JPS5953039B2 - フイブリノ−ゲンおよびフイブリン分解生成物検出用の安定な凝集因子およびその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はフィブリノーゲンおよびフィブリン分解生成物
の検出試薬として適した、貯蔵可能で安定な凝集因子お
よびその製造方法に関する。

線維素溶解系が活性化されるとフイブリノーゲＪンまた
はフィブリンが蛋白質分解的に分解する。このフィブリ
ノーゲンの分解の際、まず、いわゆるフラグメントＸお
よびＡ、ＢおよびＣと称される他の分解生成物が生ずる
。前記フラグメントＸはその大きさおよび性質がフィブ
リノーゲンと酷５似しまたトロンビンにより徐々に凝固
させることができる。フラグメントＸを更に蛋白質分解
的に分解するとフラグメントＹおよびＤが生ずる。この
フラグメントＹはトロンビンによりもはや凝固されない
。フラグメントＹを更に蛋白分解するとθ分解生成物Ｄ
およびＥが生成する。これら小さ＜なつた分解生成物Ｄ
およびＥはフィブリノーゲンのすべての抗原性決定因子
をもはや有しない。前記フィブリン分解生成物はある種
の疾病のインジケータでありまた一部フィブリン形成阻
害剤であ５り、従つてフィブリノーゲンおよび（または
）フィブリン分解生成物の含有量またはそれによつて脈
管内線維素溶解度を測定することは臨床的に重要である
。前述の分解生成物の測定方法は、基本的には、ある種
の微生物、特にブドウ球菌（ＳｔａｐｈｙｌＯｋＯｋｋ
ｅｎ）の菌株がフイブリノーゲンおよびフイプリン分解
生成物ｘおよびＹと、肉眼視し得る凝集下に反応すると
いう事実に基づく。

このプドウ球菌の凝集という特性は、十分には特徴付け
られていない細胞結合型酵素によるものである。これを
「凝集因子」 （Ｃｌｕｍｐｉｎｇ一ＦａｋｔＯｒ）と
呼ぶ。それは時に細胞結合型コアギユラーゼと解される
こともある。この凝集因子に基づく試験系、特にフイプ
リン分解生成物ｘおよびＹ測定のための試験系は迅速に
実施できしかも高感度なので線維素溶解の普通の診断に
適している。しかしながら、従来方法により製造された
適切なブドウ球菌の懸濁液はフイプリン分解生成物検出
に必要な活性をわずか数時間しか示さず、また活性保存
のため凍結乾燥した製品はしばしばもはや溶液に均質に
慇濁することができないかまたは，非特異的に凝集して
しまうことが判明した。

再懸濁した菌体の感度は急速に低下する。それは数時間
後にフイプリン分解生成物検出用試薬として適さなくな
る。本発明者は今般、多価アルコールの緩衝された２水
性溶液に懸濁された凝集因子陽性微生物、特にぶどう球
菌は、そのフイブリノーゲンおよび（ま＝＝譬？苫？＝
ｉ＝＝＝こ↑も失わないことを見出した。

ｊ従つて本発明の対象は、ＰＨ値
７．０〜７．７の緩衝された水性溶液であつて多価アル
コールを３〜５０％の濃度で溶解含有する該水性溶液の
、死滅した１１１／１ｈＢ子腸性微生物の均質懸濁液で
ある０ ＊ゝ 問題とする試験系にはすでにし
ばしば黄色ブドウ球菌ニユーマンＤ２Ｃ（Ｓｔａｐｈｙ
ｌＯｃＯｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＮｅｗｍａｎＤ２Ｃ）の
利用が報告されている。

この菌株ではニユーマン株の凝集因子陽性、可溶性コア
ギユラーゼ陰性変種が重要であるがこれはナシヨナノレ
・コレクシヨン・オブ・タイプ・カノレチヤーズ（Ｎａ
ｔｉＯｎａｌＣＯｌｌｅｃｔｉＯｎＯｆＴｙｐｅＣｕｌ
ｔｕｒｅｓ）にＮＯ．８ｌ７８として寄託された黄色ブ
ドウ球菌ニユーマンの培養液からＥ．Ｓ．Ｄｕｔｈｉｅ
（ＳＯｕｔｈａｍｐｔＯｎ在）によ引疑集因子形成に関
して選別されたものである。凝集因子陽性でありかつ可
溶性コアギユラーゼを形成できる菌株も同様に、文献に
知られるとおり、フイプリン分解生成物の測定に用いる
ことができるが、その場合前記可溶性コアギユラーゼは
例えば加熱工程により分解される。

そのように前処理されたブドウ球菌もまた本発明により
安定化させることができる。フイブリノーゲンおよびフ
イプリン分解生成物検出試薬の感度および安定性に関す
る特に良好な結果は、アメリカン・タイプ０・カノレチ
ヤ一●コレクシヨン（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌ
ｔｕｒｅＣＯｌｌｅｃｔｉＯｎ）にＡＴＣＣ番号３１１
５３として寄託された１．Ｊ．７で表示される黄色ブド
ウ球菌によつて与えられるが、この菌の形態学的性質は
次のように記載することができる。この菌株はもともと
人の咽頭塗抹標本から単離されそして細胞結合型コアギ
ユラーゼ形成に関して選別されたものである。

液体培地では、この菌株は小さな群としてまたは１対ず
つ約３０％までの割合で個々の菌体コロニーとして増殖
する。この菌株は通常のアニリン染料により染色される
。これはグラム陽性である。以下の固体培地上での黄色
ブドウ球菌１．Ｊ．７の特徴は次のとおりである。

黄色ブドウ球菌１．Ｊ．７菌株は次のような物質代謝結
果を示す。

次の物質の発酵 ノ次の
物質の液化細菌塊の得られる発酵法においてはすでに菌
の好懸濁性および凝集因子に関しての十分な収率に注意
が向けられている。

すなわち、肉ペプトン、乳酸またはその塩、ビタミンお
よびグルコース、アルカリ金属およびアルカリ土類金属
イオン、好ましくはその生理学的に許容し得る塩の形、
例えば塩化物、硫酸塩およびりん酸塩の水性溶液から本
質的に成る培地で菌増殖を行うのが好ましい。フラスコ
、ケトルまたは発酵槽内で増殖され、淵過または遠心分
離により栄養培地から分離された菌の増殖能を凝集因子
の活性が可及的に損われない手段によつて阻害する。確
実な既知の方法においては、菌の死滅は３０〜９０分間
約６０〜７０℃に加温することにより行われる。前記凝
集因子活性ブドウ球菌懸濁液の本質的な安定化作用は、
その懸濁液媒質中に３〜５０％の多価アルコールが含有
されている場合に存在する。

本明細書にいう多価アルコールとしては、炭化水素骨格
、好ましくは脂肪族炭化水素骨格中の数個の隣接炭素原
子に各々１個の水酸基を有しそして分子量が約９０〜約
５０００００の範囲にある化合物が挙げられる。この物
質群の最も簡単な化合物は２価アルコールであるグリコ
ールおよび３価アルコールであるグリセリンである。例
えば代表的な６価アルコール例えばグンニツトおよび代
表的な炭水化物例えばグルコースなども有利な安定化作
用を示す。本発明においては、低分子化合物のみならず
高分子グリコール例えばポリエチレングリコールも懸濁
液の安定化に用いることができる。そのほかに特に有利
な特性を示すものは炭水化物、特にそれらの高分子代表
物であり、それらは天然のものであつても合成によつて
得られたものであつてもよい。この例としては例えば天
然のグルコース重合体であるデキストラン、または蔗糖
からの合成多糖類が挙げられ、後者はＦｉｃＯｌｌ（Ｐ
ｈａｒｎｌａｃｉａＵｐｐｓａｌａ社の商品名）として
市販品が得られる。前記多価アルコールが利用され得る
ための条件は、懸濁すべき微生物菌体のためのほぼ等張
な環゛境をつくるために、場合により中性塩を添加する
ことのできる緩衝された水性溶液に可溶性であることで
ある。

ブドウ球菌の懸濁液は緩衝物質、例えば生化学的研究に
おいて通常用いられるような緩衝物質を用いて所望のＰ
Ｈ値に調整するのが好ましい。

これに適した緩衝物質としては例えばＧＯＯｄ等によノ
リＢｌＯｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５、４７２（１９６６）に
記載されたものが挙げられる。多価アルコールを含有す
る緩衝された水性溶液に懸濁された菌濃度は、そのブド
ウ球菌懸濁液をフイブリノーゲンおよび（または）フイ
プリン分解生成物測定試験法に直接用いる場合、１〜２
０×１０１０個／ｍｌである。しかしながら、菌濃度が
前記値よりも本質的に高くてもまたは低くても凝集因子
の安定性は保証される。本発明の対象は更に、既知方法
により培養されそして凝集因子を維持したまま死滅させ
た凝集因子形成微生物、好ましくはブドウ球菌を７．０
〜７．７、好ましくは７．３〜７．５のＰＨに緩衝され
た多価アルコールを３〜５０％含有する水性溶液に均質
に懸濁することを特徴とする微生物結合型凝集因子の安
定化方法である。言うまでもなく、本発明により安定化
した微生物懸濁液に更に生化学特に酵素化学上知られる
酵素活性維持または活性化物質例えば蛋白質特にアルブ
ミンまたはゼラチン分解生成物などを添加することは一
向差支えない。微生物汚染を防ぐために懸濁液に抗微生
物剤、例え，ば抗生物質を添加することもできる。本発
明の対象は更に、多価アルコールを含む緩衝された水性
溶液中に均質に懸濁された１〜２０Ｘ１０１０個／ｍｌ
の凝集因子陽性微生物を本質的成分として含有すＬ゛フ
イプリノーゲンおよび（また２は）フイプリン分解生成
物検出用試薬およびその製造方法である。

本発明の対象は更に（体液奸ま゛，しくは血漿または血
清中のフーイプリノーゲンお゛よび（または）フイプリ
ン分解生成物を既知方法により測定するた２めの前記安
定化ブドウ球菌懸濁液の使用である。

焔゛マ９イプ・リノーゲンおよび（または）フイプリン
分゛解＊成物ｆ）涛定は例えば供試血清の希釈系列をつ
くり、一定量の好ましくは等しい量の本発明によるブド
ウ球菌懸濁液と混合し、次いで数分以内に３なおも菌凝
集が陽性である最も高い血清希釈率を記録する。この値
を健康人の血清を希釈して得られた値と関連付けること
により、結果を正常値からのずれとして確認することが
できる。前記測定は既知の方法により、スライド上で反
３応成分を等部ずつ混合するのが特に簡単である。

゛＝「〒丁”〒電−１゜゜が添加された培地中で黄色ブ
ドウ球菌１．Ｊ．７（ＡＴＣＣ３ｌｌ５３）を１５×１
０１８個／ｍｌの菌濃度となるまで増殖させる。

次いで増殖を行つた発酵槽を９０分間７０℃に加温する
。

６５００ｒｐｍで遠心分離することにより菌を採取する
。

上澄みの培地を捨てそして菌を等張食塩溶液に懸濁しそ
して遠心分離する。最後にその遠心分離した菌を次の組
成：の緩衝溶液に懸濁する。

この溶液のＰＨ値を１Ｎ塩酸で７．４に調節し、次いで
この緩衝溶液１容量部に対し１容量部のグリセリンを添
加する。

次いでその懸濁液の菌濃度を１×１０１１個／ｍｌに調
節する。得られた懸濁液は次の試験系において１２ケ月
にわたつて一定不変の結果を示す。

ｌ健康な正常人からの血清採取 採血したばかりの血液５ｍ１を１０抗プラスミン単位に
相当する０．１ｍ１の多価プロテイナーゼ阻害剤および
１０ＮＩＨ単位に相当する０．１ｍ１のトロンビン溶液
と注意深く混合する。

その混合物を３７℃で２時間インキユベートし次いで遠
心分離により上澄みの血清を生成凝血塊から分離する。
２試験評価 ＰＨ値７．４の０．１Ｍトリス−ヒドロキシメチルアミ
ノメタン一塩酸緩衝液を用いて、１：１、１：２、１：
４、１：８などの希釈度となるように前記血清の幾何学
的希釈系列をつくる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ｐＨ値７．０〜７．７の緩衝された水性溶液であつ
   て該溶液に可溶な少くとも１種の多価アルコールを３〜
   ５０％含有する該水性溶液中の死滅した凝集因子陽性黄
   色ブドウ球菌の均質懸濁液。 ２ 凝集因子陽性黄色ブドウ球菌として黄色ブドウ球菌
   Ｉ．Ｊ．７（ＡＴＣＣ３１１５３）菌を用いる前記第１
   項記載の懸濁液。 ３ 多価アルコールの分子量が９０〜５０００００であ
   る前記第１項または第２項記載の懸濁液。 ４ フィブリノーゲンおよび（または）フィブリン分解
   生成物検出試薬の本質的成分としての菌数が１〜２０×
   １０＾１＾０個／ｍｌである前記第１〜３項のいずれか
   に記載の懸濁液。 ５ 凝集因子形成黄色ブドウ球菌を既知方法により培養
   し、前記黄色ブドウ球菌を凝集因子を保持しながら死滅
   させ、そしてｐＨ値７．０〜７．７の緩衝された水性溶
   液であつて該溶液に可溶な少くとも１種の多価アルコー
   ルを３〜５０％含有する該水性溶液中に均質に懸濁する
   ことを特徴とする黄色ブドウ球菌結合型凝集因子の安定
   化された均質懸濁液の製法。