨ、０，タ
チイーストエキス、２．２％寒天）に夫々塗布し、３／
°Ｃで一晩培養した後、０．１％ニー−トリエンドブロ
ス、’％カザミ／ｍ、！００μｇ／ｍｌチロシン１．ｚ
ｏｏμｇ／−チオストＶプトン、ｊ μ９／ ｍｌ Ｃ
ｕ５Ｏｕ ＠ｊＨ２０、０，Ｊ’ ％寒天からなる培地
を重層する。更に３／”Ｃでλ日間培養する。その結果
、ｐＩＪ７０２Ｂｇｌ Ｉ切断部位に新らたなりＮＡ断
片を含む組換体プラスミドを持つコロニーは白色とな、
り 、ｐｌＪ ７０λそのものを持つコロニーは黒色と
なる。この白色コロニー約３００個を夫々ＹＭＳ寒天培
地（／％イーストエキス、１９Ｉ＋マルトエキス、３チ
スターチ、２０μ９／ｒｕｌチオストＶプトン、／、ｉ
ｔ％寒天、ｐＨ７０，２）とＮＡ培地（ｏ、コチ二一一
トリエントプロス、ノチカザミノ酸、！ＱＯμ２／ｍｌ
チロシン、５０μＱ／ｍ、ｌチオストレプトン、！μｇ
／ｍ１ＣｕＳＯｕ ｅ！ Ｈ２Ｏ、）、！チ寒天、ｐＨ
７，２）にレプリカ法で移して３／°Ｃで３日間培養す
る。公知の方法（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｔｏｌ、、μ！、
弘／Ａ −！、２Ｆ （ツタ７グ））を用いてＶＭＳ培
地上に生育した細菌コロニーなｌ２−Ｋｌ溶液で処理し
、コロニーの周辺に白色の輪を生じたものを検出した。
この様にして得られたα−アミラーゼ遺伝子を含む組換
体プラスミドを持つ菌の中の６株から、プラスミドを公
知の方法（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｔｏｌ、 、生１．２．
２７ （／り７ｔ））で抽出した。そのうちの一つのプ
ラスミドは約２．クキロベース（Ｋｂ）のＤＮＡ断片が
組込まれており、このプラスミドをｐＭＳＩＯｌとした
。このλ、３Ｋｂの制限酵素地図を第２図に示すと共に
９Ｍ８１０／の制限酵素切断地図を第３図に示す。
体プラスミドを持つ菌の中の６株から、プラスミドを公
知の方法（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｔｏｌ、 、生１．２．
２７ （／り７ｔ））で抽出した。そのうちの一つのプ
ラスミドは約２．クキロベース（Ｋｂ）のＤＮＡ断片が
組込まれており、このプラスミドをｐＭＳＩＯｌとした
。このλ、３Ｋｂの制限酵素地図を第２図に示すと共に
９Ｍ８１０／の制限酵素切断地図を第３図に示す。
９Ｍ８１０１に組込まれているα−アミラーゼがストレ
プトマイセス・バイグロスコピカスのα−アミラーゼと
同一のものであるか否かを調べる為に、ｐＭＳＩＯｌを
持つストレプトマイセス・リビダンス６６をＶＭＳ培地
に接種し、３／”Ｃ，でλ日間培養後の培地上清を遠心
分離して採取した。この上清１０μｌを予めストレプト
マイセス・バイグロスコピカス由来のα−アミラーゼで
感作して得たウサギ由来の抗α−アミラーゼ血清１０μ
ｌとオフテロニー形成法で免疫沈降反応を行な−た結果
、−ＭＳＩＯ７を持つス）Ｌ／ブトマイセス・リビダン
ス６６の培地上清とストレプトマイセス０バイグロスコ
ピカス由来のα−アミラーゼは均一な沈降線を形成し、
両者が同一であると判明した。
プトマイセス・バイグロスコピカスのα−アミラーゼと
同一のものであるか否かを調べる為に、ｐＭＳＩＯｌを
持つストレプトマイセス・リビダンス６６をＶＭＳ培地
に接種し、３／”Ｃ，でλ日間培養後の培地上清を遠心
分離して採取した。この上清１０μｌを予めストレプト
マイセス・バイグロスコピカス由来のα−アミラーゼで
感作して得たウサギ由来の抗α−アミラーゼ血清１０μ
ｌとオフテロニー形成法で免疫沈降反応を行な−た結果
、−ＭＳＩＯ７を持つス）Ｌ／ブトマイセス・リビダン
ス６６の培地上清とストレプトマイセス０バイグロスコ
ピカス由来のα−アミラーゼは均一な沈降線を形成し、
両者が同一であると判明した。
α−アミラーゼのアミノ末端のアミノ酸配列に相当する
合成オリゴヌクレオチドは第２図に示されるＨｐａ Ｉ
とＳｔｕ Ｉに挾まれるＤＮＡ断片上にハイブリダイズ
することから、この部分の塩基配列を公知の方法（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｌｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｌ、侵、弘タター１
７．０ （／りざＯ）、同〃ηいＪ−７ｇ（ｌりｔ３）
）で決定した。その結果の一部を第２図に示す。蛋白開
始コドンであるＡＴＧの配列よシ３個のアミノ酸からな
るシグナルペプチドを構成していると思われる塩基配列
部分に続き先に決定したアミノ末端のアミノ酸配列に相
当する塩基配列が同定された。
合成オリゴヌクレオチドは第２図に示されるＨｐａ Ｉ
とＳｔｕ Ｉに挾まれるＤＮＡ断片上にハイブリダイズ
することから、この部分の塩基配列を公知の方法（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｌｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｌ、侵、弘タター１
７．０ （／りざＯ）、同〃ηいＪ−７ｇ（ｌりｔ３）
）で決定した。その結果の一部を第２図に示す。蛋白開
始コドンであるＡＴＧの配列よシ３個のアミノ酸からな
るシグナルペプチドを構成していると思われる塩基配列
部分に続き先に決定したアミノ末端のアミノ酸配列に相
当する塩基配列が同定された。
更に、蛋白開始コドンのＡＴＧのｊ′側側流流ｊ′−Ｇ
ＡＡＧＧＡＧ−Ｊ’の塩基配列（第７図のｚ）が見える
が、これはピップ等の報告（Ｂｉｂｂ、 Ｍ、Ｊ。
ＡＡＧＧＡＧ−Ｊ’の塩基配列（第７図のｚ）が見える
が、これはピップ等の報告（Ｂｉｂｂ、 Ｍ、Ｊ。
Ｃｏｈｅｎ、８．Ｎ、Ｍｏ１．ＧｅｎＧｅｎｅｔ、、
／１７．２６ｋ （／！７ｆ、Ｚ））しているストレプ
トマイセス・リビダンスのリポソーム構成成分の／Ａ
５ｒＲＮＡの３′末端側の塩基配列Ｊ’−ＵＣＵＵＵＣ
ＣＵＣＣＡＣＵＡＧ −ｊ’の一部とよく塩基対を形成
することが予想されこの部分がリポソーム結合部位とな
ることが予想される。第１図に掲げたメチオニンからグ
ルタミンに到る３個のアミノ酸がα−アミラーゼの分泌
シグナル配列であることをこのことは裏付けている。
／１７．２６ｋ （／！７ｆ、Ｚ））しているストレプ
トマイセス・リビダンスのリポソーム構成成分の／Ａ
５ｒＲＮＡの３′末端側の塩基配列Ｊ’−ＵＣＵＵＵＣ
ＣＵＣＣＡＣＵＡＧ −ｊ’の一部とよく塩基対を形成
することが予想されこの部分がリポソーム結合部位とな
ることが予想される。第１図に掲げたメチオニンからグ
ルタミンに到る３個のアミノ酸がα−アミラーゼの分泌
シグナル配列であることをこのことは裏付けている。
微生物の寄託
本発明に関連する微生物は、工業技術院微生物工業技術
研究所（機工研）に下記の通シに寄託されている。
研究所（機工研）に下記の通シに寄託されている。
Ｓ、ｈｙｇｒｏｇｅｏｐｔｃｕｓ ”
５Ｆ１０□ ６０２ 昭和９年り月２日Ｓ、１ｉｖｉｄ
ａｎｓ ＆＆ ” 乙りＦ、２ 昭和ｓｔｒ年３月１０
日８、 ｌ１ｖｌｄａｎｓ ＡＡ（ｐＭｓ勝ｊ ７１７
１２ 昭和５９年−月２ｇ日Ｓ、 １ｌｖｌｄａｎａ
＆＆（ｐＩＪ−７ゐ３ 。イ。７肴弘 Ｅ、ｃａｌｌ ＬＥＪり、２ ７ＩＩ７７ ／／Ｅ、ｃ
ｏｌｉ ＬＥＪり、２（ｐｓＨ／） ７１１１３ ／を
備考 一１ｆ／ 菌学的性質は特公昭ｇ９−／１７１号公報に
記載されている。
ａｎｓ ＆＆ ” 乙りＦ、２ 昭和ｓｔｒ年３月１０
日８、 ｌ１ｖｌｄａｎｓ ＡＡ（ｐＭｓ勝ｊ ７１７
１２ 昭和５９年−月２ｇ日Ｓ、 １ｌｖｌｄａｎａ
＆＆（ｐＩＪ−７ゐ３ 。イ。７肴弘 Ｅ、ｃａｌｌ ＬＥＪり、２ ７ＩＩ７７ ／／Ｅ、ｃ
ｏｌｉ ＬＥＪり、２（ｐｓＨ／） ７１１１３ ／を
備考 一１ｆ／ 菌学的性質は特公昭ｇ９−／１７１号公報に
記載されている。
肴λ 菌学的性質は特願昭！；ｌ−１．２．２７７号明
細書に記載されている。
細書に記載されている。
苦３ 当該プラスミドによつて導入されたジェノタイプ
または当該プラスミド作成時の遺伝子組換えに際して生
じたかも知れない使用ベクタープラスミドからのＤＮＡ
鎖の部分的欠落によるジェッタイブの変化を除けば、こ
れらの菌の７エノタイプまたは菌学的性質は宿主菌のそ
れと本質的には変らない。
または当該プラスミド作成時の遺伝子組換えに際して生
じたかも知れない使用ベクタープラスミドからのＤＮＡ
鎖の部分的欠落によるジェッタイブの変化を除けば、こ
れらの菌の７エノタイプまたは菌学的性質は宿主菌のそ
れと本質的には変らない。
＋＜ｚ 菌学的性質は、［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇＪ （Ｔ。
ｎｉｎｇＪ （Ｔ。
Ｍａｎｉａｔｉｉ １Ｉｉｉ Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に記載されて
いる。
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に記載されて
いる。
なお、本発明で使用するのに適したプラスミドとしてｐ
ｓＦ ＡｔりおよびｐｓＦ ７Ａｊがあることは前記し
たところであるが、このプラスミドを内包する微生物で
あるＳ、 ｐｌａｔｅｎｓｔｓ ５Ｆ−Ａｉｒ？および
Ｓ。
ｓＦ ＡｔりおよびｐｓＦ ７Ａｊがあることは前記し
たところであるが、このプラスミドを内包する微生物で
あるＳ、 ｐｌａｔｅｎｓｔｓ ５Ｆ−Ａｉｒ？および
Ｓ。
ｆｒａｄｉａｅ ＳＦ ７Ａｊはそれぞれ機工研条寄第
１Ｊ／号および同第１２≠号として寄託されている。
１Ｊ／号および同第１２≠号として寄託されている。
第１図は、本発明によるＤＮＡ鎖の塩基配列（ＸからＹ
ｌで）を示すものである。 第２図は、プロモーター、シグナルペプチドをコードす
る遺伝子を含むアミラーゼ遺伝子の制限酵素地図である
。 第３図は、組換プラスミドｐＭｓ １０／の制限酵素切
断地図である。斜線を附した部分が第２図のアミラーゼ
遺伝子を含む部分である。 出願人代理人 猪 股 清 手続補正置部式） 昭和５９年６月１８日 特許庁長官 若杉和夫 殿 １ 事件の表示 昭和５９年 特許願 第 ４５３１５ 号２ 発明の名
称 シグナルペプチドをコードする遺伝子 およびその利用 −３補正をする壱 事件との関係 特許出願人 （６０９）明治製菓株式会社 ４代理人 昭 和 ５９年 ５ 月 ９ 日 （発送日 昭和５９年５月２９日） ６ 補正の対象 図 面 手続補正佑 昭和６０年３り／７日 特許庁長官 志賀 学 殿 昭和５９年 特許願 第４５３１５号 ２ 発明の名称 シグナルペプチドを」−ドする遺伝：ｆおよびその利用 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 （６０９）明治製菓株式会社 ４ 代 理 人 明りＩｌ書の「発明の詳細な説明」の欄および図面 ８ 補正の内容 （１） 明細書の第７頁第１７行 「２８個ＪをＩ’３０個」と補正する。 （２） 同第７頁最終行〜第８頁第３行ｒＭｅｔ−ＧＩ
ｎＪを、下記の通りに補正する。 ｒＭｅｔ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Δｒｇ−
Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌ
ａ−Ａｌａ−Ａｔａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ
−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−ＡｌａＪ（３）
第１図を、添付のものの通りに補正ケる。 第１図 手続ンｆ１７正書 昭和６０年３ 月ニア Ｅｌ 特許庁長官 志賀 学 殿 １ 事件の表示 １１１１和５９イ１ 特ｉＪ願 第４５３１５号２ 発
明の名称 シグナルペプチドをコードす゛る遺伝子およびその利用 ３ ？＋ｌｉ正をりる者 事件どの関係 特許出願人 （６０９）明治製菓株式会社 ４ 代 理 人 東京都千代）Ｊ１区火の内三丁ｌ：１２番３号電話東５
；ミ（２１１）２３２１人代表８ 補正の内容 明細書を、−ト記の通りに補正りる。 （１） 第２０頁ｌＴ１０行ｒＢＱＩ ＩＪを、ｒＢＱ
１川」と補正。 （２） 第２２頁十から第３行ｒＢａ Ｉ ＩＪを、ｒ
ｏｏｆ］ＩＪと補正。 （３） 第２５頁第２行「２８個」を、「３０個」と補
正。 （４） 第２５頁第１５行「グルタミン」を、［アラニ
ン］ど補正。 （５） 第２５頁第１６行「２８個」を、ｒ３０個」と
補正。 （６） 第２６頁受託日の欄の第１行［昭和４５年９Ｊ
］２０」を、「昭和４５年６月１１ＥＩＪと補正。
ｌで）を示すものである。 第２図は、プロモーター、シグナルペプチドをコードす
る遺伝子を含むアミラーゼ遺伝子の制限酵素地図である
。 第３図は、組換プラスミドｐＭｓ １０／の制限酵素切
断地図である。斜線を附した部分が第２図のアミラーゼ
遺伝子を含む部分である。 出願人代理人 猪 股 清 手続補正置部式） 昭和５９年６月１８日 特許庁長官 若杉和夫 殿 １ 事件の表示 昭和５９年 特許願 第 ４５３１５ 号２ 発明の名
称 シグナルペプチドをコードする遺伝子 およびその利用 −３補正をする壱 事件との関係 特許出願人 （６０９）明治製菓株式会社 ４代理人 昭 和 ５９年 ５ 月 ９ 日 （発送日 昭和５９年５月２９日） ６ 補正の対象 図 面 手続補正佑 昭和６０年３り／７日 特許庁長官 志賀 学 殿 昭和５９年 特許願 第４５３１５号 ２ 発明の名称 シグナルペプチドを」−ドする遺伝：ｆおよびその利用 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 （６０９）明治製菓株式会社 ４ 代 理 人 明りＩｌ書の「発明の詳細な説明」の欄および図面 ８ 補正の内容 （１） 明細書の第７頁第１７行 「２８個ＪをＩ’３０個」と補正する。 （２） 同第７頁最終行〜第８頁第３行ｒＭｅｔ−ＧＩ
ｎＪを、下記の通りに補正する。 ｒＭｅｔ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Δｒｇ−
Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌ
ａ−Ａｌａ−Ａｔａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ
−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−ＡｌａＪ（３）
第１図を、添付のものの通りに補正ケる。 第１図 手続ンｆ１７正書 昭和６０年３ 月ニア Ｅｌ 特許庁長官 志賀 学 殿 １ 事件の表示 １１１１和５９イ１ 特ｉＪ願 第４５３１５号２ 発
明の名称 シグナルペプチドをコードす゛る遺伝子およびその利用 ３ ？＋ｌｉ正をりる者 事件どの関係 特許出願人 （６０９）明治製菓株式会社 ４ 代 理 人 東京都千代）Ｊ１区火の内三丁ｌ：１２番３号電話東５
；ミ（２１１）２３２１人代表８ 補正の内容 明細書を、−ト記の通りに補正りる。 （１） 第２０頁ｌＴ１０行ｒＢＱＩ ＩＪを、ｒＢＱ
１川」と補正。 （２） 第２２頁十から第３行ｒＢａ Ｉ ＩＪを、ｒ
ｏｏｆ］ＩＪと補正。 （３） 第２５頁第２行「２８個」を、「３０個」と補
正。 （４） 第２５頁第１５行「グルタミン」を、［アラニ
ン］ど補正。 （５） 第２５頁第１６行「２８個」を、ｒ３０個」と
補正。 （６） 第２６頁受託日の欄の第１行［昭和４５年９Ｊ
］２０」を、「昭和４５年６月１１ＥＩＪと補正。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 添付第７図のＸからｙｔでのアミノ酸配列を有す
るペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡからな
るものであることを特徴とする、ストＬ／ブトマイセス
属細菌を宿主とする宿主−ベクター系において該ベクタ
ーＤＮＡに組込んで使用すべき、シグナルペプチドをコ
ードする遺伝子のＤＮＡ鎖。 コ、塩基配列が碓付第７図の塩基配列のうちＸからＹま
でのものであるものまたはその縮重異性体である、特許
請求の範囲第７項に記載のＤＮＡ鎖。 ３、ストレプトマイセス属細菌がストレプトマイセス・
バイグロスコピカスである、特許請求の範囲第１項に記
載のＤＮＡ鎖。 ｌ＋ ストレプトマイセス・バイグロスコピカス５Ｆｌ
ｏｒｕ株またはその変異株由来の菌体外α−アミラーゼ
をコードする塩基配列のＤＮＡ鎖の形態にある、特許請
求の範囲第１〜３項のいずれかノ項に記載のＤＮＡ鎖。 ！、ストレプトマイセス属細菌を宿主とする宿主−ベク
ター系において使用すべきベクタープラスミドにストレ
プトマイセス・バイグロスコピカス８Ｆｉ０１１１株ま
たはその変異株由来の菌体外α−アミラーゼをコードす
る塩基配列のＤＮＡ＠を組込みかつ該ＤＮＡ鎖の遺伝情
報の発現に必要なりＮＡを持たせたものであることを特
徴とする、ストレプトマイセス属細菌を形質転換させる
べきベクタープラスミド。 ６、ストレプトマイセス属細菌がストレプトマイセス・
パイグロスコピカス菌である、特許請求の範囲第！項に
記載のベクタープラスミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59045315A JPS60188079A (ja) | 1984-03-09 | 1984-03-09 | シグナルペプチドをコ−ドする遺伝子およびその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59045315A JPS60188079A (ja) | 1984-03-09 | 1984-03-09 | シグナルペプチドをコ−ドする遺伝子およびその利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60188079A true JPS60188079A (ja) | 1985-09-25 |
Family
ID=12715868
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59045315A Pending JPS60188079A (ja) | 1984-03-09 | 1984-03-09 | シグナルペプチドをコ−ドする遺伝子およびその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60188079A (ja) |
-
1984
- 1984-03-09 JP JP59045315A patent/JPS60188079A/ja active Pending
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