JPS5939292A - 酵母銅キレチン及び該銅キレチンをコ−ドする遺伝子系 - Google Patents
酵母銅キレチン及び該銅キレチンをコ−ドする遺伝子系Info
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- JPS5939292A JPS5939292A JP58098143A JP9814383A JPS5939292A JP S5939292 A JPS5939292 A JP S5939292A JP 58098143 A JP58098143 A JP 58098143A JP 9814383 A JP9814383 A JP 9814383A JP S5939292 A JPS5939292 A JP S5939292A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（発明の背景）
発明の分野
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を操作することが
可能になったため、商業的及び生理学的に興味ある多く
の種類のポリペプチドを合成する可能性、並びに細胞の
能力及び機能を改変する可能性がすでに大きく開かれて
いる。咄乳動物に自然に存在する広範囲の種類のポリペ
プチドを製造するために単細胞微生物を使用することが
可能である。単細胞微生物の使用において、細胞に〔り
生産される全蛋白質に比べて所望の生成物の生産を増強
することが望まれる。こうすることにより、微生物の維
持及び増殖のコストとの関連で生成物のコストを実質上
低減することができる。このため、興味ある生成物の発
現を強化するだめの方法を見出すだめの多くの研究がな
されてきた。
可能になったため、商業的及び生理学的に興味ある多く
の種類のポリペプチドを合成する可能性、並びに細胞の
能力及び機能を改変する可能性がすでに大きく開かれて
いる。咄乳動物に自然に存在する広範囲の種類のポリペ
プチドを製造するために単細胞微生物を使用することが
可能である。単細胞微生物の使用において、細胞に〔り
生産される全蛋白質に比べて所望の生成物の生産を増強
することが望まれる。こうすることにより、微生物の維
持及び増殖のコストとの関連で生成物のコストを実質上
低減することができる。このため、興味ある生成物の発
現を強化するだめの方法を見出すだめの多くの研究がな
されてきた。
単細胞微生物の中で、酵母は、組替ＤＮＡ又は雑種ＤＮ
Ａ技法を用いるポリペプチドの製造において多くの利点
を供する。すでに、発酵において酵母を使用し、又商業
的に有用な多くの化学物質を製造する大きな技術が開発
されでいる。すなわち、条件、増殖、培地、及び純化方
法はすでに実用的なものとなっているｄ 酵母は安全な生物であり、そして長期間にわたり工業的
に使用されてきており、それ故に取扱及び処分方法は十
分に確立されている。酵母は原核生物ではなく真核生物
である。このため、酵母においては遺伝子発現機構が高
等哺乳動物のそれと非常に類似しており、そして酵母は
高等哺乳動物に由来する遺伝子のコードをより高率的に
認識する。
Ａ技法を用いるポリペプチドの製造において多くの利点
を供する。すでに、発酵において酵母を使用し、又商業
的に有用な多くの化学物質を製造する大きな技術が開発
されでいる。すなわち、条件、増殖、培地、及び純化方
法はすでに実用的なものとなっているｄ 酵母は安全な生物であり、そして長期間にわたり工業的
に使用されてきており、それ故に取扱及び処分方法は十
分に確立されている。酵母は原核生物ではなく真核生物
である。このため、酵母においては遺伝子発現機構が高
等哺乳動物のそれと非常に類似しており、そして酵母は
高等哺乳動物に由来する遺伝子のコードをより高率的に
認識する。
酵母にとって外来性のポリペプチドを製造するために酵
母を用いる場合、酵母の生育力を制限して所望のポリペ
プチドの生産を最高にすることが望ましい。他宿主中で
よシ多くのポリペプチドを生産するだめの１つの技法は
、多機製（マルチコピー）プラスミツドを用いる方法で
ある。多機製グラスミツドは多くの欠点を有し、その１
つは、多機製プラスミツド上の遺伝子を多数複製するた
めに、多量のＤＮＡ 、及びそのＤＮＡの維持と複製に
関する多くの物質が生産されなければならないことであ
る。すなわち、宿主のエネルギーの実質的な量が、宿主
又は生産者に所望でない生成物の生産のために浪費され
る。
母を用いる場合、酵母の生育力を制限して所望のポリペ
プチドの生産を最高にすることが望ましい。他宿主中で
よシ多くのポリペプチドを生産するだめの１つの技法は
、多機製（マルチコピー）プラスミツドを用いる方法で
ある。多機製グラスミツドは多くの欠点を有し、その１
つは、多機製プラスミツド上の遺伝子を多数複製するた
めに、多量のＤＮＡ 、及びそのＤＮＡの維持と複製に
関する多くの物質が生産されなければならないことであ
る。すなわち、宿主のエネルギーの実質的な量が、宿主
又は生産者に所望でない生成物の生産のために浪費され
る。
他の技法は、高効率プロモーター、特に、宿主の全蛋白
質中高い比率で存在するｙＪｅ ＩＪベノチドの自然生
産に関連し、又は高い転写回転速度を供する宿主のプロ
モーターを使用する方法である。
質中高い比率で存在するｙＪｅ ＩＪベノチドの自然生
産に関連し、又は高い転写回転速度を供する宿主のプロ
モーターを使用する方法である。
第３の技法は、所望の遺伝子を増加せしめる方法を用い
ることである。こめ技法は、遺伝子及びその遺伝子の増
加によるストレスに応答する制御系を用いることを含む
。外来遺伝子をフランク領域としてストレスにより増加
する遺伝子に連結することにニジ、両遺伝子を含む反復
の増加が生ずることが見出されている。
ることである。こめ技法は、遺伝子及びその遺伝子の増
加によるストレスに応答する制御系を用いることを含む
。外来遺伝子をフランク領域としてストレスにより増加
する遺伝子に連結することにニジ、両遺伝子を含む反復
の増加が生ずることが見出されている。
従来技術の記載
カギ（Ｋａｇｉ ）及びノドペルク（ＮＯｄｂｅｒｇ）
、編（１９７９年） Ｉｌ＆ｔａｌｌｏｔｈｌｏｎｅｔ
ｎ （ビルクツ１ウゼル。
、編（１９７９年） Ｉｌ＆ｔａｌｌｏｔｈｌｏｎｅｔ
ｎ （ビルクツ１ウゼル。
バーセル）、並びにビーチ（ＢｅａＣｈ ）及ヒノ母
ルミター（Ｐａｌｍｔｔｅｒ ）、ＰＮＡＳ （１９８
１年）７８：２１０−２１４にはメタロチオネインが一
般的に記載されている。ブレネス（Ｂｒｅｎｅｓ ）−
ポマレス（Ｐｏｍａｌｅｓ ）等、Ｎａｔｕｒｅ （１
９５５年）１７６：８４１−８４２には銅感受性及び銅
耐性酵母菌株が記載されている。これらの多形現象は、
遺伝子転換を研究する場合の指標として広く用いられて
きた。モルチマ−（Ｍｏｒｔｔｍｅｒ ）及びホーダル
（Ｆｏｇｅｌ ）（１９７４年） Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
ｓ ｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｌｎａｔ％０ｎｌＲ，クレス（
Ｇｒｅｌｌ ） 編（７’レヌムプレス、ニューヨーク
）２６３〜２７５頁にはこれらの研究が例示されている
。さらに、ＰＣＴ出願Ｕ、Ｓ ８１１００２３９号及び
Ｕ、Ｓ ８１１００２４０号を参照のととＯ （発明の概要） この発明は、リジン、グルタミン酸及びセリンのごとき
極性アミノ酸を高比率で含むと共に高システィン含量を
有する銅キレート化ポリペグチド（Ｃｕ−キレチｙ （
ｃｈｅｌａｔｉｎ ））を発現する新規な酵母遺伝子系
を提供する。この遺伝子系は、銅耐性酵母宿主を選択し
てキレチン遺伝子をフランクする他の遺伝子を増加せし
めてフランク遺伝子を。
ルミター（Ｐａｌｍｔｔｅｒ ）、ＰＮＡＳ （１９８
１年）７８：２１０−２１４にはメタロチオネインが一
般的に記載されている。ブレネス（Ｂｒｅｎｅｓ ）−
ポマレス（Ｐｏｍａｌｅｓ ）等、Ｎａｔｕｒｅ （１
９５５年）１７６：８４１−８４２には銅感受性及び銅
耐性酵母菌株が記載されている。これらの多形現象は、
遺伝子転換を研究する場合の指標として広く用いられて
きた。モルチマ−（Ｍｏｒｔｔｍｅｒ ）及びホーダル
（Ｆｏｇｅｌ ）（１９７４年） Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
ｓ ｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｌｎａｔ％０ｎｌＲ，クレス（
Ｇｒｅｌｌ ） 編（７’レヌムプレス、ニューヨーク
）２６３〜２７５頁にはこれらの研究が例示されている
。さらに、ＰＣＴ出願Ｕ、Ｓ ８１１００２３９号及び
Ｕ、Ｓ ８１１００２４０号を参照のととＯ （発明の概要） この発明は、リジン、グルタミン酸及びセリンのごとき
極性アミノ酸を高比率で含むと共に高システィン含量を
有する銅キレート化ポリペグチド（Ｃｕ−キレチｙ （
ｃｈｅｌａｔｉｎ ））を発現する新規な酵母遺伝子系
を提供する。この遺伝子系は、銅耐性酵母宿主を選択し
てキレチン遺伝子をフランクする他の遺伝子を増加せし
めてフランク遺伝子を。
縦列的及び非縦列的に反復複製するのに使用される。フ
ランク遺伝子の多数複製は所望のペプチドの発現のため
に使用することができる。
ランク遺伝子の多数複製は所望のペプチドの発現のため
に使用することができる。
（発明の具体的な記載）
この発明は、銅耐性酵母菌株に自然に存在する銅キレー
ト化メタロチオネインの生産を増強するための技法を提
供する。銅キレート化ポリペゾチド（銅−キレチンすな
わちＣｕ−キレチン）ｆ、その制御機構と共にコードす
る遺伝子を分離することにより、広範囲の方法で、そし
て広範囲の目的に使用することができるＤＮＡセグメン
トが得られる。
ト化メタロチオネインの生産を増強するための技法を提
供する。銅キレート化ポリペゾチド（銅−キレチンすな
わちＣｕ−キレチン）ｆ、その制御機構と共にコードす
る遺伝子を分離することにより、広範囲の方法で、そし
て広範囲の目的に使用することができるＤＮＡセグメン
トが得られる。
ＤＮＡセグメントを酵母宿主に導入することにニジ酵母
宿主に銅耐性を与えることができる。ＤＮＡセグメント
を酵母に導入し、そして銅によるストレスによって遺伝
子及びその制御機構を増幅せしめることにニジＣｕ−キ
レチンの生産を増強することもできる。遺伝子それ自体
を、又は遺伝子をその制御機構と共に他の宿主、例えば
原核生物に導入してその生物に銅耐性を与えることがで
きる。
宿主に銅耐性を与えることができる。ＤＮＡセグメント
を酵母に導入し、そして銅によるストレスによって遺伝
子及びその制御機構を増幅せしめることにニジＣｕ−キ
レチンの生産を増強することもできる。遺伝子それ自体
を、又は遺伝子をその制御機構と共に他の宿主、例えば
原核生物に導入してその生物に銅耐性を与えることがで
きる。
Ｃｕ−キレチン系をＣｕ−キレチン系の下流フランク領
域としての他の遺伝子と組縫わせて使用するのが特に有
利である。
域としての他の遺伝子と組縫わせて使用するのが特に有
利である。
Ｃｕ−キレチンを発現し得る真核宿主を、 Ｃｕ−キレ
チン遺伝子及び関連フランク遺伝子を含有するＤＮＡセ
グメントにより形質転換する。培地中の銅濃度を反復し
て、増加することによｐ、ＤＮＡセグメントが多数回縦
列的に反復され及び／又は非縦列的に反復される。この
ようにして、高い銅濃度において生存し続ける生物のク
ローンを選択する。
チン遺伝子及び関連フランク遺伝子を含有するＤＮＡセ
グメントにより形質転換する。培地中の銅濃度を反復し
て、増加することによｐ、ＤＮＡセグメントが多数回縦
列的に反復され及び／又は非縦列的に反復される。この
ようにして、高い銅濃度において生存し続ける生物のク
ローンを選択する。
このような生物の生存は、Ｃｕ−キレチン遺伝子及びそ
れに伴うフランク遺伝子の反復と関連する。
れに伴うフランク遺伝子の反復と関連する。
こうして、Ｃｕ−キレチン遺伝子及びフランク遺伝子の
いずれもが、宿主中で実質的な量において発現する。
いずれもが、宿主中で実質的な量において発現する。
最後に、Ｃ１１−キレチン自体を、広範囲の種類の廃棄
物又は他の種類の工場流から重金属、特に銅を除去する
ためのキレート剤として使用することができる。
物又は他の種類の工場流から重金属、特に銅を除去する
ためのキレート剤として使用することができる。
要約すれば、この発明は、Ｃｕ−キレチンをコードする
核酸配列、Ｃｕ−キレチンのだめの酵母制御信号を伴う
前記の配列、重金属、特に銅の存在下で全配列が縦列的
又は非縦列的に反復し得るＣｕ−キレチン遺伝子と第２
の遺伝子を含有する核酸配列、並びにＣｕ−キレチン蛋
白質又はその有効な類似体、及びそのフラグメントを対
象とする。上記のポリヌクレオチド配列はそれ自体とし
て、又は他のポリヌクレオチド配列と共に、染色体外要
素として又は酵母の染色体に組込んで使用することがで
きる。
核酸配列、Ｃｕ−キレチンのだめの酵母制御信号を伴う
前記の配列、重金属、特に銅の存在下で全配列が縦列的
又は非縦列的に反復し得るＣｕ−キレチン遺伝子と第２
の遺伝子を含有する核酸配列、並びにＣｕ−キレチン蛋
白質又はその有効な類似体、及びそのフラグメントを対
象とする。上記のポリヌクレオチド配列はそれ自体とし
て、又は他のポリヌクレオチド配列と共に、染色体外要
素として又は酵母の染色体に組込んで使用することがで
きる。
Ｃｕ−キレチンをコードするＤＮＡ配列は銅耐性酵母菌
株からの酵母染色体ＤＮＡの部分分解に工り得られる。
株からの酵母染色体ＤＮＡの部分分解に工り得られる。
この部分分解のために約１０〜３０ ｋｂｐのフラグメ
ントを供する種々の制限酵素を使用することができる。
ントを供する種々の制限酵素を使用することができる。
こうして得られたＤＮ入フラグメントは、適当なベクタ
ー、特に原核性レグリコン傘 を有するベクターを用いてクロー二／グすることができ
る。好ましくはシャトルベクターを使用し、原核性宿主
中でＤＮＡセグメントを増加せしめ、グラスミツドを分
離し、そして純化し、そして次にこれを酵母宿主の形質
転換に使用する。
ー、特に原核性レグリコン傘 を有するベクターを用いてクロー二／グすることができ
る。好ましくはシャトルベクターを使用し、原核性宿主
中でＤＮＡセグメントを増加せしめ、グラスミツドを分
離し、そして純化し、そして次にこれを酵母宿主の形質
転換に使用する。
銅耐性を有する宿主の形質転換株又は形質導入株の選択
を容易にするために野性株又は変異株の銅感受性宿主細
胞使用するのが好ましい。生じた酵母クローンを分離し
、そして銅耐性宿主を銅濃度が増加する栄養培地にゆだ
ねることにｘＤ鋼耐性形質転換宿主を選択する。銅濃度
を約０．１ｍＭの低濃度、通常は約０．３ｍＭ以上の濃
度から２０ｍＭ未満の濃度、通常約１５ｍＭ未満の濃度
までの間で段階的に増加せしめるのが好都合である。こ
の間隔は一般に約０．２ ｍＭ〜０．５ ｍＭの範囲で
変えることができる。この工うな高い銅濃度において生
存するためには、変換された宿主はＣｕ−キレチンをコ
ードする多機製遺伝子を必要とするであろう。
を容易にするために野性株又は変異株の銅感受性宿主細
胞使用するのが好ましい。生じた酵母クローンを分離し
、そして銅耐性宿主を銅濃度が増加する栄養培地にゆだ
ねることにｘＤ鋼耐性形質転換宿主を選択する。銅濃度
を約０．１ｍＭの低濃度、通常は約０．３ｍＭ以上の濃
度から２０ｍＭ未満の濃度、通常約１５ｍＭ未満の濃度
までの間で段階的に増加せしめるのが好都合である。こ
の間隔は一般に約０．２ ｍＭ〜０．５ ｍＭの範囲で
変えることができる。この工うな高い銅濃度において生
存するためには、変換された宿主はＣｕ−キレチンをコ
ードする多機製遺伝子を必要とするであろう。
銅感受性から銅耐性に形質転換された主宿から、ＤＮＡ
セグメントが発現ベクターの特定の制限部位に導入され
ているプラスミツドを分離することによｆｉ ＤＮＡセ
グメントを切シ取シ、そして変性して単鎖を得ることが
でき、この単鎖はハイブリッド形成検知体（グローブ）
として使用することができる。このプローブは染色体に
一体化されたＣｕ−キレチン遺伝子の存在を示すために
使用することができる。プローブは検知し得る信号を供
するために標識するのが便利である。種々の標識には放
射性核程、一方がハイブリッド形成検知体に結合しそし
て他方が多数標識されたリガンド又は受容体の組合わせ
例えばビオチン及びアビジン、酵素１螢光物質、並びに
これらに類するものが含まれる。
セグメントが発現ベクターの特定の制限部位に導入され
ているプラスミツドを分離することによｆｉ ＤＮＡセ
グメントを切シ取シ、そして変性して単鎖を得ることが
でき、この単鎖はハイブリッド形成検知体（グローブ）
として使用することができる。このプローブは染色体に
一体化されたＣｕ−キレチン遺伝子の存在を示すために
使用することができる。プローブは検知し得る信号を供
するために標識するのが便利である。種々の標識には放
射性核程、一方がハイブリッド形成検知体に結合しそし
て他方が多数標識されたリガンド又は受容体の組合わせ
例えばビオチン及びアビジン、酵素１螢光物質、並びに
これらに類するものが含まれる。
酵母ｃｕ−，４シー。をコードする遺伝子は約３００
ｂｐ未満である。遺伝子の転写及び翻訳に関する制御信
号と組合わせてもこのセグメントは一般に約６００ ｂ
ｐ未満である。Ｃｕ−キレチン遺伝子がその制御信号と
共に導入されている宿主をストレスした後縦列的に反復
したＤＮＡセグメントは約１〜２ ｋｂｐであることが
見出され、従って、Ｃｕ−キレチン遺伝子と共に縦列的
に反復される約１ ｋｂｐより大きな部分を、下流フラ
ンク領域としてＣｕ−キレチン遺伝子に加えることがで
きる。
ｂｐ未満である。遺伝子の転写及び翻訳に関する制御信
号と組合わせてもこのセグメントは一般に約６００ ｂ
ｐ未満である。Ｃｕ−キレチン遺伝子がその制御信号と
共に導入されている宿主をストレスした後縦列的に反復
したＤＮＡセグメントは約１〜２ ｋｂｐであることが
見出され、従って、Ｃｕ−キレチン遺伝子と共に縦列的
に反復される約１ ｋｂｐより大きな部分を、下流フラ
ンク領域としてＣｕ−キレチン遺伝子に加えることがで
きる。
第２の遺伝子をＣｕ−キレチン遺伝子の下流端に連結す
ることができる。第２の遺伝子は、プロモーター、他の
転写制御信号、例えばオペレーター、及び酵母宿主に工
って認識されるり？シーム出発部位を含む自分自身の制
御系を有するであろう。
ることができる。第２の遺伝子は、プロモーター、他の
転写制御信号、例えばオペレーター、及び酵母宿主に工
って認識されるり？シーム出発部位を含む自分自身の制
御系を有するであろう。
強力なプロモーター、すなわち酵母中に多量に存在する
ポリペプチド生成物に関連するゾロモーターを使用する
のが好ましい。特にＰＱＫ 、 ＡＤＩ（のどときプロ
モーターが好ましい。
ポリペプチド生成物に関連するゾロモーターを使用する
のが好ましい。特にＰＱＫ 、 ＡＤＩ（のどときプロ
モーターが好ましい。
酵母Ｃｕ−キレチンをコードするＲＮＡ配列の３′−末
端は、酵母Ｃｕ−キレチンのＣ末端のアミン配列から容
易に決定することができる。ポリペプチドは、常用の技
法及びアミノ酸のための多数のコードに基礎を置いて用
意された多数の検知体に工ｐ配列される。Ｃｕ−キレチ
ン遺伝子の下流に便利な制限部位が得られない場合、変
異によシこれを導入することができる。他方、Ｃｕ−キ
レチン遺伝子の下流からヌクレオチドを取シ出し、そし
て平滑末端を有する二重鎖ＤＮＡセグメントを得るため
に一次修復を用いることができる。Ｃｕ−キレチンをコ
ードし、そして制御配列を含む、ＤＮＡセグメントは第
２の遺伝子に連結することができる。こうして得られた
２種の遺伝子を含むセグメントを適当な発現ベクターに
挿入し、そして適切に方向ずけられた所望のＤＮＡ配列
を有するクローンを選択する。
端は、酵母Ｃｕ−キレチンのＣ末端のアミン配列から容
易に決定することができる。ポリペプチドは、常用の技
法及びアミノ酸のための多数のコードに基礎を置いて用
意された多数の検知体に工ｐ配列される。Ｃｕ−キレチ
ン遺伝子の下流に便利な制限部位が得られない場合、変
異によシこれを導入することができる。他方、Ｃｕ−キ
レチン遺伝子の下流からヌクレオチドを取シ出し、そし
て平滑末端を有する二重鎖ＤＮＡセグメントを得るため
に一次修復を用いることができる。Ｃｕ−キレチンをコ
ードし、そして制御配列を含む、ＤＮＡセグメントは第
２の遺伝子に連結することができる。こうして得られた
２種の遺伝子を含むセグメントを適当な発現ベクターに
挿入し、そして適切に方向ずけられた所望のＤＮＡ配列
を有するクローンを選択する。
銅濃度を前記の増加間隔で約０．３ｍＭから約２０ ｍ
Ｍ 、もっと普通には約１５ｍＭ１で逐次上昇せしめな
がら酵母細胞を増殖せしめることにより、非縦列的反復
を伴う縦列的反復が達成される。
Ｍ 、もっと普通には約１５ｍＭ１で逐次上昇せしめな
がら酵母細胞を増殖せしめることにより、非縦列的反復
を伴う縦列的反復が達成される。
次に、Ｃｕ−キレチン遺伝子及び他の遺伝子の縦列的反
復を有する変換された細胞を選択し、２つの遺伝子が発
現するように増殖せしめる。このようにして、所望の生
成物を高収斂で得ることができる。
復を有する変換された細胞を選択し、２つの遺伝子が発
現するように増殖せしめる。このようにして、所望の生
成物を高収斂で得ることができる。
多機製ベクターを使用することにより、及び／又は多数
の染色体部位に不規則な反復が生ずるように多数反復す
る遺伝子を宿主に一体化することにニジ、収量をさらに
増強することができる。そして、多数の反復単位を有す
る宿主を選択する。
の染色体部位に不規則な反復が生ずるように多数反復す
る遺伝子を宿主に一体化することにニジ、収量をさらに
増強することができる。そして、多数の反復単位を有す
る宿主を選択する。
染色体への一体化は、Ｃｕ−キレチン遺伝子及び他の遺
伝子を、染色体中の少なくとも１つの部位、好ましくは
多数の部位に存在するＤＮＡ配列に類似する追加のＤＮ
Ａ配列と組合わせることにｊシ達成することができる。
伝子を、染色体中の少なくとも１つの部位、好ましくは
多数の部位に存在するＤＮＡ配列に類似する追加のＤＮ
Ａ配列と組合わせることにｊシ達成することができる。
こうして、組替えを通じて完全な構造のＤＮＡ、すなわ
ち制御信号、Ｃｕ−キレチンをコーＰする遺伝子及び他
の遺伝子を酵母染色体の多数の部位に挿入することがで
きる。
ち制御信号、Ｃｕ−キレチンをコーＰする遺伝子及び他
の遺伝子を酵母染色体の多数の部位に挿入することがで
きる。
上記の方法に代えて、酵母動態体、少なくとも１つの自
己複製セグメン） （ａｒｓ ）並びにＣｕ−キレチン
遺伝子及び他の遺伝子を含有する小染色体（ミクロクロ
モシーム）を用いることができる。
己複製セグメン） （ａｒｓ ）並びにＣｕ−キレチン
遺伝子及び他の遺伝子を含有する小染色体（ミクロクロ
モシーム）を用いることができる。
小染色体は、選択的条件を用いないで酵母宿主中に安定
に維持することができる。
に維持することができる。
はとんどの場合、Ｃｕ−キレチン遺伝子を酵母宿主に導
入する方法に関係なく、Ｃｕ−キレチン遺伝子の多数複
製の維持を確実にするために酵母宿主を選択的条件下で
増殖せしめる。
入する方法に関係なく、Ｃｕ−キレチン遺伝子の多数複
製の維持を確実にするために酵母宿主を選択的条件下で
増殖せしめる。
すでに見出されている他の銅キレート化化合物に対する
比較として、酵母中に見出されたＣｕ−キレチンは約６
５００ｄの分子量を有する。アミノ酸組成は約１６％の
システィン、１０チのりシン、１０％のグルタミン酸、
１１％のセリン、並びに約８９６のそれぞれアスパラギ
ン、グルタミン、スレオニン及びグリシンを含んで成る
。他のアミン酸は約５チより少量ずつ存在する。
比較として、酵母中に見出されたＣｕ−キレチンは約６
５００ｄの分子量を有する。アミノ酸組成は約１６％の
システィン、１０チのりシン、１０％のグルタミン酸、
１１％のセリン、並びに約８９６のそれぞれアスパラギ
ン、グルタミン、スレオニン及びグリシンを含んで成る
。他のアミン酸は約５チより少量ずつ存在する。
次に、酵母Ｃｕ−キレチンのアミノ酸配列、及びＣｕ−
キレチンをコードするヌクレオチド配列を示し、このポ
リペプチドは約６４９０の分子量を有する。
キレチンをコードするヌクレオチド配列を示し、このポ
リペプチドは約６４９０の分子量を有する。
所望の遺伝子は、次の制限エンドヌクレアーゼすなわち
Ｔａｑｌ ｓ ＲｓａＩ 、 Ｈｉｎｆｌ ％Ｄｄ
ｅｌの制限部位によりフランクされるが、これらはコー
ド部分に制限部位を有しない。従って、Ｃｕ−キレチン
をコードする遺伝子セグメントは非コード部位を実質上
官まない状態で容易に分離することができる。
Ｔａｑｌ ｓ ＲｓａＩ 、 Ｈｉｎｆｌ ％Ｄｄ
ｅｌの制限部位によりフランクされるが、これらはコー
ド部分に制限部位を有しない。従って、Ｃｕ−キレチン
をコードする遺伝子セグメントは非コード部位を実質上
官まない状態で容易に分離することができる。
次に、実験例によりこの発明をさらに具体的に説明する
。但しくこれによりこの発明の範囲を限定するものでは
ない。
。但しくこれによりこの発明の範囲を限定するものでは
ない。
（実験）
材料及び方法
菌株及びＤＮＡ
ＤＮＡ形質転換は、次のオーキソトローゾ・マーＢＺ３
１−１−７Ｂａ株を用いて行った。銅耐性（ＣＵＰ、ｒ
）遺伝子はナスミス（Ｎａ５ｍ７ｔｈ ）及びリード（
Ｒ＠ｅｄ）、ＰＮＡＳ（１９８０年）７７：２１１９〜
２１２３に工９調製された雑種ＤＮＡの標品から選択し
た。
１−１−７Ｂａ株を用いて行った。銅耐性（ＣＵＰ、ｒ
）遺伝子はナスミス（Ｎａ５ｍ７ｔｈ ）及びリード（
Ｒ＠ｅｄ）、ＰＮＡＳ（１９８０年）７７：２１１９〜
２１２３に工９調製された雑種ＤＮＡの標品から選択し
た。
この標品は、シラスミツドＹＲｐ ７のＢａｍＨ１部位
にクローン化したＡＢ３２０ ＃母ＤＮＡの５ａｕ−３
Ａ部分分解物から調製した。この雑種標品の構成に使用
される遺伝子ＤＮＡは、菌株ＡＢ３２０ （則−史り、
雑種Ｗ８７〔ロスタイン（Ｒｏｔｈｓｔｅｔｎ ）等、
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （１９７７年）８５：３５−５４
〕からの分離株であり、おそらく−缶体Ｘ２１８０と密
接に関連している。見０士悲：（耳、吐↓１）Ｈ８１０
１株をトランスフェクションに使用した。
にクローン化したＡＢ３２０ ＃母ＤＮＡの５ａｕ−３
Ａ部分分解物から調製した。この雑種標品の構成に使用
される遺伝子ＤＮＡは、菌株ＡＢ３２０ （則−史り、
雑種Ｗ８７〔ロスタイン（Ｒｏｔｈｓｔｅｔｎ ）等、
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （１９７７年）８５：３５−５４
〕からの分離株であり、おそらく−缶体Ｘ２１８０と密
接に関連している。見０士悲：（耳、吐↓１）Ｈ８１０
１株をトランスフェクションに使用した。
ＹＲｐ７ベクターは ＴＲＰ Ｉ＋酵母遺猷子及び酵母
中で自己複製することを可能にする配列を含む１．４３
ｋｂの垣Ｒ，セグメントを有するｐＢＲ３２２の訪導
体である。ＹＲｐ １７ベクターは、１．４３ ｋｂの
ＴＲＰＩ ＥｃｏＲ４フラグメントと共にＵＲＡ 、”
酵母遺伝子をｐＢＲ３２２の村り部位に含有する。
中で自己複製することを可能にする配列を含む１．４３
ｋｂの垣Ｒ，セグメントを有するｐＢＲ３２２の訪導
体である。ＹＲｐ １７ベクターは、１．４３ ｋｂの
ＴＲＰＩ ＥｃｏＲ４フラグメントと共にＵＲＡ 、”
酵母遺伝子をｐＢＲ３２２の村り部位に含有する。
微生物の培養
Ｅ、コリは、Ｉ、Ｂ−培地〔デービス（Ｄａｖｉｓ ）
等、（１９８０年） Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒ
ｉａｌ Ｇｅｎｅｔ％ＣＢ＝Ａ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ （コール
ドスプリングハーバ−研究所、コールドスフ’ ＩＪン
グハーパー、ニューヨーク）〕で培養する。プラスミド
含有細胞を増殖せしめる場合はアンピシリン（５０μ９
７ｍｅ ）を加える。酵母の培養条件及び取扱方法はす
でに発表されている方法〔フォーグル（Ｆｏｇｅｌ ）
等（１９８１年）、Ｍｉｃｒｏｂ％ｏｌｏｇｙｏｆ ｔ
ｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ％ス
トラセム（Ｓｔｒｏｔｈｅｍ ）等線、（コールドスプ
リングハーバ−、ニューヨーク）〕によった。銅培地（
０−３ｒｎＭ、ｃｕｓｏ４）としては、１．５チの寒天
で固化した完全合成培地（ギプコ（Ｇｔｂｃｏ ）研究
所、グランドアイランド、ニューヨーク）を用いた。
等、（１９８０年） Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒ
ｉａｌ Ｇｅｎｅｔ％ＣＢ＝Ａ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ （コール
ドスプリングハーバ−研究所、コールドスフ’ ＩＪン
グハーパー、ニューヨーク）〕で培養する。プラスミド
含有細胞を増殖せしめる場合はアンピシリン（５０μ９
７ｍｅ ）を加える。酵母の培養条件及び取扱方法はす
でに発表されている方法〔フォーグル（Ｆｏｇｅｌ ）
等（１９８１年）、Ｍｉｃｒｏｂ％ｏｌｏｇｙｏｆ ｔ
ｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ％ス
トラセム（Ｓｔｒｏｔｈｅｍ ）等線、（コールドスプ
リングハーバ−、ニューヨーク）〕によった。銅培地（
０−３ｒｎＭ、ｃｕｓｏ４）としては、１．５チの寒天
で固化した完全合成培地（ギプコ（Ｇｔｂｃｏ ）研究
所、グランドアイランド、ニューヨーク）を用いた。
ＤＮＡ形 転、及び調製
酵母の形質転換はヒネン（Ｈ［ｎｎｅｎ ）の方法〔ヒ
ネン等、ＰＮＡ８（１９７８年）７５：１９２９−１９
３３：ｌに従って行った。但し次の点において異る。１
Ｍソルビトール及び５０ ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐ）１７
．５に再懸濁した後、３０℃にて１時間、細胞を０．１
俤のβ−メルカプトエタノール及び４０単位／ ｍｌの
りチコーゼ（１ｙｔｉｃａｓｅ ）で処理した。秤、り
形質転換はデービス等（前記）、及びウニシンク（Ｗｅ
ｓｔｎｋ）等、Ｃｅ１ｌ （１９７４年）３：３１５−
３２５により記載された方法によって行った。急速ＤＮ
Ａ ＩＩＪ製はストルール（５ｔｒｕｈｌ ）等、ＰＮ
ＡＱ（１９７９年）７６：１０３５−１０３９の方法に
従って行９た。ＤＮＡサブクローニン夛法はデービス等
（前記）の方法に従って行った。
ネン等、ＰＮＡ８（１９７８年）７５：１９２９−１９
３３：ｌに従って行った。但し次の点において異る。１
Ｍソルビトール及び５０ ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐ）１７
．５に再懸濁した後、３０℃にて１時間、細胞を０．１
俤のβ−メルカプトエタノール及び４０単位／ ｍｌの
りチコーゼ（１ｙｔｉｃａｓｅ ）で処理した。秤、り
形質転換はデービス等（前記）、及びウニシンク（Ｗｅ
ｓｔｎｋ）等、Ｃｅ１ｌ （１９７４年）３：３１５−
３２５により記載された方法によって行った。急速ＤＮ
Ａ ＩＩＪ製はストルール（５ｔｒｕｈｌ ）等、ＰＮ
ＡＱ（１９７９年）７６：１０３５−１０３９の方法に
従って行９た。ＤＮＡサブクローニン夛法はデービス等
（前記）の方法に従って行った。
０、５ ｔｔｇ／ｌｎｌのエチジウムプロミドを含有す
る４ ０ ｍＭ ）リス−ＯＨ１２０ｍＭ酢酸、２ ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ中にアガロースダル（０，７％）を調製し
、そして１〜１．５ Ｖ ／ｑｎにて水平眠気泳動を行
った。ＤＮＡバンドは、電気泳動的集収によυグルか°
らワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ ）ＤＥ８１Ｆ紙上で回
収した〔ウインベルク（Ｗｌｎｂ＋ｒｇ ）及ヒハマー
ショルド（Ｉ（ａｍｍａｒｓｋｊｏｌｄ ）、Ｎｕｃｌ
ｌｌｉｃｌｄ＠、Ｒｅｓ。
る４ ０ ｍＭ ）リス−ＯＨ１２０ｍＭ酢酸、２ ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ中にアガロースダル（０，７％）を調製し
、そして１〜１．５ Ｖ ／ｑｎにて水平眠気泳動を行
った。ＤＮＡバンドは、電気泳動的集収によυグルか°
らワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ ）ＤＥ８１Ｆ紙上で回
収した〔ウインベルク（Ｗｌｎｂ＋ｒｇ ）及ヒハマー
ショルド（Ｉ（ａｍｍａｒｓｋｊｏｌｄ ）、Ｎｕｃｌ
ｌｌｉｃｌｄ＠、Ｒｅｓ。
（１９８０年）８：２５２−２６５ ）。ＩＭＮａＣＡ
！による溶出に続き、エタノール沈澱を行った。ＤＮＡ
−ＤＮＡ−ハイブリッド形成用遺伝子ＤＮＡはストル
ール等（前記）の方法に従って分離し、０．５％アガロ
ースゲルで電気泳動し、そしてサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ ）の方法により硝酸七ルロースに移す。これらは、
１．２５ ｋｂ Ｓａｕ ３Ａ ＤＮＡフラグメントか
ら調製されたニックトランスレーション ｐ標識グロー
ブとハイブリッド形成する。
！による溶出に続き、エタノール沈澱を行った。ＤＮＡ
−ＤＮＡ−ハイブリッド形成用遺伝子ＤＮＡはストル
ール等（前記）の方法に従って分離し、０．５％アガロ
ースゲルで電気泳動し、そしてサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ ）の方法により硝酸七ルロースに移す。これらは、
１．２５ ｋｂ Ｓａｕ ３Ａ ＤＮＡフラグメントか
ら調製されたニックトランスレーション ｐ標識グロー
ブとハイブリッド形成する。
記号
ＹＪＷ６．９，１０．１１は、それぞれシラスミツドｐ
ＪＷ６，９．１０、又は１１を含有する酵母菌株を表わ
す。クローン化ＤＮ入配列は、プラスミドに含まれる挿
入部分に従ってＪＷ６ 、９．１０及び１１と付号を付
ける。
ＪＷ６，９．１０、又は１１を含有する酵母菌株を表わ
す。クローン化ＤＮ入配列は、プラスミドに含まれる挿
入部分に従ってＪＷ６ 、９．１０及び１１と付号を付
ける。
銅感受性（ｃｕｐｌｓ）−倍体酵母（受容体）ＢＺ３１
−７Ｂａ株を、ＹＲｐ７ベクターに含まれるＳａｕ ３
Ａ部分酵母ＤＮＡ標品によυＴＲＰＩ”に形質転換した
。この標品は材料及び方法の欄に記載したものである。
−７Ｂａ株を、ＹＲｐ７ベクターに含まれるＳａｕ ３
Ａ部分酵母ＤＮＡ標品によυＴＲＰＩ”に形質転換した
。この標品は材料及び方法の欄に記載したものである。
約５００のＴＲＰＩ＋形質転換体コロニーの内、１２株
が、受容体酵母ＢＺ−３１−１−７８ａの増殖を完全に
阻害する濃度である０、３ｍＭの銅を含有する平板培地
で増殖した。酵母中で自己複製する挿入部担持プラスミ
ドが４分離株において検出された。ずなわちＹＪＷ６、
ＹＪＷ９、ＹＪＷＩＯ及びＹＪＷＩＩであり、これらは
次にＥ、コリを形質転換するのに用いた。得られたアン
ピシリン耐性テトラサイクリン感受性細菌を、プラスミ
ドの大量調製のために増殖せしめた。グラスミドＤＮＡ
を制限エンドヌクレアーゼ分解により解析した。
が、受容体酵母ＢＺ−３１−１−７８ａの増殖を完全に
阻害する濃度である０、３ｍＭの銅を含有する平板培地
で増殖した。酵母中で自己複製する挿入部担持プラスミ
ドが４分離株において検出された。ずなわちＹＪＷ６、
ＹＪＷ９、ＹＪＷＩＯ及びＹＪＷＩＩであり、これらは
次にＥ、コリを形質転換するのに用いた。得られたアン
ピシリン耐性テトラサイクリン感受性細菌を、プラスミ
ドの大量調製のために増殖せしめた。グラスミドＤＮＡ
を制限エンドヌクレアーゼ分解により解析した。
１つの挿入フラグメン） （ｐＪＷ６ ）を３種類の酵
素、すなわちＩ（ｉｎｄ ＩＩＩ 、Ｘｔす１、及び駐
ワ１により切断した。最も左のＫｐｎ１部位から５０塩
基対（ｂｐ）離れて位置する特異的な１川回ｌｉｔ制限
部位がクローン化ＤＮＡフラグメント中に挿入された反
復セグメントの一端を決定する。Ｘｂａｌ及びＫｐｎｌ
で調製したＰＪＷ６分解物は、アガロースゲル上に２つ
のバンドを生じさせ、この合計長さは挿入部及びＹＲｐ
７ベクターより短かい。さらに、ＰＪＷ９ 、１０及び
１１により生成する２つのバンドは等モル的な強度を有
しない。Ｐ ＪＷ６の線状長さは１２．１ｋｂ、すなわ
ち５．８ｋｂ（ベクター）十′６．３ｋｂ（挿入部）で
あるが、η）ＩＬＩ及びり１の両方の分解物において、
観察されたバンドは合計８．５１ ｋｂ （６，２ｋｂ
＋１．９５ｋｂ）にすぎない。
素、すなわちＩ（ｉｎｄ ＩＩＩ 、Ｘｔす１、及び駐
ワ１により切断した。最も左のＫｐｎ１部位から５０塩
基対（ｂｐ）離れて位置する特異的な１川回ｌｉｔ制限
部位がクローン化ＤＮＡフラグメント中に挿入された反
復セグメントの一端を決定する。Ｘｂａｌ及びＫｐｎｌ
で調製したＰＪＷ６分解物は、アガロースゲル上に２つ
のバンドを生じさせ、この合計長さは挿入部及びＹＲｐ
７ベクターより短かい。さらに、ＰＪＷ９ 、１０及び
１１により生成する２つのバンドは等モル的な強度を有
しない。Ｐ ＪＷ６の線状長さは１２．１ｋｂ、すなわ
ち５．８ｋｂ（ベクター）十′６．３ｋｂ（挿入部）で
あるが、η）ＩＬＩ及びり１の両方の分解物において、
観察されたバンドは合計８．５１ ｋｂ （６，２ｋｂ
＋１．９５ｋｂ）にすぎない。
その上、制限エンドヌクレアーゼ５ＪｕＬ ａ Ａによ
る分解によｐ、０．７ｋｂ及び１．２５ ｋｂの制限フ
ラグメントが生じ、これはベクターＤＮＡフラグメント
に比べてモル的に過剰である。同様に、Ｄｄｅ Ｉ及び
Ｄｐｎ ■制限酵素分解物の電気泳動によっても、強い
けい享強斐を有する独特の非ベクターバンドが生ずる。
る分解によｐ、０．７ｋｂ及び１．２５ ｋｂの制限フ
ラグメントが生じ、これはベクターＤＮＡフラグメント
に比べてモル的に過剰である。同様に、Ｄｄｅ Ｉ及び
Ｄｐｎ ■制限酵素分解物の電気泳動によっても、強い
けい享強斐を有する独特の非ベクターバンドが生ずる。
これらの多くの観察結果及び形質転換体中の銅剛性コロ
ニーの頻度が高い（すなわち約２係）ことから、銅剛性
レベルを制御する染色体領域は縦列的に挿入された１、
９６ ｋｂのＤＮＡセグメントにより構成されている
と信じられる。各反復単位は、メチル化アデニン残基を
含む２つのＳａｕ ３Ａ−Ｄｐｎ１部位と共に１つずつ
の句すュＩ及びＸｂａ ■部位を含有する。
ニーの頻度が高い（すなわち約２係）ことから、銅剛性
レベルを制御する染色体領域は縦列的に挿入された１、
９６ ｋｂのＤＮＡセグメントにより構成されている
と信じられる。各反復単位は、メチル化アデニン残基を
含む２つのＳａｕ ３Ａ−Ｄｐｎ１部位と共に１つずつ
の句すュＩ及びＸｂａ ■部位を含有する。
他の３種のプラスミド（ＰＪＷ９、ＰＪＷｌｏ、及びＰ
ＪＷＩＩ）も剣劇性を供するＤＮＡ挿入部を含む。これ
らの電気泳動パターンもＰＪＷ６のそれと類似している
。しかしながら、プラスミドＰＪＷ９及びＰＪＷＩＩは
、末端）Ｔ＋ｎｄＩ［［部位を越えて伸びるより長い非
反復性ＤＮＡセグメントを含む。反復配列中に、次の制
限酵素すなわちＡｖａ Ｉ 、 Ｂａｍ Ｈ）、部位は
存在しない。制限酵素地図に基礎を置くこれらのデータ
を総合すると、Ｓ、セレビシェにおいて銅剛性をもたら
すことができるクローン化ＤＮＡフラグメントは３つの
、そして第４の１．９５ｋｂの反復単位の公邸を含むこ
とが示される。
ＪＷＩＩ）も剣劇性を供するＤＮＡ挿入部を含む。これ
らの電気泳動パターンもＰＪＷ６のそれと類似している
。しかしながら、プラスミドＰＪＷ９及びＰＪＷＩＩは
、末端）Ｔ＋ｎｄＩ［［部位を越えて伸びるより長い非
反復性ＤＮＡセグメントを含む。反復配列中に、次の制
限酵素すなわちＡｖａ Ｉ 、 Ｂａｍ Ｈ）、部位は
存在しない。制限酵素地図に基礎を置くこれらのデータ
を総合すると、Ｓ、セレビシェにおいて銅剛性をもたら
すことができるクローン化ＤＮＡフラグメントは３つの
、そして第４の１．９５ｋｂの反復単位の公邸を含むこ
とが示される。
高い銅濃度に対して耐性を供する最小のＤＮＡフラグメ
ントを得るために、いくつかのＤＮＡフラグメントをサ
ブクローン化した。１つの塩基反復単位よυ小さい１．
２５ｋｂのＳａｕ ３Ａ制限フラグメント、及び１．９
５ ｋｂのＸＢａ ｌフラグメント（１反復単位）をＰ
ＪＷＩＯ分解物から集めた。ＰＪＷＩＩを４四Ｒ１及び
ＢａｍＩＩＩで切断する場合、１反復単位より大きい酵
母ＤＮＡの３．１ｋｂフラグメント及びｓ ｏ ｏ ｂ
ｐの非反復ＤＮＡ配列が生ずる。これら３つのＤＮＡフ
ラグメントをベクターＹＲｐ１７（ＵＲＡ ３、ＴＲＰ
Ｉ”、及びＡＲ８１” ）中にサブクローンし、そして
銅感受性（ｃｕｐｌｓ）酵母菌株（８２３１−１−７ｂ
ａ）を述しピ及び四人１に形質転換するのに用いた。
ントを得るために、いくつかのＤＮＡフラグメントをサ
ブクローン化した。１つの塩基反復単位よυ小さい１．
２５ｋｂのＳａｕ ３Ａ制限フラグメント、及び１．９
５ ｋｂのＸＢａ ｌフラグメント（１反復単位）をＰ
ＪＷＩＯ分解物から集めた。ＰＪＷＩＩを４四Ｒ１及び
ＢａｍＩＩＩで切断する場合、１反復単位より大きい酵
母ＤＮＡの３．１ｋｂフラグメント及びｓ ｏ ｏ ｂ
ｐの非反復ＤＮＡ配列が生ずる。これら３つのＤＮＡフ
ラグメントをベクターＹＲｐ１７（ＵＲＡ ３、ＴＲＰ
Ｉ”、及びＡＲ８１” ）中にサブクローンし、そして
銅感受性（ｃｕｐｌｓ）酵母菌株（８２３１−１−７ｂ
ａ）を述しピ及び四人１に形質転換するのに用いた。
それぞれの場合に、受容体細胞は工復す“及びＵＲＡ
３に形質転換され、０．３ｍＭの銅に対して耐性を示し
た。形質転換された酵母細胞を非選択的条件下で増殖せ
しめた場合、プラスミドの自己複製に伴う不安定な表現
型を示した。すなわち、ｃｕｐ１８＋ ｔｒｐｌ−、Ｕ
ｒａ３− ＊細胞が高頻度で生じた。銅イオンに対する
活性は１．２５ｋｂの５ａｕ３ＡＤＮＡフラグメントの
存在により達成された〇銅耐性表現型はこのフラグメン
トとのみ関連しているようである。
３に形質転換され、０．３ｍＭの銅に対して耐性を示し
た。形質転換された酵母細胞を非選択的条件下で増殖せ
しめた場合、プラスミドの自己複製に伴う不安定な表現
型を示した。すなわち、ｃｕｐ１８＋ ｔｒｐｌ−、Ｕ
ｒａ３− ＊細胞が高頻度で生じた。銅イオンに対する
活性は１．２５ｋｂの５ａｕ３ＡＤＮＡフラグメントの
存在により達成された〇銅耐性表現型はこのフラグメン
トとのみ関連しているようである。
クローニングした銅剛性ＤＮＡ領域を酵母染色体ＤＮＡ
に一体化したものがいくつか分離された。第１に、３．
１ ｋｂ （ＪＷＩＩ、Ｅｃ ｏ Ｒ１−Ｆ３！！ｍＨ
，ｌ ）Ｄ平フラグメントはＹＲｐ１７に再クローニン
グされ、ベクター分子に存在するＵＲＡ ３配列を介し
て染色体２ｖ動原体に接するＵｒａ ３−５２部位の近
くに一体化される。第２に、ＰＪＷＩＯはｔｘｐｌ−２
８９に一体化され、そして第３に、ＰＪＷ９は染色体■
のｃｕｐ １部位に組替えられる。この予想一体化株は
、ｔｈｒｌの存在によυ染色体■上に遺伝的に標識され
ている株と近似していた。こうして得られた二倍体株は
胞子を形成し、そして、任意の６・１の子のう胞子を四
分子分析にかけた。
に一体化したものがいくつか分離された。第１に、３．
１ ｋｂ （ＪＷＩＩ、Ｅｃ ｏ Ｒ１−Ｆ３！！ｍＨ
，ｌ ）Ｄ平フラグメントはＹＲｐ１７に再クローニン
グされ、ベクター分子に存在するＵＲＡ ３配列を介し
て染色体２ｖ動原体に接するＵｒａ ３−５２部位の近
くに一体化される。第２に、ＰＪＷＩＯはｔｘｐｌ−２
８９に一体化され、そして第３に、ＰＪＷ９は染色体■
のｃｕｐ １部位に組替えられる。この予想一体化株は
、ｔｈｒｌの存在によυ染色体■上に遺伝的に標識され
ている株と近似していた。こうして得られた二倍体株は
胞子を形成し、そして、任意の６・１の子のう胞子を四
分子分析にかけた。
すべてのテトラドにおいて標識ｃｕｐｌ’及びｔｒｐ
１は２＋：°２−に相互分離した。これらの標識の完全
な連結が観察され、これらの間の組替体は検出されなか
った。この挙動は、ＣＵＰｌｒ座を担持したＤＮＡフラ
グメントがＴＲＰＩ”を含むＹＲ，７プラスミドに挿入
され（！ｕｐ１部位の近くに一体化された場合に予想さ
れる。牌１と 響１及び郡頃１と咀畢１のいずれの場合にも両親二型（
ＰＤ）、非両親二型ＮＰＤ及び四糖（Ｔ）はそれぞれ３
０：０：３１であった。
１は２＋：°２−に相互分離した。これらの標識の完全
な連結が観察され、これらの間の組替体は検出されなか
った。この挙動は、ＣＵＰｌｒ座を担持したＤＮＡフラ
グメントがＴＲＰＩ”を含むＹＲ，７プラスミドに挿入
され（！ｕｐ１部位の近くに一体化された場合に予想さ
れる。牌１と 響１及び郡頃１と咀畢１のいずれの場合にも両親二型（
ＰＤ）、非両親二型ＮＰＤ及び四糖（Ｔ）はそれぞれ３
０：０：３１であった。
ｐＪＷｌｏを独立に一体化した５株を父差せしめ、そし
て任意の８４の胞子を分析した。これらの前記と同じ標
識のＰＤ：ＮＰＤ：Ｔ比は３７：Ｏ：４７であった。１
４５個のテトラド分析のすべてを通じて非両親二型が存
在しない（６７：Ｏニア８）ことによシ、遺阪子−遺伝
子連結の存在か′明確に示され、そしてＣＵＰ １又は
ＴＲＰ １とＴＩＩＲ１の間の算出された地図上の距離
は２７ｃＭであシ、これは試料誤差の範囲内で公表され
ている値２８ ｃＭ（：モルチモア（ＭｏｒＮｍｏｒ
）及びシールド（５ｃｈｉｌｄ）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、Ｒｊｖ、（１９８０年）４４：５１９−５７１〕とよ
く一致する。これらのデータから、クローニングされた
ＤＮＡフラグメントがツ１感受性受容体細胞に安定な銅
耐性表現型を供し、そして、これらが染色体■中のｔｈ
ｒ １標識の遠位にＣＵＰ ｌ ｒ座の機能的セグメン
トを含有することが明らかである。
て任意の８４の胞子を分析した。これらの前記と同じ標
識のＰＤ：ＮＰＤ：Ｔ比は３７：Ｏ：４７であった。１
４５個のテトラド分析のすべてを通じて非両親二型が存
在しない（６７：Ｏニア８）ことによシ、遺阪子−遺伝
子連結の存在か′明確に示され、そしてＣＵＰ １又は
ＴＲＰ １とＴＩＩＲ１の間の算出された地図上の距離
は２７ｃＭであシ、これは試料誤差の範囲内で公表され
ている値２８ ｃＭ（：モルチモア（ＭｏｒＮｍｏｒ
）及びシールド（５ｃｈｉｌｄ）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、Ｒｊｖ、（１９８０年）４４：５１９−５７１〕とよ
く一致する。これらのデータから、クローニングされた
ＤＮＡフラグメントがツ１感受性受容体細胞に安定な銅
耐性表現型を供し、そして、これらが染色体■中のｔｈ
ｒ １標識の遠位にＣＵＰ ｌ ｒ座の機能的セグメン
トを含有することが明らかである。
複製数を測定するために、１．２５ ｋｂ Ｓａｕ ３
ＡＤＮＡフラグメントから調製したニックトランスレー
ション ｐ標識グローブを用いてサザンのＤＮＡ−ＤＮ
Ａハイブリッド形成法による分析を行った。銅耐性酵母
細胞及び銅感受性酵母細胞から調製した遺伝子ＤＮＡを
、反復単位内に切断部位を有しない制限酵素であるＥｃ
ｏＲｌにより分解した。Ｘ２１８０すなわちＣＵＰｌｒ
株に約３０ ｋｂすなわち約１５の縦列的に反復した反
復単位が存在するのに対して、ｃｕｐｌ’株は５ ｋｂ
、すなわち最高２反復単位のハイブリッド形成セグメ
ントを有していた。
ＡＤＮＡフラグメントから調製したニックトランスレー
ション ｐ標識グローブを用いてサザンのＤＮＡ−ＤＮ
Ａハイブリッド形成法による分析を行った。銅耐性酵母
細胞及び銅感受性酵母細胞から調製した遺伝子ＤＮＡを
、反復単位内に切断部位を有しない制限酵素であるＥｃ
ｏＲｌにより分解した。Ｘ２１８０すなわちＣＵＰｌｒ
株に約３０ ｋｂすなわち約１５の縦列的に反復した反
復単位が存在するのに対して、ｃｕｐｌ’株は５ ｋｂ
、すなわち最高２反復単位のハイブリッド形成セグメ
ントを有していた。
との発明に従えば、銅−キレチンと称する重金属キレー
ト化合物の製造に使用し得るＤＮＡ配列が得られる。こ
のものは酵母及び他の生物において発現する。さらに、
宿主をストレスすることにより、宿主中で、染色体外要
素であっても染色体に一体化されていても、下流フラン
ク領域を縦列的に反復せしめることができ、それによっ
て、銅キレチンをコードする遺伝子のみならず、それに
付随する領域の多数複製が可能となる。所望のポリペプ
チドをコードする領域に付随するフランク領域を有し、
そしてそれ自体の制御信号を有するために、所望のポリ
ペプチドも発現される。こうして、重金属濃度を変える
ことにより、メタロチオネイン遺伝子に関連する遺伝子
の発現を増強し、又は低下せしめることができる。
ト化合物の製造に使用し得るＤＮＡ配列が得られる。こ
のものは酵母及び他の生物において発現する。さらに、
宿主をストレスすることにより、宿主中で、染色体外要
素であっても染色体に一体化されていても、下流フラン
ク領域を縦列的に反復せしめることができ、それによっ
て、銅キレチンをコードする遺伝子のみならず、それに
付随する領域の多数複製が可能となる。所望のポリペプ
チドをコードする領域に付随するフランク領域を有し、
そしてそれ自体の制御信号を有するために、所望のポリ
ペプチドも発現される。こうして、重金属濃度を変える
ことにより、メタロチオネイン遺伝子に関連する遺伝子
の発現を増強し、又は低下せしめることができる。
実験例によシ詳細な説明をしたが、これは単なる例示で
あり、これによってこの発明の範囲を限定するものでは
ない。
あり、これによってこの発明の範囲を限定するものでは
ない。
特許出願人
ザ リーゾエンツ オブザ
ユニバーシティ オプ カリフォルニア特許出願代理人
弁理士 青 木 朗
弁理士 西 舘 和 之
弁理士 福 本 積
弁理上 山 口 昭 之
アメリカ合衆国カリフォルニア
・サンフランシスコ・イレブン
ス・アベニュ１２１５
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、酵母蛋白質を実質上含有せず、銅をキレートするこ
とができる酵母鋼キレチン、そのフラグメント、及び配
列中のアミノ酸の約９０％以上が該銅キレチンのそれと
同一である該銅キレチンの類似体。 ２、酵母細胞成分を含有しない酵母鋼キレチン。 ３、銅キレチン又はその銅キレート化フラグメントをコ
ードし、約５ ｋｂｐ未滴の天然に存在するフランク領
域を有するＤＮＡ配列。 ４、銅キレチンをコードする配列より上流に天然の酵母
発現制御信号を含有する特許請求の範囲第３項記載のＤ
ＮＡ配列。 ５、酵母宿主によって認識される発現のだめの制御信号
、及び前記銅キレチンをコー、ドする遺伝子の下流に位
置し酵母にとって外来性のポリペプチドをコードする遺
伝子を含有する特許請求の範囲第４項記載のＤＮＡ配列
。 ６、前記銅キレチンをコードする遺伝子、前記外来性遺
伝子及びこれらの制御信号が約２ｋｂｐ未滴の合計ヌク
レオチド数を有する特許請求の範囲第５項記載のＤＮＡ
配列。 ７、銅キレチン又はその銅キレチンフラグメントをコー
ドし、約５ ｋｂｐ未溝の天然に存在するフランク領域
を有するＤＮＡ配列が縦列的に反復して成る多機製ＤＮ
Ａ配列。 ８、銅キレチンをコードする遺伝子により分離された酵
母宿主によシ認識される一対の発現制御信号、及び下流
の制御信号の下流にあって制御されている外来性遺伝子
を含み、そして酵母染色体の一部分と実質上同じ約１０
０ ｂｐ以上のフランク配列を含有するＤＮＡ配列。 ９、前記フランク領域が、代謝過程に関与する酵素をコ
ードする染色体郡分と同じである特許請求の範囲第８．
！Ｊ１記載のＤＮＡ配列。 １０、酵母レプリコン、酵母にニジ認識される発現のた
めの制御信号、及び該制御信号により°制御されており
銅キレチンをコードする遺伝子を含んで成る染色体外構
成物。 １１、 （ａ）前記銅キレチン遺伝子の下流に位置し、
酵母にニジ認識される第二の発現制御信号、及び（ｂ）
前記第二の制御信号により御信されており、銅キレチン
をコードする前記遺伝子の末端コードから約１ｋｂ未滴
にある、酵母にとって外来性のポリペプチドをコードす
る遺伝子を含有する特許請求の範囲第１０項記載の染色
体外構成物。 １２、前記制御信号及び前記２つの遺伝子が約２ ｋｂ
ｐ以下のＤＮＡセグメントを含む特許請求の範囲第１１
項記載の染色体外構成物。 １３、前記制御信号及び前記２つの遺伝子が縦列的に反
復している特許請求の範囲第１１項又は第１２項記載の
染色体外構成物。 １４、前記の反復が１５回以上である特許請求の範囲第
１３項記載の染色体外構成物。 １５、酵母レプリコン、酵母にエリ認識される発現のた
めの制御信号、及び該制御信号により制御されており銅
キレチンをコードする遺伝子を含んで成る染色体外構成
物を有する酵母細胞。 １６、 （ａ）第一の発現制御信号、（ｂ）ｍｏｌキレ
チンをコードする遺伝子、（ｃ）第二の発現制御信号、
及び（ｄ）酵母細胞にとって外来性の遺伝子から成シ、
該遺伝子がそれぞれ隣接する制御信号により制御されて
おシ、そして該制御信号が酵母に認識される反復ＤＮＡ
配列を有する酵母細胞。 １７゜前記反復配列の少なくとも一部分が染色体外ＤＮ
Ａ要素の上に存在する特許請求の範囲第１６項記載の酵
母細胞。 １８、前記反復配列の少なくとも一部分が染色体上に存
在する特許請求の範囲第１６項記載の酵母細胞。 １９．１５以上の反復を有する特許請求の範囲第１６項
、第１７項、又は第１８項記載の酵母細胞。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US384821 | 1982-06-03 | ||
| US06/384,821 US4511652A (en) | 1982-06-03 | 1982-06-03 | High efficiency eukaryotic metallothionein promoter system |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5939292A true JPS5939292A (ja) | 1984-03-03 |
Family
ID=23518897
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58098143A Pending JPS5939292A (ja) | 1982-06-03 | 1983-06-03 | 酵母銅キレチン及び該銅キレチンをコ−ドする遺伝子系 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4511652A (ja) |
| EP (1) | EP0096491A3 (ja) |
| JP (1) | JPS5939292A (ja) |
| CA (1) | CA1207686A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02101720U (ja) * | 1989-01-31 | 1990-08-14 | ||
| JPH0745673A (ja) * | 1993-07-27 | 1995-02-14 | Nec Corp | 半導体ペレットのマウント性能検査方法 |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0078154A3 (en) * | 1981-10-28 | 1985-01-09 | The Regents Of The University Of California | Plasmids and cells for heterologous expression of metallothioneins and processes for producing and using the metallothionein |
| WO1983001783A1 (en) * | 1981-11-23 | 1983-05-26 | University Patents Inc | Control of dna sequence transcription |
| GB8334261D0 (en) * | 1983-12-22 | 1984-02-01 | Bass Plc | Fermentation processes |
| US4740461A (en) * | 1983-12-27 | 1988-04-26 | Genetics Institute, Inc. | Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells |
| US4696898A (en) * | 1984-01-16 | 1987-09-29 | Integrated Genetics, Inc. | Vector encoding hepatitis B surface antigen |
| US4626505A (en) * | 1984-02-24 | 1986-12-02 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Selectable markers for yeast transformation |
| US4940661A (en) * | 1984-05-17 | 1990-07-10 | Genentech, Inc. | Metallothionein transcription control sequences and use thereof |
| US4935350A (en) * | 1985-11-18 | 1990-06-19 | Amgen | Materials and methods for controlling plasmid copy number and stability |
| US5443964A (en) * | 1987-08-10 | 1995-08-22 | Duke University | Poxvirus insertion/expression vector |
| US5578468A (en) * | 1987-08-10 | 1996-11-26 | Duke University | Site-specific RNA cleavage |
| WO1990002762A1 (en) | 1988-09-02 | 1990-03-22 | The Rockefeller University | Macrophage-derived inflammatory mediator (mip-2) |
| US5614409A (en) * | 1989-05-30 | 1997-03-25 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Production of IBDV VP2 in highly immunogenic form |
| WO1994020079A1 (en) | 1993-03-10 | 1994-09-15 | Smithkline Beecham Corporation | Human brain phosphodiesterase |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2441659A1 (fr) * | 1978-11-14 | 1980-06-13 | Anvar | Nouveaux plasmides hybrides et microorganismes les contenant |
| EP0078154A3 (en) * | 1981-10-28 | 1985-01-09 | The Regents Of The University Of California | Plasmids and cells for heterologous expression of metallothioneins and processes for producing and using the metallothionein |
-
1982
- 1982-06-03 US US06/384,821 patent/US4511652A/en not_active Expired - Lifetime
-
1983
- 1983-05-18 CA CA000428457A patent/CA1207686A/en not_active Expired
- 1983-05-19 EP EP83302879A patent/EP0096491A3/en not_active Withdrawn
- 1983-06-03 JP JP58098143A patent/JPS5939292A/ja active Pending
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| ARCH.BIOCHEM.BIOPHYS=1975 * |
| BIOCHIM BIOPHYS ACTA=1977 * |
| BIOCHIM BIOPHYS ACTA=1979 * |
| FEBS LETTERS=1982 * |
| HOPPE-SEYLER'S Z.PHYSIOL.CHEM=1975 * |
| PLANT CELL PHYSIOL=1976 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02101720U (ja) * | 1989-01-31 | 1990-08-14 | ||
| JPH0745673A (ja) * | 1993-07-27 | 1995-02-14 | Nec Corp | 半導体ペレットのマウント性能検査方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4511652A (en) | 1985-04-16 |
| EP0096491A2 (en) | 1983-12-21 |
| CA1207686A (en) | 1986-07-15 |
| EP0096491A3 (en) | 1986-02-19 |
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