【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、セファロスポリンＣからＤ−アミノ酸オキシダーゼ含有物を用いてグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸に酵素変換する方法の改良法に関する。さらに詳しくは該酵素中に共存するエステラーゼ酵素を選択的に不活性化またはエステラーゼ酵素反応を選択的に阻害する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸（以下「ＧＬ−７ＡＣＡ」と称する）はセファロスポリンＣ（以下「ＣＰＣ」と称する）から７−アミノセファロスポラン酸を製造するための製造中間体であることはよく知られている。ＧＬ−７ＡＣＡを高い収率で得るために、トリゴノプシス・バリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）のＤ−アミノ酸オキシダーゼ（以下「ＤＡＯ」と称する）の作用を利用して、ＣＰＣからＧＬ−７ＡＣＡへ酵素的に変換する種々の方法が知られている。
【０００３】
例えば、特公昭５０−７１５８号公報、特公昭５５−３５１１９号公報等には、カタラーゼによるＨ２Ｏ２の分解を防止するために、無機アザイド類や過ホウ酸塩などのカタラーゼ阻害剤の存在下でＣＰＣの酵素的酸化を行い、ＧＬ−７ＡＣＡを得る方法、特公昭５９−１５６３５号公報には、カタラーゼ阻害剤を存在させる代わりに、カタラーゼで分解される以上の過酸化水素の存在下で反応させる方法が述べられている。特公昭５５−３５１１８号公報には、トリゴノプシス・バリアビリスの活性化細胞にナトリウムアジドなどのカタラーゼ阻害剤を用いることによってＣＰＣの酵素的酸化反応を行い、高い収率のＧＬ−７ＡＣＡを得る方法が述べられている。特開平３−５３８７９号公報には、ｐＨ約１１〜１２の塩基性水溶液で処理してカタラーゼ活性を不活化したＤＡＯを使用する方法が述べられている。
【０００４】
また、特開平３−５３８７９号公報には、デスアセチル−ＣＰＣおよびデスアセチル−ＧＬ−７ＡＣＡの副生を防止するために、トリゴノプシス・バリアビリスの細胞をアセトン／水で処理して、エステラーゼ活性を不活性化したＤＡＯを使用する方法が述べられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、前記の酵素反応を工業スケールで経済的に実施するには、いくつかの問題を含んでいた。それらの課題の１つに、トリゴノプシス・バリアビリスに由来するエステラーゼの存在による収率の低下がある。
エステラーゼは、ＣＰＣからＧＬ−７ＡＣＡへの酸化反応中に、そこに生成したα−ケト−アジポイル−７−アミノセファロスポラン酸（以下「ＫＥＴＯ−ＣＰＣ」と称する）反応中間体ならびにＣＰＣおよびＧＬ−７ＡＣＡの３位のアセトキシメチル基のアセチル基を脱離（脱アセチル化）し、ＧＬ−７ＡＣＡの収量を減少させる。
【０００６】
また、該エステラーゼによって副生されるデスアセチル−ＣＰＣおよびデスアセチル−ＧＬ−７ＡＣＡは、不純物としてＧＬ−７ＡＣＡの品質に多大な悪影響を及ぼす。したがって、ＧＬ−７ＡＣＡの収率および品質を向上させるために、該エステラーゼの不活性化あるいは該エステラーゼ反応の阻害は重要である。
一方、エステラーゼの不活性化を図る方法として、ＤＡＯ生産菌を９０〜５０％の水／アセトン（２：１、ｖ：ｖ）混合液で処理することによってエステラーゼを除去する方法（特開平３−５３８７９号公報）等が知られている。しかし、アセトンを除去する等の処理が複雑かつ面倒であり、さらに、工業レベルに応用できる簡易かつ効率的なエステラーゼ活性の不活性化法の確立が望まれていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
以上の点に鑑みて本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ＤＡＯ生産菌であるトリゴノプシス・バリアビリス由来のＤＡＯ含有物にＣｕ化合物、例えば、ＣｕＳＯ４を接触させることによって、ＤＡＯ活性存在下でエステラーゼを選択的に不活性化することができることを、また、該ＤＡＯ含有物およびＣＰＣを含有した液に、Ｃｕ化合物を接触させることによって、ＤＡＯによる酵素的酸化反応中にエステラーゼ反応のみを特異的に阻害することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、ＤＡＯの存在下でエステラーゼを不活性化させる方法であって、該酵素混合物にＣｕ化合物を接触させることを特徴とするエステラーゼの不活性化方法であり、また、本発明は、ＣＰＣからＤＡＯ含有物を用いてＧＬ−７ＡＣＡを製造する方法において、Ｃｕ化合物と接触させた、ＤＡＯ含有物を用いることを特徴とするＧＬ−７ＡＣＡの製造方法、前記の方法においてＤＡＯ含有物およびＣＰＣを含有した液に、Ｃｕ化合物を接触させることを特徴とするＧＬ−７ＡＣＡの製造方法である。
【０００９】
本発明において酸化反応に用いるＣＰＣ溶液は、ＣＰＣ粉末を水に溶解した水溶液、あるいはＣＰＣ生産菌であるアクレモニウム・クリソゲナムを適当な培地、例えば、シュークロース２％、炭酸カルシウム０．５％、硫酸カルシウム１．２５％、酢酸アンモニウム０．８％、コーンスターチ３％、ビートモラセス５％、脱脂大豆６％、メチルオレート３％等を含む培地、またはその他ＣＰＣ生産菌に好適な栄養培地によって培養され菌体、固形分等が除去された培養液を挙げることができる。
【００１０】
ＤＡＯ含有物にＣｕ化合物を接触させるエステラーゼの不活性化方法は、該酵素が未精製の状態あるいは部分的に精製された状態の如何なる形態であってもよく、例えば、トリゴノプシス・バリアビリスの細胞、部分的に破壊した細胞、膜透過性にした細胞、それから該酵素を抽出した細胞不含の抽出液、固定化酵素等として存在している場合が挙げられる。これらは、従来公知の方法で得ることができる。
本発明において用いられるＤＡＯ含有物は、トリゴノプシス・バリアビリスに由来するものが好ましいが、ＫＥＴＯ−ＣＰＣの副生を阻止するためには、カタラーゼを欠損した菌株、例えば、トリゴノプシス・バリアビリス ＫＣ−１０３株（受託番号：微工研菌寄第１３０７４号、国際寄託番号；ＦＥＲＭ ＢＰ−４３５９）などを使用するのがより好ましい。
【００１１】
ＤＡＯ含有物の水溶液または懸濁液に、１０〜２０００ｐｐｍ濃度のＣｕ化合物を溶解させ、５〜２５℃で２〜２４時間接触処理することにより、エステラーゼ活性が選択的に低減される。この処理により、エステラーゼ活性を半分以下にすることができる。前記処理において、Ｃｕ化合物濃度を１０〜４００ｐｐｍ程度の範囲で行えば、ＤＡＯ活性に全く影響することなくエステラーゼを不活性化することができる。さらに、Ｃｕ化合物濃度を５０〜４００ｐｐｍの範囲で前記処理を行えば、エステラーゼ活性が１／１０以下に低減し、エステラーゼ／ＤＡＯの活性比を１％以下にすることができるので好ましい。
【００１２】
本発明においては、共存するエステラーゼの不活性化は、酵素的酸化反応前だけでなく、共存するエステラーゼを不活性化させていないＤＡＯ含有物を作用させて、ＣＰＣからＧＬ−７ＡＣＡに酵素的酸化反応する段階においてＣｕ化合物を接触させてもよい。すなわち、前記のＣｕ化合物の接触を、エステラーゼが共存するＤＡＯ含有物に前もって直接行うのではなく、該酵素含有物をＣＰＣ溶液に反応させる際に、Ｃｕ化合物を添加することにより行われる。この場合においても、前記反応液中のＣｕ化合物の濃度が１０〜２０００ｐｐｍの範囲になるようにＣｕ化合物を接触させればよい。さらに、Ｃｕ化合物濃度を５０〜４００ｐｐｍの範囲で前記反応を行えば、エステラーゼ／ＤＡＯの活性比を１％以下にすることができるので好ましい。本発明で使用するＣｕ化合物は、ＣｕＳＯ４などが挙げられる。
【００１３】
エステラーゼ活性は、適量の酵素サンプルを、０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解した２ｇ／Ｌ濃度のＧＬ−７ＡＣＡ溶液に添加し、２５℃で３０分間反応させた後、等量のメタノールを添加することによって反応を停止させ、生成したデスアセチル−ＧＬ−７ＡＣＡの量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより求めることができる。
また、ＤＡＯ活性は、適量の酵素サンプルを０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解した１０ｇ／Ｌ濃度のＣＰＣ溶液に添加し、２５℃で１５分間反応させた後、等量のメタノールを添加することによって反応を停止させ、生成したＧＬ−７ＡＣＡおよびＫＥＴＯ−ＣＰＣをＨＰＬＣにて定量することにより求めることができる。
ＤＡＯ含有物を酵素的酸化反応中にＣｕ化合物と接触させる場合は、酵素的酸化反応の前後のデスアセチル−ＣＰＣとデスアセチル−ＧＬ−７ＡＣＡを定量する。ＣＰＣに対するデスアセチル誘導体の増加分を、エステラーゼ／ＤＡＯの活性比とする。
【００１４】
ＣＰＣ含有液にＤＡＯ含有物を作用させることにより酵素的酸化反応を行うに当たっては、通常、反応液に酸素を吹き込みながら行われる。反応温度は通常２０〜３０℃の範囲で行われる。反応時間はＣＰＣ濃度、ＤＡＯ含有物の使用量または活性度合い、反応温度、ｐＨにより左右されるが、ＨＰＬＣ，薄層クロマトグラフィー等により、反応の経過を追跡することができるので、ＧＬ−７ＡＣＡが最大に生成される時期を待って適宜反応を終了すればよい。通常は３０分〜４時間程度である。ＫＥＴＯ−ＣＰＣの残存量を低減させるために、過酸化水素を反応液に加えてもよい。
得られた反応液から目的とするＧＬ−７ＡＣＡを採取、精製するには、公知の方法により行えばよい。
【００１５】
【実施例】
以下に，本発明について実施例および参考例を挙げて，さらに詳しく説明するが、本発明は，これらの実施例により何等限定されるものではない。
（実施例１）
トリゴノプシス・バリアビリス ＫＣ−１０３株をグルコース２％、コーンスチープリカー２％およびＤＬ−メチオニン０．２％を含む培地により、２５℃で６０時間培養し、得られた培養液６０ｍｌ（湿菌体６ｇを含む）にトルエン０．３ｍｌを加え、２５℃で２時間撹拌して菌体の膜透過性を付与した。
【００１６】
得られたトルエン含有培養液に、２３．６ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを溶解し、室温で２時間放置した。得られたトルエン−Ｃｕ含有培養液から適量の酵素サンプルを取り出し、これを０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）に溶解した２ｇ／ＬのＧＬ−７ＡＣＡ溶液に添加し、２５℃で３０分間反応させた後、等量のメタノールを加えることによって反応を停止させた。生成したデスアセチル−ＧＬ−７ＡＣＡの量をＨＰＬＣで定量したところ、新たに生成したデスアセチル−ＧＬ−７ＡＣＡは定量できず、該酵素サンプル中のエステラーゼは十分に不活性化されていることがわかった。
次いで、１０ｇのＣＰＣ粉末を１０００ｍｌの水に溶解し、これをｐＨ７．５に調節したＣＰＣ溶液を、前記のトルエン−Ｃｕ含有培養液と混合し、該混合液中に酸素を吹き込みながら、２０℃で約１８０分間反応させたところ、９３．２％の収率でＧＬ−７ＡＣＡが得られた。
【００１７】
（実施例２）
実施例１と同様の方法によって培養を行い、該培養液に膜透過性を付与し、かつ、エステラーゼを不活性化させたトリゴノプシス・バリアビリス ＫＣ−１０３株のトルエン−Ｃｕ含有培養液を得た。一方、８．５ｇ／Ｌ濃度のＣＰＣを含むアクレモニウム・クリソゲナムの培養液をｐＨ２．５で除菌した後、ｐＨ７．５に調節し，得られたＣＰＣ培養液１２００ｍｌを前記トルエン−Ｃｕ含有培養液６０ｍｌと混合した。
次いで、前記混合培養液に酸素を吹き込み、かつ、３．５％濃度の過酸化水素２３．９ｍｌを連続的に添加しながら，２０℃で約２４０分間反応させたところ、９２．８％の収率でＧＬ−７ＡＣＡが得られた。
【００１８】
（実施例３）
実施例１と同様の方法によって培養を行い、該培養液に膜透過性を付与したトリゴノプシス・バリアビリス ＫＣ−１０３株のトルエン含有培養液を得た。一方、１０ｇのＣＰＣ粉末を１０００ｍｌの水に溶解し、これをｐＨ７．５に調節したＣＰＣ溶液を前記トルエン含有培養液６０ｍｌと混合した。
次いで、該混合液に０．５ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを添加溶解し、酸素を吹き込みながら、２０℃で約１８０分間反応させたところ、９２．２％の収率でＧＬ−７ＡＣＡが得られた。
なお、反応の前後でエステラーゼによるデスアセチル−ＣＰＣ、デスアセチル−ＧＬ−７ＡＣＡの増加は、両者を合わせても、添加したＣＰＣの量の１％以下であった。
【００１９】
（実施例４）
実施例１と同様の方法によって培養を行い、該培養液に膜透過性を付与したトリゴノプシス・バリアビリス ＫＣ−１０３株のトルエン含有培養液６０ｍｌと、実施例２と同様の方法によって得られたＣＰＣ培養液１２００ｍｌとを混合した。
次いで、該混合液に０．５ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを添加溶解し、酸素を吹き込み、かつ、３．５％濃度の過酸化水素２３．９ｍｌを連続的に添加しながら、２０℃で約２４０分間反応させたところ、９２．０％の収率でＧＬ−７ＡＣＡが得られた。
なお、反応の前後でエステラーゼによるデスアセチル−ＣＰＣ、デスアセチル−ＧＬ−７ＡＣＡの増加は、両者を合わせても、添加したＣＰＣの量の１％以下であった。
【００２０】
（実施例５）
実施例１と同様の方法によって培養を行い、得られたトリゴノプシス・バリアビリス ＫＣ−１０３株の培養液４００ｍｌ（湿菌体４０ｇを含む）にトルエン２．０ｍｌを加え、実施例１と同様の方法で処理した。
該トルエン含有培養液に１５７．３ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを溶解し，室温で２時間放置した。得られたトルエン−Ｃｕ含有培養液から適量の酵素サンプルを取り出し、実施例１と同様の方法でエステラーゼ活性を測定したところ、該酵素サンプル中のエステラーゼは、実施例１と同様に十分に不活性化されていることがわかった。
次いで、１０ｇのＣＰＣ粉末を１０００ｍｌの水に溶解し、これをｐＨ７．５に調節したＣＰＣ溶液を、前記のトルエン−Ｃｕ含有培養液と混合し、該混合液中に酸素を吹き込みながら、２０℃で約３０分間反応させたところ、９９．０％の収率でＧＬ−７ＡＣＡが得られた。
【００２１】
（実施例６）
実施例１と同様の方法によって培養を行い、該培養液に膜透過性を付与したトリゴノプシス・バリアビリス ＫＣ−１０３株のトルエン含有培養液４００ｍｌと、実施例１と同様の方法によって得られたＣＰＣ溶液１０００ｍｌとを混合した。
次いで、該混合液に０．６６ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを添加溶解し、酸素を吹き込みながら、２０℃で約３０分間反応させたところ、９８．１％の収率でＧＬ−７ＡＣＡが得られた。
なお、反応の前後でエステラーゼによるデスアセチル−ＣＰＣ、デスアセチル−ＧＬ−７ＡＣＡの増加は、両者をあわせても、添加したＣＰＣの量の１％以下であった。
【００２２】
（参考例１）
実施例１と同様の方法によって培養を行い、該培養液に膜透過性を付与したトリゴノプシス・バリアビリス ＫＣ−１０３株のトルエン含有培養液６０ｍｌと、実施例１と同様の方法によって得られたＣＰＣ溶液１０００ｍｌを混合した。次いで、該混合液に酸素を吹き込みながら、２０℃で約１８０分間反応させたところ、８３．０％の収率でＧＬ−７ＡＣＡが得られた。
【００２３】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼと共存するエステラーゼを、特異的に不活性化、あるいは該エステラーゼ反応のみを阻害することができるので、極めて高収率で高品質のＧＬ−７ＡＣＡが得られる。また、本発明は、極めて簡単かつ安全性がよいので、工業スケールで実施可能である。[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to an improved method for enzymatically converting cephalosporin C to glutaryl-7-aminocephalosporanic acid using a substance containing D-amino acid oxidase. More specifically, the present invention relates to a method for selectively inactivating an esterase enzyme coexisting in the enzyme or selectively inhibiting an esterase enzyme reaction.
[0002]
[Prior art]
Glutaryl-7-aminocephalosporanic acid (hereinafter referred to as "GL-7ACA") is a production intermediate for producing 7-aminocephalosporanic acid from cephalosporin C (hereinafter referred to as "CPC"). well known. In order to obtain GL-7ACA in high yield, enzymatic conversion of CPC to GL-7ACA is carried out by utilizing the action of Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase (hereinafter referred to as "DAO"). Various methods are known.
[0003]
For example, Japanese Patent Publication No. 50-7158 and Japanese Patent Publication No. 55-35119 disclose the existence of catalase inhibitors such as inorganic azides and perborate in order to prevent the decomposition of H 2 O 2 by catalase. Japanese Patent Publication No. 59-15635 discloses a method for obtaining GL-7ACA by enzymatic oxidation of CPC under the following conditions. In the presence of a catalase inhibitor, instead of the presence of a catalase inhibitor, A method of reacting is described. Japanese Patent Publication No. 55-35118 discloses a method for obtaining a high yield of GL-7ACA by performing an enzymatic oxidation reaction of CPC by using a catalase inhibitor such as sodium azide in activated cells of Trigonopsis variabilis. Have been. JP-A-3-53879 describes a method of using a DAO in which catalase activity has been inactivated by treatment with a basic aqueous solution having a pH of about 11 to 12.
[0004]
JP-A-3-53879 discloses that in order to prevent by-products of desacetyl-CPC and desacetyl-GL-7ACA, Trigonopsis variabilis cells are treated with acetone / water to inhibit esterase activity. A method using activated DAO is described.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
However, economically carrying out the enzymatic reaction on an industrial scale involves several problems. One of those challenges is the reduction in yield due to the presence of esterase from Trigonopsis variabilis.
Esterase reacts with α-keto-adipoyl-7-aminocephalosporanic acid (hereinafter referred to as “KETO-CPC”) reaction intermediate formed during the oxidation reaction of CPC to GL-7ACA, and CPC and GL-7ACA. The acetyl group of the acetoxymethyl group at position 3 is eliminated (deacetylated) to reduce the yield of GL-7ACA.
[0006]
In addition, desacetyl-CPC and desacetyl-GL-7ACA by-produced by the esterase have a great adverse effect on the quality of GL-7ACA as impurities. Therefore, in order to improve the yield and quality of GL-7ACA, inactivating the esterase or inhibiting the esterase reaction is important.
On the other hand, as a method for inactivating the esterase, a method of removing the esterase by treating a DAO-producing bacterium with a 90-50% water / acetone (2: 1, v: v) mixed solution (Japanese Unexamined Patent Publication No. No. 53879) is known. However, treatments such as removal of acetone are complicated and troublesome, and furthermore, a simple and efficient method for inactivating esterase activity applicable to an industrial level has been desired.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In view of the above points, the present inventors have conducted intensive studies, and as a result, by contacting a DAO-containing substance derived from a DAO-producing bacterium Trigonopsis variabilis with a Cu compound, for example, CuSO 4 , in the presence of DAO activity The fact that the esterase can be selectively inactivated and that the solution containing the DAO-containing substance and the CPC is brought into contact with a Cu compound to specifically inhibit only the esterase reaction during the enzymatic oxidation reaction by DAO. And found that the present invention was completed.
[0008]
That is, the present invention relates to a method for inactivating esterase in the presence of DAO, which is a method for inactivating esterase, which comprises contacting the enzyme mixture with a Cu compound. A method for producing GL-7ACA from a CPC using a DAO-containing material, wherein the method comprises the step of using the DAO-containing material in contact with a Cu compound; A method for producing GL-7ACA, comprising contacting a Cu compound with a liquid containing CPC.
[0009]
The CPC solution used for the oxidation reaction in the present invention is an aqueous solution obtained by dissolving CPC powder in water, or a CPC-producing bacterium, Acremonium chrysogenum, in a suitable medium, for example, sucrose 2%, calcium carbonate 0.5%, sulfuric acid Cultured and cultured in a medium containing 1.25% calcium, 0.8% ammonium acetate, 3% corn starch, 5% beet molasses, 6% defatted soybean, 3% methyl oleate, or other nutrient medium suitable for CPC producing bacteria A culture solution from which the body, solid content, etc. have been removed can be mentioned.
[0010]
The method of inactivating an esterase in which a DA compound is brought into contact with a Cu compound may be in any form in which the enzyme is in an unpurified state or in a partially purified state, for example, a cell, a part of Trigonopsis variabilis. Examples include cells that have been disrupted, cells that have been made membrane permeable, cell-free extracts from which the enzyme has been extracted, and immobilized enzymes. These can be obtained by a conventionally known method.
The DAO-containing substance used in the present invention is preferably derived from Trigonopsis variabilis, but in order to prevent KETO-CPC by-product, a strain deficient in catalase, for example, Trigonopsis variabilis KC-103 strain ( Accession No .: No. 13074, Microcosms International Deposit No .; FERM BP-4359) is more preferable.
[0011]
Esterase activity is selectively reduced by dissolving a Cu compound at a concentration of 10 to 2,000 ppm in an aqueous solution or suspension of a DAO-containing substance and subjecting it to a contact treatment at 5 to 25 ° C for 2 to 24 hours. By this treatment, the esterase activity can be reduced to half or less. If the concentration of the Cu compound is in the range of about 10 to 400 ppm in the above treatment, the esterase can be inactivated without any influence on the DAO activity. Further, it is preferable to perform the above treatment at a Cu compound concentration of 50 to 400 ppm, since the esterase activity can be reduced to 1/10 or less and the esterase / DAO activity ratio can be reduced to 1% or less.
[0012]
In the present invention, inactivation of the coexisting esterase is carried out not only before the enzymatic oxidation reaction but also by enzymatic oxidation of CGL to GL-7ACA by reacting a DAO-containing substance which does not inactivate the coexisting esterase. A Cu compound may be brought into contact at the stage of reacting. That is, the above-mentioned contact of the Cu compound is not performed directly beforehand with the DAO-containing substance in which the esterase coexists, but by adding the Cu compound when reacting the enzyme-containing substance with the CPC solution. Also in this case, the Cu compound may be brought into contact so that the concentration of the Cu compound in the reaction solution is in the range of 10 to 2000 ppm. Further, it is preferable to carry out the above reaction at a Cu compound concentration in the range of 50 to 400 ppm, since the esterase / DAO activity ratio can be reduced to 1% or less. Examples of the Cu compound used in the present invention include CuSO 4 .
[0013]
Esterase activity was determined by adding an appropriate amount of an enzyme sample to a 2 g / L GL-7ACA solution dissolved in 0.2 M phosphate buffer (pH 7.5) and reacting at 25 ° C. for 30 minutes. The reaction can be stopped by adding methanol, and the amount of produced desacetyl-GL-7ACA can be determined by quantifying the amount of desacetyl-GL-7ACA by high performance liquid chromatography (HPLC).
The DAO activity was determined by adding an appropriate amount of an enzyme sample to a 10 g / L CPC solution in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.5), reacting it at 25 ° C. for 15 minutes, and adding an equal amount of methanol. Is added to stop the reaction, and the resulting GL-7ACA and KETO-CPC can be determined by quantification by HPLC.
If the DAO-containing material is contacted with a Cu compound during the enzymatic oxidation reaction, desacetyl-CPC and desacetyl-GL-7ACA before and after the enzymatic oxidation reaction are quantified. The increase of the desacetyl derivative relative to CPC is defined as the esterase / DAO activity ratio.
[0014]
In performing an enzymatic oxidation reaction by allowing a DAO-containing substance to act on a CPC-containing liquid, the reaction is usually performed while blowing oxygen into the reaction liquid. The reaction temperature is usually in the range of 20 to 30 ° C. The reaction time depends on the CPC concentration, the amount or activity of the DAO-containing substance, the reaction temperature, and the pH. However, the progress of the reaction can be monitored by HPLC, thin-layer chromatography, or the like. The reaction may be appropriately terminated after waiting for the maximum generation time. Usually, it is about 30 minutes to 4 hours. Hydrogen peroxide may be added to the reaction solution in order to reduce the remaining amount of KETO-CPC.
The target GL-7ACA can be collected and purified from the obtained reaction solution by a known method.
[0015]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Reference Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
(Example 1)
Trigonopsis variabilis KC-103 strain was cultured at 25 ° C. for 60 hours in a medium containing 2% glucose, 2% corn steep liquor and 0.2% DL-methionine, and 60 ml of the resulting culture solution (wet 6 g of wet cells) 0.3 ml of toluene was added thereto, and the mixture was stirred at 25 ° C. for 2 hours to impart membrane permeability to the cells.
[0016]
In the obtained toluene-containing culture solution, 23.6 mg of CuSO 4 .5H 2 O was dissolved and left at room temperature for 2 hours. An appropriate amount of an enzyme sample was taken out from the obtained toluene-Cu-containing culture solution, added to a 2 g / L GL-7ACA solution dissolved in 0.2 mol / L potassium phosphate buffer (pH 7.5), and added at 25 ° C. After reaction for 30 minutes, the reaction was stopped by adding an equal amount of methanol. When the amount of the produced desacetyl-GL-7ACA was quantified by HPLC, newly produced desacetyl-GL-7ACA could not be quantified, and it was found that the esterase in the enzyme sample was sufficiently inactivated. Was.
Next, 10 g of CPC powder was dissolved in 1000 ml of water, and a CPC solution adjusted to pH 7.5 was mixed with the above-mentioned toluene-Cu-containing culture solution. And GL-7ACA was obtained with a yield of 93.2%.
[0017]
(Example 2)
Culture was carried out in the same manner as in Example 1 to obtain a toluene-Cu-containing culture solution of Trigonopsis variabilis KC-103 strain in which the culture solution was imparted with membrane permeability and esterase was inactivated. On the other hand, a culture solution of Acremonium chrysogenum containing 8.5 g / L of CPC was sterilized at pH 2.5, adjusted to pH 7.5, and 1200 ml of the obtained CPC culture solution was cultured in the toluene-Cu-containing culture. The solution was mixed with 60 ml.
Subsequently, the mixture was reacted at 20 ° C. for about 240 minutes while blowing oxygen into the mixed culture medium and continuously adding 23.9 ml of 3.5% hydrogen peroxide. GL-7ACA was obtained at a rate.
[0018]
(Example 3)
Culture was carried out in the same manner as in Example 1 to obtain a toluene-containing culture solution of Trigonopsis variabilis KC-103 strain in which the culture solution was imparted with membrane permeability. On the other hand, 10 g of CPC powder was dissolved in 1000 ml of water, and a CPC solution adjusted to pH 7.5 was mixed with 60 ml of the toluene-containing culture solution.
Then, 0.5 g of CuSO 4 .5H 2 O was added and dissolved in the mixture, and the mixture was reacted at 20 ° C. for about 180 minutes while blowing oxygen, whereby GL-7ACA was obtained at a yield of 92.2%. Was done.
In addition, before and after the reaction, the increase of desacetyl-CPC and desacetyl-GL-7ACA by esterase was 1% or less of the amount of CPC added even when both were added.
[0019]
(Example 4)
Cultivation was carried out in the same manner as in Example 1, and 60 ml of a toluene-containing culture solution of Trigonopsis variabilis KC-103 strain having membrane permeability imparted to the culture medium, and CPC culture obtained in the same manner as in Example 2. The solution and 1200 ml were mixed.
Next, 0.5 g of CuSO 4 .5H 2 O was added and dissolved in the mixture, oxygen was blown in, and 23.9 ml of 3.5% hydrogen peroxide was continuously added at 20 ° C. After reacting for about 240 minutes, GL-7ACA was obtained with a yield of 92.0%.
In addition, before and after the reaction, the increase of desacetyl-CPC and desacetyl-GL-7ACA by esterase was 1% or less of the amount of CPC added even when both were added.
[0020]
(Example 5)
Cultivation was carried out in the same manner as in Example 1, and 2.0 ml of toluene was added to 400 ml (containing 40 g of wet bacterial cells) of the obtained culture solution of Trigonopsis variabilis KC-103, followed by the same method as in Example 1. Processed.
157.3 mg of CuSO 4 .5H 2 O was dissolved in the toluene-containing culture solution and left at room temperature for 2 hours. When an appropriate amount of an enzyme sample was taken out from the obtained toluene-Cu-containing culture solution and the esterase activity was measured in the same manner as in Example 1, the esterase in the enzyme sample was sufficiently inactive as in Example 1. It turned out that it was.
Next, 10 g of CPC powder was dissolved in 1000 ml of water, and a CPC solution adjusted to pH 7.5 was mixed with the above-mentioned toluene-Cu-containing culture solution. For about 30 minutes, GL-7ACA was obtained in a yield of 99.0%.
[0021]
(Example 6)
Culture was carried out in the same manner as in Example 1, and 400 ml of a toluene-containing culture solution of Trigonopsis variabilis KC-103 strain having membrane permeability imparted to the culture medium, and a CPC solution obtained by the same method as in Example 1. 1000 ml.
Next, 0.66 g of CuSO 4 .5H 2 O was added and dissolved in the mixture, and the mixture was reacted at 20 ° C. for about 30 minutes while blowing oxygen. As a result, GL-7ACA was obtained at a yield of 98.1%. Was done.
In addition, before and after the reaction, the increase of desacetyl-CPC and desacetyl-GL-7ACA by esterase was 1% or less of the amount of CPC added even if both were added.
[0022]
(Reference Example 1)
Culture was performed in the same manner as in Example 1, and 60 ml of a toluene-containing culture solution of Trigonopsis variabilis KC-103 strain having membrane permeability imparted to the culture solution, and a CPC solution obtained by the same method as in Example 1. 1000 ml were mixed. Next, the mixture was allowed to react at 20 ° C. for about 180 minutes while blowing oxygen, whereby GL-7ACA was obtained at a yield of 83.0%.
[0023]
【The invention's effect】
According to the method of the present invention, esterase coexisting with D-amino acid oxidase can be specifically inactivated or only the esterase reaction can be inhibited, so that GL-7ACA of very high yield and high quality can be obtained. can get. Further, the present invention can be implemented on an industrial scale because it is extremely simple and has good safety.