JPS59220200A - 微生物の検出方法 - Google Patents
微生物の検出方法Info
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- JPS59220200A JPS59220200A JP4477784A JP4477784A JPS59220200A JP S59220200 A JPS59220200 A JP S59220200A JP 4477784 A JP4477784 A JP 4477784A JP 4477784 A JP4477784 A JP 4477784A JP S59220200 A JPS59220200 A JP S59220200A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は微生物、特にナイセリアゴノレ（Ｎｅｉｓｓｅ
ｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（Ｎ−ｇ−）及び（又
は）ナイセリアメニンギチジス（Ｎｅｌｓｓｅｒｉａｍ
ｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（Ｎ．ｍ．）（Ｄ検出法に関
するｏＮ．ｇ．感染の有無の検出のための公知の一方法
は被検試料をレクチン（ｌｅｃｔｌｎ）（抗体様活性物
質）又ハ小麦胚芽のアグルチニン（ｗｈｅａｔｇｅｒｍ
ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＷＧＡ）と接触させて微生物
を凝集させる方法である。ドイル（Ｄｏｙｌｅ）等の米
国特許第≠λタざ６♂タ号明細書開示の方法においてＷ
ＧＡと試料との凝集反応の存在はＮ．ｇ．菌の存在の推
定的表示であると記載されている。この試験法に関する
ひとつの問題がカーチス等の報文（ＣｕＦｔｌｓ，ａ．
ｏ．ｗ．，ｅｔａｌ．＃Ｓｒ．Ｊ．Ｖｅｎｅｒ．Ｄｉｓ
．ｓ／７ざ／：３７：．２３３−Ｊ−）中に報告されて
いる。該報文はＮ．ｇ−以外の微生物例えばナイセリア
メニンギチジス（Ｎ．ｍ．）もレクチン凝集菌株である
ので上記の試験方法はＮ．ｇ．の同定用として信頼し得
ないと述べている。この試験法Ｋ関する他の問題は試料
の自動的凝集が起ることがあることである。この事実は
Ｎ．ｇ．同定可能の割合の増大のために新たに単離した
ものの使用を必要とすることを示す；さもないとＮ．ｇ
．感染の診断を成程度誤る怖れがあり得る。
ｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（Ｎ−ｇ−）及び（又
は）ナイセリアメニンギチジス（Ｎｅｌｓｓｅｒｉａｍ
ｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（Ｎ．ｍ．）（Ｄ検出法に関
するｏＮ．ｇ．感染の有無の検出のための公知の一方法
は被検試料をレクチン（ｌｅｃｔｌｎ）（抗体様活性物
質）又ハ小麦胚芽のアグルチニン（ｗｈｅａｔｇｅｒｍ
ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＷＧＡ）と接触させて微生物
を凝集させる方法である。ドイル（Ｄｏｙｌｅ）等の米
国特許第≠λタざ６♂タ号明細書開示の方法においてＷ
ＧＡと試料との凝集反応の存在はＮ．ｇ．菌の存在の推
定的表示であると記載されている。この試験法に関する
ひとつの問題がカーチス等の報文（ＣｕＦｔｌｓ，ａ．
ｏ．ｗ．，ｅｔａｌ．＃Ｓｒ．Ｊ．Ｖｅｎｅｒ．Ｄｉｓ
．ｓ／７ざ／：３７：．２３３−Ｊ−）中に報告されて
いる。該報文はＮ．ｇ−以外の微生物例えばナイセリア
メニンギチジス（Ｎ．ｍ．）もレクチン凝集菌株である
ので上記の試験方法はＮ．ｇ．の同定用として信頼し得
ないと述べている。この試験法Ｋ関する他の問題は試料
の自動的凝集が起ることがあることである。この事実は
Ｎ．ｇ．同定可能の割合の増大のために新たに単離した
ものの使用を必要とすることを示す；さもないとＮ．ｇ
．感染の診断を成程度誤る怖れがあり得る。
Ｎ．ｇ．及びＮ．ｍ．のアミノペグチグーゼに関する性
質は既に研究されていてクロモダン（色原体：含有基質
の使用によりＮ．ｇ．とＮ．ｍ．とを区別し得ること及
びその測定が再現可能であることが報告されている［Ｐ
ｅｒｒｉｎｅ，Ｓ．＃ａｎｄＷａｔｓｏｎ，Ｒ．Ｒ．＃
ＡｂｓｔｒａｃｔｓｏｆｔｈｅＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉ
ｎｇｏｆｔｈｅ＾ＪｎｅｒｌＣａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏ
ｒＭＩＣｒＯｂｌＯＩＯｇｙｓｐ・３タＣＩ’？７３；
）’３。即ちガンマーグルタミルアミノペプテダーゼ（
ＧＧＡ）はＮ．ｇ−と反応しないから、該ＧＧＡを含む
基質の反応生成物の存在はＮ．ｍ．ｋ含むけれどもＮ．
ｇ．を含まない試料の陽性表示であることが該報文に開
示されている。もしこの試験結果が陽性であればそれは
試料がＮ．ｍ．を含みＮ．ｇ−を含まないことを示す。
質は既に研究されていてクロモダン（色原体：含有基質
の使用によりＮ．ｇ．とＮ．ｍ．とを区別し得ること及
びその測定が再現可能であることが報告されている［Ｐ
ｅｒｒｉｎｅ，Ｓ．＃ａｎｄＷａｔｓｏｎ，Ｒ．Ｒ．＃
ＡｂｓｔｒａｃｔｓｏｆｔｈｅＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉ
ｎｇｏｆｔｈｅ＾ＪｎｅｒｌＣａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏ
ｒＭＩＣｒＯｂｌＯＩＯｇｙｓｐ・３タＣＩ’？７３；
）’３。即ちガンマーグルタミルアミノペプテダーゼ（
ＧＧＡ）はＮ．ｇ−と反応しないから、該ＧＧＡを含む
基質の反応生成物の存在はＮ．ｍ．ｋ含むけれどもＮ．
ｇ．を含まない試料の陽性表示であることが該報文に開
示されている。もしこの試験結果が陽性であればそれは
試料がＮ．ｍ．を含みＮ．ｇ−を含まないことを示す。
けれどもその試験結果が陰性であればＮ．ｇ．が試料中
に存在するか否かは確定されない。この試験法に関する
池の問題はガンマーグルタミルアミノペグチダーゼ活性
の検出のための公知の基質はその反応に当り長時間例え
ば３７℃で２時間の恒温保持を要するので比較的のろい
試験であることである。
に存在するか否かは確定されない。この試験法に関する
池の問題はガンマーグルタミルアミノペグチダーゼ活性
の検出のための公知の基質はその反応に当り長時間例え
ば３７℃で２時間の恒温保持を要するので比較的のろい
試験であることである。
ホリス等の報文（Ｈｏｌｌｌｓ，Ｄ．Ｇ．．ｅｔａｌ−
ｔＡｐｐｌ．Ｍｌｃｒｏｂｉｏｌ．．／７：７／−７７
（／タ６タ）〕はラクトース資化性のナイセリア菌（Ｎ
．ｌ．）を記ｔし：コルベット等の報文（ｃｏｒｂｅｔ
ｔｌＰ．，ａｎｄＵｌｉｖｅｌｌｉ，Ａ．，Ｊ．ｓａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．ｌ９ｊ：ｊコーｊ７（ｌ５ｉ’ＡＪ））
はラクトースー陽性ナイセリアのがラクトシダーゼ活性
を記載している０ペーターガラクトシダーゼ活性の検出
に用いられる基質のひとつは０−ニトロ７エニル一〇−
ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）である（ＬｅＭｉｎｏ
ｒ，Ｌ．，ａｎｄＳｅｎＨａｒｎｉｄａ＋Ｆ−ｓＡｎｎ
．ｌｎｓｔ．ＰａＳｔｅｕｒ＊／０−２：２１，７Ｃ／
タ６λ）〕。
ｔＡｐｐｌ．Ｍｌｃｒｏｂｉｏｌ．．／７：７／−７７
（／タ６タ）〕はラクトース資化性のナイセリア菌（Ｎ
．ｌ．）を記ｔし：コルベット等の報文（ｃｏｒｂｅｔ
ｔｌＰ．，ａｎｄＵｌｉｖｅｌｌｉ，Ａ．，Ｊ．ｓａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．ｌ９ｊ：ｊコーｊ７（ｌ５ｉ’ＡＪ））
はラクトースー陽性ナイセリアのがラクトシダーゼ活性
を記載している０ペーターガラクトシダーゼ活性の検出
に用いられる基質のひとつは０−ニトロ７エニル一〇−
ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）である（ＬｅＭｉｎｏ
ｒ，Ｌ．，ａｎｄＳｅｎＨａｒｎｉｄａ＋Ｆ−ｓＡｎｎ
．ｌｎｓｔ．ＰａＳｔｅｕｒ＊／０−２：２１，７Ｃ／
タ６λ）〕。
組織化学的細胞染色のためにロイクンー≠−メトキシー
ペーターナフチルアミドを用いるロイクンアミノペグチ
ダーゼの検出も又公知である（Ｎａｃｈｌａｓ，Ｍ．Ｍ
＝，ｅｔａ＋．ｅＪ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｌｏｃｈｅｍ
．Ｃｙｔｏｌ．，７：．２＆／Ｃ／９乙Ｏ）〕。
ペーターナフチルアミドを用いるロイクンアミノペグチ
ダーゼの検出も又公知である（Ｎａｃｈｌａｓ，Ｍ．Ｍ
＝，ｅｔａ＋．ｅＪ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｌｏｃｈｅｍ
．Ｃｙｔｏｌ．，７：．２＆／Ｃ／９乙Ｏ）〕。
本発明の一般的目的はＮ．ｇ．及びＮ．ｍ．の存在が疑
われている微生物の分別検出のための迅速で正確な試験
方法の提供にある。
われている微生物の分別検出のための迅速で正確な試験
方法の提供にある。
本発明の特別な目的は一■一Ｂ、．カタラリス（Ｂ．ｃ
ａｔａ：二７ｓ”）’六暦Ｗｒ：ｂ’ｏ’””６、ｍ法
の提供にある。
ａｔａ：二７ｓ”）’六暦Ｗｒ：ｂ’ｏ’””６、ｍ法
の提供にある。
更に本発明の目的は試料中の微生物の自動的凝集のメカ
ニズムを逆転さゼる方法を提供し、それによって凝集試
験法における偽の陽性表示を減ずることにある。
ニズムを逆転さゼる方法を提供し、それによって凝集試
験法における偽の陽性表示を減ずることにある。
本発明のそれ以外の目的及び態様は本発明の好適な具体
化に関する下文によって明かとなろう。
化に関する下文によって明かとなろう。
本発明め上記の諸目的にそって試料中のＮ．ｇ−菌及び
Ｎ．ｍ．菌の分別検出の一方法が提供される，第／工程
ＫおいてＮ−アセチルグルコサミン又はＮ，Ｎ’−ノア
セチルキトビオースと反応してＭ集生成物を与える型の
レクテ／と被検試料の一部とを反応させる。これとは別
のレクチン試験法を好ｍに侵用丁るかこれはＮ．ｇ．に
対するＷＧＡ試験法並びに病原性ナイセリアに関するレ
クチン確認試験法〔この方法においては大豆アグルチニ
ン（ＳＢＡ），バレイショのソラニ９ムツペロンムアグ
ルチニン（Ｓｏｌａｎｌｕｍ−ｒｕｂｅｒｏｓｏｍａｇ
ｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＳＴＡ）及びパンイショのレクチ
ンのいず負か単独又は組合せを使用する〕を含む。Ｎ．
ｇ．とＮ．ｍ．との分別のために試料を別個の部分（複
数）に分け、これらの部分とＩＮ．ｇ．及び〜．ｍ．中
に存在する互いに異る夫々の酵素に対して省異的な基質
１とを反応させ、反応生成物をジアゾ染料とカグリ／グ
ざせて呈色させる。迅速に反応するＮ．ｒｎ．及びＮ．
ｇ−用の好適基質は夫々ガンマーグルタミルナ７チルア
ミド及びプロリンナフチルアミドであって、双方共に電
．子供与基によりその弘位及び（又は）乙位を置換され
ているものである。
Ｎ．ｍ．菌の分別検出の一方法が提供される，第／工程
ＫおいてＮ−アセチルグルコサミン又はＮ，Ｎ’−ノア
セチルキトビオースと反応してＭ集生成物を与える型の
レクテ／と被検試料の一部とを反応させる。これとは別
のレクチン試験法を好ｍに侵用丁るかこれはＮ．ｇ．に
対するＷＧＡ試験法並びに病原性ナイセリアに関するレ
クチン確認試験法〔この方法においては大豆アグルチニ
ン（ＳＢＡ），バレイショのソラニ９ムツペロンムアグ
ルチニン（Ｓｏｌａｎｌｕｍ−ｒｕｂｅｒｏｓｏｍａｇ
ｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＳＴＡ）及びパンイショのレクチ
ンのいず負か単独又は組合せを使用する〕を含む。Ｎ．
ｇ．とＮ．ｍ．との分別のために試料を別個の部分（複
数）に分け、これらの部分とＩＮ．ｇ．及び〜．ｍ．中
に存在する互いに異る夫々の酵素に対して省異的な基質
１とを反応させ、反応生成物をジアゾ染料とカグリ／グ
ざせて呈色させる。迅速に反応するＮ．ｒｎ．及びＮ．
ｇ−用の好適基質は夫々ガンマーグルタミルナ７チルア
ミド及びプロリンナフチルアミドであって、双方共に電
．子供与基によりその弘位及び（又は）乙位を置換され
ているものである。
上記試験法はＮ．ｔ．菌に対する試験法と組合ゼで使用
され得る。Ｎ．ｔ．菌は試料の一部と１ペーターガラク
トシダーゼ（ＢＧｌ％素と反応する基質１と金接触させ
ることにより検出され、次にこの酵素（基質に対して反
応する酵素）により生成された反応生成物の存在を検し
、かようにして試料がＮ．ｔ．を含有することの陽性表
示とするのである。
され得る。Ｎ．ｔ．菌は試料の一部と１ペーターガラク
トシダーゼ（ＢＧｌ％素と反応する基質１と金接触させ
ることにより検出され、次にこの酵素（基質に対して反
応する酵素）により生成された反応生成物の存在を検し
、かようにして試料がＮ．ｔ．を含有することの陽性表
示とするのである。
好適基質はＯＮＰＧである。更に弘一及び（又は）６一
位に置換基をもつグリシループロリルナフチルアミドを
使用してＢ．カタラリス（Ｂ．ｃ．）に対する試験も遂
行され得る。
位に置換基をもつグリシループロリルナフチルアミドを
使用してＢ．カタラリス（Ｂ．ｃ．）に対する試験も遂
行され得る。
本発明に従い各種ナイセリア菌即ちＮ．ｇ．，Ｎ．ｍ．
＊Ｎ．ｌ．及びＢ．ｃ．に対する迅速で正確な試験方法
が提供される。好ましい態様においては迅速酵素試験法
による確認試験と組合せたレクテン凝集試験法を用いる
。
＊Ｎ．ｌ．及びＢ．ｃ．に対する迅速で正確な試験方法
が提供される。好ましい態様においては迅速酵素試験法
による確認試験と組合せたレクテン凝集試験法を用いる
。
選択ざれた培地、例えばタイアーマアチン（Ｔｈａｙｅ
ｒ−Ｍａｒｔｉｎ）培地、の上で微生物を生育させた後
にダラム染色とオキシダーゼテストとを行って該微生物
がグ２ム陰性双球菌であること、オキシダーゼテスト陽
性であることを決定する。
ｒ−Ｍａｒｔｉｎ）培地、の上で微生物を生育させた後
にダラム染色とオキシダーゼテストとを行って該微生物
がグ２ム陰性双球菌であること、オキシダーゼテスト陽
性であることを決定する。
これはＮ．ｇ−＊Ｎ．ｒｎ−＊Ｎ−１．及び（又は）Ｂ
．ｃ．存在可能の推定表示である。試料の一部を用いて
適宜の型のレクチノを用いる凝集によりＮ．ｇ．又はＮ
．ｍ．菌の存在を試験する。この目的のためにＮ−アセ
チルグルコサミン又はＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビオー
スに対して反応する型のｌ種又は複数種のレクテンを選
ぶ。該菌の凝集反応の存在は試料がＮ．ｇ．か又はＮ．
ｍ．か又はそれら両者を含むことの陽性表示である。
．ｃ．存在可能の推定表示である。試料の一部を用いて
適宜の型のレクチノを用いる凝集によりＮ．ｇ．又はＮ
．ｍ．菌の存在を試験する。この目的のためにＮ−アセ
チルグルコサミン又はＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビオー
スに対して反応する型のｌ種又は複数種のレクテンを選
ぶ。該菌の凝集反応の存在は試料がＮ．ｇ．か又はＮ．
ｍ．か又はそれら両者を含むことの陽性表示である。
上記のナイセリア菌の或る菌株は自動的凝集のａ向ｉ有
する。試料の一部分についてこれがレクチン不在下に自
動的凝集を起すか否かを測定してみるべきである。もし
自動的凝集が起れば、本発明に従い、自動的凝集のメカ
ニズムを逆転させる目的で、レクチ／凝集以前に試料を
前処理するための処理法が提供される，、該処理法のひ
とつにおいては試料と粗又は純のＤＮＡ’アーゼ又はＤ
ＮＡ’アーゼ含有品とを有効濃度（例えば／’ｎ９／ｄ
）において反応させる。池の処理方法においては試料中
の微生物に対し陰性電荷を与える物質を反応させて凝集
体の中の個々の微生物を相互に反撥させる。適当な陰性
電荷付与剤には適宜濃度（例えば０．２ｊｍ９７ｍｌ）
の無水コ・・ク酸が含まれる。
する。試料の一部分についてこれがレクチン不在下に自
動的凝集を起すか否かを測定してみるべきである。もし
自動的凝集が起れば、本発明に従い、自動的凝集のメカ
ニズムを逆転させる目的で、レクチ／凝集以前に試料を
前処理するための処理法が提供される，、該処理法のひ
とつにおいては試料と粗又は純のＤＮＡ’アーゼ又はＤ
ＮＡ’アーゼ含有品とを有効濃度（例えば／’ｎ９／ｄ
）において反応させる。池の処理方法においては試料中
の微生物に対し陰性電荷を与える物質を反応させて凝集
体の中の個々の微生物を相互に反撥させる。適当な陰性
電荷付与剤には適宜濃度（例えば０．２ｊｍ９７ｍｌ）
の無水コ・・ク酸が含まれる。
従前技袷においてＮ．ｇ．存在下の凝集の目的の達成の
ために想定されたレクチ／はＷＧＡである。
ために想定されたレクチ／はＷＧＡである。
けれどもＷＧＡ存在下ですべてのＮ，ｇ．菌が凝集する
わけではないことが見比された。偽の陰性の凝集結果の
問題を解決するためには異る諸試験において異るレクチ
ン（複数）を用いることが好ましい。適切な補助的なレ
クテン試験法においては試料の一部と病源性ナイセリア
（ｘ−ｍａｗＮ−ｇ・・Ｎ．ｔ．及びＢ．ｃ．）を凝集
させるレクチンとを混合する。この試験法は非％異的で
あるけれどもＷＧＡ試験法は偽の陰性結果を与えること
を技術者に警告する働きをする。この補助試験のために
適切なレクチンはＳＢＡ又はＳＴＡの夫々単独又はそれ
らの組合せである。
わけではないことが見比された。偽の陰性の凝集結果の
問題を解決するためには異る諸試験において異るレクチ
ン（複数）を用いることが好ましい。適切な補助的なレ
クテン試験法においては試料の一部と病源性ナイセリア
（ｘ−ｍａｗＮ−ｇ・・Ｎ．ｔ．及びＢ．ｃ．）を凝集
させるレクチンとを混合する。この試験法は非％異的で
あるけれどもＷＧＡ試験法は偽の陰性結果を与えること
を技術者に警告する働きをする。この補助試験のために
適切なレクチンはＳＢＡ又はＳＴＡの夫々単独又はそれ
らの組合せである。
最高の正確度の達成のために各種の病源性ナイセリアを
区別する場合に上記のレクチン試験とひとつ又は複数の
確認試験との組合せが重要であることが見出された。本
発明に従えば確認試験のひとつはＮ．ｍ．がＧＧＡ酵素
活性を持つけれどもグロリンアミノベグテダーゼ（ＰＡ
）活性を赫舷ないという知識からみちびがれた。逆にＮ
．ｇ．はＰＡ活性をもつがＧＧＡ活性をもたない。従っ
てＧＧＡと反応するがＦＡと反応しない基質は被検試料
がＮ．ｍ．を含むけれどもＮ−ｇ．ｋ含まないことの陽
性表示として利用され得る。詳言すればかような基質全
試料の一部に添加したとき基質と試料との反応生成物の
存在は該試料がＮ．ｍ．を含みＮ．ｇ−を含まないとい
うことの陽性表示である。
区別する場合に上記のレクチン試験とひとつ又は複数の
確認試験との組合せが重要であることが見出された。本
発明に従えば確認試験のひとつはＮ．ｍ．がＧＧＡ酵素
活性を持つけれどもグロリンアミノベグテダーゼ（ＰＡ
）活性を赫舷ないという知識からみちびがれた。逆にＮ
．ｇ．はＰＡ活性をもつがＧＧＡ活性をもたない。従っ
てＧＧＡと反応するがＦＡと反応しない基質は被検試料
がＮ．ｍ．を含むけれどもＮ−ｇ．ｋ含まないことの陽
性表示として利用され得る。詳言すればかような基質全
試料の一部に添加したとき基質と試料との反応生成物の
存在は該試料がＮ．ｍ．を含みＮ．ｇ−を含まないとい
うことの陽性表示である。
アミノ酸ペーターｆ７ｔルアミドは酵累存在の表示とし
てペーターナフダルアミンク口モーグンを放出する基質
であることが公知である。けれどもこの類の公知の基質
例えばガンマーグルタミルーペーターナフチルアミドは
ジアゾ染料とのカグリングによる呈色定量のために３７
℃で．２時間もの長時間の恒温保持を必要とする。該基
質はノア！染料の添加により変色會起す。基質一酵素反
応の検出のための他の一方法においては放出されたナ７
タルアミンを螢光検出する方法を採用し得る。
てペーターナフダルアミンク口モーグンを放出する基質
であることが公知である。けれどもこの類の公知の基質
例えばガンマーグルタミルーペーターナフチルアミドは
ジアゾ染料とのカグリングによる呈色定量のために３７
℃で．２時間もの長時間の恒温保持を必要とする。該基
質はノア！染料の添加により変色會起す。基質一酵素反
応の検出のための他の一方法においては放出されたナ７
タルアミンを螢光検出する方法を採用し得る。
アミノ酸ナ７チルアミド基質のカテリング反応の速度は
下記構造式で示される通りその≠一位、６一位又はそれ
ら両位を電子供与基Ｒ（例えばアルコキシ基、例えばメ
トキシ、ヒドロキシル基又はハロｒン） で置換することにより大きく増加することが見出ざれた
。
下記構造式で示される通りその≠一位、６一位又はそれ
ら両位を電子供与基Ｒ（例えばアルコキシ基、例えばメ
トキシ、ヒドロキシル基又はハロｒン） で置換することにより大きく増加することが見出ざれた
。
従ってＮ．ｍ．のガンマーグルタミルアミノペノチダー
ゼ酵素に対する有効基質はガンマーグルタミルー≠−ア
ルコキシーペーターナフチルアミド、特にそのアルコキ
シ基がメトキシであるものである。該基質と適切なジア
ゾカグリング物質とを使用すれば同濃度の反応体につい
て温度３７℃でｌＯ分間以下の恒温保持で変色が起る。
ゼ酵素に対する有効基質はガンマーグルタミルー≠−ア
ルコキシーペーターナフチルアミド、特にそのアルコキ
シ基がメトキシであるものである。該基質と適切なジア
ゾカグリング物質とを使用すれば同濃度の反応体につい
て温度３７℃でｌＯ分間以下の恒温保持で変色が起る。
Ｎ．ｍ．に対する酵素一基質反応試験と類似の該反応試
験がＮ．ｇ．についても使用され得る，〕この試験の遂
行のためにＮ．ｇ．のグロリンアミノペグチダーゼ酵素
部分に対する基質を試料の一部に加える。未置換のプロ
リンーペーターナ７チルアミドを使用し得るけれども迅
速反応の基質は既述の型の電子供４基で≠一位、乙一位
、又はそれら両位を置換した化合物を包含する。特に有
効な基質はゾロリンー≠−アルコ午シーペーターナフチ
ルアミド、特にその≠−メトキシ化合物、を包含する。
験がＮ．ｇ．についても使用され得る，〕この試験の遂
行のためにＮ．ｇ．のグロリンアミノペグチダーゼ酵素
部分に対する基質を試料の一部に加える。未置換のプロ
リンーペーターナ７チルアミドを使用し得るけれども迅
速反応の基質は既述の型の電子供４基で≠一位、乙一位
、又はそれら両位を置換した化合物を包含する。特に有
効な基質はゾロリンー≠−アルコ午シーペーターナフチ
ルアミド、特にその≠−メトキシ化合物、を包含する。
Ｂ．Ｃ．については池の類似の酵素一基質反応試験を使
用し得る。この試験に当りＮ．Ｇ．のグリシループロリ
ルーアミノベ！チダーゼ酵素部分に対する基質を試料の
一部に加える。迅速検出用の基質は≠一位、乙一位、又
は両位を既述の型の亀子供与基で置換したグリシルーグ
ロリルーナフチルアミドを包含する。特に有効な基質は
グリンループロリルー≠−アルコキシーベーターナフチ
ルアミド、特にその弘一メトキシ化合物である。
用し得る。この試験に当りＮ．Ｇ．のグリシループロリ
ルーアミノベ！チダーゼ酵素部分に対する基質を試料の
一部に加える。迅速検出用の基質は≠一位、乙一位、又
は両位を既述の型の亀子供与基で置換したグリシルーグ
ロリルーナフチルアミドを包含する。特に有効な基質は
グリンループロリルー≠−アルコキシーベーターナフチ
ルアミド、特にその弘一メトキシ化合物である。
本発明の他の特徴的態様は上記のレクチン凝集反応とａ
ＧＡ（ｇｌ素試験との組合せの試験方法である。該方法
において試料中のＮ．ｔ．菌の存在は試料の一部と’Ｂ
Ｇ酵素（この酵素はＮ．ｔ．菌体上に存在する）と反応
する基質１とを接触させることにより検出ざれる。Ｎ．
ｔ．菌体中のＢＧ酵素と基質との反応生成物は該試料が
Ｎ．ｔ．菌を有することの陽性表示である。この目的に
かなう適切な基質はＯＮＰＧ％そのプロモクロローイン
ドキシル誘導体及びそのペーターナフチル誘導体を包含
する。特異的基質はＯ−ニトロフエニルーＤ−ガラクト
ピラノシド、ｐ−ニトロ７エニル−Ｄ−ガラクトビラノ
シド、フェノールフタレインーＤーガラクトピラノシド
、ｊ−ブロモー≠−クロローインドイルーＤ−ガラクト
ピラノシド、プロモチモール７タレイン一〇−ガラクト
ピラノシド及びナフチルーガラクト♂ラノシドを包含す
る。
ＧＡ（ｇｌ素試験との組合せの試験方法である。該方法
において試料中のＮ．ｔ．菌の存在は試料の一部と’Ｂ
Ｇ酵素（この酵素はＮ．ｔ．菌体上に存在する）と反応
する基質１とを接触させることにより検出ざれる。Ｎ．
ｔ．菌体中のＢＧ酵素と基質との反応生成物は該試料が
Ｎ．ｔ．菌を有することの陽性表示である。この目的に
かなう適切な基質はＯＮＰＧ％そのプロモクロローイン
ドキシル誘導体及びそのペーターナフチル誘導体を包含
する。特異的基質はＯ−ニトロフエニルーＤ−ガラクト
ピラノシド、ｐ−ニトロ７エニル−Ｄ−ガラクトビラノ
シド、フェノールフタレインーＤーガラクトピラノシド
、ｊ−ブロモー≠−クロローインドイルーＤ−ガラクト
ピラノシド、プロモチモール７タレイン一〇−ガラクト
ピラノシド及びナフチルーガラクト♂ラノシドを包含す
る。
総括すると病源性ナイセリア（Ｎ．ｍｅｔＮ．ｇ−＊Ｂ
．ｃ．又はＮ．ｔ．”）Ｋ対する特異的分別試験の四方
法が次表に示される： （注）＊≠一位又は乙一位ケ電子供与基で置換されてい
ることを示す。
．ｃ．又はＮ．ｔ．”）Ｋ対する特異的分別試験の四方
法が次表に示される： （注）＊≠一位又は乙一位ケ電子供与基で置換されてい
ることを示す。
記号十は特定のナイセリア菌との陽性反応を示す。
記号一は特定のナイセリア菌との不反応を示す０
基質一酵紫反応生成物を着色型へ転化させるための適当
なジアゾカノリング染料は下記の諸物質を包含すル：ｌ
Ｌｔ−アミノーｊＪ−ジメトキシー弘′−ニトロアゾベ
ンゼンジアゾニウム塩；テトラアゾ化された０−ジアニ
シジン；ゾアゾ化されたー≠′−アミノーＪ’．ｊ’−
ジエトキシペンズアニリトの塙化ｎｌｉｆｆｉ塩；グー
ペンゾイルアミノ−２Ｊ−ジメトキ７アニリン塩化面鉛
塩のジアゾ化物；〇一アミノア／｝ルエ／のジアゾニウ
ム埴〔７アストがーネット（ＦａｓｔＧａｒｎｅｔ）と
いう名称で公知されている〕；アントラキノンー／−ジ
アゾニウムクロ！Ｉｌ’；ｊ−ニトロー２−アミノーメ
トキシベンゼンシツアゾテー｝；Ｎ’，Ｎ’−ジェチル
−４４−メトキシメタニルアミドのジアゾニウム塩；λ
−アミノー≠−メトキシペンズアミドのジアゾニウム埴
；ジアゾー！−アミノーよ−クロロアニソール．Ｍｉち
ジアゾーよ−クロロ一〇一アニンジン；ｊ−クロロ−２
−トルイジンジアゾニ，ウムクｐリドの半壌化亜鉛塩；
よ−クロロー弘−ぺ冫ズアミド−２−メチルベンゼンジ
アゾニウムクロリドの半塩化亜鉛塩；６−ぺ冫ズアミド
ーｊ−メトキシ−ｍ−｝ルイジンジアゾニウムクロリド
；及びその池のジアゾニウム塩。
なジアゾカノリング染料は下記の諸物質を包含すル：ｌ
Ｌｔ−アミノーｊＪ−ジメトキシー弘′−ニトロアゾベ
ンゼンジアゾニウム塩；テトラアゾ化された０−ジアニ
シジン；ゾアゾ化されたー≠′−アミノーＪ’．ｊ’−
ジエトキシペンズアニリトの塙化ｎｌｉｆｆｉ塩；グー
ペンゾイルアミノ−２Ｊ−ジメトキ７アニリン塩化面鉛
塩のジアゾ化物；〇一アミノア／｝ルエ／のジアゾニウ
ム埴〔７アストがーネット（ＦａｓｔＧａｒｎｅｔ）と
いう名称で公知されている〕；アントラキノンー／−ジ
アゾニウムクロ！Ｉｌ’；ｊ−ニトロー２−アミノーメ
トキシベンゼンシツアゾテー｝；Ｎ’，Ｎ’−ジェチル
−４４−メトキシメタニルアミドのジアゾニウム塩；λ
−アミノー≠−メトキシペンズアミドのジアゾニウム埴
；ジアゾー！−アミノーよ−クロロアニソール．Ｍｉち
ジアゾーよ−クロロ一〇一アニンジン；ｊ−クロロ−２
−トルイジンジアゾニ，ウムクｐリドの半壌化亜鉛塩；
よ−クロロー弘−ぺ冫ズアミド−２−メチルベンゼンジ
アゾニウムクロリドの半塩化亜鉛塩；６−ぺ冫ズアミド
ーｊ−メトキシ−ｍ−｝ルイジンジアゾニウムクロリド
；及びその池のジアゾニウム塩。
実施例
本発明に従う検出法の一例は下記の通りである。
タイアー！アチン平面培地上に生育させたー試料を被検
物とした。この試料微生物をダラム染色し、このタイア
ーマアチン平面培地からダラム陰性双球菌の純粋培養が
得られたことを確認した。
物とした。この試料微生物をダラム染色し、このタイア
ーマアチン平面培地からダラム陰性双球菌の純粋培養が
得られたことを確認した。
オキシダーゼテストヲ行ってこの微生物がオキシダーゼ
陽性であることを確証した。形態学的に類似する多数の
コロニイを除去してから適宜の緩衝物質例えばリン酸塩
でＰＨ７．２で緩衝された試験管内の食塩溶液の中で乳
化させた。
陽性であることを確証した。形態学的に類似する多数の
コロニイを除去してから適宜の緩衝物質例えばリン酸塩
でＰＨ７．２で緩衝された試験管内の食塩溶液の中で乳
化させた。
この細菌懸濁物の最終的な混濁度はマク７アランド（Ｍ
ｃＦａｒｌａｎｄ）Ｎｈ３又はｒｈ＋ｏ硫酸ハｌＪウＡ
標準液とおよそ等しくあるべきである。試験管又は凝集
板或は凝集皿の中でこの細菌懸濁物の一滴に対しＷＧＡ
（水溶液又は緩衝溶液／一当りおよそｌダ）の一滴を加
えた。他の第２の試験管又は凝集板又は凝集皿の中でこ
の細菌懸濁物の池の一滴に対しリン酸塩緩衝食塩溶液の
一滴を加えた。
ｃＦａｒｌａｎｄ）Ｎｈ３又はｒｈ＋ｏ硫酸ハｌＪウＡ
標準液とおよそ等しくあるべきである。試験管又は凝集
板或は凝集皿の中でこの細菌懸濁物の一滴に対しＷＧＡ
（水溶液又は緩衝溶液／一当りおよそｌダ）の一滴を加
えた。他の第２の試験管又は凝集板又は凝集皿の中でこ
の細菌懸濁物の池の一滴に対しリン酸塩緩衝食塩溶液の
一滴を加えた。
第３の試験管又は凝集板／皿の中でこの細菌懸濁物の一
滴に対しＳＢＡ又はＳＴＡ（水溶液又は緩衝溶液／ｆｎ
ｌ当りおよそ／ｍ９）の一滴を加えた。
滴に対しＳＢＡ又はＳＴＡ（水溶液又は緩衝溶液／ｆｎ
ｌ当りおよそ／ｍ９）の一滴を加えた。
〔すべての該試験管／板／皿を振盪した。〕対照食塩溶
液は振盪後に凝集陰性であるべきである。
液は振盪後に凝集陰性であるべきである。
もし対照食塩溶液が凝集陽性であるならばこれは自動的
凝集を起したものであるから試料を処理してこの処理済
みの細菌懸濁物についてＷＧＡ及びＳＢＡ／ＳＴＡを用
いて自動的凝集試験を行うべきである。自動的凝集を逆
転させる適宜の処理としてはＷＧＡ及びＳＢＡを用いる
凝集試験の遂行以前にＯ．．２一の試料に対しｏ．ｏｏ
ｓ−の無水コハク酸溶液を加える。ＷＧＡ及びＳＢＡ／
ＳＴＡを用いる凝集反応が陽性であればこれはＮ．ｇ−
又は不被嚢（ｎｏｎ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）のＭ
．ｃ．の存在を示すｏＷＧＡ使用による凝集が陰性であ
るがＳＢＡ／ＳＴＡ使用による凝集が陽性であるならば
これはＮ．ｍ．又はＮ−ｇ−（その表面構造は変化して
いる）の存在の可能性を示す。
凝集を起したものであるから試料を処理してこの処理済
みの細菌懸濁物についてＷＧＡ及びＳＢＡ／ＳＴＡを用
いて自動的凝集試験を行うべきである。自動的凝集を逆
転させる適宜の処理としてはＷＧＡ及びＳＢＡを用いる
凝集試験の遂行以前にＯ．．２一の試料に対しｏ．ｏｏ
ｓ−の無水コハク酸溶液を加える。ＷＧＡ及びＳＢＡ／
ＳＴＡを用いる凝集反応が陽性であればこれはＮ．ｇ−
又は不被嚢（ｎｏｎ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）のＭ
．ｃ．の存在を示すｏＷＧＡ使用による凝集が陰性であ
るがＳＢＡ／ＳＴＡ使用による凝集が陽性であるならば
これはＮ．ｍ．又はＮ−ｇ−（その表面構造は変化して
いる）の存在の可能性を示す。
次に試料の一滴を下記の基質の各溶液の一滴に対して別
々に添加する：ガンマーグルタミルー弘一メトキシーベ
ータ・−ナ７チルアミド，ｆロリルー≠−メトキシーペ
ーターナフチルアミド，ＯＮＰＧ．及びグリシルーゾロ
リルー≠−メトキシーベータ−ナフチルアミド。但し濃
度はトリスーＮＣｔ（Ｔｒｌｓ−ＮＣｔ）綴＃ｋ溶液又
はリン酸塩緩衝溶液中／ｇＩＬ！当り／ｆｆｌ＆である
。ＯＮＰＧについて試験結果が陽性であれば、即ち３７
℃でＩＯ分間以内に無色から黄色に変色すれば、これは
Ｎ．ｔ．の存在を示すＯＧＧＡについて試験結果が陽性
ならば、即ち細ｍ懸濁液を用いガンマーグルタミルー≠
−メトキシーベーターナ７チルアミド含有溶液中におい
て３７℃に７０分間恒濡保持した後に、及び７アストガ
ーネツ｝ＧＢＧ塩（水溶液／一中およそ０．２ｍ９の濃
度）添加の後に、赤からピンクへの変色が示されるなら
ば、これはＮ．ｍ．の存在を示す。ＰＡについて試験結
果が陽性ならば、即ち細菌懸濁液を用いゾロリルー≠−
メトキシーペーターナ７チルアミド含有溶液中において
３７℃に／θ分間恒温保持した後に、及び７アストガー
ネツ｝ＧＢＣ塩溶液添加の後に、赤からピンクへの変色
が示されるならば、これはＮ．ｇ．の存在を示す。ＧＰ
Ａについて試験結果が陽性ならば、即ちグリシルーグｐ
リルー≠−メトキシーペーターナフチルアミド含有浴液
中において３７Ｃに２０分間恒温保持した後に、及び７
アストガーネツ｝ＧＢＣ塩溶液添加の後に、赤からピン
クへの変色が示されるならば、これは８．Ｃ．の存在を
示す。
々に添加する：ガンマーグルタミルー弘一メトキシーベ
ータ・−ナ７チルアミド，ｆロリルー≠−メトキシーペ
ーターナフチルアミド，ＯＮＰＧ．及びグリシルーゾロ
リルー≠−メトキシーベータ−ナフチルアミド。但し濃
度はトリスーＮＣｔ（Ｔｒｌｓ−ＮＣｔ）綴＃ｋ溶液又
はリン酸塩緩衝溶液中／ｇＩＬ！当り／ｆｆｌ＆である
。ＯＮＰＧについて試験結果が陽性であれば、即ち３７
℃でＩＯ分間以内に無色から黄色に変色すれば、これは
Ｎ．ｔ．の存在を示すＯＧＧＡについて試験結果が陽性
ならば、即ち細ｍ懸濁液を用いガンマーグルタミルー≠
−メトキシーベーターナ７チルアミド含有溶液中におい
て３７℃に７０分間恒濡保持した後に、及び７アストガ
ーネツ｝ＧＢＧ塩（水溶液／一中およそ０．２ｍ９の濃
度）添加の後に、赤からピンクへの変色が示されるなら
ば、これはＮ．ｍ．の存在を示す。ＰＡについて試験結
果が陽性ならば、即ち細菌懸濁液を用いゾロリルー≠−
メトキシーペーターナ７チルアミド含有溶液中において
３７℃に／θ分間恒温保持した後に、及び７アストガー
ネツ｝ＧＢＣ塩溶液添加の後に、赤からピンクへの変色
が示されるならば、これはＮ．ｇ．の存在を示す。ＧＰ
Ａについて試験結果が陽性ならば、即ちグリシルーグｐ
リルー≠−メトキシーペーターナフチルアミド含有浴液
中において３７Ｃに２０分間恒温保持した後に、及び７
アストガーネツ｝ＧＢＣ塩溶液添加の後に、赤からピン
クへの変色が示されるならば、これは８．Ｃ．の存在を
示す。
上記の諸試験は凹味Ｃｍｔｌｉ）を有する一個の平板の
上で遂行し得るものであってＮ．ｇ．，Ｎ．ｍ．及びＮ
．ｔ．を迅速（即ち３０分間以内）に同定させる。
上で遂行し得るものであってＮ．ｇ．，Ｎ．ｍ．及びＮ
．ｔ．を迅速（即ち３０分間以内）に同定させる。
更にＳＢＡ又はＳＴＡとＷＧＡとの組合せの使用により
、及び自動的凝集が問題である場合にはＤＮＡ’アーゼ
及び（又は）無水コー・ク酸を用いて試料を処理するこ
とにより、同定の正確度は増大する０
、及び自動的凝集が問題である場合にはＤＮＡ’アーゼ
及び（又は）無水コー・ク酸を用いて試料を処理するこ
とにより、同定の正確度は増大する０
Claims (1)
- （１）試料中存在の疑ある微生物ナイセリアゴノレ及び
微生物ナイセリアメニンギチジスの分別検出方法におい
て、下記の各工程即ち （ａ）ナイセリアゴノレ菌及びナイセリアメニンギチジ
ス菌を含有する疑のある試料の一部とＮ−アセチルグル
コサミン又はＮ．Ｎ’−ジアセチルキトビオースに対し
て反応性あるレクチンとを接触させ、この試料がナイセ
リアゴノレ、ナイセリアメニンギチジスのいずれか又は
それら両者を含むことの陽性表示としてナイセリアゴノ
レ菌又はナイセリアメニンギテジス菌の表面上における
レクチンとＮ−アセチルグルコサミン又はＮ．Ｎ’−ジ
アセチルキトビオースとの反応にもとづく凝集反応の存
在を検出し、そして Ｑ））ナイセリアゴハ１及びナイセリアメニンギチジス
菌を含有する疑のある試料の一部とナイセリアメニンギ
チジスに反応するガンマーグルタミルアミノ−２ｆチダ
ーゼに対して特異的な基質及びナイセリアゴノレに反応
するプロリンアミノベグチダーゼに対して特異的な基質
から成る群から選ばれる基質とを接触させ、この試料が
ナイセリアメニンギチジス又はナイセリアゴノレを含む
ことの陽性表示として該試料の一部と基質との反応にも
とづく反応生成物の存在を検出する 該工程を含むことを特徴とする上記の方法Ｏ（２）ナイ
セリアゴノレ、ナイセリアメニンギチノス及び一一一Ｂ
．カタラリスから成る群から選シ１れるナイセリア菌の
酵素部分を迅速に検出する方法において、下記の各工程
即ち （ａ）ガンマーグルタミルナフチルアミド，プロリンナ
フチルアミド及びグリシルーゾロリルーナ７チルアミド
から成る群から選ばれる基質であって各基質のび一位、
６一位、又は両位が電子供与基によって置換された該迅
速検出用基質とナイセリア菌とを接触させ、そして（ｂ
）該工程（ａ）の反応生成物とジアゾ染料呈色剤とをカ
ブリングさせる 該工程を含むことを特徴とする上記の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US47266383A | 1983-03-07 | 1983-03-07 | |
| US472663 | 1999-12-27 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3860893A Division JPH0622792A (ja) | 1983-03-07 | 1993-02-26 | 微生物の検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59220200A true JPS59220200A (ja) | 1984-12-11 |
| JPH0563158B2 JPH0563158B2 (ja) | 1993-09-09 |
Family
ID=23876437
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4477784A Granted JPS59220200A (ja) | 1983-03-07 | 1984-03-07 | 微生物の検出方法 |
| JP3860893A Pending JPH0622792A (ja) | 1983-03-07 | 1993-02-26 | 微生物の検出方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3860893A Pending JPH0622792A (ja) | 1983-03-07 | 1993-02-26 | 微生物の検出方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0122023A1 (ja) |
| JP (2) | JPS59220200A (ja) |
| CA (1) | CA1219201A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3345748A1 (de) * | 1983-12-17 | 1985-08-29 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Phenolsulfonphthaleinyl-ss-d-galactoside, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur bestimmung der ss-d-galactosidase |
| CA1298763C (en) * | 1986-06-16 | 1992-04-14 | Mary Lou Gantzer | Rapid detection of n. gonorrhoeae without culture |
| US5554388A (en) * | 1989-02-25 | 1996-09-10 | Danbiosyst Uk Limited | Systemic drug delivery compositions comprising a polycationi substance |
| GB9700624D0 (en) | 1997-01-14 | 1997-03-05 | Danbiosyst Uk | Drug delivery composition |
| AU3008599A (en) | 1998-03-18 | 1999-10-11 | Meadox Medicals, Inc. | Improved ptfe vascular prosthesis and method of manufacture |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3862011A (en) * | 1971-08-16 | 1975-01-21 | Robert E Smith | Method for quantitatively determining enzyme concentrations in homogenates |
| US3957584A (en) * | 1974-09-30 | 1976-05-18 | Warner-Lambert Company | Detection of beta-galactosidase producing micro-organisms |
| US4298689A (en) * | 1978-09-25 | 1981-11-03 | Research Corporation | Gonorrhea diagnostic test |
| GB2031949B (en) * | 1978-10-16 | 1983-01-06 | American Home Prod | Identification of microrganisms |
| EP0018825B1 (en) * | 1979-05-02 | 1985-02-13 | National Research Development Corporation | A process for the identification of bacteria and a kit of reagents for use in this process |
-
1984
- 1984-03-06 CA CA000448977A patent/CA1219201A/en not_active Expired
- 1984-03-07 EP EP84301507A patent/EP0122023A1/en not_active Withdrawn
- 1984-03-07 JP JP4477784A patent/JPS59220200A/ja active Granted
-
1993
- 1993-02-26 JP JP3860893A patent/JPH0622792A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0122023A1 (en) | 1984-10-17 |
| JPH0563158B2 (ja) | 1993-09-09 |
| JPH0622792A (ja) | 1994-02-01 |
| CA1219201A (en) | 1987-03-17 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |