JPS5915635B2 - Method for producing 7-(4-carboxybutanamide)-3-cephem-4-carboxylic acid compound - Google Patents
Method for producing 7-(4-carboxybutanamide)-3-cephem-4-carboxylic acid compoundInfo
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- JPS5915635B2 JPS5915635B2 JP51040588A JP4058876A JPS5915635B2 JP S5915635 B2 JPS5915635 B2 JP S5915635B2 JP 51040588 A JP51040588 A JP 51040588A JP 4058876 A JP4058876 A JP 4058876A JP S5915635 B2 JPS5915635 B2 JP S5915635B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、一般式
(式中、Xはヒドロキシ基、アセトキシ基または求核性
残基を示す)で表わされる7−(4−カルボキシブタン
アミド)−3−セフェム−4−カルボン酸化合物の製法
lこ関する。Detailed Description of the Invention The present invention provides 7-(4-carboxybutanamide)-3-cephem- This relates to a method for producing a 4-carboxylic acid compound.
セファロスポリンC(CeC)は7−アミノセファロス
ポラン酸(7−、ACA)に変換され、それから優れた
抗菌活性を有するCeCの7−アシルアミド同族体、例
えばセファロチン、セファロリジン、セファログリシン
、セファゾリンなどに変換することができる。Cephalosporin C (CeC) is converted to 7-aminocephalosporanic acid (7-, ACA), which is then converted into 7-acylamide analogues of CeC with excellent antibacterial activity, such as cephalothin, cephaloridine, cephaloglycin, cefazolin, etc. can be converted to .
しかしながら、CeCのN−説アシル化による7−AC
Aの製造は、化学的に行なう方法が数多く開示されてい
るが、生化学的lこは側鎖がD−5アミノ−5−カルボ
キシペンタノイル基の構造Eこより極めて困難であると
されでいる。However, 7-AC due to N-hypothesis acylation of CeC
Many chemical methods have been disclosed for producing A, but biochemical methods are said to be extremely difficult due to the structure E, in which the side chain is a D-5 amino-5-carboxypentanoyl group. .
最近、一般式
(式中、Xは前記と同じ基を示す)で表わされる化合物
またはその塩Eこ好気的条件下アスペルギルス属、ペニ
シリウム属、ノイロスポラ属、エアロバクター属または
トリゴノプシズ・パリアビリスに属するD−アミノ酸酸
化酵素活性を有する菌体またはその処理物を作用させ、
そして目的物質のRが−COCOOH’基である場合l
こはカタラーゼ活性を存在せしめることよりなる、一般
式(式中、Rは−COOH基または−COCOOH基、
Xは前記と同じ基を示す)で表わされるセファロスポリ
ン化合物の製造法(ベルギー特許第736943号明細
書、特開昭47−39595号公報)が開示された。Recently, a compound represented by the general formula (wherein X represents the same group as above) or a salt thereof E under aerobic conditions has been developed. - act on bacterial cells having amino acid oxidase activity or processed products thereof,
And when R of the target substance is -COCOOH' group, l
This is a general formula (wherein R is -COOH group or -COCOOH group,
A method for producing a cephalosporin compound represented by (X represents the same group as described above) (Belgium Patent No. 736943, Japanese Patent Application Laid-Open No. 1983-39595) has been disclosed.
上記方法によれば、該D−アミノ酸酸化酵素活性を有す
る菌体またはその処理物Eこカタラーゼが存在するため
(こ、そのカタラーゼ阻害の有無によって式(1)のR
が−COOH基である7−(4−カルボキシブタンアミ
ド)−3−セフェム−4−カルボン酸誘導体〔I〕(以
下化合物〔I〕と称す〕または式(1)のRが−COC
0OH基である7−(5−カルボキシ−5−オキソペン
タンアミド)−3−セフェム−4−カルボン酸誘導体が
生成される。According to the above method, since the bacterial cells having the D-amino acid oxidase activity or the treated product E catalase are present, R of formula (1) is determined by the presence or absence of inhibition of the catalase.
is -COOH group, 7-(4-carboxybutanamido)-3-cephem-4-carboxylic acid derivative [I] (hereinafter referred to as compound [I]) or R in formula (1) is -COC
A 7-(5-carboxy-5-oxopentanamido)-3-cephem-4-carboxylic acid derivative, which is an 0OH group, is produced.
ところが、前者の化合物の方が後者の化合物より安定で
あるために、前者の化合物CI)の製造を目的とする方
が操作上好ましい。However, since the former compound is more stable than the latter compound, it is operationally preferable to aim for the production of the former compound CI).
その場合カタラーゼを失活させてD−アミノ酸酸化酵素
反応が行なわれる。In that case, catalase is inactivated and the D-amino acid oxidase reaction is carried out.
カタラーゼを失活させる方法としては、カタラーゼ阻害
剤、例えばアスコルビン酸、3−アミノ−1,2,3−
)リアゾール、アルカリ金属アジド、特lこナトリウム
アジドを用いる方法、または熱処理lこより失活させる
方法が開示されている。As a method for inactivating catalase, catalase inhibitors such as ascorbic acid, 3-amino-1,2,3-
) A method using lyazole, an alkali metal azide, especially sodium azide, or a method of deactivation by heat treatment is disclosed.
しかしながら、ナトリウムアジドを使用する場合は、反
応液から目的の化合物CI)を分離精製する際、反応液
を酸性(こして非親水性有機溶媒で抽出するのであるが
、酸性にすることにより使用したナトリウムアジドが分
解して猛毒のアジ化水素ガスを発生し、作業上人体に非
常な危険性を与えるのみならず、廃水tども適さないの
で、工業的lこ極めて好泳しくない問題を生じる。However, when using sodium azide, when separating and purifying the target compound CI from the reaction solution, the reaction solution is acidified (and then extracted with a non-hydrophilic organic solvent; Sodium azide decomposes and generates highly poisonous hydrogen azide gas, which not only poses a great danger to the human body during work, but also poses a problem that is extremely unsuitable for industrial use, as wastewater is not suitable.
また熱処理により失活させる方法の場合には、カタラー
ゼを完全に失活させる条件ではD−アミノ酸酸化酵素も
失活し、D−アミノ酸酸化酵素を失活させない範囲の条
件ではカタラーゼが失活しないために化合物CI)とR
が−COCOOH基である化合物CI)を生成すること
lこなり、化合物CI’)のみを高率よく得る方法とし
ては好ましい方法ではなG)。In addition, in the case of the method of inactivating by heat treatment, D-amino acid oxidase is also inactivated under conditions that completely inactivate catalase, and catalase is not inactivated under conditions that do not inactivate D-amino acid oxidase. Compounds CI) and R
G) is not preferable as a method for obtaining only compound CI') at a high rate because it does not produce compound CI) in which is a -COCOOH group.
そこで、本発明者らは、上記の欠点を解決すべく、カタ
ラーゼ活性を阻害し、工業的Eこ危険性がなく、且つ化
合物CI)までのD−アミノ酸酸化酵素反応を阻害しな
い物質を種々検索した結果、過ホウ酸塩が極めて安全且
つ有効に使用でき、化合物(1)を高率よく製造できる
ことを見出した(特願昭5O−14550)。Therefore, in order to solve the above-mentioned drawbacks, the present inventors searched for various substances that inhibit catalase activity, have no industrial risk, and do not inhibit the D-amino acid oxidase reaction up to compound CI). As a result, it was found that perborate can be used extremely safely and effectively, and that compound (1) can be produced at a high rate (Japanese Patent Application No. 50-14550).
本発明者らは、さらに研究を続けた結果、カタラーゼ活
性の阻害剤を添加する代りに、カタラーゼ作用により分
解されない程の量の過酸化水素を添加することfこより
、D−アミノ酸酸化酵素反応を阻害することなく、極め
て安全lこ化合物(1)を高率よく製造できることを見
出した。As a result of further research, the present inventors discovered that instead of adding an inhibitor of catalase activity, they added hydrogen peroxide in an amount that would not be decomposed by the action of catalase, thereby increasing the D-amino acid oxidase reaction. It has been found that extremely safe compound (1) can be produced at high efficiency without causing any hindrance.
本発明は、上記の知見に基いて完成されたものであり、
一般式(II)で表わされる化合物(以下化合物(II
〕と称す)またはその塩lこ好気的条件下アスペルギル
ス属、フサリウム属、セファロスポリウム属またはトリ
ゴノプシス・パリアビリスに属するD−アミノ酸酸化酵
素生産菌またはその処理物を作用させて化合物CI)を
製造するtこ際し、過酸化水素の存在下で作用させるこ
とを特徴とする化合物CI、lの製法であって、その目
的とするところは、化合物(n)から化合物〔I〕を製
造する方法において、工業的に危険性がなく、安全lこ
使用でき、且つD−アミノ酸酸化酵素活性を阻害しない
過酸化水素を使用して工業的(こ高率よく化合物〔I〕
を製造する方法を屍供することにある。The present invention was completed based on the above findings,
Compound represented by general formula (II) (hereinafter compound (II)
) or a salt thereof under aerobic conditions to produce a compound CI) by reacting with a D-amino acid oxidase-producing bacterium belonging to the genus Aspergillus, genus Fusarium, genus Cephalosporium, or Trigonopsis parabilis, or a treated product thereof. A method for producing compound CI,l, characterized in that the reaction is carried out in the presence of hydrogen peroxide, the objective of which is a method for producing compound [I] from compound (n). In this method, hydrogen peroxide, which is industrially non-hazardous, can be safely used, and does not inhibit D-amino acid oxidase activity, is used to produce compound [I] with high efficiency.
The method of manufacturing is to sacrifice a corpse.
本発明Eこおいて使用されるD−アミノ酸酸化酵素生産
菌としては、アスペルギルス属、フサリウム属、セファ
ロスポリウム属またはトリゴノプシス・パリアビリスに
属する微生物が適宜利用される。As the D-amino acid oxidase-producing bacteria used in the present invention E, microorganisms belonging to the genus Aspergillus, Fusarium, Cephalosporium, or Trigonopsis parabilis are appropriately used.
このような微生物は菌株保存機関に保存されているタイ
プ・カルチャーの中から選択することもできるし、自然
界から分離することもできる。Such microorganisms can be selected from type cultures stored in strain archives or isolated from nature.
また目的の化合物〔■〕の生成活性を高めるために上記
の微生物から通常の手段で得られる変異株も本発明に有
利fこ使用され得る上記のD−アミノ酸酸化酵素生産菌
としては、
アスペルギルス・ウスタスIM116045(Aspe
rgillus ustus )アスペルギルス°フ
ラブスIM I 52104 (Aspergillu
s flavus )アスペルギルス・フラブスーオ
リゼエIMI44(Aspergillus fla
vus −oryzae ) 242アスペルギルス
・バラシチカスIM115947(Aspergill
us parasiticus )フザリウム・ソラ
ニM −0009(Fusarium 5olani
)フザリウム・ソラニM−0718(F E RM−P
2688)(菌学的性状は特願昭49−117205号
明細書に記載)セファロスポリウム・ポトロニI F
05306 (Cephalosporium pot
ronii )セファロスポリウム・ポトロニIFO5
706セフアロスポリウム・スピーシーズM−4267
トリコソプシス・パリアビリスCB54095(Tri
gonopsis Variabilis )などが挙
げられるこのようなり一アミノ酸酸化酵素生産菌を用い
て目的の化合物〔I〕を製造するためには、通常、先ず
これらの微生物を培養し、得られる菌体またはその処理
物を化合物(n)に適当な条件下で作用させるのがよい
。In addition, mutant strains obtained from the above-mentioned microorganisms by conventional means to increase the production activity of the target compound [■] can also be advantageously used in the present invention. Ustas IM116045 (Aspe
rgillus ustus ) Aspergillus flavus IM I 52104 ( Aspergillus
s flavus ) Aspergillus flavus oryzae IMI44 ( Aspergillus fla
Vus-oryzae) 242 Aspergillus balasiticus IM115947 (Aspergill
us parasiticus) Fusarium solani M-0009 (Fusarium 5olani
) Fusarium solani M-0718 (FE RM-P
2688) (Mycological properties are described in Japanese Patent Application No. 117205/1982) Cephalosporium potoroni IF
05306 (Cephalosporium pot
ronii) Cephalosporium potoroni IFO5
706 Cephalosporium sp. M-4267
Trichosopsis parabilis CB54095 (Tri
In order to produce the target compound [I] using monoamino acid oxidase-producing bacteria such as S. gonopsis Variabilis), these microorganisms are usually cultured first, and the resulting microorganisms or their processed products are cultured. is preferably allowed to act on compound (n) under appropriate conditions.
菌体を得るための培養方法としては、通常好気的培養が
望ましく、好適fこは液体通気攪拌培養により行なわれ
る。As a culture method for obtaining bacterial cells, aerobic culture is usually desirable, and liquid aeration agitation culture is preferably carried out.
培地組成としては、通常カビの培地として使用される培
地、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・
スチープ・リカー、大豆蛋白解物、アミノ酸などの窒素
源、糖蜜、ブドウ糖、シュクロースなどの炭素源、リン
酸塩、マグネシウム塩、食塩その他の無機塩、または場
合(こよりその他の生育促進物質などを適宜含有する栄
養培地をpHを適宜に調製して使用するが、培地中tこ
D−(またはDL−)アミノ酸、例えばD−(またはD
L−)メチオニン、D−(またはDL−)アラニン、D
−(またはDL−)バリンなどを含有している場合には
優れたD−アミノ酸酸化酵素活性が得られる。The medium composition includes medium commonly used as a mold medium, such as peptone, meat extract, yeast extract, and corn/mold extract.
Nitrogen sources such as steep liquor, soybean protein lysate, amino acids, carbon sources such as molasses, glucose, sucrose, phosphates, magnesium salts, common salt and other inorganic salts, or other growth-promoting substances. A nutrient medium containing an appropriate amount is used after adjusting the pH appropriately.
L-)methionine, D-(or DL-)alanine, D
- (or DL-) When containing valine, etc., excellent D-amino acid oxidase activity can be obtained.
培養温度は23〜28°C1培養時間は培養条件特(こ
培養装置、培養組成、培養温度などにより異なるが、D
−アミノ酸酸化酵素活性が最大を示す時点に培養を終了
するよう決定するのがよく、通常2〜10日間が適当で
ある。The culture temperature is 23-28°C. The culture time is different depending on the culture conditions (culture equipment, culture composition, culture temperature, etc.)
- It is best to decide to terminate the culture at the time when the amino acid oxidase activity reaches its maximum, and 2 to 10 days is usually appropriate.
こうして得られた菌体またはその処理物が化合物(II
)のD−アミノ酸酸化反応に使用されるが、ここでいう
菌体の処理物とは、菌体tこ適当な処理を加えてD−ア
ミノ酸酸化酵素活性を高め化合物〔I〕の製造に有利な
形にしたものを指し、例えば本発明におけるD−アミノ
酸酸化酵素活性は通常菌体内に存在するので、D−アミ
ノ酸酸化酵素生産菌の培養物から集菌洗浄された菌体か
ら物理的あるいは化学的手段を適用して得られる無細胞
抽出液、または無細胞抽出液から公知の酵素分離精製方
法を適用して得られる部分精製あるいは精製されたD−
アミノ酸酸化酵素、または部分精製あるいは精製された
後、物理的あるいは化学的手段によって水不溶性高分子
物質または無機担体に結合されたD−アミノ酸酸化酵素
活性体、または菌体を活性化処理して得られる活性化菌
体などを指す。The bacterial cells thus obtained or their treated products are compound (II
) is used in the D-amino acid oxidation reaction, but the treated bacterial cells here refer to bacterial cells that have been subjected to appropriate treatment to increase the D-amino acid oxidase activity, which is advantageous for the production of compound [I]. For example, since the D-amino acid oxidase activity in the present invention normally exists within the bacterial body, the D-amino acid oxidase activity in the present invention is collected from a culture of D-amino acid oxidase-producing bacteria. A cell-free extract obtained by applying conventional methods, or partially purified or purified D- obtained by applying a known enzyme separation and purification method from a cell-free extract.
Amino acid oxidase, or partially purified or purified D-amino acid oxidase active form bound to a water-insoluble polymeric substance or inorganic carrier by physical or chemical means, or bacterial cells obtained by activation treatment. This refers to activated bacterial cells, etc.
本発明においては、前記の可溶性酵素の調製および再使
用は実用性が限られているの(こ対し、活性化菌体を使
用するような不溶性酵素を使用することは、回収および
再使用が可能な点で便利である。In the present invention, the preparation and reuse of the soluble enzyme described above has limited practicality (on the other hand, the use of an insoluble enzyme, such as the use of activated bacterial cells, allows recovery and reuse). It is convenient in many ways.
前記の菌体の活性化処理は、菌体をある種の緩和な損傷
を与え、崩壊を起こさせる程ではない条件に付すること
によりもたらせる。The above-mentioned activation treatment of the bacterial cells can be brought about by subjecting the bacterial cells to conditions that cause some kind of mild damage and do not cause disintegration.
これら活性化処理の例としては、酸1’fEpH例えば
pH約3〜4で一10°C以下で凍結させ、次いで融解
させる方法、菌体を1種またはそれ以上の有機溶媒、例
えばアセトン、n−ブタノール、2−フェニルエタノー
ル、ジメチルエーテル、ジクロヘキサン、ベンゼン、ト
ルエンなどと共に水相中で処理する方法、0゜1〜10
%の表面活性剤、例えばアセチルトリメチルアンモニウ
ム、セチルピリジニウム、セチルジメチルベンジルアン
モニウムハライドなどのカチオン界面活性剤、ドデシル
サルフェート、アルキルアリールスルフォン酸アルカリ
金属塩、ナトリウムデスオキシコレートなどのアニオン
界面活性剤、ソルビタンモノラウレートトライトン×1
00などの非イオン界面活性剤の水溶液で処理する方法
、水酸化カリウムまたは水酸化すl−IJウムの希薄溶
液で処理する方法、高浸透圧溶液、例えば2M蔗糖溶液
中に懸濁させ、次いで急速に水で希釈する方法などが挙
げられる。Examples of these activation treatments include freezing the cells at below 10° C. with an acid 1'fEpH, e.g. pH about 3-4, followed by thawing, freezing the cells in one or more organic solvents, e.g. acetone, n. - Processing in an aqueous phase with butanol, 2-phenylethanol, dimethyl ether, dichlorohexane, benzene, toluene, etc., 0°1-10
% surfactants, cationic surfactants such as acetyltrimethylammonium, cetylpyridinium, cetyldimethylbenzylammonium halide, anionic surfactants such as dodecyl sulfate, alkylarylsulfonic acid alkali metal salts, sodium desoxycholate, sorbitan mono Laurate Triton x 1
00, dilute solutions of potassium hydroxide or sulfur hydroxide, suspension in hypertonic solutions such as 2M sucrose solution, and then Examples include a method of rapidly diluting with water.
これらの活性化処理は、温度、処理時間、pH1試薬の
濃度などの種々の袈素により左右されるので、活性化の
至適条件を適宜確かめることが必妥である。Since these activation treatments are influenced by various factors such as temperature, treatment time, and concentration of the pH 1 reagent, it is necessary to appropriately confirm the optimal conditions for activation.
このようtこして得られるD−アミノ酸酸化酵素生産菌
の菌体またはその処理物を過酸化水素の存在下水性媒体
中で化合物(II)iこ接触させればよい。The cells of the D-amino acid oxidase-producing bacteria thus obtained or the treated product thereof may be brought into contact with compound (II) in an aqueous medium in the presence of hydrogen peroxide.
過酸化水素はカタラーゼ作用により分解を受けずに残存
するに足りるだけの量が使用されるが、その使用量は菌
体またはその処理物の量、本酵素力価、カタラーゼ作用
、化合物〔■〕の使用量およびその濃度lこより左右さ
れる。Hydrogen peroxide is used in an amount sufficient to remain without being decomposed by the action of catalase, but the amount used depends on the amount of bacterial cells or their processed material, the titer of this enzyme, the action of catalase, and the compound [■] It depends on the amount used and its concentration.
通常は本酵素力価1万単位/TILl当り35係過酸化
水素水量7〜10TLl(約0.07〜0.1モル)の
量が使用される。Usually, an amount of 7 to 10 TLl (about 0.07 to 0.1 mol) of 35% hydrogen peroxide solution is used per 10,000 units/TIL of the enzyme titer.
添加時期は、反応時に一度に添加すると反応液中の過酸
化水素濃度が極めて上るためにD−アミノ酸酸化酵素活
性が失活したり、あるいは化合物CI)の1位の硫黄原
子が酸化を受けを恐れがあるので、少量づつ断続的に添
加するか、あるいは反応中を通して連続的に添加するの
が好ましい。The timing of addition should be determined because if it is added all at once during the reaction, the concentration of hydrogen peroxide in the reaction solution will be extremely high and the D-amino acid oxidase activity may be inactivated, or the sulfur atom at position 1 of compound CI) may not be oxidized. Therefore, it is preferable to add intermittently in small amounts or continuously throughout the reaction.
従って、上記の酵素反応は、通常過酸化水素が反応中を
通して連続的に添加されるような濃度の条件下で行なわ
れる。Therefore, the enzymatic reaction described above is usually carried out under conditions such that hydrogen peroxide is added continuously throughout the reaction.
本酵素反応は、通常6〜8のpHで行なわれる。This enzymatic reaction is usually carried out at a pH of 6 to 8.
反応温度としては30〜40℃で行なうのが望ましい。The reaction temperature is preferably 30 to 40°C.
反応時間は主として酵素力価により左右されるが、通常
1〜5時間である。The reaction time mainly depends on the enzyme titer, but is usually 1 to 5 hours.
上記の酵素反応は好気的条件下で行なわれるのr通常攪
拌あるいは空気または酸素の通気下で行なうのが好まし
い。The above enzymatic reaction is carried out under aerobic conditions, usually with stirring or preferably under aeration of air or oxygen.
CeCはその両性的な構造および吸湿性のために醗酵プ
ロスから抽出することが困難であるが、本発明方法によ
れば、CeC醗酵プロス中で、菌体を除去した後、適当
な条件下で行なうことができ生成した化合物CI)(X
−アセトキシ基)を溶媒抽出またはイオン交換樹脂吸着
などにより回収することができる。Although it is difficult to extract CeC from a fermentation process due to its amphoteric structure and hygroscopicity, according to the method of the present invention, CeC can be extracted under appropriate conditions in a CeC fermentation process after removing bacterial cells. The compound CI) (X
-acetoxy group) can be recovered by solvent extraction or ion exchange resin adsorption.
Xがアセトキシ基である化合物CI、]は、反応液から
、例えばp H2,5またはそれ以下に調節し、適当な
有機溶媒、例えば酢酸エチル、n−ブタノールなどで抽
出することができぬ。Compound CI, in which X is an acetoxy group, cannot be extracted from the reaction solution by adjusting the pH to 2.5 or lower, for example, and using a suitable organic solvent such as ethyl acetate, n-butanol, etc.
またイオン交換樹脂と溶媒抽出の組合せを使用すると好
結果が得られる。Good results have also been obtained using a combination of ion exchange resin and solvent extraction.
適当なイオン交換樹脂は液体アミンアニオン交換樹脂で
ある。Suitable ion exchange resins are liquid amine anion exchange resins.
好ましい溶媒は酢酸エチル酢酸ブチル、 n−ブタノー
ルなどである。Preferred solvents include ethyl acetate, butyl acetate, n-butanol, and the like.
CeC醗酵ブロスを使用した反応液からの抽出は、予め
ブロスのpHを3〜5程度に調節して行なうと有利であ
る。It is advantageous to perform extraction from a reaction solution using CeC fermentation broth by adjusting the pH of the broth to about 3 to 5 in advance.
また個体のイオン交換樹脂を使用してXがアセトキシ基
である化合物CI)を分離することができる。It is also possible to separate compounds CI) in which X is an acetoxy group using solid ion exchange resins.
その場合の適当な溶出溶媒としては、予備的実験で容易
に決めることができるが、アセトンが有利である。A suitable elution solvent in this case can be easily determined through preliminary experiments, but acetone is advantageous.
Xがヒドロキシ基または求核性残基である化合物(I)
はそれらが生成された水性媒体から前記したと同様の方
法で回収することができる。Compound (I) where X is a hydroxy group or a nucleophilic residue
can be recovered from the aqueous medium in which they were produced in a manner similar to that described above.
その場合X基の性質により前記の抽出条件が左右される
力\これらは予備的な実験によって容易に決定すること
ができる。In that case, the properties of the X group influence the above-mentioned extraction conditions. These can be easily determined by preliminary experiments.
〔■〕は相当する4−エステル化合物をイミドハライド
に変換し、これをイミノエーテルEこ変換し、これを分
解することによって相当する7β−アミノ化合物fこ変
換することができる。[■] can be converted into the corresponding 7β-amino compound by converting the corresponding 4-ester compound into an imidohalide, converting this into an iminoether E, and decomposing this.
またコマモナス属またはシュードモナス属に属する微生
物の培養物またはその処理物を用いて7β−アミノ化合
物lこ変換することもできる(特願昭49−10471
号明細書、同昭49−142761号明細書)。It is also possible to convert 7β-amino compounds using cultures of microorganisms belonging to the genus Comamonas or Pseudomonas (Japanese Patent Application No. 10471/1989).
No. 49-142761 specification).
Xがヒドロキシ基である本発明方法の出発物質は、特公
昭39−9894号公報、特公昭42−7553号公報
記載の方法により製造することができ、Xが求核性残基
である場合には、特公昭38−26179号公報記載の
ようEこしてピリジンまたは他の3級アミンと、特公昭
39−17936号公報記載のようlこして硫黄結合、
窒゛素結合または無機求核性化合物と、特公昭41−4
714号公報、特公昭42−1305号公報記載のよう
Eこして値黄結合求核性化合物と、特公昭46−130
23号公報、特公昭46−14735号公報、特公昭4
6−15951号公報記載のようにしてチオールと反応
させることにより製造することができる。The starting material for the method of the present invention in which X is a hydroxy group can be produced by the method described in Japanese Patent Publication No. 39-9894 and Japanese Patent Publication No. 42-7553, and when X is a nucleophilic residue, is, as described in Japanese Patent Publication No. 38-26179, pyridine or other tertiary amine, and as described in Japanese Patent Publication No. 39-17936, a sulfur bond,
Nitrogen bond or inorganic nucleophilic compound and Japanese Patent Publication No. 41-4
No. 714 and JP-B No. 1305-1980, a yellow binding nucleophilic compound and JP-B No. 46-130
Publication No. 23, Special Publication No. 46-14735, Special Publication No. 4
It can be produced by reacting with thiol as described in Japanese Patent No. 6-15951.
上記の求核性残基は限定的列挙ではなく説明のためにの
み挙げたものであって、セファロスポリン化合物lこ関
する他の明細書に列挙されている他の求核性残基も使用
できる。The above nucleophilic residues are provided for illustrative purposes only and not as a restrictive list; other nucleophilic residues listed in other specifications relating to cephalosporin compounds may also be used. can.
次に参考例および実施例を挙げて本発明方法を更に詳細
に説明するが、これにより本発明を限定するものではな
い。Next, the method of the present invention will be explained in more detail with reference to Reference Examples and Examples, but the present invention is not limited thereto.
参考例 1
トリゴノプシス・パリアビリスの培養
グルコース2チ、D−メチオニン0.3%、酵母エキス
0.5係、KH2PO40,4先MgSO4・7H20
0,1%、KCl0.05%、F e SO4” 7
H200,0025%を含む液体培地(pH6,0)1
00dを500wLl容三角フラスコlこ分注し、12
0℃で15分間蒸気滅菌後、トリゴノプシス・パリアビ
リスCB54095を接種し、30℃で48時間振盪培
養する。Reference example 1 Trigonopsis parabilis culture 2 parts glucose, 0.3% D-methionine, 0.5 part yeast extract, KH2PO40, 4 parts MgSO4 7H20
0.1%, KCl0.05%, FeSO4” 7
Liquid medium containing 200,0025% H (pH 6,0) 1
Dispense 00d into 1 500wL Erlenmeyer flask, 12
After steam sterilization at 0°C for 15 minutes, Trigonopsis parabilis CB54095 is inoculated and cultured with shaking at 30°C for 48 hours.
培養後、培養液34分を集め、遠心分離して集菌し、湿
潤菌体(含水率約90係)68gを得る。After culturing, 34 minutes of the culture solution was collected and centrifuged to collect the bacteria to obtain 68 g of wet bacterial cells (water content about 90 parts).
参考例 2
トリゴノプシス・パリアビリスの活性化
(2a)参考例1で得た湿潤菌体209を0.1Mリン
酸塩緩衝液(pH7,5)に懸濁し、100m1とする
。Reference Example 2 Activation of Trigonopsis palabilis (2a) Wet bacterial cells 209 obtained in Reference Example 1 were suspended in 0.1M phosphate buffer (pH 7.5) to a volume of 100 ml.
これにトルエンITLlを加え、37℃、60分間攪拌
処理した後、集菌してトルエン処理菌体を得る。Toluene ITLl was added to this, and after stirring at 37°C for 60 minutes, the bacteria were collected to obtain toluene-treated bacterial cells.
(2b)参考例1で得た湿潤菌体20gを0.1Mリン
酸塩緩衝液(pH7,5)に懸濁し、100dとする。(2b) 20 g of the wet bacterial cells obtained in Reference Example 1 are suspended in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.5) to a total volume of 100 d.
これ(こトルエン11rLlを加え、50℃、5時間攪
拌処理した後、集菌してトルエン熱処理菌体を得る。After adding 11 rLl of toluene and stirring at 50°C for 5 hours, the bacteria were collected to obtain toluene heat-treated bacterial cells.
(2c)参考例1で得た湿潤菌体20gをジメチルエー
テル100TILlで4回浸漬振盪後、ジメチルエーテ
ルを除去してMOM処理菌体を得る。(2c) 20 g of wet bacterial cells obtained in Reference Example 1 are soaked and shaken four times in 100 TILl of dimethyl ether, and then the dimethyl ether is removed to obtain MOM-treated bacterial cells.
参考例 3
フザリウム・ソラニの培養
グルコース2チ、コーン・スチーブ・リカー2係、DL
−アラニン0.2%を含む液体培地(pH5,0)10
0m13を5001d容三角フラスコニ分注し、120
℃で15分間蒸気滅菌した後、フザリウム・ソラニM−
0718(FE RM−P2688)を接種し、26°
Cで2日間回転振盪培養する。Reference example 3 Fusarium solani culture glucose 2 parts, corn stew liquor 2 parts, DL
-Liquid medium containing 0.2% alanine (pH 5,0) 10
Dispense 0m13 into a 5001d Erlenmeyer flask, 120
After steam sterilization for 15 minutes at °C, Fusarium solani M-
0718 (FE RM-P2688) and 26°
Culture with rotary shaking at C for 2 days.
培養後、培養液31分を集め、集菌後水洗して湿潤菌体
90gを得る。After culturing, 31 minutes of the culture solution was collected and washed with water to obtain 90 g of wet bacterial cells.
参考例 4
セファロスポリウム・ポトロニの培養
参考例31こおいて、フザリウム・ソラニM−0718
の代りにセファロスポリウム・ポトロニIF05306
を用いて湿潤菌体85gを得る。Reference Example 4 Culture of Cephalosporium potoroni In reference example 31, Fusarium solani M-0718
Cephalosporium potoroni IF05306 instead of
to obtain 85 g of wet bacterial cells.
参考例 5
フザリウム・ソラニの活性化
参考例3で得たフザリウム・ソラニM−0718(FE
RM−P2688)の湿潤菌体10gを0.1Mリン酸
塩緩衝液(pH7,5)40TILlに懸濁し、これl
こトルエン0.4 rul、を加えて37℃、1時間攪
拌した後、集菌してトルエン処理菌体を得る。Reference Example 5 Activation of Fusarium solani Fusarium solani M-0718 (FE) obtained in Reference Example 3
RM-P2688) was suspended in 40 TIL of 0.1M phosphate buffer (pH 7.5), and
After adding 0.4 rul of toluene and stirring at 37°C for 1 hour, the bacteria were collected to obtain toluene-treated bacterial cells.
参考例 6
セファロスポリウム・ポトロニの活性化
参考例4で得たセファロスポリウム・ポトロニIF05
306の湿潤菌体1(lを0.1Mリン酸塩緩衝液(p
H7,5) 40m1lこ懸濁し、これIこトルエン0
.4 mlを加えて37°C11時間攪拌した後、集菌
してトルエン処理菌体を得る。Reference Example 6 Activation of Cephalosporium potoroni Cephalosporium potoroni IF05 obtained in Reference Example 4
306 wet bacterial cells 1 (l) were dissolved in 0.1 M phosphate buffer (p
H7, 5) Suspend 40ml of this and add 0 of toluene.
.. After adding 4 ml and stirring at 37°C for 11 hours, the bacteria were collected to obtain toluene-treated bacterial cells.
実施例中のRf値および化合物CI)の生成率は次の方
法fこより求めた。The Rf value and the production rate of compound CI) in the Examples were determined by the following method.
(1)Rf値
担体;シリカゲルニスポットフィルム(東京化成社製)
展開溶媒;
aln−ブタノール−酢酸−水(3:1:1)b:n−
ブタノール−酢酸−水−ホルムアルデヒド(3:1:1
:5)
を用いる薄層クロマトグラフィー(TLC)lこより求
めた。(1) Rf value carrier; silica gel Nispot film (manufactured by Tokyo Kasei Co., Ltd.); developing solvent; aln-butanol-acetic acid-water (3:1:1) b:n-
Butanol-acetic acid-water-formaldehyde (3:1:1
:5) It was determined by thin layer chromatography (TLC) using:
(2)化合物CI)の生成率
試料溶液を高圧p紙電気泳動(3,5KV、1時間、蟻
酸−酢酸−水(22ニア5 :900)の混合溶媒(p
H1,8)使用〕fこかける。(2) Formation rate of compound CI) The sample solution was subjected to high-pressure p paper electrophoresis (3.5 KV, 1 hour, mixed solvent of formic acid-acetic acid-water (22 Nia 5:900) (p
H1, 8) Use] f.
化合物CI)のスポットを0.1 M IJン酸塩緩衝
液(pH7,0)で抽出し、この抽出液をO,D、26
0mμにおける吸光度を測定し、標品の化合物CI)の
検量線からプロットして化合物(1)量を求めることに
より算定する。A spot of compound CI) was extracted with 0.1 M IJ phosphate buffer (pH 7,0), and this extract was mixed with O, D, 26
It is calculated by measuring the absorbance at 0 mμ and plotting it from the calibration curve of the standard compound CI) to determine the amount of compound (1).
上記のスポットは、例えばCeCを用いた場合(こは、
残存するCeCば陰極側へ1.3crfL移動し、生成
した3−アセトキシメチル−7−(4−カルボキシブタ
ンアミド)−3−セフェム−4−カルボン(Xがアセト
キシ基である化合物CI)は陽極側へ4.1 am移動
する点に示す。For example, when CeC is used (this spot is
The remaining CeC moves to the cathode side by 1.3 crfL, and the generated 3-acetoxymethyl-7-(4-carboxybutanamide)-3-cephem-4-carvone (compound CI in which X is an acetoxy group) moves to the anode side. The point shown is 4.1 am.
3−アセトキシメチル−7−(5−カルボキシ−5−オ
キソ−ベンクンアミド)−3−セフェム−4−カルボン
酸の生成した場合は陽極側へ5.5 (m移動する点l
こ示す。When 3-acetoxymethyl-7-(5-carboxy-5-oxo-bencunamido)-3-cephem-4-carboxylic acid is generated, the point l moves 5.5 m (m) toward the anode.
This is shown.
実施例 1
3−アセトキシメチル−7−(4−カルボキシブタンア
ミド)−3−セフェム−4−カルボン酸の製造
2336γ/1rLlを含有するCeC水溶液51をp
H7,6に調節し、これlこ参考例2b記載と同様の
方法で得たトリゴノプシス・パリアビリスCB5409
5のトルエン−熱処理菌体315TILl(全り一アミ
ノ酸酸化酵素力価369000単位)を加え、37°C
で通気量毎分121、攪拌速度毎分300回転の条件下
、35%過酸化水素水23TLlを3時間かけて連続的
lこ添加する。Example 1 Production of 3-acetoxymethyl-7-(4-carboxybutanamide)-3-cephem-4-carboxylic acid CeC aqueous solution 51 containing 2336γ/1rLl was
Trigonopsis parabilis CB5409 adjusted to H7.6 and obtained in the same manner as described in Reference Example 2b.
Add 315 TILl of toluene-heat-treated bacterial cells from No. 5 (total monoamino acid oxidase titer 369,000 units) and heat at 37°C.
Under conditions of an aeration rate of 121 revolutions per minute and a stirring speed of 300 revolutions per minute, 23 TL of 35% hydrogen peroxide solution was continuously added over 3 hours.
反応液から菌体を除菌して得られる溶液(目的物質量1
610γ/TLl、生成率91.4%、CeCの残存率
9係、RニーC0C0OHである化合物(1)は検出で
きなかった)を塩酸でpH1に調節し、酢酸エチルで抽
出する。A solution obtained by removing bacteria from the reaction solution (amount of target substance 1
610γ/TLl, production rate 91.4%, CeC residual rate 9, compound (1) which is Rnee C0C0OH could not be detected) was adjusted to pH 1 with hydrochloric acid and extracted with ethyl acetate.
酢酸エチル層を無水硫酸す) IJウムで乾燥後、減圧
濃縮する。The ethyl acetate layer was dried over anhydrous sulfuric acid (IJ) and concentrated under reduced pressure.
残渣を酢酸エチル−ヘキサンで処理して目的物質の粉末
8.25gを得る。The residue was treated with ethyl acetate-hexane to obtain 8.25 g of powder of the desired substance.
R,f =0.48(a)、 0.76ら)上記の方法
において、過酸化水素を使用しない場合の目的物質の生
成率は65%、残りはR=−COCOOHである化合物
(1)の生成を認めた。R, f = 0.48 (a), 0.76 et al.) In the above method, the production rate of the target substance when hydrogen peroxide is not used is 65%, and the remainder is compound (1) where R = -COCOOH The formation of
実施例 2
3−アセトキシメチル−7−(4−カルボキシブタンア
ミド)−3−セフェム−4−カルボン酸の製造
実施例IIこおいて、酢酸エチル層を乾燥、減圧濃縮す
る代りEこIN水酸化ナトリウム水溶液で中和的lこ抽
出して抽出液1.251(目的物質含量5.8m9/r
rLl)を得る。Example 2 Preparation of 3-acetoxymethyl-7-(4-carboxybutanamido)-3-cephem-4-carboxylic acid In Example II, instead of drying and concentrating the ethyl acetate layer under reduced pressure, E was hydroxylated. Neutralized extraction with an aqueous sodium solution yielded an extract of 1.251 m (target substance content: 5.8 m9/r).
rLl).
(の抽出液は特願昭49−10471または特願昭49
−142761号の方法による7−ACAの製造にその
まメの形で使用される。(The extract of
It is used in raw form for the production of 7-ACA by the method of No. 142,761.
実施例 3
3−アセトキシメチル−7−(4−カルボキシブタンア
ミド)−3−セフェム−4−カルボン酸の製造
CeC醗酵から得た培養プロスを除菌した培養P液(C
eC5000γ/1rLl)20TL11こ参考例5で
得たフザリウム・ソラニM−0718(FERM−P2
688)のトルエン処理菌体6gを加え、37℃で3時
間回転振盪機で攪拌する。Example 3 Production of 3-acetoxymethyl-7-(4-carboxybutanamide)-3-cephem-4-carboxylic acid Culture P solution (C
Fusarium solani M-0718 (FERM-P2) obtained in Reference Example 5
Add 6 g of toluene-treated bacterial cells of 688) and stir with a rotary shaker at 37°C for 3 hours.
攪拌中35係過酸化水素水0.611Llを6回に分け
て30分毎に添加する。While stirring, 0.611 Ll of 35% hydrogen peroxide solution was added every 30 minutes in 6 portions.
反応液中の目的物質の生成率は79.5係、R−−CO
COOHである化合物(1)の生成は検出されなかった
。The production rate of the target substance in the reaction solution was 79.5%, R--CO
No formation of compound (1), which is COOH, was detected.
過酸化水素水を添υ口しない場合の目的物質の生成率は
38係であった。The production rate of the target substance when hydrogen peroxide solution was not added was 38.
実施例 4
3−アセトキシメチル−7−(4−カルボキシブタンア
ミド)−3−セフェム−4−カルボン酸の製造
実施例3において、フザリウム・ソラニM−0718(
FERM−P2688)のトルエン処理菌体の代りにセ
ファロスポリウム・ポトロニ■FO5306のトルエン
処理菌体を用いて目的物質を77.6%の生成率で得た
。Example 4 Production of 3-acetoxymethyl-7-(4-carboxybutanamide)-3-cephem-4-carboxylic acid In Example 3, Fusarium solani M-0718 (
Using toluene-treated bacterial cells of Cephalosporium potoronii FO5306 instead of the toluene-treated bacterial cells of FERM-P2688), the target substance was obtained at a production rate of 77.6%.
R=−COCOOHである化合物(1,1の生成は検出
されなかった。Compound where R=-COCOOH (no formation of 1,1 was detected.
過酸化水素水を添加しない場合は40係であった。When hydrogen peroxide solution was not added, it was 40 units.
実施例 5
3−アセトキシメチル−7−(4−カルボキシブタンア
ミド)−3−セフェム−4−カルボン酸の製造
実施例1において、参考例2bで得たトルエン熱処理菌
体の代りに参考例2aで得たトルエン処理菌体315m
A!および参考例2cで得たMOM処理菌体40gを用
いて、各々目的物質を86%および72係の生成率で得
た。Example 5 Production of 3-acetoxymethyl-7-(4-carboxybutanamide)-3-cephem-4-carboxylic acid In Example 1, reference example 2a was used instead of the toluene heat-treated bacterial cells obtained in reference example 2b. 315 m of toluene-treated bacterial cells obtained
A! Using 40 g of the MOM-treated bacterial cells obtained in Reference Example 2c, the target substances were obtained at production rates of 86% and 72%, respectively.
実施例 6
7−(4−カルボキシブタンアミド) −3−(5−メ
チル−1,3,4−チアジアゾール−2−イル)チオメ
チル−3−セフェム−4−カルボン酸の製造
7−(D−アミノアジピンアミド)−3−(5−メチル
−1,3,4−チアジアゾール−2−イル)チオメチル
−3−セフェム−4−カルボン酸100曙を0.1Mリ
ン酸塩緩衝液(pH7,5)fこ溶解し、これに参考例
2bで得たトルエン−熱処理菌体31rLlを加え、3
7℃で3時間回転振盪機で攪拌する。Example 6 Preparation of 7-(4-carboxybutanamide)-3-(5-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-3-cephem-4-carboxylic acid 7-(D-amino Adipinamide)-3-(5-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-3-cephem-4-carboxylic acid (100%) in 0.1M phosphate buffer (pH 7.5) To this was added 31rLl of toluene-heat treated bacterial cells obtained in Reference Example 2b, and 3
Stir on a rotary shaker for 3 hours at 7°C.
攪拌中35%過酸化水素水0.6 ydを6回に分けて
30分毎に添加する。While stirring, 0.6 yd of 35% hydrogen peroxide solution was added every 30 minutes in 6 portions.
反応液を塩酸でp H1#こ調節し、酢酸エチルで抽出
する。The reaction solution was adjusted to pH 1 with hydrochloric acid and extracted with ethyl acetate.
酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮
して目的物質を得る。The ethyl acetate layer is dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under reduced pressure to obtain the desired substance.
Rf=0.38(a)
実施例 7
3−ヒドロキシメチル−7−(4−カルボキシブタンア
ミド)−3−セフェム−4−カルボン酸の製造
実施例6において、7−([)−5−アミノアジピンア
ミド)−3−(5−メチル−1、3、4−チアジアゾー
ル−2−イル)チオメチル−3−セフェム−4−カルボ
ン酸の代りに3−ヒドロキシメチル−7−(D=5−ア
ミノアジピンアミド)−3−セフェム−4−カルボン酸
を用いて目的物質を69.5%の生成率で得た。Rf=0.38(a) Example 7 Production of 3-hydroxymethyl-7-(4-carboxybutanamido)-3-cephem-4-carboxylic acid In Example 6, 7-([)-5-amino 3-hydroxymethyl-7-(D=5-aminoadipine)-3-(5-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-3-cephem-4-carboxylic acid The target substance was obtained using amide)-3-cephem-4-carboxylic acid at a yield of 69.5%.
Rf =0.44(a)R=−COCOOHである化合
物(1)の生成は認められなかった。Rf=0.44 (a) No formation of compound (1) where R=-COCOOH was observed.
実施例 8
N−(7−(4−カルボキシブタンアミド)−3−セフ
ェム−3−イルメチル〕ピリジニウムー4−カルボキシ
レートの製造
実施例6において、7−(D−5−アミノアジピンアミ
ド)−3−(5−メチル−1,3,4−チアジアゾール
−2−イル)チオメチル−3−セフェム−4−カルボン
酸の代りにN−(7−(D−5−アミノアジピンアミド
)−3−セフェム−3−イルメチル〕ピリジニウムー4
−カルボキシレートを用いて目的物質を得た。Example 8 Preparation of N-(7-(4-carboxybutanamide)-3-cephem-3-ylmethyl]pyridinium-4-carboxylate In Example 6, 7-(D-5-aminoadipinamide)-3- N-(7-(D-5-aminoadipinamido)-3-cephem-3 instead of (5-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-3-cephem-4-carboxylic acid -ylmethyl]pyridinium-4
- The target substance was obtained using carboxylate.
Claims (1)
残基を示す)で表わされるセファロスポリン化合物また
はその塩に好気的条件下トリゴノプシス・パリアビリス
、フザリウム属またはセファロスポリウム属に属するD
−アミノ酸酸化酵素生産菌の菌体またはその処理物を作
用させて一般(式中、Xは前記と同じ基を示す)で表わ
される7−(4−カルボキシブタンアミド)−3−セフ
ェム−4−カルボン酸化合物を製造するに際し、過酸化
水素の存在下で作用させることを特徴とする7−(4−
カルボキシブタンアミド)−3−セフェム−4−カルボ
ン酸化合物の製法。[Scope of Claims] 1. A cephalosporin compound represented by the general formula (wherein X represents a hydroxyl group, an acetoxy group, or a nucleophilic residue) or a salt thereof under aerobic conditions such as Trigonopsis parabilis or Fusarium. D belonging to the genus or Cephalosporium
- 7-(4-carboxybutanamide)-3-cephem-4- represented by the general formula (wherein, 7-(4-
Method for producing (carboxybutanamide)-3-cephem-4-carboxylic acid compound.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP51040588A JPS5915635B2 (en) | 1976-04-09 | 1976-04-09 | Method for producing 7-(4-carboxybutanamide)-3-cephem-4-carboxylic acid compound |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP51040588A JPS5915635B2 (en) | 1976-04-09 | 1976-04-09 | Method for producing 7-(4-carboxybutanamide)-3-cephem-4-carboxylic acid compound |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS52125696A JPS52125696A (en) | 1977-10-21 |
JPS5915635B2 true JPS5915635B2 (en) | 1984-04-10 |
Family
ID=12584647
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP51040588A Expired JPS5915635B2 (en) | 1976-04-09 | 1976-04-09 | Method for producing 7-(4-carboxybutanamide)-3-cephem-4-carboxylic acid compound |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5915635B2 (en) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5272886A (en) * | 1975-12-12 | 1977-06-17 | Banyu Pharmaceut Co Ltd | Preparation of cephalosporin compound |
-
1976
- 1976-04-09 JP JP51040588A patent/JPS5915635B2/en not_active Expired
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5272886A (en) * | 1975-12-12 | 1977-06-17 | Banyu Pharmaceut Co Ltd | Preparation of cephalosporin compound |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS52125696A (en) | 1977-10-21 |
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