JPS5967225A - ユツカの組織培養によるステロイド類およびステロイドグリコシド類の製造 - Google Patents

ユツカの組織培養によるステロイド類およびステロイドグリコシド類の製造

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JPS5967225A
JPS5967225A JP58168091A JP16809183A JPS5967225A JP S5967225 A JPS5967225 A JP S5967225A JP 58168091 A JP58168091 A JP 58168091A JP 16809183 A JP16809183 A JP 16809183A JP S5967225 A JPS5967225 A JP S5967225A
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yutsuka
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plant
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steroids
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JP58168091A
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English (en)
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イ−・ジヨン・スタバ
ジ−ン・ジエ−・マツカ−シ−
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University of Michigan
Original Assignee
University of Michigan
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J71/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton is condensed with a heterocyclic ring
    • C07J71/0005—Oxygen-containing hetero ring

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明は、ユツカ（ｙｕｃｃａ）植物の連続的増殖培養
物、即ち細胞、根−細胞及び新芽培養物の確立と維持及
びその培養物からのステロイＰ及びステロイドグリコシ
Ｐの抽出による、放射性同位元素標識ステロイド及びス
テロイドグリコシｒを含む有用なステロイド類及びステ
ロイドグリコ７ド類の製造方法に向けられたものである
。植物組織培養物ハユツカステロイドグリコクＰ類（サ
ハセニン類）の独特な生物学的源泉である。
従来技術 各種植物組織培養物系の開始、維持及び用途（ま文献に
よく記載されているし［植物組織と紺、胞培養（Ｐｌａ
ｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ）Ｊ　、　（Ｂｏｔａｎ−ｉｃａｌ　Ｍｏｎｏｇｒａ
ｐｂｓ、第１１巻％Ｈ，Ｅ、５ｔｒｅｅｔ（Ｅｄ）。
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　
ｐｒｅｓｓ出版、１９７７年）〕。
ストース、ローゼンパーグ及びブレット等（Ｓｔ□ｈｓ
。
ＲｏｓｅｎｂｅｒｇおよびＢｕｌ　１ｅｔｓ、　Ｐ　Ｉ
ａｎｔａ　Ｍｅｄｉｃａ　、第ｒ巻。
第２５７−２６１頁、１９７５年）は植物培養物におけ
るステロイド及びステロール代謝についての文献の包括
的総説を刊行した。
各種ユツカ植物種はステロイドサポニン類ヲＫｍ生する
（　Ｒｏｔｈｍａｎ等の米国特許第２，７１５，１２２
号明細書およびＷａｌｌ等の米国特許第２，８９５，９
５３号明細書参照）。すぽゲニン類はユツカ植物の各種
部分から単離されてきた（ＳｔｏｈｓおよびＲｏｓｅｎ
ｂｅｒｇ　。
Ｌｌｏｙｄｉａ、第関巻（３）、第１８１−１９４頁、
　１９７５年）。
ユツカの大部分のステロイド類はサルササポゲニン、そ
の異性体のスミラゲニン、マルコゲニン。
チザゲニン、ヘコゲニン、及びギトゲニンである。
ジオスゲニンのステロイｒホルモンの前駆体としての使
用によりステロイー源としての植物組織培養物の検討が
もたらされた。ヤング、スタｄ及びギム等（Ｊｈａｎｇ
、　５ｔａｂａおよびＫｉｍ、　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ第９
巻（４）、第２５３−２５９頁、１９７４年）は、はぼ
４乾燥重量％のステロイドグリコ／Ｐ類を産生ずるパナ
ツクスギンケポリウム（Ｐａｎａｘ　ｑｕｉｎｑｕｅｆ
ｏｌｉｕｍ。
アメリカニンジン）及びノ９ナツクスギンセング（Ｐａ
ｎａｘ　ｇｉｎｓｅｎｇ　ｌｌチョウセンニンジン）ノ
未分化カルス及び細胞懸濁液を確立した。ニンジン根或
いは細胞培養物によるニンジンサポニンＨ＆に対して、
メツツ及びラングＣＭｅｔｚ　＆　Ｌａｎｇ）は西独特
許第１，２１６，００９号（１９６６年）を受け、右岸
は特公昭４８−３１９１７号（１９７３年）を受けた。
ジオスコリ了（１）　１ｏｓｃｏｒｅａ　）種の未分化
細胞培養物によるステロイドジオスゲニンの製造につい
て幾つかの報告がある（　Ｍａｒｓｈａｌ　＋及びＳ　
ｔａｂａ、　Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　。
第１５巻、第５３−５５頁、１９７６年；Ｔａｉ及びＱ
ｏｌｄ−ｂｅｒｇ、　Ｐｌａｎｔａ　Ｍｅｄｉｃａ　、
第４４巻、第１０７−１１０頁、１９８２年；　Ｔｏｍ
ｉｔａ等、　Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第９巻、
第１１１−１１４頁、１９７０年）。ストース等ｔｐｈ
ｙ−ｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１３巻、第２１４５−
２１４８頁、　１９７４年）は［４−”Ｃ−２２，２３
−３Ｈ〕クトステロールをジオスコリ了・デルトイデア
（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ　ｄｅｌｔ−ｏｉｄｅａ　）細胞
懸濁液のジオスゲニンに導入した。ストース等（上記文
献、１９７４年）は固体培地上に生育したユツカ拳グラ
ウカ（Ｙｕｃｃａ　ｇｌａｕｃａ　）の未分化カルス培
養物はザボゲニンギトゲニン及び微量のサポゲニンマル
コゲニン乞産生することを示した。しかしながら、カル
ス培養物を液体培地中に継代し、懸濁培養液として生育
すると、ステロイドザボゲニン類を生合成する能力は限
定されたものであった（上記３　ｔｏｈｓ等の文献、　
１９７５年）。
キンテｏ　（Ｑｕｉｎｔｅｒｏ）等（ＩＡＰＴＣＡｂｓ
ｔｒ、、　１９７４年、７月、第１１−１６頁、１９８
２年、東京）は、ユツカフイリフエーラ（Ｙｕｃｃａ　
ｆｉｌｉｆｅｒａ）のカルス細胞ハステロイドサルササ
ポゲニンを含有すると報告した。ジエイン、ローゼンパ
ーグ及びストース等（Ｊａｉｎ、　Ｈｏｓｅｎｂｅｒｇ
および５ｔｏｈｓ、　ｐｌａｎｔａ　Ｍｅｄ、第３１巻
、第１０９−１１１頁、１９７７年）はトリザネラーフ
ェニウムーグラエカム（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ　ｆａｅ
ｎｉｕｍ−ｇｒａｅｃｕｍ　）のカルス培養物からすｌ
ゲニン類のチゴゲニン及びギトゲニンを単離した。
今日まで、ユツカ組織培養物からのユツカステロイドグ
リコシド類の製造は報告されていない。
発明の概要 本発明は広義において、ユツカ組織培養物からのユツカ
ステロイドグリコシＰ類の製造方法に向けられたもので
ある。
ユツカ植物の組織培養物は、先ず成長調整物質を含有す
る栄養植物細胞培地上に確立される。この培養物は、細
胞、根−細胞或いは新芽組織であってもよいが、カルス
が産生されるまで生育条件下に維持される。この培養物
を成長調整物質を含有する液体栄養植物細胞培地に移す
ことにより継代培養する。この継代培養液を最・適培養
生育及びステロイｒグリコシＰ産生が達成されるまで、
通常、継代培養後約４〜６週間、生育条件下に維持する
。ユツカ植物組織培養物を次いで培地から採取し、ステ
ロイＰグリコクド類を抽出する。培養生育は全くの暗闇
から全光の範囲の条件下で起こるが、ステロイＰグリコ
シＰ産生がより多くもたらされるので培養物は光の中で
生長させる方が好ましい。ステロイド類は、ステロイＰ
グリコクド類から酸加水分解により分子の糖部分な除去
して得られる。初期組織培養物中に放射性同位元素標識
前駆体を導入することにより、放射性同位元素標識ステ
ロイｒグリコシＰ類及びステロイド類を製造する。
好ましい実施態様の具体的な説明 ステロイドグリコシＰ類（サポニン類）はステロイド（
サポゲニン）及び糖より構成されている。
現在、ユツカ植物の部分として添加されているユツカ植
物からのすｓｐ二ノン類、動物飼料添加剤として使用さ
れている。ユツカ植物は、砂漠及び半乾燥気候領域、例
えばアメリカの南西部及びメキシコに生育する。それら
は、収穫量及び利用可能性に関しては気候の変化に支配
される。強い繊維状若芽は収穫機械に対して特別の問題
な提起する。
このために、若芽はしばしば手で収穫されている。
ｆｊ＃維状ユツカ植物組織は容易に抽出することができ
ず、特別のプレス或いは粉砕機な必要とする。
これに対して、ユツカの組織懸濁培養液は容易ｉ’？［
立すれ、ユツカステロイドグリコンＰ類の管理可能な生
物学的源泉である。これらの培養液は。
連続的に且つよく規定された培養条件下で維持すること
ができる。ステロイドグリコシ１２類は容易に採取され
、抽出される。ユツカ細胞及び器官培養物は迅速に生育
する。ユツカ組織培養によるステロイｒグリコシＰ製造
は培養条件を操作することにより高められ、且つ制御す
ることができる。
更に、これらの組織培養物は放射性同位元累標識基質と
共に容易にインキュベートされて現在生化学その他の応
用用に市販されていない放射性同位元累標識サポニン類
を生合成することができる。
本発明は、特にユツカ・シジゲラ（Ｙｕｃｃａ　ｓｃｈ
ｉ−ｄｉｇｅｒａ）について説明されろが、本発明はユ
ツカ植物の全ての種について適用可能である。これらの
具体例としてはＹ、ペニンシュラリス（Ｙ、ｐｅｎｉ−
ｎｓｕｌａｒｉｓ　）、Ｙ、ホイップライ（Ｙ、　ｗｈ
ｉｐｐｌｅｉ　）、Ｙ。
アングステインマ（Ｙ、　ａｎｇｕｓｔｉｓｓｉｍａ）
、Ｙ、アリゾニ力（Ｙ、　ａｒｉｚｏｎｉｃａ　）　、
Ｙ、パッカタ（ｙ、　ｂａｃｃａｔａ　）、Ｙ、エラー
タ（Ｙ、　ｅｌａｔａ）、Ｙ、フ了りソニ了す（Ｙ。
ｆａｘｏｎ　ｉ　ａｎａ　）、Ｙ、プレビポリ了（ｙ、
　ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）、Ｙ、モハペンシス（Ｙ、　
ｍｏｈａｖｅｎｓｉｓ　）、Ｙ、ライリフエラ（Ｙ、　
ｆｉｌｉｆｅｒａ）　などが挙げられる。特定のステロ
イｒサポニン含量は植物種に応じて異る。
培養は適当なユツカ組織を選択し、成長調整物質を含有
する栄養植物細胞培地上で生育させることにより開始さ
れる。無菌条件を確実にするために、培養は無菌発芽さ
れた種から産生された苗糾織で開始するのが好ましい。
若し、非−無菌植物部分が使用される場合には、それら
は培地中に導入する前に殺菌する。
その他のものも使用することが可能であるが、好ましい
培地は村重−スクーグ（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＢ　
Ｉｃｏｏｇ　）の寒天を含有する修正タバコ培地（ＭＳ
）である。この固体培地は、２，４−ジクロロフェノキ
シ酢酸（２，４−Ｄ）のような成長調整物質、キネチン
及び／又はベンジルアゾ、；ンなどのようなントギニン
様成長調整物質、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ　）或いはイ
ンドール酢酸のようなオーキシン様成長調整物質等を産
生を希望する特別の植物部分に応じて含有することが好
ましい。例えば、２．４−Ｄは細胞成長を促進する。ク
トギ二ノ様調整物質は若萄成長を促進し、及びオーキシ
ン様調整物質は根の成長を促進する。
２．４−Ｄが使用される場合には、それは約ｏ、ｏｏｔ
　〜ｔｏｐｐｍ　、好ましくは約０．０１〜１　ｐｒｉ
ｍの虜にて培地中に梼−人される。ベンジル了デニンカ
使用される場合には、それは約０．００１〜３０ｐｐｍ
、好ましくは約００吋〜５　ｐｐｍの量にて培地中に導
入される。キネチンが使用される場合には、その量は約
０．００１〜４０１）Ｉ）ｍ　、好ましくは約０．０１
〜６ｐｐｍであり、ナフタレン酢酸は約０．００１〜１
５ｐｐｍ好ましくは帆５〜５１１ｐｍであり、及びイン
ドール酢酸は約０．０１〜１０　ｐｐｍ　、好ましくは
約０．５〜５ｐｐｍである。
初期培養は、カルスが産生されるまで約１０〜３８℃の
温度において１〜１２週間好気性培養生育条件下に維持
される。初期インキュ４−ジョンは、好ましくは暗所に
おいて行われる。
これらの培養物は、次いで成長調整物質を含有する液体
培地、好ましくは村重−スクーグの寒天のない培地中に
移すことにより継代培養される。
量は通常前記範囲である。液体培養液は空気にさらされ
、好ましくは振盪され或いはゆっくり動かされて空気を
培地中に導入するか、或いは空気をチューブにより培養
容器内に導入する。培養液は約１０〜３８℃、好ましく
は約２０〜３０℃の温度において、適当な生育条件下に
維持される。ｐＨは約３．０〜８．０好ましくは約５．
０〜７，０である。培養液は全暗黒乃至全党の光条件下
において種々時間を変えて生育することができる。全ス
テロイＰグリコシＰ産生が党内で連続的に生育された培
養物において最も高いのでこれが好ましい。典型的な光
条件は約１００〜３０００フート燭元度の範囲である。
その培養は継代培養の時から約６〜７週間まで維持され
る。その後培養物成長は衰退する。培養物は、例えば濾
過により生育培地を除去して採集される。採即された培
養物は、例えば、凍結乾燥により乾燥され、微細粉末に
磨砕され、ステロイドグリコシド類を通常の溶媒抽出技
術を用いて抽出する。対応するステロイド類は、ステロ
イドグリコシド類から通常の酸加水分解により分子の糖
部分を除去して得られる。
光中で生育される培養物は極めて容易に緑色になった。
この緑化は、培養物ケ継代培養に引続き直ちに暗所に置
いた場合には起こらなかった。培養液は、継代培養から
約６〜７週間後に活性成長が終り、成長サイクルの静止
期に入るにつれ老化に近づくと光中において褐色に発色
した。しかしながら、老化をたどる組織中においてもス
テロイドグリコシドの蓄積の増加が明らかに見られた。
全ステロイＰグリコシｒ類の産生は根−細胞、細胞及び
若４・組織培養液の順番でより条理に行われた。
放射性同位元累標識ステロイｒグリコシｒ類及びステロ
イド類は組織培養物な放射性同位元素標識前駆体１例え
ば、ｃ　Ｉ−１４ｃ　］アセテート、と共にインキュベ
ートすることにより製造される。これらの培養物は、前
記した懸濁継代培養条件下でイア　＊　ユヘ−）されろ
。インキュベーノヨンノ時間は約２〜２５時間の範囲内
であり得る。インキュペーンヨンの終りに、培養物を洗
浄して残存放射性−酸同位元累を除去し、次いで組織を
採取し、放射性同位元累標識ステロイＰグリコシドを上
記方法と同様にして分離する。放射性同位元素標識ステ
ロイ１３類はそのステロイドグリコシド類の酸加水分解
により得られる。
以下、具体例により本発明を説明する。
例１ ユツカ・／ジゲラ（ｙｕｃｃａ　ｓｃｈｉｄｉｇｅｒａ
）　（ユリ利）の種を無菌的に発芽して苗組織を産生じ
た。この苗組織な］、、Ｑｐｐｍの２．４−Ｄを含有す
る村重−スクーグ（ＭＳ）修正培地に入れ、暗所中にお
いてカルスが産生するまでインキュベートした。
このカルス？　３．０　ｐｐｍのナフタレン酢酸（ＮＡ
Ａ）を補給した液体８正ＭＳ培地中で継代培養した。
それを次いで７８ｒｐｍで回転するシェーカー上におい
て郡±２℃において光中でインキュベートした。
元サイクルは１６時間の元、８時間の暗闇であった。
照明はＧｅｎｅｒａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ社の螢元白色
元及びＷｅｓ　ｔ　ｉｎｇｈｏｕｓｅ社の白熱灯で提供
した。光強度は発生した。これらの根−細胞培養物は極
めて容易に緑色になり、この緑化は培養物が継代培養に
引続いて直ちに暗所に置かれた場合には起こらなか（１
７）　　　　　　　　　　　　　１ｒｓ＾つた。培養物
は党内において最終的に褐色になった。これは、培養物
が活性な成長を終り、成長サイクルの静止期に入った時
に起こった。緑色着色培養物の細胞は大きな、輪郭のは
つきりした葉緑体を有していた。培養物は根状組織及び
細胞（単−細胞或いは小凝集物）よりなっていた。根は
最Ｗ三角形形状であったが、しかし引きｒ売き輪郭のは
つきりした枝峻いは腕（２−３）を発達させた。
これらの分岐は、初期の根毛或いは拡散銀系の分岐に対
応し得る突起を有していた。この根組織は暗所において
３　ｐｐｍのＮＡＡを有する固体（寒天補給）修正ＭＳ
培地においた場合に実際に根毛を発達させた。光学顕微
鏡で検食したところ、これらの根組織は典型的な根の解
剖学的特徴な有していた。即ち、キャップ状根先端、小
さな（おそらくは分裂）細胞の領域及び伸長細胞の領域
があった。
根−細胞培養の成長は継代培養の時から約６週間まで上
昇し、その後衰退した。
緑色着色（０，３７１乾燥重量）及び褐色着色（［８） （０，２２，９乾燥重量）根−細胞培養物を抽出及び分
析のために採取した。生育培地は吸引沖過により除去し
た。採取した培養物な乾燥するまで凍結乾燥し、微細粉
末に磨砕し、単−厚みセルロース抽出筒（Ｗｈａｔｍａ
ｎ　）に入れた。この筒に抽出中の粉末のｍ失ｆ防止す
るためにガラスウールヲ詰め、次いでこのものをガラス
製ソックスレー装置に入れた。
ｉｉＩ４ｍはクロロホルム？用いてニレ脱脂した。各脱
脂期間は８時間であり、各回約１００ｍｔのクロロホル
ムが使用された。収率は緑色着色組織の乾燥重量ｇ当り
２１．１ｍ９脂質であり、褐色着色組織の乾燥重量ｙ当
り１９．４ｍｇ脂質であ−）た。採取前に１週間緑色択
一細胞組織を暗所に置くと脂質収量が９乾燥重量当り３
３．８■に上昇した。
脂質除去後組織及びソックスレー筒を空気乾燥し、次い
でｎ−ブタノールを抽出溶媒として用いてニレステロイ
ｒグリコシｒ類の抽出な行った。
各抽出は８時間行われ、はぼ１００ｍＡのｎ−ブタノー
ルを使用した。ｎ−ブタノール画分なプールし、ｎ−ブ
タノールをＢｕｃｈｌｅｒフラッノユ蒸発器を用いて除
去した。乾燥抽出物を秤量し、分析のためＶｃｎ〜ブタ
ノールに再溶解した。全ステロイＰグリコシＰ収量は次
の通りである。緑色着色組織についてｙ乾燥重量当り２
１３．１り、褐色着色組織についてｇ乾燥重量当り３７
０．３ｍ９゜これは、老化が進行している組織において
もステロイドグリコシドの蓄積が増太し得ることを示し
ていた。採取前に１週間暗所に置かれた緑色着色組織に
対する全すぽニン収量は、　　１５１．９〜／ｇ乾燥重
量であり、最適すｓ５ニン合成は光中で起ったことを示
していた。
ｎ−ブタノール抽出物を薄層クロマトグラフィー（Ｔｌ
、Ｃ’）を用いて各々のステロイｒグリコー７１−４類
について分析した。２５０ミクロンのシリカゲルＧ　（
Ａｎａｌ　ｔｅｃｋ　）で予備被覆されたガラス板を用
いた。
陪媒系はクロロホルム：メタノール：水、６５：２５＝
１　（ｖ／ｖ／ｖ）であった。組織培養抽出物はＤｉｓ
ｔｒｉ−ｂｕｔｏｒｓ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社（カリ
フォルニア州、ポーターヴイル）からのＹ、シジゲラ植
物の抽出物と共に共−クロマトグラフした。この植物抽
出物のステロイドグリコシド類はステロイド類を糖から
切断し、次いでステロイド類を同定することにより予め
同定されてあった。これは下記の酸加水分解法により行
われた。ステロイドグリコシド類はＴＬＣ板に硫酸第二
セリウムスプレー試薬（５０％硫酸中３％硫酸第二セリ
ウム、Ｗ／Ｖ　）をスプレーすることにより可視化され
た。この板を次いで１２０℃において５分間加熱した。
この比較に基づいて、ステロイド類チゴゲニン（５α、
２０α、２２α、２５Ｄ−スピロスタン−３β−オール
）、ヘコゲニン（５α、加α、２２α。
２５Ｄ−スピロスタン−３β−オール−１２−オン）、
サルササポゲニン（５β、加α、２２α、２５Ｓ−スピ
ロスタン−３β−オール）及び１１、ケトチげゲ＝７（
５α、加α、ρα％２５Ｄ−スピロスタンー３β−オー
ル−１１−オン）を含有するステロイドグリコシド類が
褐色着色組織内に存在していたことが同定された。ステ
ロイｒ類チザゲニン、ヘフゲニン、サルササポゲニン、
１１．ケトチゴゲニン及びマルコゲニンを含有するステ
ロイドグリコシド類は緑色着色組織中に存在していたこ
とが同定された。
未加水分解ｎ−ブタノール抽出物を更に重力カラムクロ
マトグラフィーな用いて分別した。この技術は、核磁気
共鳴（ＮＭＲ）分光計分析用に十分に精製されたステロ
イドグリコシド画分を与えた。
これはユツカ根−細胞培養物により生成された代謝物の
真のステロイドグリコクＰの性質の決定を可能にした。
−以上の糖部分に結合したステロイドは特性的蘭スペク
トルを与える。ガラスカラム（Ａｌｔｅｋ、　１．０Ｃ
ＩＸＸ　５００ｃｍ）に吸着剤シリカゲルｆ５０　（Ｍ
ｅｒｋ　％粒径０．０４０−０．０６：３１ｊ＋）を充
填した。
ｎ−ブタノールを窒素下で組織培養抽出物から留去した
。抽出物をメタノールに再溶解し、　４５．４■に相当
するアリコートを重力カラムに適用した。
溶出溶媒はメタノール−クロロホルムであった。
溶出溶媒の極性を９５％クロロホルム中５％メタノール
から各加力ラム画分当り５％の増加分により、６０％ク
ロロホルム中４０％メタノールに増大した。
ｉｍ１画分を３２８型ｌ５ＣＯＲｅｔｒｉｅｖｅｒ　１
１１画分採集器により採集した。カラム画分を窒累下で
蒸発乾固し、メタノール−クロロホルム中に再溶解し、
上記のＴＬＣｔ、）用いてステロイＰグリコ７Ｐ類のス
クリーニングな行った。同一のＴＬＣＲｆ値を有する両
分をプールして次のＮＭＲ分析に用いた。ＪＥＯＬＦＸ
　９０　Ｑフーリエ変換ＮＭＲ分元計（６０ＭＴＴｚ）
を用いた。−以上の糖分子に結合したステロイド分子の
特性スペクトルが得られた。これらのプールされた重力
カラム画分の一つはサルササボゲニン及びチザゲニンを
ステロイド類として含有するステロイＰグリコシげに対
囚した。
例　２ ユツカの根細胞培養物が新規ステロイドグリコノＰな合
成する能力を■することを立証するため、及び放射性同
位元素標識ステロイドグリコシＰ類及びステロイド類を
製造するために、放射性同位元素標識前駆（１ｉｆ［，
１−Ｃ］アセテートを用いてインキュベーションヲ行っ
た。緑色ユツカ根培養物を継代培養から７週間生育した
。培養物（０，５９新鮮重４寸）馨、１．５ｍＡの無菌
修正ＭＳ培地（３，０ｐｐｍＮＡＡを補給）中の１７．
８５ｎモルの〔１−１４ｃ　］アセテート、ナトリウム
塩（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ。
比活性５６ｍＣ１，ｍｍｏｌ　　）と共にインキュベー
トした。培養物を７８ｒｐｍで回転する７エーカー上に
おいて段±２℃の温度でインキュベートした。インキュ
ベーションは元素及び暗闇中においてインキュベーショ
ン培地ｐＨ６、０及びインキュベーション培地ｐＨ７，
０において行った。元素における光時間は８時間２０分
であった。インキユベーシヨンの時間は１６時時間分、
或いは５時間開分（元素）のいずれかであった。インキ
ュベーションの終りに培養物を一度洗浄して残留放射性
同位元素を除去し、吸引濾過により採取し、凍結乾燥し
た。凍結乾燥組織を抽出し１例１と同様にしてＴＬＣに
よりｃ　１４　ｃ　）ステロイドグリコンＰ類を分析し
た。
ｎ−ブタノール抽出物の了すコー）（１００μｔ）ヲＷ
ｔ　数容器内の液体クンチレーションＰｈａｓｅ　Ｃｏ
ｍ−ｂｉｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ｐ　ＣＳ、　Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ社）１０ｍｌに溶解し、Ｂｅｃｋｍａｎ　
ＬＳ　１００Ｃシンチレーシヨンカウンターケ用いて全
［１４Ｃ］ステロイＰグリコシｒ類中の［１４Ｃ］標識
の導入数を数えた。１６時時間分間のインキュベーショ
ン後の全［：１４Ｃ］ステロイドグリコシド類中の［１
−”Ｃ］アセテート導入率は次の通りである。１１．６
％（ｐＨ６，０，光中）、１５．４％（ｐＨ７，０、元
素）、８．４％（ｐＨ５，Ｑ、暗闇中）。元素及びｐＨ
６，０における５時間５０分のインキュ４−シヨン後の
導入率は５．９％であった。これは、ユツカ［１４Ｃ］
ステロイドグリコシド類の最適合成は光中及びｐＨ７，
０の培地において起ったことを示した。全（１４ｃ〕ス
テロイドグリコシド類の合成は、培養物が成長の静止期
に入るに従って増大した。
前記の分析ＴＬＣを用いてｎ−ブタノール抽出物の個々
の［１４Ｃ］ステロイドグリコシＰ類の分析を行った。
個々のｃ１４ｃ〕ステロイＰグリコシド類は又調製ＴＬ
Ｃを用いて単離した。１００ミクロンのシリカゲルＧで
予備被覆されたガラス調製板が用いられた。分析ＴＬＣ
及び調製ＴＬＣの両者の溶媒系はクロロホルム：メタノ
ール：水、６５：２５：１（Ｖ／ｖ／ｖ）であった。分
析及び調製プレートはＢｅｒｔｈｏｌｄ　Ｒラジオクロ
マトグラムプレートスキャナーを用いて走査した。〔Ｃ
〕スアロイＰグリコンド類は走査クロマトグラムを用い
て配置化した。
個々のｃ　１４　ｃ　〕ステロイドグリコシド帯は調製
板上にマークされた。各マークされた帯を擦り落し。
３回メタノール：クロロホルム（６５：１．Ｖ／Ｖ）で
溶出した。
溶出された［　　Ｃ〕ススアロイドグリコシド類メタノ
ール性６ＮＨＣＩで９０℃において１４時間加水分解し
た。擦り落されたＴＬＣ帯の残留シリカゲルも又面接に
メタノール性６Ｎ）ＴＣＩで９０℃において１４時間処
理され、なおりリカゲルに付着する〔Ｃ〕ステロイドグ
リコシドを加水分解した。加水分解物ヲ冷却し、〔Ｃ〕
スアロイＰ類をクロロホルムで水相から抽出した。
加水分解物から回収された［　Ｃ］スアロイＰ類な例１
で説明した分析ＴＬＣを用いて真正なステロイＰ基準化
合物と共に共−クロマトグラフを行った。板をＢｅｒｔ
ｈｏｌｄラジオクロマトグラムＴＬＣプレートスキャナ
ーを用いて走査して〔Ｃ〕スアロイド類を配置化した。
基準ステロイド類は硫酸第二セリウムスプレー試薬な用
いて配置化した。
［１４ｃ　〕ステロイド類は、かようにして、基準化合
物のＴＬＣ特性との比較により同定した。
この技術により、サポニン類、例えば、［Ｃ］へコゲニ
ン、［１４ｃ　〕マルコゲニン及び［”Ｃ］　１１　。
ケトチげゲニンなどを含有するサポニン類は上記条件の
下でユツカ根培養物により合成された代謝物と同定され
た。
上記で説明した抽出及び分析技術によれば、ｌｐｐｍの
２．４−Ｄを補給したＭＳ培地上で生育された細胞は、
１３０ｍ９全ステロイド類／９乾燥重量で得られるグリ
コシド類を含有し、また３、Ｑｐｐｍのベンジルアデニ
ン（ＢＡ）を補給したＭＳ培地上で生育した若芽は、２
００■全ステロイド類／ｇ乾燥重量で得られるグリコシ
ド類を含有していた。
若芽培養物はマルコゲニン、ヘコゲニンおよび１１゜ケ
トチゴゲニンを含有していた。
以上、アメリカの砂漠植物ユツカ・シジゲラの組織培養
物を確立する方法を説明した。これはＹ。
／ジゲラの根−細胞懸濁培養物を確立するための１］■
作が開示された初めてのものである。この培養物及び細
胞及び若芽培養物はユツカステロイド類を含有するステ
ロイドグリコ７ド類を産生じた。
最適ステロイドグリコ７ド類生に影響を及ぼす条件（元
及び老化）が開示された。〔Ｃ〕スアロイ）’り１１コ
ンド類の産生並びに最適産生のための条件（光、　ｐＨ
，［Ｃ１ｊ＋Ｌ”ｉｔとのインキュベーションの長さ）
が開示された。
前記した本発明の多くの修正及び変更が本発明の精神及
びその範囲から離れることなくなされることは明らかで
あろう。説明された特別の実施態様は例示を目的とする
のみであり、本発明は特許請求の範囲によってのみ直走
されるものである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、下記のＡ）〜Ｅ）の工程な含むことを特徴とする。 ユツカ植物のステロイＰグリコシＰ類の製造方法。 Ａ）ユツカ植物の組織培養を成長調整物質を含有する栄
    養植物細胞培地上で確立し、 Ｂ）生育条件下で維持し、 Ｃ）得られた培養物を成長調整物質を含有する液体栄養
    植物細胞培地に移し、 Ｄ）この継代培養液を生育条件下で維持し、そして Ｅ）培地からユツカ植物組織培養物を採取し、それより
    ステロイＰグリコシド類を抽出する工程。 ２ユツカ植物の組織培養物が細胞培養物、根−細胞培養
    物及び新芽培養物よりなる群から選ばれる、特Ｖ１−請
    求の範囲第１項記載の方法。 ３継代培養液が少なくとも約６週間生育条件下で維持さ
    れる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、継代培養液が元の下で約１０〜３８℃の温度、約３
    〜８のｐＨにおいて少なくとも６週間維持される根−細
    胞培養物である、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、下記のＡ）−Ｆ）の工程を含むことケ特徴とする。 ユツカ植物のステロイ）′類の製造方法。 Ａ）ユツカ植物の組織培養を成長調整物質を含有する栄
    養植物細胞培地上で確立し、 Ｂ）生育条件下で維持し、 Ｃ）得られた培養物を成長調整物質を含有する液体栄養
    植物細胞培地に移し、 Ｄ）この継代培養液を生育条件下で維持し。 Ｅ）培地からユツカ植物組織培養物を採取し。 それよりステロイドグリコノｒ類を抽出し、そして Ｆ）得られたステロイドグリコシｒａ’ｖ＋夜加水分解
    してその糖部分な除去する工程。 ６、下記のＡ）〜Ｆ）の工程を含むことケ特徴とする。 ユツカ植物の放射性同位元累椋識ステロイｒグリコシＰ
    類の製造方法。 Ａ）ユツカ植物の組織培養を成長調整物質を含有する栄
    養植物細胞培地上で確立し、 Ｂ）生育条件下で維持し、 Ｃ）得られた培養物を成長調整物質を含有する液体栄養
    植物細胞培地に移し、 Ｄ）この継代培養液を生育条件下で糺持し、Ｅ）この継
    代培養液をその成長サイクルの終り頃に放射性同位元素
    とインキュベートし、そして Ｆ）培地からユツカ植物組織培養物を採取し、もたらさ
    れた放射性同位元累標識ステロイドグリコシＰ類をそれ
    から抽出する工程。 ７、放射性同位元素が［１４Ｃ］同位元累である、特許
    請求の範囲第６項記載の方法。 ８ユツカ植物の組織培養物力鳩山胞培養物、根−細胞培
    養物及び新芽培養物よりなる群から選ばれる、特許請求
    の範囲第６項記載の方法。 ９、継代培養液が少なくとも約６週間生育条件下で維持
    され、放射性同位元素と少なくとも約２時間インキュベ
    ートされる、特許請求の範囲第６項記載の方法。 １０下紀のＡ）−〇）の工程を含むこと乞特徴とする。 ユツカ植物の放射性同位元素標識ステロイド類の製造方
    法。 Ａ）ユツカ植物の組織培讐を成長調整物質ケ含有する栄
    養植物細胞培地上で確立し、 Ｂ）生育条件下で維持し、 Ｃ）得られた培養物を成長調整物質を含何する液体栄養
    植物細胞培地に移し、 Ｄ）との継代培養液を生育条件下で維持し、Ｅ）この継
    代培養液をその成長サイクルの終り頃に放射性同位元素
    とインキュベートし、Ｆ）培地からユツカ埴物組織培養
    物を採取し、もたらされた放射性同位元累標識ステロイ
    ドグリコクド類をそれから抽出し、そしてＧ）得られた
    ステロイドグリコ７ド類を酸加水分解してその糖部分を
    除去する工程。 １１、ユツカ植物の放射性同位元累標識ステロイドグリ
    コシＰ類。 １２、グリコシド類が［１４ｃ　］スステロイドグリコ
    シＰである、特許請求の範囲第１１項記載の放射性同位
    元素標識ステロイドグリコ７ド類。 １３、ユツカ植物の放射性同位元素標識ステロイド類。 １４、ステロイド類が〔１４Ｃ〕ステロイド類である、
    特許請求の範囲第１３項記載の放射性同位元素標識ステ
    ロイド類。 １５ステロイｒ類が（１４ｃ　〕へコゲニン、［：１４
    Ｃ］マルコゲニン及び［１４Ｃ〕１１　、ケトチザゲニ
    ンよりなる群から選ばれる、特許請求の範囲第１４項記
    載の放射性同位元素標識ステロイド類。
JP58168091A 1982-09-13 1983-09-12 ユツカの組織培養によるステロイド類およびステロイドグリコシド類の製造 Pending JPS5967225A (ja)

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