JPS5966900A - 無水弗化水素でのグリコシド結合選択的開裂によるオリゴサツカライドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明はオリゴサツカライドの製造方ｍ％さらに具体的
には、よジ高度の選択性で以てグリコシド結合ケ開裂さ
せる方法に関゛１−るものである。

多糖類を形成するグリコシド結合の開裂方法は知られて
忰υ、これりの結合強度および加水分解され易さか中に
含まれる糖類および結合特性に応じて変るものであると
いう事実の通りである。しかし、多糖類開裂の従来法は
さほど高い選択性をもうていなかった。これらの方法に
よってオリゴサツカライドへうまく・開裂され得る多糖
類の例は比較的少数しかなく、その結果、従来法はオリ
ゴサツカライドを得る信頼できる方法ではブよかった。

多くの多糖類の場合において、従来の反応はは：とんど
完全に多糖類を単糖類加水分解する。

オリゴサツカライドを生成させるために過去において用
いた一つの技法はいわゆる部分加水分解であり、その場
合、多糖類は硫俵のような強い鉱酸のｍ液中に溶解し１
８０から２００下（８３から９４℃）の程度の温度へ加
熱された。この方法はオリゴサツカライドと単糖とｆｔ
倉む複雑な混合物を生成する。その上、反応はほんのわ
ずかに選択的であ）、生成物収率は低い。反応を継続す
るにつれ、反応においてはじめに形成したオリゴサツカ
ライドは次第に単糖類へ加水秒解する。生成物分離の内
錐さと雑然とした諸反応の結果として。

少“緊のオリゴザツカライドケイ４するのに太はの多糖
類を必要とする。

このようＫ、従来法より多糖類中のグリコシド結合をよ
り選択的に開裂させ、より尚収率でオリゴサツカライド
を提供し得る方法馨求める要望が存在して腔る。

発明の総括 前記要望は無水弗化水素を用いて多糖類を開裂させる方
法乞提供する本発明において満たされる。

本発明は無水ＨＦで以て低温において加溶媒分解するこ
とによって多糖類中のグリコシド結合を選択的に開裂さ
せる方法において具体化される。本発、明の一つの具体
化によれば、多糖を無水ＨＦと反応容器中で接触させる
。多くの場合においては、この多糖をこのＨＦ中に事実
上溶解させるが、しかし他の場合においては、その多糖
類の性質に応じて、そうではなくて、液状ＨＦと多糖、
類との界面において反応が進行する。

反応は一般には一つのＨ，？反応装置を用いて実施し、
その装置においては、多糖類を□含む反応容器’１ＱＨ
ＴＩ’の沸点よ、り十分に下の温度ぺ冷却し、ＨＦを、
、ＨＦガスの凝縮によって反応容、器゛中へ導入する。

ＨＦはその濃度と、無関係に反応を行う′：まり犬・過
剰で使用する。反応は通常は約１５分またはそれ以下の
間貸なわせ、そのＨＦを中和することによるかあるいは
エチルエーテ・ルのような不活性有機溶媒で以て反応を
押えることによって停止させてよい。

これらの二つの技法のうち、後者の方がオリゴサツカラ
イド収率が高くより容易に分離されるので好ましい。Ｈ
Ｆもまた回収できこの方法に再使用できる。

中和はまた反応剤を炭酸カルシウムのような固体中和剤
のスラリーの中へ注入・するζどによって達成してもよ
い。

本発明は典型的には図に示すようなＨＦ反応装置を用い
て実施される。この装置は数字１０によって示され、一
連の弁１４．１６および１８を中ヒもつ水平マユ１ホー
ルド１２がら成木。ヤニホールド１２の一端は圧縮珪Ｆ
ガ諌のシリゾｆｉ−’−２’２べ連結され、一方、他婦
１お竺方弁１３侵経てに空′敏シブ３″し復圧＃ｉ４望
素′源３４へ連がれ□ている。貞：＋ポンプ３２と圧縮
窒素源：３４の画者は直列トラップ２６と２７を経てそ
れぞれマニホールド１２と連通し、とれらのト列ツブに
は通過するガスからＩ（Ｆを除去するＣａＯのような薬
剤を充填さればいる。この系□に１ままだ好ましくはト
ランプ２６１′の−に流においで空気）厚入口が備えら
れこｉれば必□要なときに系中へ空気乞吹き込むのに使
用できる。

□垂直な貯槽３′ｉは弁１６と１８どの間の１代列□で
備えられて□いる。貯槽３′６は任意的□め若ので、り
わ、Ｔ（Ｆの低容積源として機能し、反応前にシリンダ
ー２２火閉じさせ、系が破（Ｄの場合に太容績６”’　
）］　Ｆが笑気中に逸□散する危険ケ最小化するもので
ある。

装置１０には二方弁４０ン経てマニホールド１２へ結合
するｍｌ直平衡化容器３８が備えられていする。

平衡化舜器３′８はこんどは可撓性デフロ１ンチューブ
４４（７）片を□経七反□応容器４２へ連結されている
。　。

チューブ４４は容器３８の底から反応容器４２の底の中
へのび、直列の弁４６ケ備えている。□反応容器４２は
また二方弁４８をと９つけたある長さの垂直管を経てマ
ニホールド１２へ連結される。

弁５２をもつ第二のテフロンチューブ片５０は反応器４
２の底の内側から冷却用コイル５４へ、かつ、このコイ
ルからドライアイスと炭酸カルシウムのような中和剤と
のスラリ７あるいは・エーテルとドライアイスとの混合
物、の・ような中和および／または冷却剤（クエンチン
グ剤、）５７・を含むテンロン管のようなりエンチング
容器５６へ、のびている。

図に示す具体化は反応を押えるエーテルを使用するよう
設計されている。ニー、テルン使用する場合には、オリ
ゴサツカライドはＨＦ溶液から沈澱し、反応ヶ停止させ
たのちに、生成物は弁５８を通して排出される。、直列
のテフロンフィルター６０が備えられていて、この上に
・オリゴサツカライドが他の生成物が捕集容器６２の中
へ排出されるときに集められる。

図示の装置においては、容器３６，３８およ６４２と冷
却用コイル５４＆’！冷却浴（図示せず）で以て冷却し
てよい。□使用するこの浴のタイプは楽の特定容暮中で
望ｉれる温度に依存する。実験室的応用においてんい本
冷却浴はよく知られて９木。

ドライアイスと、ア卆ト□ン、クロロベンゼンおよび四
基イヒ炭素のよるな肴機液体との混合物を用いることか
できる！　　　　　　′　　　　　　　　□上記の系あ
操作をことでさらに詳細に論する。

装置ＩＯは系から水分を□除くために反応前に脱気する
。圧力ヘッドに逆らってＨＦカスを移動さ騒ないこ′と
′はま□た系の操作を容易にする。この目的のため、系
にはＡ皐ボングが備えられ、とれ（ｉ論比カルレウムを
詰込たトラップ２６を経て系へ連かれている。系の橘気
に先立ち、多糖類を反’ｔｍ□器４２の中に省き、系の
脱蔵時に多糖中に存□在ｊる水分０−、−べ−Ｃヶ、え
除くｊうにする。　　　１　□ＨＦは捷ずシリンダー２
−から貯槽３６へ移さ□れる。□これば弁１４と１６を
閉じ弁１８を開いてＨｉシリンダー２２からマニホール
ド１２の吊ヘゆっくりと吹き出させる。ことによって達
成さＪＬる。貯槽３６はドライ、アイ、、ツ：とア、七
トンとの混合物のような冷却浴１中に浸し、ＨＦはそ、
９中＜ｐ縮によって蓄積する。、適当邪：のＨＦ欠貯槽
３６中マ集めたのち、弁１．８．２閉じて、シリンダー
２２．ン閉釧する。　　　　　　　　　　。

その後、　ＨＦ乞貯槽３６から平衡化容器３８へ移しこ
の容器は反応に使用する温度へＱＦを冷却するのに使用
する。これは弁１６と４０ｙａｌ−開きＨＦが中に凝縮
するように容器、３ｓ、７冷Ｎ！する。弁１６を次に閉
じ、ＨＦは平衡化容器の中でＨＦ、　”ｇ均一に反応温
度にする十分な時間保持される。同時に、多糖類を入れ
た容器４２は反応温阜へ平衡化される。ｌ（ｐ’が平衡
化されると５それケ反応容器４２へ容器３８の底からの
びているテフロン、チューブ４４を経て移Ｌ０この移送
は乾燥窒素で以て平衡化容器３８に、圧カン加えるこく
によって行なわれる。これは−ｆｐｌ、、４と４０を開
き、弁４８を閉じ、弁１３を真空３２から窒素３４へ切
替えることによって達成される。容器β８な加圧し弁４
６を開くこと・：によグで、液状ＨＦは容１器３′８か
□らすで多糖が、中に置かれでいる反応容器４２へ移さ
れる。反応容器′４２を平衡化容器：３８と同じ温度へ
冷却する。多糖はＨ・Ｆ移送が実、施される前に反応温
度へ平衡化されて望ましくない・開裂の生起′Ｙ減らさ
、ねばならない。

ＨＴ＋’は多糖類と約５から２０分反応させ”る。反、
応條件に応じである多糖類についてはより如かいあるい
はより長い反応時間を゛必要とず・るがも七れない。一
般的には約１０から１・５分の反応時・間が用いられる
。。・本発明のＨＦ反応はあ□る程度まで時間依存性で
あるので、反応時間はオリゴッ゛ツカ、ライドが容易に
加水分解し得る昔の加水分解反応におけるように、臨界
的ではない。

この加溶媒分解反応に続いて、反応生成物は回収容器５
６へ移される。この移送は容器３８から容器４２へのＨ
Ｐ移送と同様にして実施される。

テフロン配管５０は反応容器４２の底から回収容器５６
へのび弁５２ン備えている。反応容器は弁、４８を開き
弁１６．４０および４６７！ｌ−閉じることによって加
圧される。

本発明の反応の選侭性はきわめて温度依存的である。あ
とにさらに詳−に聯明するように、グリコシド結合量？
加溶、媒分解活性ｉしエネルギーにおける小さな差異が
利用さ、れるものと信じられる。

従って、反応生成物がこのようにして生成したオリゴサ
ツカライドがさやに加溶媒分解されないようにＨＦの存
在下において暖められないことが肝、要である。このよ
うに１．反応生成物はＨＦが中和されてしまうまでは反
応温度以上に暖められるべきでない。この理由のために
、冷却浴または他の冷凍手段を用いろ反応容器、とは、
ぼ同じ温度またはそれより低い温度へ冷りされる冷却用
コイル５４乞直列で備えること、が望ましい。同様に、
中和塔は反応温度またはそれ界下へ冷却される。

、図に示す反硲装置（門エーテルの千つな有機溶媒によ
る急冷によって反応を停止さくるよう眸計嘩れている。

配管５０からの生成物はエーテルとドライアイスとを含
む痔器５６の中）快出される。。

中和剤（この場合は工、−チル）＆、裏Ｈ，Ｆ中和時の
卑生熱が他のグリコシド結合にまだ存在しているＨＦと
反応をおこさせそれによって収率ン低下させないように
冷却される。エーテルと接触すると、オリゴサツカライ
ドは１（Ｆ溶液から沈澱する。□このオリゴサツカライ
ドは混合物な直列テフロンフィルタ−６０ケ通過させる
ことによって除き、そこで、オリゴ：サツカライドが集
められ、エーテル。

ＨＦおよび単糖類は排棄される。容器５６カ・らフィル
ター６０への生成物の移送はニードルバルブ５８で以て
制御される。

エチルエーテルの、ほかに、他の低沸点有機溶媒７Ｈｉ
ｒ反応を押えるために使用し得る。選ばれる有機溶媒は
、例えばｍｙと複合体な形成することによってＨ・Ｆを
中和するもの、およびオリコサツカライドが実質的に不
溶かつ不活性であるもの□でなければならない。好まし
い方法においては、）］Ｆは回収され再使用される。こ
のような１的の：ために、ＨＦと複合化しかつオリゴサ
ツカライド除去後の加熱時にＨＩＦを放出する溶媒が：
望童・・しい。

加溶媒分解反応ン停止させるもう一つの方法は炭酸カル
シウムのような中和剤を含む容器の中へ反応生成物を排
出させることである。オリゴサツカライドの加溶媒分解
を防ぐためには、中和剤はドライアイ褒のスラリーＡし
て提供さ誉ねばならない。さもなければ、ＨＦが中和さ
れるときに、反応生成物はより低い温度では加ｍ媒分解
し得ない結合とＨＦが反応して望ましくない開裂がおこ
る温度へ温度が上昇する。　。

オリゴサツカライドはさらに、例えばゲル透過与えられ
たり１ノコシト結合の加溶媒４解され易さおよびその加
溶媒分解の収率はその結合によって架橋されている糖類
詰びに立体化学性に依存する。例えばグリ・シト結合し
薔室温で数時間放置後に加溶媒分解され得るのみである
ものから一７３℃で１５分で不安定＋鼠るものまで陽範
囲にまたがっている。本発明によれば、あ慝多ｉ類のグ
リコシド結合は加溶媒４解時に＝糖類中のある限定され
た数の結合が開裂されるよう、制−されたやり方士加溶
媒雰解される。たのような方法で、オリゴサツカライド
はよ、す高い収率で生成される。

オリゴサツカライドが単糖類へ分解される頻度は減少す
る。

本発明の方法は、漬る多糖類をＪＶ晟している各ｊグリ
コシド結合を開裂′ｊるのに必要とされる活性化エネ尤
ギ一〇おけう７１、さな差を漬」用−ｊ７ｓも。

であると信じられる。一般的には、本発明の方法はＯ℃
以下好４しくは−２（）℃以下必温度においント：結谷
の加溶媒分解速度におけろ顕著な差鼻を励立することが
できて、従って、あるグリコシド結合はより高い頻度去
以て開裂され□、−搗１也のグリルド結合はきわめでｊ
ｂｔｔｒ、−程度い、ヵ、開裂さ□れないようになる。

温度□が低くなるにつれて加溶媒分解の選択性がよくな
る。このように、本発明賃よれば、多糖類は開裂されか
つ生物学的に活性なオリゴサツカライドを得ることがで
きる５、１１Ｆは多糖類から特定オリゴサツカライド′
Ｊ−を高収率で生成させるのに使用できろ。Ｒ，ジャ月
・□ ニカム３工１１）３８によって牛１視した多ＩＡ　ｊ′
ｎはペンタツノカライド単位の繰返しで構成されている
。

−２３ｐにおける”ＩＦ中中杭５後後昼いて、このポリ
マーは一つのｌ−ＩＪサッカライ°ドと二つの単糖類へ
開裂される。−４２℃で３０分後においては、主生成物
はベンタザ□ツがライド繰返し単位である、これらの結
果は、−２３℃に罫けるＩＦはアルファー結合ヘキンー
ズのアルファ結合を開裂するがしかしウロン酸ｉたはベ
ーター結合ヘキソーズの結合を開裂しないこと、□およ
”びコ４２°においてはアルフチ結□合の一つの選択的
□加礒媒分解が存在すること、を示している。他の多糖
類に関する結果は一２３℃におけるＨＦに対するベータ
ーヘキソーズのより高い安定性を確認し、′さらに一４
２℃におけるベーターおよびアルファーｉ＠≠オキシヘ
キソーズの加溶媒分解速度の間の顕著な差を示している
。オリゴサラガライド類１を生成させるためにＨＦを使
用する更に別の利点は、植物および細菌性多糖類中に普
通に見出されるアセテートエステルが７Ｊ１１溶媒分解
中に除去されないことである。

本発明を以下の非仮定的の実施例によって明瞭に脱晶す
る。

実施例Ｉ Ａ　　Ｒ，ジャポニカム３１１ｂ１３８　　における停
止期培養物からの多糖類（１０１ｍ９　）を１０４−の
ＨＦ中で一２３℃（反応容器をドライアイス／四塩化炭
素の浴で以て冷却することによる）において処理した。

１５分後、このＨＦｍ液を１２．．５ｍ／のエーテルを
含むテフロンパイプの中に強制ワタに入れ、、これはそ
の中へドライアイス塊を落とすことによって冷却した。

沈澱が形成しパイプの底へと９つけたテフロンフィルタ
ー上で捕集した。エーテル／’ＩＩＦＩ１７Ｐ液を炭酸
力ルシウ今で以て中和した。沈澱を１００−のエーテ、
ルで以て洗滌して残留ＨＦを除き、次いで真空下、で乾
燥した。収量：３１■の沈澱。

沈澱をバイオーゲｐｖ　（Ｂｉｏ　−ｇｅｌ、、、）　
Ｐ　−２刀ラム上でクロマトグラフにかけ、本質的には
単−成ｉ、トリサッカライｉ°であることが示さ些た。

ＯＡｃ これは理論収率の５０％を表わす。もとの多糖類がペン
タサツカライドの繰返、シマあるからである。

Ｉ（Ｆを中和するの瞥使用する炭酸カルシウムは２００
ｓｌ／の水で以て抽出した。−の画分をまた）くイオー
ゲルＰ−２上、でクロマトグラフにかけ、二つの主要成
分、グクコースと４−ｏ−、メチルガラクトースを含む
ことが示された。どの両分中においてもトリサツカライ
ド以外にマンノースがほんのわずかしか存在しないので
、トリサツカライドの１００％以下の収率は反応の非特
異性によるのでなくむしろ操作上の損失によっておこっ
たように思われる。

Ｂ　　Ｒ，ジャポニカム　３工１ｂ　　１．、．３８　
の停止期培養物からの多糖２０４ツを１０ＭｅのＨＦで
以て一４０℃において３０分間処理し、次いで一７３℃
の冷却コイルを通して炭酸カルシウム、ドライアイスお
よびジクロロメタンのスラリーの中へ送つた。シクロロ
イタン除もシオリゴザツカライドを水で以て溶離し、次
いでバイオ−ゲルＰ−２カラムを通過させた。カラｔか
ら溶離する主成分ゾ収ザを糖の４０％）は″″７７タツ
゛２カライド下、″・ 、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　（０：θ、ン、
３０悌は恐らくは繰返し単位のダイマーであり、残り、
は大部分は一２３℃でＨ，Ｆを使用して生成さ才力φ十
のと同等のトリサツカライドの少胛ケ含むエト、ラサツ
、力旨イドであった。

実施例２ Ｒ，ジャポニカム：３工１ｂ８３によつ゛［つくられた
多糖類１１．、、、、、４７０−メチルグノークロノラ
ムナンをＨＦで以て−２３’Ｃで１５分間処理し、炭酸
カルシウムで具で中和し、次いでバイオ−グルＰ＝２上
でクロマトグラフにかけた。物竺は二つのＩ！Ｑ１分あ
る。この多糖類の構造と分裂片の組成から、次の分裂様
式が推論される。

４−〇−メチルー Ｇ　ｌ’ｃ　ＵＡ この多糖類を−４１）℃において処理□し上述のように
分析するとき、三つの画分が□バイオーゲルＰ−２カラ
ム上で分離された。二つの主画分はデトラサツカライ峯
゛とジサッカライド罠相当した。これらの成分は繰返し
□単位あたり唯一個のポリマー開裂から生じたテトラサ
ツカライドと、繰返し単位あ□、２′イカ、）１韮カ、
５生藝ジ番□ッ；、イ、・（実際には二つの異なるもの
％４′−〇−メチルグｐｖクロン酸ラムノースと２ムノ
−スジサツカライド）に相当する。

ここに記述した方法は本発明の好ましい具体化を構成す
るものであるが、本発明はこれらの精細な方法に限定さ
れるものではなく、竺許請求の範囲！中に規定する本発
明の領域力゛らずれることなしに各種の一更をなし得る
ことが理解されるはずである。６

【図面の簡単な説明】

図は不発！を実施するため９代表的反応装置の線図でや
るで ２２　：　ＨＦ’シリンダー３２二力攬ホンプ　、。 ：３４　、：、　Ｎ２源　２６，２７：トラツプ３６：
ＨＦＦｆ槽　３８：　１ｊ’Ｆ：’）’７衡化容器、　
、　。 ４２、＋疼応器　５４：冷却コイル ５６ニイエンチング容器 ５７：クエンテング剤 ６（ｌテフロンフィルター 、　　　　　　　１ 特許出願人　チャールズ・エフ・ケタリング・）７ウン
１−ジョン　　　　　　。 代理人ｆｒ埋土揚　浅　恭１−住 １−一！ （９＋）”＋腎ちン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）　　多糖ｍ７無水液状）ＴＦと、該多糖類を
   形成するグルコシ・ド結合がＨＦ中で各種速度の加溶媒
   分解な示す０℃より低い反応温度において、反応させ、 （ｂＪ　　上記液状ＩＦを上記多糖類と上記反応温度に
   おいて、上記多糖類を選択的に加溶媒分解してオリゴサ
   ツカライドを生成させるのに十分な時間の間、接触させ
   て保ち、 （Ｃ）有機溶媒の添加および／または上記ＨＦの中和剤
   による中和によって上記反応を押えることによって、工
   程（ｂ）において生成したオリゴサツカライドの実質的
   加溶媒分解を伴なうことなしに上記加溶媒分解を停止さ
   せ、（ｄ）　　反応生成物からオリゴサンカライドを分
   離する。 ことかう成る。オリゴサツカライドの製造方法、２、上
   記反応温度が一２０℃より低い、特許ｒａｒ＃。 求の範囲第１・項に記載の方法。 ３、上記加溶媒分解を、上記ＨＦを中和しかつオリ・ゴ
   サツカライドが析出する有機溶媒で以て上記反応の生成
   物を押えることによって、停止する、特許請求の範囲第
   ２項に記載の方法。 ４、上記加溶媒分解を反応生成物をエーテル仁。 接触させること葬よって停止される。、　％　１：′Ｉ
   ’　ｚｔｊ求の範囲第３項に記載、の方法。、　１・ ５、上記溶媒が上記反応温度と同じ温度であるかそれよ
   、Ｖ低い温度である、特許請求の範囲第３項に記載の方
   法っ ６、上記反応温度がで４．０℃より低い、　’（４？許
   ８１賃求の範囲第１埴に記載の方法。 ７、上記有機溶媒および／または上記中和剤をドライア
   イスとのスラリー・とじて上記反応外添加する。特許請
   求の範囲第１項に記載の方法。 ８、、Ｊ：、記有機溶剤がエチルエーテルである。特許
   請求の範囲第１項に記載の方法。 ′９．上記中和剤か炭酸カルシウムである、特許請求の
   範囲第８歩に記載の方法。　　　　、、、。 １０、（ａ）　　Ｒ，ジャポニカム３工ＩＬ＋１３８に
   よってつくられる多糖ｍｗ、ｏ℃より低く該多糖類を形
   成するグリコシド結合がＨＦ中で各種速度の加溶専分’
   Ｍｔｔ示す温度において、無水液状ＩＰと反応させ、 （ｂ）　　上記液状ＨＦを上記多糖類と、該多糖類を選
   択的に加溶媒分解してオリゴサツカライドな生成さ亡る
   のに十分な時間の間、上記反応温度において接触して保
   ち、 ＣＧ）　　有機溶剤の添加および／または上記ＨＦの中
   和により上記反応を押えることによって、工程（ｂ）中
   で生成したオリゴザツカライドの実質的加溶媒分解を伴
   なうことなく上記反応を停止させ、 （ｄ）上記オリゴザツカライドχ反応生成物から分離す
   る、 Ｒ，ジャ、ξニカム３工１ｂ１３８によって生成した多
   糖類を選択的に開裂させる方法。 、′１工　上記反応温度が一２０℃より低い、特許請求
   、、９範囲第１０項に記載の方ｆ。 □　・　・、　　゛・。 １２　上記ＩＦを中和しかつ上記オリゴサツカライド所
   析出する有機溶媒で以て押えるこ左に、Ｊ：す、′誠記
   加ｍ媒分解を停止させる、件青許６Ｍ求のｄｉ）間第１
   １項に記載の方法。 】；３　反応生成物をエチルニーデルと接触させること
   によって上記；＃容！ｖｒ停止トさせる。特π［請、１
   りのｉｐｐ、門弟１２項に記載の方法。　、　　　　　
   。 １４、上記有機溶媒および／またけ上記中和剤乞ドライ
   アイス中のスラリーとして上記反応生成物へ添加する、
   特許請求の範囲第１Ｏ項に記載の方法。 １５、上記反応温度が一４０℃より低い、特許請求の範
   囲第１０頓に記６方法。